Methodenartikel

Veredeling door ontwerp voor functionele rijst met genoombewerkingstechnologieën

DOI:

10.3791/67336

⸱

3 januari 2025

 ,  ,  ,  , 
1Bellagen Biotechnology Co. Ltd, 2School of Life Sciences, Shandong Normal University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol beschrijft het veredelen van resistente zetmeelrijstvariëteiten door ontwerp met behulp van genoombewerkingstechnologieën op een nauwkeurige, efficiënte en technisch eenvoudige manier.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De conventionele benaderingen van gewasveredeling, die voornamelijk gebaseerd zijn op tijdrovende en arbeidsintensieve methoden zoals traditionele hybridisatie en mutatieveredeling, staan voor uitdagingen bij het efficiënt introduceren van gerichte eigenschappen en het genereren van diverse plantenpopulaties. Omgekeerd heeft de opkomst van technologieën voor het bewerken van het genoom een paradigmaverschuiving ingeluid, waardoor de precieze en versnelde manipulatie van plantengenomen mogelijk is om opzettelijk de gewenste kenmerken te introduceren. Een van de meest verspreide bewerkingstools is het CRISPR/Cas-systeem, dat door onderzoekers is gebruikt om belangrijke biologiegerelateerde problemen te bestuderen. De precieze en effectieve workflow van genoombewerking is echter niet goed gedefinieerd in de gewasveredeling. In deze studie hebben we het hele proces aangetoond van het veredelen van rijstvariëteiten verrijkt met een hoog gehalte aan resistent zetmeel (RS), een functionele eigenschap die een cruciale rol speelt bij het voorkomen van ziekten zoals diabetes en obesitas. De workflow omvatte verschillende belangrijke stappen, zoals de selectie van het functionele SBEIIb-gen , het ontwerpen van het single-guide RNA (sgRNA), het selecteren van een geschikte genoombewerkingsvector, het bepalen van de vectorafgiftemethode, het uitvoeren van plantenweefselcultuur, genotypering van mutaties en fenotypische analyse. Bovendien is het tijdsbestek dat nodig is voor elke fase van het proces duidelijk aangetoond. Dit protocol stroomlijnt niet alleen het veredelingsproces, maar verbetert ook de nauwkeurigheid en efficiëntie van de introductie van eigenschappen, waardoor de ontwikkeling van functionele rijstvariëteiten wordt versneld.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traditionele veredeling is gebaseerd op het introduceren van eigenschappen in gewassen of het produceren van plantenpopulaties met voldoende variatie, wat langdurige veldobservatie vereist 1,2. Vanwege de beperkingen van traditionele veredeling is er technologie voor het bewerken van genen ontwikkeld, die het genoom van gewassen nauwkeurig kan wijzigen om de gewenste eigenschappen van plantenpopulaties te verkrijgen. Het meest gebruikte genbewerkingssysteem in planten is CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease), dat vertrouwt op een programmeerbaar RNA-geleid endonuclease om gerichte dubbelstrengsbreuken (DSB's) in het DNA te creëren 4,5. Deze DSB's worden vervolgens gerepareerd door de natuurlijke DNA-reparatiemechanismen van de cel 6,7, wat vaak resulteert in de introductie van de gewenste genetische veranderingen. Hoewel deze technologie is geïmplementeerd in verschillende gewassen, waaronder tarwe8, maïs9, soja10 en rijst11, wordt deze voornamelijk gebruikt om biologische problemen aan het licht te brengen. Vergeleken met de uitgebreide toepassing ervan bij het ophelderen van plantgenfuncties, blijft onderzoek naar het toepassen van genbewerkingstechnologieën op gewasveredeling relatief schaars12.

