Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

iPSC-afgeleide cocultuur van epitheel, mesenchymale, endotheelcellen en immuuncellen om de integriteit van de luchtwegbarrière bij longgezondheid en ziekte te modelleren

2.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67247

⸱

6 december 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sanford Consortium for Regenerative Medicine, 2Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 3Department of Pediatrics, University of California, San Diego School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft de generatie van een complex, meercellig luchtwegbarrièremodel dat bestaat uit geïnduceerd pluripotent stamcel (iPSC)-afgeleid longepitheel, mesenchym, endotheelcellen en macrofagen in een lucht-vloeistofinterfacecultuur.

Samenvatting

Menselijk longweefsel bestaat uit een onderling verbonden netwerk van epitheel, mesenchym, endotheel en immuuncellen van de bovenste luchtwegen van de nasopharynx tot de kleinste alveolaire zak. Interacties tussen deze cellen zijn cruciaal bij de ontwikkeling en ziekte van de longen en fungeren als een barrière tegen schadelijke chemicaliën en ziekteverwekkers. Huidige in vitro co-cultuurmodellen maken gebruik van onsterfelijke cellijnen met verschillende biologische achtergronden, die mogelijk niet nauwkeurig het cellulaire milieu of de interacties van de long weergeven. We differentieerden menselijke iPSC's in 3D-longorganoïden (die zowel epitheel als mesenchym bevatten), endotheelcellen en macrofagen. Deze werden samen gekweekt in een lucht-vloeistofinterface (ALI) -formaat om een epitheel/mesenchymale apicale barrière te vormen die is belegd met macrofagen en een basolaterale endotheliale barrière (iAirway). iPSC-afgeleide iAirways vertoonden een vermindering van de barrière-integriteit als reactie op infectie met respiratoire virussen en sigarettentoxines. Dit longcocultuursysteem met meerdere afstammingslijnen biedt een platform voor het bestuderen van cellulaire interacties, signaalroutes en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan longontwikkeling, homeostase en ziekteprogressie. iAirways bootsen de menselijke fysiologie en cellulaire interacties nauwkeurig na, kunnen worden gegenereerd op basis van van de patiënt afgeleide iPSC's en kunnen worden aangepast om verschillende celtypen van de luchtwegen op te nemen. Over het algemeen bieden iPSC-afgeleide iAirway-modellen een veelzijdig en krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de integriteit van barrières om genetische drijfveren voor ziekte, pathogene respons, immuunregulatie en ontdekking of hergebruik van geneesmiddelen in vitro beter te begrijpen, met het potentieel om ons begrip en onze behandeling van luchtwegaandoeningen te vergroten.

Inleiding

De bloed-luchtbarrière in de grote luchtwegen omvat de luchtpijp, bronchiën en bronchiolen. Het speelt een cruciale rol bij het behoud van de gezondheid van de luchtwegen en bestaat uit het luchtwegepitheel, het basaalmembraan, bloedvaten en endotheelcellen en immuuncellen. De primaire epitheelcellen in de luchtwegen omvatten basale cellen, clubcellen, trilhaarcellen en slijmbekercellen. Basale cellen, die fungeren als de stamcellen van het luchtwegepitheel, zijn multipotente voorlopercellen met een hoog proliferatief en zelfvernieuwend vermogen, waardoor rijpe luchtwegepitheelcellen ontstaan1. Clubcellen zijn niet-gecilieerde, secretoire cellen die bijdragen aan het behoud van de luchtwegbekleding door beschermende eiwitten en oppervlakteactieve stoffen af te scheiden2. Bekercellen, die zich in het lumen en in de submucosale klieren bevinden, scheiden mucines af om puin op te vangen en de luchtweg te beschermen3. Ciliated cellen zijn een integraal onderdeel van het mucociliaire roltrapmechanisme en voorkomen de ophoping van schadelijke micro-organismen4. Het basaalmembraan bestaat uit een extracellulaire matrix, die structurele ondersteuning biedt5. De luchtpijp en de rest van de luchtwegen zijn omgeven door een rijk netwerk van bloedvaten, die zijn bekleed met endotheelcellen die een vitale rol spelen bij het ondersteunen van de tracheale functie door voedingsstoffen en zuurstof te leveren, afvalstoffen te verwijderen, ontstekingen te reguleren en bij te dragen aan weefselherstel en angiogenese6. Ten slotte zijn luchtwegmacrofagen weefselspecifieke immuuncellen, essentieel voor de bescherming van de luchtwegen tegen infecties, het opruimen van ingeademde deeltjes en het handhaven van een evenwichtige immuunrespons7.

De gecoördineerde werking van epitheel-, mesenchymale, endotheelcellen en macrofaagcellen is van cruciaal belang voor een effectieve immuunrespons op ziekteverwekkers in de luchtwegen8. Epitheelcellen vormen de eerste verdedigingslinie tegen virale infecties door te fungeren als een fysieke barrière, met nauwe verbindingen die de doorgang van schadelijke stoffen beperken. De gecoördineerde werking van trilhaarcellen en slijmbekercellen helpt om ingeademde deeltjes, ziekteverwekkers en puin op te vangen en te verwijderen4. Bovendien produceren luchtwegepitheelcellen cytokines en chemokines om immuuncellen te rekruteren9. Endotheelcellen behouden de vasculaire integriteit, voorkomen de verspreiding van virale deeltjes door de bloedbaan, reguleren adhesiemoleculen (VCAM-1) om de adhesie van immuuncellen te vergemakkelijken en produceren pro-inflammatoire cytokines om immuuncellen uit de bloedbaan naar de plaats van infectie te rekruteren10. Luchtwegmacrofagen verzwelgen en verteren virale deeltjes, geïnfecteerde cellen en puin, presenteren virale antigenen aan T-cellen en produceren cytokines om andere immuuncellen te activeren en te rekruteren, samen met type I-interferonen om virale replicatie te remmen11. De gecoördineerde werking van epitheel-, mesenchymale, endotheel- en macrofaagcellen creëert een robuust en dynamisch afweersysteem dat de luchtwegen beschermt tegen virale infecties en de gezondheid van de luchtwegen in stand houdt.

