Uitvoeren van een in vitro genoombrede CRISPR-knock-outscreening in chimere antigeenreceptor-T-cellen

Samenvatting

Het artikel beschrijft een protocol voor de toepassing van een in vitro model voor uitputting om een genoombrede CRISPR-knockoutscreening te voltooien in gezonde chimere antigeenreceptor-T-cellen van de donor.

Samenvatting

Chimere antigeenreceptor T (CART) celtherapie is een innovatieve vorm van gerichte immunotherapie die een revolutie teweeg heeft gebracht in de behandeling van kanker. De duurzame respons blijft echter beperkt. Recente studies hebben aangetoond dat het epigenetische landschap van pre-infusie CART-celproducten de respons op therapie kan beïnvloeden, en genbewerking is voorgesteld als een oplossing. Er moet echter meer werk worden verzet om de optimale strategie voor het bewerken van genen te bepalen. Genoombrede CRISPR-schermen zijn populaire hulpmiddelen geworden om zowel mechanismen van resistentie te onderzoeken als strategieën voor het bewerken van genen te optimaliseren. Toch brengt hun toepassing op primaire cellen veel uitdagingen met zich mee. Hier beschrijven we een methode om een genoombrede CRISPR-knock-outscreening in te vullen in CART-cellen van gezonde donoren. Als proof-of-concept-model hebben we deze methode ontworpen om de ontwikkeling van uitputting in CART-cellen gericht tegen het CD19-antigeen te onderzoeken. We zijn echter van mening dat deze benadering kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan mechanismen van resistentie tegen therapie in verschillende CAR-constructies en tumormodellen aan te pakken.

Inleiding

Chimere antigeenreceptor T (CART)-celtherapie heeft indrukwekkend succes geboekt bij de behandeling van B-cel maligniteiten; De duurzame respons is echter beperkt tot 30-40%1,2,3,4,5. Hoewel onderzoekers verschillende benaderingen hebben ontwikkeld en getest om mechanismen van resistentie tegen CART-celtherapie aan te pakken, waaronder de optimalisatie van CAR-ontwerp, genbewerking en combinatietherapieën, blijft de ontwikkeling van resistentie grotendeels onbekend. Onlangs is er steeds meer bewijs dat het basisgenexpressieprofiel van pre-infusie CART-celproducten een belangrijke bepalende factor is voor zowel de toxiciteit als de werkzaamheid van CART-therapie 6,7,8,9. Als zodanig is genbewerking tijdens de productie van CART-cellen een populaire benadering geworden om het succes van CART-celtherapie te verbeteren.

Ons laboratorium toonde bijvoorbeeld eerder aan dat het gebruik van geclusterde, regelmatig op afstand geplaatste korte palindromische herhalingen (CRISPR) Cas9-technologie om de gengranulocyt-macrofaagkoloniestimulerende factor (GM-CSF) uit te schakelen, de CART-celactiviteit verbetert en tekenen van CART-geassocieerde toxiciteit vermindert 10,11,12. Bovendien is door CRISPR gemanipuleerde celtherapie getest in klinische onderzoeken en heeft het werkzaamheid en veiligheid aangetoond¹³. Samen geeft dit aan dat genbewerking met CRISPR-technologie niet alleen ons begrip van CART-celbiologie kan vergroten, maar ook vertaalbare CART-celproducten kan genereren.

Genoombrede CRISPR-knock-outschermen zijn steeds populairdere hulpmiddelen geworden in kankerbiologisch onderzoek om mechanismen van resistentie tegen therapieën te begrijpen. Bij deze techniek worden tienduizenden gids-RNA's (gRNA's) afgeleverd aan celpools om de invoer van één gRNA per cel¹⁴ aan te moedigen. Vervolgens ondergaan cellen drukinducerende omstandigheden waarbij cellen die zijn getransduceerd met gRNA's die gericht zijn op essentiële genen, afsterven en cellen die zijn getransduceerd met gRNA's die gericht zijn op remmende genen, overleven en zich vermenigvuldigen. Door gebruik te maken van sequencing van de volgende generatie, kunnen we bepalen hoe de gRNA-representatie verandert in het CRISPR-scherm¹⁴.