Het proces van genbewerking in gewassen volgt doorgaans een goed gedefinieerde workflow die verschillende belangrijke stappen omvat13. De eerste stap is het identificeren van het specifieke gen of genetische gebied dat moet worden gewijzigd om de gewenste eigenschap te bereiken. Ten tweede wordt een strategie voor het bewerken van genen ontworpen, waarbij een geschikt genbewerkingssysteem wordt geselecteerd (bijv. CRISPR-Cas9 of CRISPR-Cas12) en het ontwerp van specifieke gids-RNA's om het endonuclease naar de doellocatie te leiden. Ten derde wordt het genbewerkingssysteem vervolgens opgenomen in een afgiftevector, die wordt gebruikt om de bewerkingsmachines in de plantencellen te introduceren. Deze vectoren kunnen DNA-, RNA- of ribonucleoproteïne (RNP)-complexen zijn. Vervolgens worden de vectoren voor het bewerken van genen in plantencellen afgeleverd met behulp van verschillende methoden, waaronder Agrobacterium-gemedieerde transformatie, deeltjesbombardement of elektroporatie. Onmiddellijk worden de getransformeerde plantencellen onder geschikte omstandigheden gekweekt om genetisch bewerkte callus of embryogene weefsels te genereren. Deze weefsels worden vervolgens geregenereerd tot hele planten door middel van weefselkweektechnieken. De geregenereerde planten worden onderworpen aan een rigoureuze moleculaire karakterisering om de aanwezigheid van de gewenste genetische veranderingen te bevestigen.

Een eerder artikel van Tsakirpaloglou et al.14 geeft een breed overzicht van het genbewerkingsproces, van vectorontwerp tot het genereren van bewerkte zaailingen, maar het gaat niet in op de gedetailleerde analyse van specifieke eigenschappen die verband houden met het beoogde gen, noch op de daaropvolgende evaluatie van agronomische prestaties of functionele validatie van de bewerkte gewassen. We zijn verder gegaan dan alleen het aantonen van de haalbaarheid van het bewerken van een gen in rijst. Ons werk beoordeelt uitgebreid de impact van deze bewerking op de biochemische, moleculaire en agronomische eigenschappen van de bewerkte rijstlijnen. Dit omvat het evalueren van de zetmeelsamenstelling, een kritische factor die van invloed is op de graankwaliteit en voedingswaarde, die niet uitgebreid is onderzocht in eerdere onderzoeken naar genbewerking.

Rijstzetmeel bestaat meestal uit ~20% amylose en ~80% amylopectine15. SBEIIb is een enzym dat essentieel is voor de synthese van amylopectine en wordt tot expressie gebracht in het endosperm16. De knockdown van OsSBEIIb door haarspeld-RNA (RNAi) en microRNA-expressie verhoogde het gehalte aan resistent zetmeel17,18. Resistent zetmeel is een substraatzetmeel dat niet kan worden verteerd en opgenomen in de dunne darm, maar door bepaalde spijsverteringsbacteriën in de darmen kan worden afgebroken tot vetzuren en gassen met een korte keten. Omdat het niet snel kan worden afgebroken, heeft het een lagere glycemische index in vergelijking met ander zetmeel en veroorzaakt het geen snelle stijging van de bloedsuikerspiegel binnen korte tijd na het eten, wat diabetes tot op zekere hoogte in de voeding kan verlichten19. Bovendien heeft resistent zetmeel meer fysiologische functies, zoals het verminderen van de insulinerespons, het reguleren van de darmfunctie, het voorkomen van vetophoping, het vergemakkelijken van gewichtsbeheersing en het bevorderen van de opname van minerale ionen. Daarom wordt het op grote schaal nagestreefd als een nieuw type voedingsvezel20.

Om deze uitdagingen te overwinnen en met succes genbewerkingstechnologieën te gebruiken voor het veredelen van functionele rijstvariëteiten, hebben we de operationele protocollen binnen rijst verfijnd en geoptimaliseerd. Onze focus lag op het nauwgezet analyseren van het ontwerp van doelgenloci, het zorgvuldig selecteren van de meest geschikte genbewerkingstools en het uitvoeren van rigoureuze fenotypische analyses tijdens het veredelingsproces. Als bewijs van de kracht en efficiëntie van deze technologieën presenteren we een casestudy die de snelle ontwikkeling van een functionele rijstvariëteit verrijkt met hoogresistent zetmeel laat zien. Dit voorbeeld onderstreept het potentieel van genbewerking bij het versnellen van de veredeling van functionele rijst, waarmee het huidige gebrek aan onderzoek op dit gebied wordt aangepakt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie werd uitgevoerd bij Bellagen Biotechnology Co. Ltd in China volgens de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek. Voorafgaand aan deelname werd het onderzoeksprotocol grondig uitgelegd aan de proefpersonen, die geïnformeerde toestemming gaven.