Het begrijpen van de dynamische interacties tussen verschillende celtypen in de menselijke long is cruciaal voor het begrijpen van de reactie van de long op virale infecties, ontstekingsziekten en medicijnafgifte. In vitro co-culturen maken de studie mogelijk van cel-celsignalering tussen het epitheel, endotheelcellen en aangeboren immuuncellen12. We ontwikkelden het eerste authentieke longmodel van het meercellige type dat is afgeleid van patiëntspecifieke hiPSC's13. Dit omvat zowel epitheel- als mesenchymale celpopulaties, gevormd in een 3D-oriëntatie. Vervolgens kunnen de longvoorlopercellen worden gedifferentieerd tot een "luchtwegorganoïde"14, gekweekt op steriele celkweekinserts en worden blootgesteld aan een lucht-vloeistofinterface (ALI), die de toestand van de menselijke luchtwegen nabootst 15,16,17. iPSC-afgeleide endotheelcellen worden gekweekt aan de basolaterale zijde van het membraan en bootsen hun oriëntatie na in de menselijke luchtwegen, gelegen onder de epitheel/mesenchymale laag in het basaalmembraan. Ten slotte worden iPSC-afgeleide macrofagen toegevoegd aan de apicale zijde van het membraan, in interactie met epitheelcellen en in afwachting van activeringssignalen (Figuur 1A). Dit model reproduceert nauwkeurig de biologie en functie van de luchtwegen. We stellen dat hiPSC-afgeleide, patiëntspecifieke, authentieke multi-cell type iAirway-culturen het meest geschikt zijn om de intrinsieke, acute respons van de luchtwegbarrière en pathogenen, waaronder virale infecties, op te helderen. Dit model kan bijvoorbeeld worden gebruikt om (1) virale binnenkomst en replicatie te bestuderen, (2) de initiële immuunrespons door epitheel- en weefselspecifieke immuuncellen te onderzoeken, (3) de integriteit en functie van de barrière te onderzoeken, (4) de werkzaamheid van therapeutische middelen te testen, en (5) cellulaire en moleculaire mechanismen van pathogenese te bestuderen in een patiëntspecifiek model.

Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het bereiden van meercellige longco-culturen om cellulaire reacties op virale infecties te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit onderzoeksprotocol is goedgekeurd door de Institutional Review Board van UCSD's Human Research Protections Program (181180). Dit protocol maakt gebruik van kleine moleculen en groeifactoren om de differentiatie van pluripotente stamcellen naar luchtwegcellen, endotheelcellen en macrofagen te sturen. Deze cellen worden vervolgens samen gekweekt op celkweekinzetstukken en gepolariseerd in een lucht-vloeistofinterface. De details van de gebruikte reagentia, verbruiksartikelen en apparatuur staan vermeld in de Materiaaltabel. De media en buffersamenstellingen worden verstrekt in aanvullend bestand 1.

1. Generatie van iPSC-afgeleide luchtwegorganoïden (dag 1 - 30)

OPMERKING: Dit protocol schetst de stappen die nodig zijn om iPSC-afgeleide luchtwegorganoïden te genereren (Figuur 1B), volgens de methodologie beschreven in Leibel et al.13. Het proces omvat inductie van definitief endoderm (dag 1-3), generatie van endoderm van de voorste voordarm (dag 4-6) en differentiatie in longvoorlopercellen (dag 7-16). Gedetailleerde methodologie is te vinden in de eerdere publicatie13. De volgende stappen beschrijven het genereren van luchtwegorganoïden uit longvoorlopers.