De schaal en selectietijd die nodig zijn voor genoombrede genverstoringen kunnen echter een uitdaging zijn om te bereiken in primaire cellen, zoals CART-cellen. Als zodanig hebben groepen gerichte CRISPR-schermen gebruikt om de mechanismen van therapeutische resistentie beter te begrijpen^15,16. Gerichte schermen zijn vaak gemakkelijker in te vullen in primaire cellen, omdat ze kleinere bibliotheken hebben die minder cellen nodig hebben om een adequate bibliotheekweergave te bereiken. Hoewel deze studies ons begrip van mechanismen van resistentie tegen CART-celtherapie hebben verbeterd, introduceren gerichte schermen een vertekening als gevolg van de handmatige selectie van gendoelen. Dit artikel probeert een methode te beschrijven om een in vitro genoombrede CRISPR-knock-outscreening te voltooien in CART-cellen van gezonde donoren. Als zodanig maakt deze high-throughput-benadering een efficiënte, onbevooroordeelde identificatie mogelijk van belangrijke routes en genen die kunnen worden bewerkt om de therapeutische respons te verbeteren 17,18,19.

In het bijzonder is het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, ontworpen om het begrip van het veld van CART-celuitputting te vergroten door het genoombrede CRISPR-knock-outscherm aan te vullen met een in vitro model voor uitputting. Uitputting is een disfunctioneel lot van CART-cellen dat betrokken is bij non-respons op CART-celtherapie 20,21,22. Het is bekend dat dit cellulaire lot epigenetisch gereguleerd is en wordt gekenmerkt door een afname van de proliferatie van CART-cellen, een afname van de productie van effectorcytokines en een toename van de expressie van remmende receptoren²³. In eerdere literatuur is genbewerking in staat geweest om de ontwikkeling van uitputting te voorkomen door sleutelgenen op of neer te reguleren 24,25,26. Gezien zowel de afname van het proliferatieve vermogen als CART-cellen uitgeput raken als het bewijs dat genbewerking het optreden ervan kan voorkomen, hebben we onze in vitro genoombrede CRISPR-knock-outscreening gemodelleerd naar dit cellulaire lot. Dit protocol zou echter in de toekomst kunnen worden gewijzigd om andere mechanismen van resistentie tegen CART-celtherapie te onderzoeken.

Protocol

Belangrijk is dat het hieronder beschreven protocol de richtlijnen volgt van en goedkeuring heeft gekregen van de Institutional Review Board van de Mayo Clinic (IRB 18-005745) en de Institutional Biosafety Committee (IBC HIP00000252.43). Al het celkweekwerk, inclusief de productie van lentiviraal, moet worden uitgevoerd in een celkweekkap met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. In het bijzonder moet lentiviraal werk worden uitgevoerd onder bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) voorzorgsmaatregelen, inclusief het gebruik van 10% bleekmiddel om items te desinfecteren voordat ze worden weggegooid.