1. Ontwerpen van sgRNA en constructievector (timing 5-7 dagen)

OPMERKING: Een binaire vector werd gebruikt om het CRISPR/Cas-SF01-systeem21 uit te drukken. Niet minder dan 3 nucleotiden (nt) mismatch hebben met mogelijke off-target site voor sgRNA. De sgRNA-adapter moet het kleverige uiteinde aanvullen, dat wordt gegenereerd door de Bsa I-enzymvertering van de bewerkingsvector. De keuze van de software was gebaseerd op de gerapporteerde hoge efficiëntie en specificiteit van de software in rijst14, evenals het gebruiksgemak en de toegankelijkheid voor de onderzoeksgroep.

  1. Navigeer naar de NCBI-website (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) om het gen OsSBEIIb (LOC4329532) in Japonica op te halen. Download en open het referentiegenoom binnen de SnapGene-software.
  2. Analyseer de inserties/deleties (InDel) en single nucleotide polymorfismen (SNP) in de exonsequentie van OsSBEIIb van de X134-variëteit en vergelijk deze met het referentiegenoom. Gebruik NCBI Primer Blast22 om primers te ontwerpen die de exon-regio's flankeren (aanvullende tabel 1).
  3. Om de exonsequentie van het OsSBEIIb-gen in X134 te valideren door middel van Sanger-sequencing, bereidt u de reactie als volgt voor: 10 μL polymerasemixbuffer met 1 μL voorwaartse primer, 1 μL omgekeerde primer, 1 μL gDNA uit X134-weefsels en 7 μL gedestilleerd water. Voer het PCR-programma als volgt uit: 95 °C, 3 min; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) met 35 cycli, en 72 °C, 5 min.
  4. Ontwerp het sgRNA op OsSBEIIb exon-sequentie van X134, houd u aan het Tsakirpaloglou et al.14-protocolen zorg ervoor dat de PAM-sequentie TTN is.
  5. Wijzig de sgRNA-sequentie door -ACAC- oligos toe te voegen aan het 5'-uiteinde van de voorwaartse primer en -GGCC- oligo's toe te voegen aan het 5'-uiteinde van de omgekeerde primer. Commercieel synthetiseren van de voorwaartse/achterwaartse primers (voor sgRNA).
  6. Los de voorwaartse en achterwaartse primers op tot een concentratie van 10 μmol/l, neem 1 μl van elk en voeg toe aan 8 μl gloeibuffer (Tris-EDTA-buffer + 50 mM NaCl) en meng door te pipetteren. Plaats in de PCR-machine en voer het gloeiprogramma als volgt uit op een PCR-machine: langzaam afkoelproces 95 °C tot 16 °C bij 0,1 °C/s.
  7. Assembleer het sgRNA in de genoombewerkingsvector. Bereid de reactie als volgt voor: 20 μL mengbuffer met 0,5 μL T4 DNA-ligase, 1 μL Bsa I, 2 μL 10x restrictiebuffer, 2 μL 10x T4-DNA-ligasebuffer, 2 μL gloeiprimers, 2,5 μL vector (het volume wordt aangepast aan de verhouding) en 10 μL gedestilleerd water. Gebruik in alle gevallen een wisselplaat-tot-vectorverhouding van 2:1 om montage-efficiëntie te bereiken. Voer het PCR-montageprogramma uit als (37 °C, 2 min; 16 °C, 3 min) met 30 cycli en 55 °C, 30 min.
  8. Transformeer de resulterende vector in E. coli-cellen zoals beschreven23.
  9. Ontwerp primers die de gRNA-insertieplaats in het plasmide flankeren. Voer met behulp van deze primers PCR-amplificatie uit op individuele kolonies om te screenen op succesvolle inserties. Voer Sanger-sequencing van de PCR-producten uit om het succesvolle klonen te bevestigen en plasmide24 te isoleren.