  1. Extraheren en dissociëren van longvoorlopersferoïden uit ECM-polymeer (dag 17)
    1. Ontdooi extracellulaire matrix (ECM) polymeer (8-9 mg/ml) op ijs.
    2. Zuig verbruikte media op, met behulp van een vacuümaspirator, van longorganoïden die zijn ingebed in ECM.
      NOTITIE: Gebruik voor de volgende aspiratiestappen een vacuümzuiger, tenzij anders vermeld.
    3. Voeg 1 ml 2 E/ml dispase aangevuld met 10 μM ROCK1-remmer (ROCKi) toe aan de cellen en gebruik een P1000-pipet om de longvoorlopercellen in ECM handmatig te resuspen. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C en suspendeer het mengsel om de 15 minuten om de doeltreffendheid van de dissociatie te verbeteren door middel van mechanische verwerking.
    4. Plaats 15 minuten voor gebruik 45 ml PBS op kamertemperatuur in een vriezer van -20 °C om af te koelen. Zorg ervoor dat PBS kouder is dan 4 °C voor optimale ECM-depolymerisatie in de volgende stappen.
    5. Breng na 30 minuten dispase-incubatie de organoïde en dispase-oplossing over in een conische buis van 15 ml.
    6. Voeg gekoelde PBS (2 ml per 1 ml protease) toe om te wassen en verzamel resterende organoïde en ECM-materiaal van de plaat. Resuspendeer de organoïden met behulp van een P1000-pipet en centrifugeer gedurende 5 minuten op 400 x g .
      OPMERKING: Alle centrifugatiestappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven in dit protocol.
    7. Na het centrifugeren moet een troebele ECM-pellet met organoïden zichtbaar zijn. Zuig het bovenstaande voorzichtig op via een pipet en vermijd de ECM-pellet.
    8. Voer een tweede PBS-wasbeurt uit met gekoelde PBS, suspendeer opnieuw met een P1000-pipet en centrifugeer gedurende 5 minuten op 400 x g . Zuig het bovenstaande op via een pipet en laat ~100 μL restoplossing over.
    9. Voeg 2 ml trypsine-achtig protease toe aan de organoïden in de conische buis van 15 ml. Resuspendeer met een P1000-pipet. Incubeer gedurende 10-12 minuten bij 37 °C, keer de buis om of tik om het mengsel halverwege de incubatie opnieuw te suspenderen.
      OPMERKING: Voer 10-12 minuten trypsine-achtige proteasedissociatie uit om organoïden als aggregaten door te geven.
    10. Stop na 12 minuten de trypsine-achtige proteasereactie door 2 ml 2% FBS toe te voegen aan de basismedia (Stop Media, zie aanvullend bestand 1). Resuspendeer de oplossing met een P1000-pipet en centrifugeer gedurende 5 minuten op 400 x g .
    11. Aspireer het bovenstaande op en resuspensiet organoïden in Stop Media aangevuld met 10 μM ROCKi. Neem een monster van 10 μL voor het tellen van cellen met behulp van een hemocytometer en trypan blauw. Houd organoïden op ijs tijdens de telling.
    12. Bereken het volume dat nodig is om 100.000 cellen per put te verkrijgen. De aliquot-cel aggregeert in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeert gedurende 5 minuten bij 400 x g. Verwijder overtollig supernatant en laat 10 μL restmedia over.
    13. Resuspendeer de celpellet in 200 μL koud ECM-polymeer (vermijd luchtbellen en werk snel om voortijdige polymerisatie te voorkomen). Voeg 200 μL van het ECM- en celmengsel toe aan de bodem van elk putje in een plaat met 12 putjes. Laat ECM 5 minuten gedeeltelijk polymeriseren bij kamertemperatuur in de bioveiligheidskast.
    14. Breng de plaat gedurende 30-60 minuten over naar een incubator van 37 °C om de ECM-polymerisatie te voltooien. Voeg vervolgens 1,5 ml organoïde inductiemedium van de luchtwegen toe (aanvullend bestand 1).
    15. Vervang het medium om de dag gedurende 14 dagen tot dag 30. Als het medium binnen 24 uur geel wordt, verhoog dan het volume tot 2 ml.

2. Generatie van iPSC-afgeleide endotheelcellen (dag 1 - 14)

OPMERKING: De volgende procedure beschrijft de generatie van endotheelcellen uit iPSC's (Figuur 1C), aangepast van Patsch et al.18. Deze methode omvat de voorbereiding van platen, differentiatie van iPSC's, inductie van endotheelcellen, sortering en expansie. Tabel 1 geeft een overzicht van de antilichamen die in dit onderzoek zijn gebruikt.