1. Versterking van de CRISPR-bibliotheek

1. Versterk de CRISPR-bibliotheek volgens de aanbevelingen van de fabrikant. In het kort, elektropoleer de CRISPR-bibliotheek in vier aliquots van elektrocompetente cellen door het volgende te voltooien:
   1. Voeg 2 μL 50 ng/μL CRISPR-bibliotheekplasmide toe aan 25 μL elektrocompetente cellen in een cuvet van 1,0 mm.
   2. Elektropoleer de samples met de volgende instellingen: 10 μF, 600 Ohm, 1.800 volt en een tijdconstante tussen 3,5 ms en 4,5 ms.
   3. Herstel in 975 μL herstelmedia en breng over naar een buis met nog eens 1 ml herstelmedia.
   4. Draai alle aliquots gedurende 1 uur bij 37 °C op 250 tpm rond.
2. Plaat de transformaties:
   1. Verzamel alle aliquots van geëlektropoleerde cellen en meng goed.
   2. Plaat alle geëlektroporeerde cellen door 400 μL van het transformatiemengsel te verspreiden op voorverwarmde 10 cm Luria-bouillon (LB) platen met 100 μg/ml carbenicilline. Plaats de plaat gedurende 14 uur in een broedmachine bij 32 °C.
3. Oogst de koloniën:
   1. Pipetteer 1 ml LB-media + 100 μg/ml carbenicilline op elke plaat. Schraap de kolonies van elke plaat en verzamel ze in een conische buis van 50 ml.
   2. Voeg nog eens 1 ml LB-media + 100 μg/ml carbenicilline toe aan elke plaat om te wassen en volledig herstel te garanderen.
   3. Voer een maxi-prep uit door de instructies van een maxi-prep kit te volgen.
   4. Bundel het resulterende plasmide-DNA.

2. Sequencing van de volgende generatie om de basislijn gRNA-representatie in de CRISPR-bibliotheek te verifiëren

OPMERKING: NGS-primers voor deze CRISPR-bibliotheek zijn ontworpen in een eerdere publicatie²⁷. Door voor elk monster een andere reverse primer te gebruiken, wordt elk monster van een barcode voorzien en kunnen monsters tijdens de sequencing worden samengevoegd.

1. Bereid de monsters voor op PCR met het volgende reactiemengsel (totaal volume = 50 μL): high-fidelity PCR-mastermix, 2x: 25 μL; gepoold sjabloon-DNA, 0,5 μg: 1 μL; NGS-bibliotheek voorwaartse primer, 10 μM: 1,25 μL; NGS-bibliotheek omgekeerde primer, 10 μM: 1,25 μL; DNasevrij water: 21,5 μL.
2. Voer PCR uit met de volgende cyclusomstandigheden: cyclus 1: denatureren bij 98 °C gedurende 3 min; cycli 2-23: denatureren bij 98 °C gedurende 10 s, gloeien bij 63 °C gedurende 10 s, verlengen bij 72 °C gedurende 25 s; cyclus 24: verleng bij 72 °C gedurende 2 min.
3. Zuiver de PCR-reactie door de PCR-reacties voor elk monster samen te voegen en het PCR-product te zuiveren met een PCR-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant.
4. Laat 3 μg van het PCR-product voor elk monster op een agarosegel van 2% (m/v) lopen.
5. Verwijder het PCR-product (~260-270 bp) uit de gel door het DNA uit de gel te extraheren met behulp van een gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant. Streef naar ten minste 500 ng DNA.
6. Bewaar de geëxtraheerde monsters bij -20 °C.
7. Voer next-generation sequencing (NGS) uit met de monsters en streef naar 100 lezingen per gRNA²⁷.
8. Analyseer de sequencingresultaten met de MAGeCK-VISPR-pijplijn en zorg ervoor dat meer dan 99,5% van de gRNA's in de bibliotheek vertegenwoordigd zijn²⁸.