2. Transformatie van Agrobacterium (timing 4 dagen)

  1. Ontdooi EHA105 Agrobacterium Competent Cell op ijs. Voeg 1-2 μL plasmide-DNA (met ~100-200 ng DNA) toe aan de celsuspensie en meng voorzichtig.
  2. Voer een hitteschoktransformatie uit door de buis 5 minuten op ijs te plaatsen, vloeibare stikstof gedurende 5 minuten, hitteschok bij 37 °C gedurende 5 minuten en vervolgens 5 minuten in het ijsbad.
  3. Voeg 700 μL Gistextract Pepton (YEP) media, zonder antibioticum, toe aan de tube en meng voorzichtig. Recupereer de cellen in een schudincubator bij 28 °C, 200-250 rpm, gedurende 2-3 uur.
  4. Centrifugeer de cultuur op 2.800 x g gedurende 1 min. Gooi het grootste deel van het supernatant weg, laat ongeveer 100 μL over, en resuspendeer de cellen. Verdeel de cellen over YEP-agarplaten met 1% antibiotica (Kanamycine en Rifampicine) voor plasmideselectie. Incubeer de plaat bij 28 °C gedurende 24-48 uur.
  5. Streep de YEP-plaat (met antibioticaresistentie) aan met een pipetpunt met daarin een enkele kolonie Agrobacterium die de CRISPR/Cas herbergt en breng de cellen over in 5 ml vloeibare YEP-media met de juiste antibiotica. Incubeer de vloeistof gedurende 3 dagen bij 28 °C.
  6. Bewaar de getransformeerde Agrobacterium-stammen als glycerolvoorraden bij -80 °C voor verder gebruik.

3. Rijsttransformatie door Agrobacterium (timing 3 maanden)

OPMERKING: Er zijn verschillende planttransformatiemethoden gerapporteerd voor de afgifte en expressie van de vreemde DNA-sequentie in de plantencel25. Gezien de integratie van enkele kopieën en de lage frequentie van DSB's in het genoom, is Agrobacterium-gemedieerde transformatie de voorkeursmethode voor het integreren van het expressie-DNA-fragment in rijstchromosomen.

  1. Voer Agrobacterium-gemedieerde transformatie van rijst uit volgens het protocol in25. De actief groeiende calli (geelachtig wit, relatief droog en 1-3 mm in diameter) is een belangrijk punt voor een efficiënte transformatie. Gooi de zaden met zaailingontwikkeling of bruine eelt weg voordat u de eelt infecteert met Agrobacterium.

4. Genotypering van transgene planten en zaadoogst (timing 8 maanden)

OPMERKING: Twee generaties rijst zullen worden verbouwd om homozygote mutatie en vreemde DNA-vrije lijnen te bereiken.

  1. Bemonstering van zaailingweefsel: Verplant de transgene planten in potten en laat ze 1 maand in een kas groeien. Om het mutatietype te bepalen, verzamelt u 2-3 mg verse bladeren van elke frees van een enkele zaailing en combineert u ze tot een enkel monster.
  2. Extractie van genomisch DNA: Volg een vastgesteld protocol voor DNA-extractie van plantengenoom26.
  3. Ontwerpen van de mutatieprimers (aanvullende tabel 1): Ontwerp PCR-primers om het SBEIIb-gengebied rond de sgRNA-doellocatie14 te amplificeren. Het versterkte fragment is 493 bp lang.
  4. Genotypering van de mutatie: sequentie van de PCR-fragmenten rechtstreeks of kloon ze in een T-kloonvector en sequentie met behulp van de Sanger-methode om mutaties te identificeren14.
  5. Zaden oogsten: Kies de E0-lijnen die homozygote frame-shift-mutaties vertonen en plant ze in een kas om zaden te verkrijgen.
  6. Ontwerp de primers om T-DNA te identificeren: Ontwerp drie specifieke primers voor de hygromycinecassette, UBI-cassette en Cas-cassette van het construct om vreemde DNA-vrije lijnen tussen de mutaties te identificeren (aanvullende tabel 1).
  7. Bevestiging van vreemde T-DNA-vrije lijnen: Oogst bladeren van 2 weken oude zaailingen en extraheer het DNA van het plantengenoom zoals beschreven in stap 4.2. Voer genomische PCR uit met het volgende programma: 95 °C, 3 min; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) met 35 cycli, en 72 °C, 5 min. Dit maakt de detectie van hygromycine, UBI en Cas-cassette in het plantengenoom mogelijk.
  8. Analyseer de PCR-producten door middel van gelelektroforese en selecteer lijnen die geen banden vertonen, wat aangeeft dat het transgenvrije E1-lijnen zijn. Oogst de zaden van deze geselecteerde lijnen.