  1. Uitplating van iPSC's voor endotheliale differentiatie (dag 0)
    1. Begin met de differentiatie van endotheelcellen wanneer hiPSC's 70%-80% confluentie bereiken. Voeg een uur voor de dissociatie 10 μM ROCKi Y-27632 toe aan elk putje.
    2. Zuig de media op, was putjes met 1 ml PBS en dissocieer vervolgens iPSC's door 1 ml celloslatingsoplossing toe te voegen per putje van een plaat met 12 putjes. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C.
    3. Neutraliseer de oplossing voor celloslating door 2 ml stopmedia aan de putjes toe te voegen. Pipet om een eencellige suspensie te verkrijgen. Breng de cellen over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g.
    4. Aspireer de supernatant, resuspensie van iPSC's in iPSC-kweekmedia aangevuld met 10 μM ROCKi en voer een celtelling uit. Plaat 100.000 hiPSC's per putje van een ECM-gecoate plaat met 12 putjes in 1 ml iPSC-kweekmedia met 10 μM ROCKi. Incubeer een nacht bij 37 °C.
      OPMERKING: De zaaidichtheid voor iPSC-endotheliale differentiatie moet mogelijk per cellijn worden geoptimaliseerd. Beoordeel de differentiatie-efficiëntie met behulp van flowcytometrie voor CD31 op dag 6.
  2. Laterale mesoderm-inductie (dag 1-3)
    1. Zuig iPSC-kweekmedia op uit geplateerde iPSC's en voeg 3 ml N2B27-basismedia toe, aangevuld met 6 μM CHIR en 25 ng/ml BMP4 per putje (aanvullend bestand 1). Verwarm de media voordat u deze aan de cellen toevoegt. Verander de media gedurende 3 dagen niet.
  3. Inductie van endotheelcellen (dag 4-5)
    1. Zuig op dag 4 de N2B27-media op en voeg 2 ml endotheliale differentiatiemedia (EDM) toe, aangevuld met 200 ng/ml VEGF165 en 2 μM forskolin per putje. Verander de media op dag 5.
  4. Sorteren en herplateren van endotheelcellen (dag 6)
    1. Bereid op dag 5 of 6 een met fibronectine beklede T75-kolf voor voor verrijking met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) door 1 mg fibronectine in steriel water te reconstitueren om een 100 μg/ml fibronectine-oplossing te maken. Smeer de T75-kolf in met 6 ml fibronectineoplossing en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Zuig de fibronectine-oplossing op en was met steriel water. Laat de T75-kolf op kamertemperatuur drogen. Extra gemaakte kolven kunnen bij 4 °C worden bewaard.
    2. Bereid endotheliale onderhoudsmedia (EMM) voor18.
    3. Verrijk op dag 6 iPSC-afgeleide endotheelcellen via FACS met behulp van het CD31-antilichaam18.
    4. Voeg 10 μM ROCKi Y-27632 toe aan elk putje een uur voor de dissociatie bij 37°C. Zuig het medium op en was met PBS. Voeg 1 ml voorverwarmde celloslatingsoplossing toe per putje van een plaat met 12 putjes en incubeer gedurende 8-10 minuten bij 37°C.
    5. Piket voorzichtig om ervoor te zorgen dat de enkele cel loskomt. Breng de cellen over naar een conische buis van 15 ml en voeg een gelijk volume stopmedia toe. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g.
    6. Zuig het bovenstaande op en resusinfecteer endotheelcellen in 1 ml Stop Media aangevuld met 10 μM ROCKi.  Haal de cellen door het 70 μm filter door eerst 1 ml stopmedia toe te voegen om het filter nat te maken en pipetteer vervolgens de cellen door het filter. Neem een monster van 10 μL voor het tellen van cellen met behulp van een hemocytometer en trypan blauw. Houd cellen op ijs tijdens de telling.
    7. Voer een celtelling uit. Bereid een aliquot van 200.000 cellen voor als een ongekleurde negatieve controle. Breng de resterende cellen over in een Eppendorf-buis van 1,5 ml en voeg 10 μL CD31-APC toe voor elke 1 miljoen cellen in 100 μL FACS-buffer. Incubeer gedurende 30 minuten op een rotator bij 4 °C.
    8. Zodra de incubatie is voltooid, centrifugeert u de Eppendorf-buis met cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g, wast u de cellen door 1 ml PBS toe te voegen. Herhaal de was- en centrifugatiestap twee keer. Verwijder het bovenstaande middel handmatig tussen de wasbeurten door.
    9. Resuspendeer de celpellet in 1 ml FACS-buffer en 5 μg/ml DAPI-oplossing voor levensvatbaarheidskleuring, 5 minuten voor het sorteren. Sorteer op institutionele richtlijnen.
    10. Verzamel FACS-gesorteerde cellen in een conische buis van 15 ml met 2 ml EMM. Centrifugeer de conische buis van 15 ml met cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g. Zuig het bovenstaande op en resusinfecteer endotheelcellen in 10 ml EMM aangevuld met 10 μM ROCKi Y-27632 en penicillinestreptomycine (1%).
    11. Breng de geresuspendeerde, met FACS verrijkte iPSC-afgeleide endotheelcellen over naar de met fibronectine beklede kolf. Verdeel de cellen gelijkmatig en plaats ze een nacht in een broedmachine van 37 °C.
      OPMERKING: Gebruik minimaal 500.000 cellen en maximaal 2.000.000 cellen per T75-kolf.
  5. Expansie en cryopreservatie van gesorteerde endotheelcellen (Dag 7+)
    1. Vervang de EMM-media elke 2-3 dagen na FACS-verrijking. Zodra de T75-kolf confluent wordt (ongeveer 7 dagen na FACS, afhankelijk van de zaaidichtheid), kunnen de iPSC-afgeleide endotheelcellen worden gebruikt voor co-cultuur of worden gecryopreserveerd voor toekomstige toepassingen.
    2. Bereid een 2x endotheliale vriesoplossing voor voorafgaand aan celdissociatie (80% Endo-CM2, 20% DMSO, 20 μM ROCKi).
    3. Label cryoviale buisjes in een ethanolbestendige pen met de bijbehorende informatie. Lijn-ID, passagenummer, cultuurmedia, 'ontdooien in een 6-put', datum van bevriezing.
    4. Wanneer de gesorteerde iPSC-afgeleide endotheelcellen samenvloeien, start dan dissociatie.
    5. Was de T75-kolf met 5 ml PBS -/-.
    6. Dissocieer iPSC-afgeleide endotheelcellen met 5 ml trypsine-achtige protease per T75. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 37 °C en controleer de T75 regelmatig om te controleren of de cellen zijn opgetild.
    7. Neutraliseer de reactie door 5 ml Stop Media toe te voegen. Breng 10 ml cellen in oplossing over in een buis van 15 ml. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 min.
    8. Zuig de supernatant op, suspendeer endotheelcellen in E-CBM-media en neem een monster van 10 μl voor telling via een hemacytometer.
    9. Na het celgetal aliquot 1 miljoen cellen per 0,5 ml EGM2-media.
      OPMERKING: De volgende stap is tijdgevoelig. Bereid cryovials en vriesvaten voor op onmiddellijk gebruik.
    10. Aliquot gelijk volume van 2x vriesoplossing op endotheelcellen. De uiteindelijke concentratie is 90% Endo-CM2, 10% DMO en 10 μM ROCKi (1 ml/1 miljoen cellen).
    11. Breng de afgedekte injectieflacons onmiddellijk over in een vrieskamer en zet ze een nacht bij -80 °C en vervolgens de volgende dag in vloeibare stikstof (-180 °C) voor langdurige opslag.

3. Aanmaak van iPSC-afgeleide macrofagen (Dag 1 - 26)

OPMERKING: Deze procedure schetst de stappen om macrofagen te genereren uit iPSC's (Figuur 1D), aangepast van Wilgenburg et al.19 en Pouyanfard et al.20. Het omvat eencellige aanpassing van iPSC's, embryoïde lichaamsdifferentiatie, vorming van macrofaagvoorlopercellen en rijping van macrofagen.