3. Productie van CRISPR-bibliotheek en CAR-expressie lentivirussen

1. Bereid lentivirus voor zoals eerder beschreven ^10,29.
   1. Dag 1: Begin met T175-kolven van 80-90% confluente 293T-cellen die zijn gegroeid in D10-media die zijn samengesteld uit 10% foetaal runderserum (FBS) (v/v), 1% penicilline-streptomycine-glutamine (PSG) (v/v) en Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium. Alvorens te beginnen, verwarm transfectiereagentia en DNA tot kamertemperatuur en kwantificeer het DNA.
   2. Etiketteer voor elke 293T-kolf twee conische buisjes A en B van 50 ml. Voeg 4,5 ml gereduceerd serummedium toe aan buisje A en aan buisje B.
   3. Meng in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml het volgende DNA en laat 1 minuut staan: 18 μg pCMVR8.74 (gag, pol, tat en rev), 7 μg pMD2.G (VSV-G) en 15 μg lentivirale expressievector (CRISPR-bibliotheek A- of CAR19-28ζ-vectoren).
   4. Voeg 129 μL transfectiereagens toe aan buis A. Meng tube A goed door vingervortex.
   5. Voeg het DNA-mengsel toe aan buisje B. Meng tube B goed door middel van vingervortexing.
   6. Voeg 111 μL neutraal co-lipidenreagens toe aan buisje B. Meng tube B goed door middel van vingervortexing.
   7. Voeg de inhoud van buis A toe aan buis B en meng goed door middel van vingervortex. Incubeer buis B gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   8. Tegen het einde van de incubatietijd van 30 minuten bereidt u de 293T-cellen voor door de bestaande media op te zuigen. Voeg 16 ml R10-media toe, samengesteld uit 10% FBS (v/v), 1% PSG (v/v) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
   9. Voeg na de incubatietijd van 30 minuten de inhoud van buisje B (ongeveer 9 ml) druppelsgewijs toe aan de kolf met 293T-cellen. Leg de kolf neer en draai hem voorzichtig rond voordat u hem bij 37 °C (5 % CO₂) uitbroedt.
   10. Op Dag 2 (ongeveer 24 uren na transfectie), verzamel lentivirus als volgt:
       OPMERKING: Koel alle apparatuur en materialen voor en voer het volgende uit op ijs om het virale bovenstaande koud te houden.
       1. Breng het bovenstaande over van de getransfecteerde 293T-kolven in voorgekoelde conische buizen van 50 ml.
       2. Voeg 30 ml voorverwarmde R10-media toe aan de 293T-kolven.
       3. Pellet cellulair afval door de conische buizen van 50 ml bij 900 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C in gesloten rotoren te centrifugeren.
       4. Filtreer na het centrifugeren het bovenstaande met een filter van 0,45 μm. Centrifugeer het filtraat in een ultracentrifuge bij 112.700 g ×bij 4 °C gedurende 2 uur.
       5. Zuig na 2 uur centrifugeren het bovenstaande op tot er ongeveer 5 ml over is. Resuspendeer de virale deeltjes door voorzichtig 10x op en neer te pipetteren. Bewaar de virale suspensie een nacht bij 4 °C.
   11. Verzamel en bewaar op dag 3 lentivirus als volgt:
       1. Breng het bovenstaande over van de getransfecteerde 293T-kolven in voorgekoelde conische buizen van 50 ml.
       2. Voeg 30 ml 10% bleekmiddel toe aan de 293T kolven.
       3. Pellet het celafval in het bovenstaande door de conische buisjes van 50 ml bij 900 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C in gesloten rotoren te centrifugeren.
       4. Filtreer na het centrifugeren het bovenstaande met een filter van 0,45 μm. Centrifugeer het filtraat in een ultracentrifuge bij 112.700 g ×bij 4 °C gedurende 2 uur.
       5. Zuig na de centrifuge van 2 uur het bovenstaande op tot er nog ongeveer 2 ml over is en suspendeer opnieuw door 10x voorzichtig op en neer te pipetteren. Bewaar het virale supernatans in aliquots van 300-500 μl en bewaar het bij -80 °C.

4. Berekening van de virale titer voor lentivirus dat CAR tot expressie brengt

OPMERKING: CAR lentivirus werd getiterd zoals eerder beschreven^10,12.