5. Meting van het gehalte aan resistent zetmeel (timing 4 dagen)

  1. Oogst zaden van gemuteerde en X134-planten en laat ze op natuurlijke wijze drogen bij kamertemperatuur, waarbij een vochtgehalte van ongeveer 13%-15% behouden blijft. Bepaal het gehalte aan resistent zetmeel met behulp van de α-amylose/amyloglucosidase (AMG)-procedure van de pancreas.
  2. Activeer de schilmachine en doe 10 g rijstkorrels in de feeder om de lijmschaal efficiënt te verwijderen, wat resulteert in verwerkte rijstzaden.
  3. Breng de gepelde rijstzaden over in de rijstmolen en laat deze 60 s draaien om de aleuronlaag te verwijderen, wat gepolijste rijst oplevert.
  4. Plaats de gepolijste rijst in de tissuemolen en stel de maalfrequentie in op 60 Hz. Laat de molen 15 s draaien en herhaal de cyclus 2x om rijstpoeder te produceren.
  5. Doe het gemalen rijstpoeder in een petrischaaltje en plaats het in een voorverwarmde oven. Stel de temperatuur in op 37 °C en laat het 12 uur drogen.
  6. Weeg 100 mg ± 5 mg monsters nauwkeurig af en giet ze rechtstreeks in een microcentrifugebuisje van 2,0 ml. Tik zachtjes op de buis om ervoor te zorgen dat het monster op de bodem neerzakt.
  7. Voeg 180 μL gezuiverd water toe aan de buis en kook de monsters gedurende 20 minuten in een waterbad.
  8. Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur en breng vervolgens 4 ml AMG (3 E/ml) bevattend pancreas-α-amylase (10 mg/ml) in elk buisje.
  9. Sluit de buizen stevig af, meng ze op een vortexoscillator en incubeer de buizen bij 37 °C gedurende 16 uur met continu roeren.
  10. Voeg 4 ml ethanol toe en meng met behulp van een draaikolk. Centrifugeer de buis bij 1.500 x g gedurende 10 minuten.
  11. Decanteer het supernatant, voeg 2 ml 50% ethanol toe, gevolgd door 6 ml 50% IMS, en meng met behulp van een vortex en centrifuge.
  12. Giet het supernatans voorzichtig af en keer de buis om om overtollige vloeistof af te voeren. Plaats de buisjes in een ijsbad, voeg 2 ml 2 M KOH toe aan elk buisje en roer de monsters 20 minuten om de vlokken te resuspenderen en resistent zetmeel op te lossen.
  13. Voeg 8 ml 1,2 M natriumacetaatbuffer (pH 3,8) toe aan elke reageerbuis en meng met een magnetische roerder.
  14. Breng onmiddellijk 0,1 ml AMG (3300 E/ml) in, meng grondig en incubeer gedurende 30 minuten in een waterbad bij 50 °C met intermitterend mengen met behulp van een vortex. Centrifugeer vervolgens de buis op 1.500 x g gedurende 10 minuten.
  15. Breng 0,1 ml van het supernatans over in een glazen buis, voeg 3 ml glucoseoxidase/peroxidase (GOPOD) reagens toe en incubeer gedurende 20 minuten bij 50 °C. Bereid een blanco reagens voor door 0,1 ml 100 mM natriumacetaatbuffer en 3 ml GOPOD-reagens te mengen. Bereid standaarden voor door 0,1 ml D-glucose te mengen met 3 ml GOPOD-reagens.
  16. Pipetteer voorzichtig 200 μl van elke blanco oplossing, de te testen oplossing en de standaardoplossing op een plaat met 96 putjes.
  17. Meet de extinctie van elk monster bij 510 nm ten opzichte van de blanco-oplossing en bereken het gehalte aan resistent zetmeel met behulp van de meegeleverde formule.
    Resistent zetmeel (g/100 g) = ΔA × F/W ×9,27
    Waarbij ΔA = extinctie afgelezen tegen het blanco reagens; F = omrekening van extinctie naar microgram (de extinctie verkregen voor 100 μg D-glucose in de GOPOD-reactie wordt bepaald); W = drooggewicht van het geanalyseerde monster.