  1. Eencellige aanpassing van iPSC's
    1. Wanneer iPSC's ~70%-90% confluentie bereiken zonder zichtbare tekenen van differentiatie, begin dan met eencellige passage met trypsine-achtig protease.
    2. Opgezogen media opzuigen en spoelen met PBS. Verwijder PBS en voeg trypsine-achtig protease toe (1 ml/putje van een plaat met 6 putjes, 500 μl/putje van een plaat met 12 putjes). Incubeer 2-5 minuten bij 37 °C totdat iPSC-kolonies van de plaat uiteenvallen.
    3. Neutraliseer trypsine-achtig protease met een gelijk volume Stop Media (1 ml/putje van een plaat met 6 putjes, 500 μl/putje van een plaat met 12 putjes). Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 5 min.
    4. Zuig het bovenstaande op en resusinfecteer de cellen voorzichtig in iPSC-kweekmedia met 10 μM ROCKi. Doorgang op nieuwe ECM-gecoate platen. Herhaal dit gedurende 2-3 passages voordat u de eencellige aangepaste iPSC's gaat cryopreserveren of gebruiken.
      OPMERKING: Pas de passageverhouding aan van 1:2 tot 1:10 op basis van de gezondheid en aanpassing van de cellen. Bovendien leveren iPSC's die ten minste drie eencellige passages hebben ondergaan en een lage passage hebben, optimale macrofaagdifferentiaties op.
  2. Embryoïde lichaamsvorming (dag 0-6)
    1. Wanneer eencellige aangepaste iPSC's ~75% confluentie bereiken, worden iPSC's met trypsine-achtig protease gepasseerd volgens de stappen 3.1-3.4.
    2. Resuspendeer de cellen in Stop Media en voer ze door een celzeef van 70 μm in een nieuwe conische buis van 50 ml om klonten te verwijderen. Resuspendeer de cellen en neem een monster van 10 μl voor het celgetal via een hemacytometer.
    3. Voor het genereren van embryoïde lichaam (EB) worden 8.000-50.000 cellen geplateerd per putje van een plaat met 96 putjes voor ultra-lage hechting (ULA). Bereken het totale aantal cellen dat nodig is om 60 putjes van een ULA-plaat met 96 putjes te zaaien.
      OPMERKING: De zaaidichtheid van iPSC's moet mogelijk per cellijn worden geoptimaliseerd.
    4. Centrifugeer iPSC's in 15 ml conisch bij 200 x g gedurende 5 min. Aspiratie van het bovenlevende.
    5. Voor 480.000 iPSC's (8.000 cellen/putje in 60 putjes), resuspenseren in 6 ml (100 ul/putje in 60 putjes) EB-inductiemedia.
    6. Voeg 150 μL PBS toe aan de 36 buitenste putjes van een ULA-plaat met ronde bodem en 96 putjes.
    7. Resuspendeer iPSC's in EB-media en breng ze over naar een mediatrog. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 100 μl/putje celsuspensie toe aan de middelste 60 putjes van de ULA-plaat met 96 putjes. Resuspendeer iPSC's in EB-media met tussenpozen om een gelijkmatige verdeling van cellen te garanderen.
    8. Centrifugeer de plaat met 96 putjes bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C (indien beschikbaar). Breng de platen over naar een broedstoof van 37 °C.
    9. Vervang na 48-72 uur 50 μL van de media (halve mediawissel). Controleer na 6 dagen op cystevorming.
      OPMERKING: Sommige iPSC-lijnen vormen eerder of gemakkelijker EB's dan andere. Bewaak de vorming van EB's en zorg ervoor dat EB's op het juiste tijdstip worden overgedragen (ze zouden cysten moeten ontwikkelen).
  3. Gelatinecoating en EB-overdracht voor de vorming van macrofaagvoorlopercellen (dag 6-19)
    1. Bereid twee met 0,1% gelatine omhulde borden met 6 putjes voor. Voeg 1 ml 0,1% gelatine per putje toe en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de gelatineoplossing op en laat de platen 30-60 minuten in de kap drogen.
    2. Breng de EB's over van de plaat met 96 putjes naar de met gelatine beklede platen met 6 putjes met behulp van een serologische pipet van 2 ml. Verdeel ongeveer 8-10 EB's per putje van een met gelatine omhulde plaat met 6 putjes.
    3. Verwijder voorzichtig de resterende EB-media die van de overdracht zijn gebruikt. Voeg 2 ml macrofaagcultuurmedia 1 (Mac-CM1) per putje toe. Incubeer EB's ongestoord bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 5-7 dagen.
      OPMERKING: Idealiter kan een plaat met 96 putjes embryoïde lichamen worden opgesplitst in twee platen met 6 putjes. Als de EB's slecht ontwikkeld zijn, kan het aantal EB's dat per plaat met 6 putjes wordt overgedragen, worden aangepast om de differentiatiestap van iPSC naar embryoïde lichaam te optimaliseren.
  4. Generatie van macrofaagvoorlopers
    1. Vervang 2/3 van de media twee keer per week en verhoog het volume tot 3 ml als de kleur van de media verandert.
    2. Controleer culturen tussen dag 8-19 om te bepalen of ze klaar zijn voor het oogsten van macrofaagvoorlopers. Als EB's loskomen, breng dan EB's over naar een vers gecoate plaat met Mac-CM1 en incubeer ze ongestoord gedurende 7 dagen.
      OPMERKING: Het onderhoud van het macrofaag-voorlopervormende complex is van vitaal belang voor de ontwikkeling en continue generatie van macrofaagvoorlopers. Geoptimaliseerde macrofaag-voorlopervormende complexen zullen gedurende 2-6+ maanden continu myeloïde voorlopers genereren.
  5. Oogsten van myeloïde voorlopercellen (Dag 19-26+)
    1. Wanneer er macrofaagvoorlopercellen in suspensie zijn, oogst dan de media met cellen en breng ze over naar een conische buis van 50 ml. Centrifugeer 5 minuten op 200 x g en verwijder voorzichtig het supernatant.
    2. Resuspendeer macrofaagvoorlopercellen in Mac-CM2 en breng over naar een onbehandelde steriele kweekschaal/kolf. Incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 3-4 dagen.
      OPMERKING: Afhankelijk van het aantal geoogste cellen, overbrengen naar een petrischaal van 10 cm (3-4 putjes van een plaat met 6 putjes), T25-kolf (1-2 putjes van een plaat met 6 putjes) of T75-kolf (volle plaat met 6 putjes) met het juiste volume media. Gebruik 5-6 ml media voor een T25-kolf, 10-12 ml media in een petrischaaltje en 12-15 ml media voor een T75-kolf. Voor volgende oogsten kunnen myeloïde voorlopercellen en macrofaagcellen worden samengevoegd van eerdere oogsten als ze uit dezelfde lijn/myeloïde vormende complexen komen. Zorg er gewoon voor dat de kolf voldoende is om het aantal cellen in de kolf(s) te onderhouden en te voeden. Macrofagen vermenigvuldigen zich niet; Ze worden gegenereerd uit voorlopers van macrofagen. Macrofagen kunnen worden samengevoegd en gedurende 2-6 weken worden onderhouden zonder expressiemarkers te verliezen.
  6. Macrofagen oogsten
    OPMERKING: Na 14 dagen macrofaagdifferentiatie in Mac-CM2-media zijn macrofaagculturen klaar voor co-cultuur of flowcytometrie-analyse.
    1. Verzamel gebruikte media en breng deze over naar een conische buis van 50 ml. Spoel de kolf/plaat af met PBS om achtergebleven media en cellen te verwijderen.
    2. Voeg basismedia toe aan de kolf (3 ml voor T25 en 5 ml voor T75) en gebruik een steriele celschraper om de cellen los te maken van de bodem van de kolf/plaat. Breng de cellen over naar een conische buis en herhaal het schrapen indien nodig.
    3. Centrifugeer op 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig het bovenstaande en suspendeer de cellen opnieuw in de juiste media of buffer voor verder gebruik.