1. Activeer en plaat op dag 1 T-cellen.
   1. Isoleer 1 × 10⁶ T-cellen van gezonde donor-PBMC's met behulp van een negatieve selectiekit.
   2. Tel de T-cellen.
   3. Was voldoende CD3⁺/CD28⁺ kralen om de T-cellen te stimuleren in een 3:1 kraal:cel verhouding. Om bijvoorbeeld 1 × 10⁶ T-cellen te stimuleren, wast u 3 × 10⁶ kralen. Was hiervoor de kralen door de volgende 3x te voltooien:
      1. Gebruik magnetische scheiding om de kralen uit de suspensie te verwijderen.
      2. Verwijder de supernatant.
      3. Voeg 1000 μL T-celmedia (TCM) toe, bestaande uit 10% humaan serum (v/v), 1% PSG (v/v) en hematopoëtisch celmedium.
         OPMERKING: TCM moet vóór gebruik worden gesteriliseerd door te filtreren met een steriel vacuümfilter van 0.45 μm en vervolgens met een steriel vacuümfilter van 0.22 μm.
      4. Voeg kralen toe aan de T-celsuspensie in een kraal:celverhouding van 3:1.
      5. Resuspendeer de T-cellen tot 1 × 10⁶ cellen/ml in TCM.
      6. Voeg 100 μL geactiveerde T-cellen toe aan 10 putjes van een plaat met 96 putjes. Incubeer de plaat bij 37 °C, 5% CO₂.
2. Voeg op dag 2 een verdunning van CAR-lentivirus toe door als volgt een verdunningsplaat te maken:
   1. Voeg 100 μL TCM toe aan zeven putjes van een plaat met 96 putjes.
   2. Voeg aan het eerste putje 50 μL van het interessante virus toe; Meng goed.
   3. Verdun het virus verder door 50 μL toe te voegen van putje 1 tot putje 2; Meng goed.
   4. Voeg 50 μL toe van putje 2 tot putje 3 en ga door met dit patroon tot putje 7.
   5. Verwijder na het mengen van putje 7 50 μL. Zorg ervoor dat alle putjes een totaal volume van 100 μL hebben.
   6. Voeg vanaf dag 1 50 μl uit elk putje van de verdunningsplaat toe aan de eerste zeven putjes van de T-celplaat. Meng goed.
   7. Voeg aan de laatste drie putjes van de T-celplaat 50 μL TCM toe; Meng goed. Bewaar de plaat in een broedmachine bij 37 °C, 5% CO₂.
3. Voed de cellen op dag 3 door 100 μL TCM toe te voegen aan alle putjes van de T-celplaat; Meng goed.
4. Voer op dag 4 flowcytometrie uit om het percentage cellen te detecteren dat CAR tot expressie brengt met een anti-kappaketenantilichaam, een surrogaatmarker voor CAR-expressie, door het volgende in te vullen:
   1. Draai de T-celplaat gedurende 3 minuten op 1.000 × g en decanteer.
   2. Was de plaat 3x met anti-kappa-ketenantilichaambuffer (samengesteld uit 4% runderserumalbumine in PBS (w/v)) door 200 μL anti-kappa-ketenantilichaambuffer toe te voegen, de plaat gedurende 3 minuten op 1.000 × g te draaien en te decanteren.
   3. Voeg aan elk putje een biotine anti-kappa ketenantilichaam toe. Incubeer gedurende 45 minuten op een wip bij 4 °C.
   4. Was de plaat 3x met anti-kappa chain antilichaambuffer zoals in stap 4.4.2.
   5. Kleur de cellen voor flowcytometrie met een fluorchroom-geconjugeerd streptavidine-antilichaam en een levend/dood antilichaam. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
   6. Was de monsters eenmaal in stroombuffer (samengesteld uit 2% FBS (v/v) en 1% natriumazide (v/v) in PBS) door 200 μL stroombuffer toe te voegen, de plaat gedurende 3 minuten op 1.000 × g te draaien en te decanteren.
   7. Resuspendeer in 100 μL flowbuffer en laat op de cytometer draaien.
   8. Voer negatieve gating uit met de drie niet-getransduceerde putjes.