6. Postprandiale bloedglucoserespons (timing 5 dagen)

  1. Gebruik de volgende inclusiecriteria voor deelnemers: gezonde Aziatisch-Chinese volwassenen tussen 18 en 60 jaar, niet-roker, een body mass index (BMI) tussen 18,5 en 25 kg/m2 en normale bloeddruk (< 140/90 mm. Hg). Gebruik de volgende uitsluitingscriteria: stofwisselingsziekten (zoals diabetes, hypertensie, enz.), gastro-intestinale stoornissen, afwijkingen van het endocriene systeem of psychische aandoeningen. In totaal werden 10 deelnemers gescreend en geworven.
  2. Procedure voor testsessies (gedurende twee opeenvolgende dagen)
    1. Dag 0 (voorbereidingsdag): Vraag de deelnemers om de eerste 3 dagen voorafgaand aan de test een regelmatig slaappatroon en een normaal dieet aan te houden. Vraag de deelnemers op de avond voorafgaand aan de test (na 20.00 uur) om af te zien van vezelrijke en suikerrijke maaltijden. Krachtige lichaamsbeweging wordt ontmoedigd op de ochtend van dag 1.
    2. Dag 1 (testdag): Bereid witte rijst voor door de rijstzaden te malen en spoel de witte rijst vervolgens 2x af. Vul een pan met 1,5 deel water op 1 deel witte rijst. Kook de rijst tot het water volledig is opgenomen. Zet het vuur uit, dek de pan af en laat 10 minuten rusten.
    3. Wijs de 10 deelnemers willekeurig toe aan twee gelijke groepen: een testgroep die witte rijst met resistent zetmeel krijgt en een controlegroep die X134 witte rijst krijgt. Vraag de deelnemers om 10 minuten te rusten voordat het testen begint.
    4. Steriliseer de vingertoppen met 75% medische alcohol. Druk het lancetapparaat voorzichtig tegen de vingertop en laat de veer los om in de huid te prikken. Knijp voorzichtig in de vinger om een kleine bloeddruppel te produceren en raak deze druppel aan tegen het bloedabsorberende uiteinde van de teststrip in de meter. De meter zuigt automatisch het bloed op en start het testproces. Wacht tot de bloedglucosemeting wordt weergegeven.
    5. Rijstconsumptie en bloedafname: Presenteer de deelnemers 50 g van de bereide rijst met 200 ml water en vraag hen om dit binnen 5-10 minuten in een comfortabel tempo te eten. Verzamel na de maaltijd veneuze bloedmonsters op de volgende tijdstippen: 15 min, 30 min, 60 min, 90 min en 120 min vanaf het begin van de maaltijd. Voer een bloedglucoseanalyse uit zoals in stap 6.2.4.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de huidige studie werden de hele procedures van het veredelen van functionele rijst gedemonstreerd door middel van genoombewerking om stabiele resistente zetmeelrijstvariëteiten te verkrijgen. We integreerden sgRNA gericht tegen SBEIIb in CRISPR/Cas-SF01 (aanvullende figuur 1), infiltreerden rijst met behulp van Agrobacterium-transformatie en verkregen E0-generatieplanten na screening- en bewortelingsfasen. Planten met verlies van genfunctie werden g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het proces van het construeren van op CRISPR/Cas-SF01 gebaseerde knockdown-vectoren is een nauwgezette selectie van single-guide RNA's (sgRNA) cruciaal. Dit vereist de toepassing van sequenties die een hoge bewerkingsefficiëntie vertonen met minimale off-target effecten. Bovendien bevat de synthese van targetingprimers oligo's met korte adapters die overeenkomen met de lasplaatsen van de vector, wat zorgt voor een naadloze integratie. Met name, in tegenstelling tot eerdere methodologi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door financiering van de Biological Breeding-Major Projects (2023ZD04074).