4. Co-cultuur van luchtwegcellen, endotheelcellen en macrofagen

OPMERKING: Deze procedure beschrijft de stappen voor de co-cultuur van luchtwegcellen, endotheelcellen en macrofagen (Figuur 1A) met behulp van celkweekinserts, aangepast van Costa et al.12.

  1. ECM-coating van celkweekinserts voor co-cultuur (dag 0 van co-cultuur)
    1. Smeer 3,0 μm poriënpolyester (PET) celcultuurinserts in met 4 mg/ml ECM-oplossing. Smeer de apicale zijde van de invoegingen van de celcultuur kort in de plaat in met 4 mg/ml ECM-oplossing. Pipetteer de resterende ECM-oplossing af. Plaats de plaat 1 uur in de broedmachine bij 37 °C.
    2. Zorg voor een grote petrischaal (100 mm x 20 mm of 150 mm x 20 mm). Breng met een schoon pincet de celkweekinzetstukken van de plaat met 12 putjes steriel over in de grote petrischaal. Keer de inzetstukken om zodat de basolaterale zijde rechtop staat.
    3. Smeer de basolaterale zijde in met 4 mg/ml ECM-oplossing. Pipetteer de resterende ECM-oplossing af. Plaats de petrischaal met ECM-gecoate celcultuurinzetstukken in een incubator van 37 °C om een nacht te drogen.
  2. Dissociatie en plating van iPSC-afgeleide endotheelcellen (dag 1 van co-cultuur)
    1. Was de T75-kolf met PBS en aspiratieoplossing. Voeg 5 ml trypsine-achtig protease toe aan de T75-kolf en incubeer gedurende 8 minuten bij 37 °C. Beoordeel visueel of de endotheelcellen uit de kolf zijn opgetild.
      OPMERKING: Verlang de tijd van typsine-achtige protease-dissociatie als de van iPSC afgeleide endotheelcellen niet uit de kolf zijn opgetild.
    2. Tik op een kolf om ervoor te zorgen dat de endotheelcellen loskomen en breng de cellen over in een kegelvormige vorm van 15 ml. Voeg 5 ml stopmedia toe om de dissociatie te stoppen. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 min.
    3. Aspireer supernatans en suspendeer de celpellet in 1 ml endotheliale kweekmedia met 10 μM ROCKi. Verkrijg 10 μL geresuspendeerde oplossing voor het celgetal en plaats de cellen tijdens de telling op ijs.
    4. Gebruik 150.000 iPSC-endotheelcellen per 12 mm celkweekinsert in 100 μL endotheelkweekmedia. Pas het respectieve mediavolume aan om het gewenste aantal cellen per invoegsel te bereiken.
    5. Haal een petrischaaltje met ECM-gecoate 3,0 μm celkweekinzetstukken uit de incubator (zie stappen 4.1-4.3).
    6. Resuspendeer iPSC-endotheelcellen en pipetteer 100 μl met 150.000 cellen op het omgekeerde celkweekinzetstuk (basolaterale kant naar boven). Herhaal het pipetteren voor elk van de voorbereide celkweekinserts
    7. Breng de cellen voorzichtig over in de broedmachine en laat ze 3 uur ongestoord.
    8. Voeg in een plaat met 12 putjes 1 ml endotheelkweekmedia toe aan elk putje (voor het respectieve aantal voorbereide celkweekinzetstukken).
    9. Haal het petrischaaltje met endotheelcellen uit de broedmachine. Breng met een schoon pincet de celkweekinzetstukken voorzichtig over in de plaat met endotheelkweekmedia (draai de insteekplaat om zodat de onderkant nu naar beneden in de media wijst).
    10. Controleer visueel met een microscoop of endotheelcellen zich hadden gehecht. Plaats de plaat een nacht in een broedmachine van 37 °C.
  3. Dissociatie en plating van iPSC-afgeleide luchtwegorganoïden (Dag 2 van de co-cultuur)
    NOTITIE: Raadpleeg de stappen 1.1.1-1.1.15 voor isolatie van luchtwegorganoïden van ECM-polymeer. Wijzig de duur van de dissociatie van trypsine-achtig protease (stap 1.1.10) naar 15-20 minuten om eencellige suspensie te verkrijgen.