5. Berekening van virale titer voor CRISPR-bibliotheeklentivirus

OPMERKING: Dit protocol beschrijft een minimum aantal T-cellen voor het titreren van het CRISPR-bibliotheeklentivirus, maar het kan worden opgeschaald om plaats te bieden aan meer T-cellen en dus grotere virusvolumes.

1. Activeer op dag 0 de T-cellen door 18 × 10⁶ CD3⁺/CD28⁺ kralen (3:1 kraal:celverhouding) toe te voegen aan 6 × 10⁶ T-cellen en het uiteindelijke volume op 6 ml te brengen met TCM. Verdun 0,5 ml van de T-celsuspensie in 12 putjes van een plaat met 48 putjes. Bewaren in een broedmachine bij 37 °C, 5% CO₂.
2. Vierentwintig uur later, op dag 1, voeg je het CAR-virus met een multipliciteit van infectie (MOI) van 3 toe aan elk putje. Meng goed door meerdere keren op en neer te pipetteren. Bewaren in een broedmachine bij 37 °C, 5% CO₂.
3. Achtenveertig uur later, op dag 2, voegt u een reeks CRISPR-bibliotheekvirusvolumes toe aan de geactiveerde CART-cellen door een van de volgende volumes CRISPR-virus aan elk putje toe te voegen (0 μL, 0 μL, 6,25 μL, 6,25 μL, 12,5 μL, 12,5 μL, 25 μL, 50 μL, 50 μL, 100 μL of 100 μL). Meng goed door meerdere keren op en neer te pipetteren. Bewaren in een broedmachine bij 37 °C, 5% CO₂.
4. Voeg op dag 3 1 μg puromycine per ml media toe aan de helft van de putjes, inclusief één putje dat elk van de volgende CRISPR-virusvolumes heeft ontvangen (0 μL, 6,25 μL, 12,5 μL, 25 μL, 50 μL en 100 μL). De andere putten worden niet behandeld met puromycine.
5. Tel van dag 4 - 8 dagelijks de T-cellen en pas de uiteindelijke celdichtheid aan op 1 × 10⁶ cellen/ml met 1 μg/ml puromycine in TCM voor de putjes voor de behandeling met puromycine en met TCM voor de onbehandelde putjes.
6. Tel op dag 8 het aantal levende cellen per putje en bereken de transductie-eenheden/ml viraal supernatans met behulp van de volgende vergelijking:
   
   Waarbij A: Aantal levende cellen in viraal getransduceerde put; B: Het aantal levende cellen in een goede controle zonder antibioticaselectie; V: Virusvolume dat wordt gebruikt voor infectie in elk putje; D: Verdunningsvouw.
7. Bereken met behulp van de TU/ml-put berekend uit een put met een transductie-efficiëntie van ongeveer 20% het virusvolume dat nodig is om 1 × 10⁶ cellen te transduceren bij een MOI van 0,3 met behulp van de volgende formule:
   

6. CART-celproductiefase van CRISPR-scherm (dag 0 - 8)

OPMERKING: Het volgende protocol beschrijft de voltooiing van de CRISPR-screening in één biologische replicaat. Dit protocol is echter eerder gevalideerd met drie biologische replicaten en we raden het gebruik van ten minste drie biologische replicaten aan voor anderen die dit protocol³⁰ voltooien.