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2 x Taq Plus Master Mix IIVazyme Biotech Co.,LtdP213 Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid SolutioPhyto TechnologyD309
AAM mediumShandong Tuopu Biol-engineering Co., LtdM9051C
BsaI-HFNew england biolabsR3535Bsa I enzymatische vertering van de bewerkingsvector
Carbenicillin antibioticsApplygenAPC8250-5Selectie  medium, regeneratiemedium
CasaminoacidBBI-Life SciencesCorporationA603060-0500Callusinductiemedium, co-cultuurmedium, selectiemedium, regeneratiemedium
DH5α Chemically Competent CellWeidi Biotechnology Co., Ltd.DL1001E. coli competent cellen
D-SorbitolBBI-Life SciencesCorporationA610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrateDiamondA100105-0500CTAB-buffer
EHA105 Chemically Competent CellWeidi Biotechnology Co., Ltd.AC1010Agrobacterium competent cellen
FastPure Plasmid Mini KitVazyme Biotech Co.,LtdREC01-100Geïsoleerd plasmide
Hygromycin antibioticsYeasen60224ESCo-cultuurmedium, selectiemedium, regeneratiemedium en wortelmedium
Kanamycin antibioticsYeasen60206ES10Selectie agrobacterium
KOHMacklinP766798CTAB-buffer
L-GlutaminePhyto TechnologyG229Callusinductiemedium, co-cultuurmedium, selectiemedium, regeneratiemedium
L-ProlinePhyto TechnologyP698Callusinductiemedium, co-cultuurmedium, selectiemedium, regeneratiemedium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134)--Japonica-variëteiten voor de kweek van RS-rijst
Mill rice mechineMARUMASUMHR1500AOm witte rijst te produceren
Murashige SkoogPhyto TechnologyM519Wortelmedium, regeneratiemedium
Myo-inositolPhyto TechnologyI703Regeneratiemedium
NaClMacklinS805275Voor  YEP-media
NB Basal MediumPhyto TechnologyN492Callusinductiemedium, co-cultuurmedium, selectiemedium, regeneratiemedium
Peptone SolarbioLA8800Voor  YEP-media
PhytogelShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS24793
Pot Midea group Co.MB-5E86Voor het koken van rijst
RefrigeratorHaierBCD-170Opslag van het medium
Resistant Starch Assay KitMegazymeK-RSTARMeting en analyse van resistent zetmeel
Rifampicin antibioticsSigmaR3501-250MGSelectie agrobacterium
Sodium hypochlorite solutionMacklinS817439Voor zaadsterilisatie
SucroseShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdB21647Callusinductiemedium, co-cultuurmedium, selectiemedium, regeneratiemedium
T4 DNA LigaseNew england biolabsM0202Verbinding van sgRNA met het CEISPRY/Cas-SF01-vector
The glucose monitorMedical Equipment & Supply Co., LtdXuetang 582Detectie van de bloedglucose
Tris-HCLMacklinT766494CTAB-buffer
Yeast AgarSolarbioLA1370Voor  YEP-media
YEP media--Kweek van Agrobacterium