    1. Stop na 15-20 minuten de trypsine-achtige proteasereactie door 3 ml Stop Media toe te voegen. Resuspendeer de oplossing met een P1000-pipet en centrifugeer gedurende 5 minuten op 400 x g .
    2. Zuig het bovenstaande op en suspendeer de luchtwegorganoïden in 1 ml luchtwegexpansiemedia met 10 μM ROCKi. Neem een monster van 10 μL voor een hemacytometer celtelling en plaats de cellen tijdens de telling op ijs.
    3. Zaai 300.000 iPSC-luchtwegcellen in 500 μL luchtwegexpansiemedia per 12 mm celkweekinsert. Pas het respectieve mediavolume aan om het gewenste aantal cellen per voorbereide insert te bereiken.
    4. Verwijder de plaat met celkweekinzetstukken met endotheelcellen (gezaaid aan de basolaterale zijde) uit de broedmachine van 37 °C.
    5. Resuspendeer iPSC-luchtwegcellen en pipetteer 500 μl met 300.000 cellen in de apicale kamer van elke celkweekinsert. Plaats de plaat gedurende 48 uur in een incubator van 37 °C met de apicale cellen in vloeistof-vloeistofomstandigheden.
  4. Co-cultuur luchttransport (Dag 4 van co-cultuur)
    1. Verwijder media van de apicale zijde van de celcultuurinsert. Verander basolaterale media naar 1:1 luchtwegdifferentiatiemedia en endotheliale cultuurmedia. Plaats de plaat terug in de broedmachine.
  5. Dissociatie en plating van iPSC-afgeleide macrofagen (dag 5 van co-cultuur)
    1. Dissocieer iPSC-afgeleide macrofagen van de kolf met behulp van een celschraper (zie stappen 3.22-3.24). Centrifugeer 5 minuten bij 300 x g en zuig de supernatant op.
    2. Resuspendeer iPSC-macrofagen in 1 ml Mac-CM2. Neem een monster van 10 μL voor het tellen van cellen en plaats de cellen tijdens de telling op ijs. Het aantal macrofagen weerspiegelt het aantal gezaaide luchtwegcellen (1:1 verhouding van macrofagen tot luchtwegcellen).
    3. Na het celgetal worden ongeveer 300.000 macrofagen in media van 35 μl per putje bereide celcultuur in een microcentrifugebuis van 1,5 ml ingebracht. Centrifugeer op 200 x g gedurende 5 min.
    4. Na het centrifugeren pipet u het supernatant eruit. Resuspendeer macrofagen in de respectievelijke Mac-CM2 uit berekeningen.
    5. Verwijder inserts met co-culturen van endotheel- en luchtwegcellen uit de couveuse. Zaai 300.000 macrofagen in 35 μL Mac-CM2 op de apicale zijde van de celkweekinsert. Plaats de plaat gedurende 48 uur in een broedstoof van 37 °C.
      OPMERKING: Om de hechting van iPSC-immuuncellen aan de celkweekinsert te bevestigen, kunnen cellen worden gelabeld met een fluorescerende sonde. Bevestig de therapietrouw via microscopie voor een fluorescerend signaal 48 uur na de macrofaagplaat.
  6. Drievoudige co-cultuur (Dag 7 van de co-cultuur)
    1. Zorg ervoor dat de co-cultuur klaar is voor stroomafwaartse toepassingen zoals infectiestudies, metingen van transepitheliale elektrische weerstand (TEER) en tests voor barrière-integriteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Er zijn meerdere stadia waarin de differentiatie van iPSC-afgeleide luchtwegorganoïden, endotheelcellen, immuuncellen en co-culturen als succesvol kan worden beoordeeld. Differentiaties kunnen worden uitgevoerd in verschillende iPSC-lijnen en dit protocol is getest in ten minste vijf verschillende lijnen. Het protocol moet wel worden aangepast aan elke nieuwe iPSC-lijn, met name door de zaaidichtheid aan te passen en te optimaliseren.