1. Dag 0: Isoleer en stimuleer T-cellen uit gezond donorbloed zoals eerder beschreven¹⁰.
   1. Isoleer perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) uit geanonimiseerd gezond donorbloed.
      1. Voeg 15 ml van een dichtheidsgradiëntmedium toe aan een dichtheidsgradiëntscheidingsbuis.
      2. Voeg 1:2 verdund bloed toe aan de bovenkant van de scheidingsbuis voor dichtheidsgradiënt. Centrifugeer bij 1.200 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
         OPMERKING: Bloed moet worden verdund met isolatiebuffer (2% FBS (v/v) in fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS]).
      3. Giet de toplaag uit in een nieuwe conische buis van 50 ml en verdubbel het volume met isolatiebuffer. Centrifugeer het monster gedurende 8 minuten bij 300 × g bij 4 °C. Aspiratie van het bovenlevende.
      4. Resuspendeer de celpellet met isolatiebuffer en tel de PBMC's.
   2. Isoleer T-cellen van PBMC's met behulp van een negatieve selectiekit. Volg de instructies van de fabrikant voor de kit.
      OPMERKING: Ga uit van een herstel van 10-20% van T-cellen uit PBMC's.
   3. Stimuleer T-cellen met CD3⁺/CD28⁺ kralen.
      1. Tel de T-cellen.
      2. Voldoende CD3⁺/CD28⁺ kralen om de T-cellen te stimuleren in een 3:1 kraal:cel verhouding. Om bijvoorbeeld 110 × 10⁶ T-cellen te stimuleren, aliquoot 330 × 10⁶ kralen. Was de kralen 3x door de kralen eerst met magnetische scheiding uit de suspensie te scheiden en vervolgens 1.000 μL TCM toe te voegen.
      3. Voeg de kralen toe aan de T-cel suspensie. Resuspendeer de T-cellen tot 1 × 10⁶ cellen/ml in TCM.
      4. Verdeel de T-cellen in platen met 6 putjes voor de beste transductie-efficiëntie. Voeg 5 × 10⁶ T-cellen toe aan elk putje. Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO₂ gedurende 24 uur.
2. Dag 1: Ontdooi onder BSL-2+-omstandigheden voldoende CAR-lentivirus om T-cellen te transduceren met een infectieveelvoud van 3.0. Breek de T-celrozetten voorzichtig af voordat u de juiste hoeveelheid gepoold lentivirus toevoegt om 5 × 10⁶ T-cellen te transduceren bij een MOI van 3,0. Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO₂.
   OPMERKING: Pool lentivirus van meerdere producties in één buisje voordat T-cellen worden getransduceerd. Dit zorgt ervoor dat alle T-cellen dezelfde behandeling krijgen. Bovendien mag lentivirus slechts één keer worden ontdooid.
3. Dag 2: Ontdooi onder BSL-2+-omstandigheden voldoende CRISPR-lentivirus om T-cellen te transduceren met een MOI van 0,3. Breek de T-celrozetten voorzichtig en suspendeer de T-cellen opnieuw voordat u de juiste hoeveelheid gepoold lentivirus toevoegt om 5 × 10⁶ T-cellen te transduceren met een MOI van 0,3. Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO₂.
   OPMERKING: Pool lentivirus van meerdere producties in één buisje voordat T-cellen worden getransduceerd. Dit zorgt ervoor dat alle T-cellen dezelfde behandeling krijgen.
4. Dag 3 - 5: Resuspendeer de CART-cellen om rozetten te breken en tel de cellen. Breng de uiteindelijke celconcentratie op 1 × 10⁶ cellen/ml in TCM met 1 μg/ml puromycine. Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO₂.
5. Dag 6: Resuspendeer de CART-cellen om rozetten te breken, verwijder de CD3⁺/CD28⁺ kralen door magnetische scheiding en tel de CART-cellen. Voeg TCM toe met 1 μg/ml puromycine om de uiteindelijke celconcentratie op 1 × 10⁶ cellen/ml te brengen en incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO₂. Bepaal de CAR-expressie met flowcytometrie zoals beschreven in stap 4.4.