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, X., Huang, S., Han, B., Li, J. The integrated genomics of crop domestication and breeding. Cell. 185 (15), 2828-2839 (2022).
  2. Labroo, M. R., Studer, A. J., Rutkoski, J. E. Heterosis and hybrid crop breeding: A multidisciplinary review. Front Genet. 12, 643761(2021).
  3. Khalil, A. M. The genome editing revolution: review. J Genet Eng Biotechnol. 18 (1), 68(2020).
  4. Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
  5. Rath, D., Amlinger, L., Rath, A., Lundgren, M. The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications. Biochimie. 117, 119-128 (2015).
  6. Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Curr Opin Biotechnol. 32, 76-84 (2015).
  7. Koonin, E. V., Makarova, K. S. Mobile Genetic Elements and evolution of CRISPR-Cas systems: All the way there and back. Genome Biol Evol. 9 (10), 2812-2825 (2017).
  8. Zhang, Y., et al. Analysis of the functions of TaGW2 homoeologs in wheat grain weight and protein content traits. Plant J. 94 (5), 857-866 (2018).
  9. Svitashev, S., Schwartz, C., Lenderts, B., Young, J. K., Mark Cigan, A. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Comm. 7, 13274(2016).
  10. Li, Z., et al. Cas9-guide RNA directed genome editing in Soybean. Plant Physio. 169 (2), 960-970 (2015).
  11. Li, M., et al. Reassessment of the four yield-related genes Gn1a, DEP1, GS3, and IPA1 in rice using a CRISPR/Cas9 system. Front Plant Sci. 7, 377(2016).
  12. Karlson, C. K. S., Mohd-Noor, S. N., Nolte, N., Tan, B. C. CRISPR/dCas9-based systems: Mechanisms and applications in plant sciences. Plants. 10 (10), 2055(2021).
  13. Hua, K., et al. Perspectives on the application of genome-editing technologies in crop breeding. Mol Plant. 12 (8), 1047-1059 (2019).
  14. Tsakirpaloglou, N., Septiningsih, E. M., Thomson, M. J. Guidelines for performing CRISPR/Cas9 genome editing for gene validation and trait improvement in crops. Plants. 12 (20), 3564(2023).
  15. Jeon, J. S., Ryoo, N., Hahn, T. R., Walia, H., Nakamura, Y. Starch biosynthesis in cereal endosperm. Plant Physio Biochem. 48 (6), 383-392 (2010).
  16. Crofts, N., et al. Amylopectin biosynthetic enzymes from developing rice seed form enzymatically active protein complexes. J Exp Bot. 66 (15), 4469-4482 (2015).
  17. Butardo, V. M., et al. Impact of down-regulation of starch branching enzyme IIb in rice by artificial microRNA- and hairpin RNA-mediated RNA silencing. J Exp Bot. 62 (14), 4927-4941 (2011).
  18. Baysal, C., et al. Inactivation of rice starch branching enzyme IIb triggers broad and unexpected changes in metabolism by transcriptional reprogramming. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (42), 26503-26512 (2020).
  19. Keenan, M. J., et al. Role of resistant starch in improving gut health, adiposity, and insulin resistance. Adv Nutr. 6 (2), 198-205 (2015).
  20. Shen, L., Li, J., Li, Y. Resistant starch formation in rice: Genetic regulation and beyond. Plant Comm. 3 (3), 100329(2022).
  21. Duan, Z., et al. An engineered Cas12i nuclease that is an efficient genome editing tool in animals and plants. Innovation (Camb). 5 (2), 100564(2024).
  22. Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinform. 13, 134(2012).
  23. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  24. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Meth Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  25. Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nat Protoc. 1 (6), 2796-2802 (2006).
  26. Aboul-Maaty, N. A. F., Oraby, H. A. S. Extraction of high-quality genomic DNA from different plant orders applying a modified CTAB-based method. Bull Natl Res Cent. 43, 25(2019).
  27. Li, P., et al. Genes and their molecular functions determining seed structure, components, and quality of rice. Rice. 15 (1), 18(2022).
  28. Huang, X., et al. Structural basis for two metal-ion catalysis of DNA cleavage by Cas12i2. Nat Commun. 11 (1), 5241(2020).
  29. Lv, P., et al. Genome editing in rice using CRISPR/Cas12i3. Plant Biotechnol J. 22 (2), 379-385 (2024).
  30. Čermák, T., et al. A Multipurpose toolkit to enable advanced genome engineering in plants. Plant Cell. 29 (6), 1196-1217 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CRISPR Casresistent zetmeelSBE2b gensingle guide RNAplantweefselkweekgenotyping van mutatiesfenotypische analysebloedglucoseanalyse

Gerelateerde artikelen