De succesvolle opbrengst ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De ontwikkeling en implementatie van een model van de bloed-luchtbarrière in de grote luchtwegen voor het bestuderen van virale infecties en andere toxines vereist nauwgezette aandacht voor detail om de succesvolle differentiatie en functie van de verschillende betrokken celtypen te garanderen. Deze discussie gaat in op de belangrijkste factoren voor succesvolle differentiatie, mogelijke uitdagingen, alternatieve toepassingen en implicaties voor het bestuderen van ziekten bij de mens.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door CIRM (DISC2COVID19-12022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
12 well platesCorning3512
12-well inserts, 0.4 µm, translucent VWR10769-208
2-mercaptoethanol Sigma-AldrichM3148
AccutaseInnovative Cell TechAT104
Activin AR&D Systems338-AC
All-trans retinoic acid (RA) Sigma-AldrichR2625
ascorbic acidSigmaA4544
B27 without retinoic acid ThermoFisher12587010
BMP4 R&D Systems314-BP/CF
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution Gibco15260-037
Br-cAMPSigma-AldrichB5386
CD 14 (FITC)BioLegend982502
CD 31 PECAM-1(APC)R&D SystemFAB3567A
CD 45 (PE)BD Biosciences560975
CD 68 (PE)BioLegend33808
CHIR99021 Abcamab120890
CPMFujifilm014-27501
Dexamethasone Sigma-AldrichD4902
Dispase StemCellTech7913
DMEM/F12 Gibco10565042
DorsomorphinR&D Systems3093
E-CAD/CD 324 (APC)BioLegend324107
EGFR&D Systems236-EG
EGM2 MediumLonzaCC-3162
EPCAM/CD 326 (APC)BioLegend324212
FBS Gibco10082139
FGF10R&D Systems345-FG/CF
FGF7R&D Systems251-KG/CF
FibronectinFisher356008
ForskolinAbcamab120058
Glutamax Life Technologies35050061
Ham’s F12 Invitrogen11765-054
HEPESGibco15630-080
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)Sigma-AldrichI5879
IL-3Peprotech200-03
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax Invitrogen31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828028
MatrigelCorning354230
M-CSFPeprotech 300-25
Monothioglycerol SigmaM6145
mTeSR plus Kit (10/case)Stem Cell Tech5825
N2 ThermoFisher17502048
NEAALife Technologies11140050
PBSGibco10010023
Pen/strepLonza17-602F
ReleSRStem Cell Tech5872
RPMI1640 + Glutamax Life Technologies12633012
SB431542 R&D Systems1614
SCFPeproTech300-07
SMAInvitrogen50-9760-80
STEMdiff APEL 2 MediumSTEMCELL Technologies5275
TrypLE ExpressGibco12605-028
VEGF165Preprotech100-20
VimentinCell Signaling5741S
Y-27632 (Rock Inhibitor) R&D Systems1254/1
ZO-1Invitrogen339100

Referenties

  1. Wu, M., Zhang, X., Lin, Y., Zeng, Y. Roles of airway basal stem cells in lung homeostasis and regenerative medicine. Respir Res. 23 (1), 122(2022).
  2. Blackburn, J. B., Li, N. F., Bartlett, N. W., Richmond, B. W. An update in club cell biology and its potential relevance to chronic obstructive pulmonary disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (5), L652-L665 (2023).
  3. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  4. Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Ann Am Thorac Soc. 15 (Suppl 3), S143-S148 (2018).
  5. Khalilgharibi, N., Mao, Y. To form and function: On the role of basement membrane mechanics in tissue development, homeostasis and disease. Open Biol. 11 (2), 200360(2021).
  6. Mcdonald, D. M., Yao, L. C., Baluk, P. Dynamics of airway blood vessels and lymphatics: Lessons from development and inflammation. Proc Am Thorac Soc. 8 (6), 504-507 (2011).
  7. Parker, D., Prince, A. Innate immunity in the respiratory epithelium. Am J Respir Cell Mol Biol. 45 (2), 189-201 (2011).
  8. Davis, J. D., Wypych, T. P. Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium. Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).
  9. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 210-229 (2011).
  10. Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Front Cardiovasc Med. 8, 619690(2021).
  11. Wang, Y., Zheng, J., Wang, X., Yang, P., Zhao, D. Alveolar macrophages and airway hyperresponsiveness associated with respiratory syncytial virus infection. Front Immunol. 13, 1012048(2022).
  12. Costa, A., De Souza Carvalho-Wodarz, C., Seabra, V., Sarmento, B., Lehr, C. M. Triple co-culture of human alveolar epithelium, endothelium and macrophages for studying the interaction of nanocarriers with the air-blood barrier. Acta Biomater. 91, 235-247 (2019).
  13. Leibel, S. L., Mcvicar, R. N., Winquist, A. M., Snyder, E. Y. Generation of 3D whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease. J Vis Exp. (170), e62456(2021).
  14. Mccauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 45 (1), e51(2018).
  15. Choi, K. -Y. G., Wu, B. C., Lee, A. H. -Y., Baquir, B., Hancock, R. E. W. Utilizing organoid and air-liquid interface models as a screening method in the development of new host defense peptides. Front Cell Infect Microbiol. 10, 228(2020).
  16. Fulcher, M. L., Randell, S. H. Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture. Methods Mol Biol. 945, 109-121 (2013).
  17. Hao, S., et al. Long-term modeling of SARS-COV-2 infection of in vitro cultured polarized human airway epithelium. mBio. 11 (6), e02852-e02920 (2020).
  18. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 17 (8), 994-1003 (2015).
  19. Van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long-term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), e71098(2013).
  20. Pouyanfard, S., et al. Human-induced pluripotent stem cell-derived macrophages ameliorate liver fibrosis. Stem Cells. 39 (12), 1701-1717 (2021).
  21. Ardini-Poleske, M. E., et al. Lungmap: The molecular atlas of lung development program. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 313 (5), L733-L740 (2017).
  22. Ronaghan, N. J., et al. M1-like, but not m0- or m2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion. PLoS One. 17 (10), e0276013(2022).
  23. Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 3 (3), 394-403 (2014).
  24. Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nat Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
  25. Firth, A. L., et al. Generation of multiciliated cells in functional airway epithelia from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), E1723-E1730 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

iPSC-luchtwegmodelco-cultuursysteemepitheliale mesenchymale cellenendotheelcellenmacrofaag co-cultuurlucht-vloeistofinterfacelongorganoïdenbarrièrefunctie-assaymodellering van respiratoire ziekten
iPSC-afgeleide cocultuur van epitheel, mesenchymale, endotheelcellen en immuuncellen om de integriteit van de luchtwegbarrière bij longgezondheid en ziekte te modelleren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.