7. gRNA-selectiefase van CRISPR-scherm (dag 8 - 22)

1. Dag 8: Bewaar monsters voor next-generation sequencing (NGS) en start de co-cultuur.
   1. Was de CART-cellen 3x in TCM door de monsters gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 300 × g te centrifugeren, het supernatant op te zuigen en de monsters opnieuw te suspenderen in 20 ml TCM.
   2. Tel de CART-cellen.
   3. Bewaar monsters voor NGS door het volgende te doen:
      1. Aliquot voldoende CART-cellen in een conische buis van 50 ml om een gRNA-vertegenwoordiging van 500 cellen per gRNA te behouden (bijv. ongeveer 33 × 10⁶ CART-cellen bij gebruik van een CRISPR-bibliotheek met 65.383 gRNA's). Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 300 × g bij 4 °C.
      2. Resuspendeer de celpellet in 1 ml PBS en breng over naar een microcentrifugebuis van 2 ml. Was de conische buis van 50 ml met 1 ml PBS en breng de was over naar de microcentrifugebuis van 2 ml.
      3. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 500 × g bij 4 °C. Verwijder de supernatant. Bewaar de celpellets bij -20 °C.
      4. Begin de co-cultuur door CART-cellen toe te voegen aan CD19⁺ JeKo-1-cellen in een verhouding van 1:1. Voeg bijvoorbeeld 80 × 10⁶ CART-cellen toe aan 80 × 10⁶ JeKo-1-cellen. Breng het totale volume van de co-cultuur op 160 ml met TCM. Bewaar de monsters in een incubator bij 37 °C, 5% CO_{2 .}
         OPMERKING: We raden aan om te beginnen met ten minste 80 × 10⁶ CART-cellen om de bibliotheekrepresentatie te behouden en om voldoende cellen te hebben om de monsters op dag 15 en dag 22 te bewaren.
2. Dag 10: Om de CART-cellen te restimuleren, verzamelt u de co-culturen in conische buisjes van 50 ml en centrifugeert u de monsters gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 300 × g. Resuspendeer elk monster in 80 ml TCM en voeg 80 × 10⁶ JeKo-1-cellen toe aan 80 ml TCM. Bewaar de monsters in een incubator bij 37 °C, 5% CO_{2 .}
3. Dag 12 en 14: Restimuleer CART-cellen zoals in stap 7.2.
4. Dag 15: Bewaar de monsters voor NGS en restimuleer de CART-cellen.
   1. Isoleer CART-cellen uit co-cultuur door eerst de cellen te tellen en vervolgens een positieve selectiekit voor CD4⁺ T-cellen te combineren met een positieve selectiekit voor CD8⁺ T-cellen om T-cellen te isoleren uit de CART-JeKo-1-co-culturen. Tel de T-cellen.
   2. Bewaar de monsters voor NGS door 33 × 10⁶ CART-cellen in een conische buis van 50 ml te verdelen en het monster gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 300 × g te centrifugeren. Resuspendeer het monster in 1 ml PBS en breng het over in een microcentrifugebuis van 2 ml. Was de conische buis van 50 ml met 1 ml PBS en breng de was over naar de microcentrifugebuis van 2 ml. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 500 × g bij 4 °C; verwijder de supernatant; en bewaar de celpellets bij -20 °C.
   3. Zet co-culturen op om het in vitro model voor uitputting voort te zetten door 80 × 10⁶ CART-cellen toe te voegen aan 80 × 10⁶ JeKo-1-cellen. Breng vervolgens het totale volume van de co-cultuur op 160 ml met TCM. Bewaar de monsters in een incubator bij 37 °C, 5% CO_{2 .}
5. Dag 17, 19 en 21: Restimuleer CART-cellen zoals in stap 7.2.
6. Dag 22: Bewaar de monsters voor NGS.
   1. Isoleer CART-cellen uit de co-cultuur door eerst de cellen te tellen. Combineer vervolgens een positieve selectiekit voor CD4⁺ T-cellen met een positieve selectiekit voor CD8⁺ T-cellen om T-cellen te isoleren uit de CART-JeKo-1-co-culturen. Tel de T-cellen.
   2. Herhaal stap 7.4.2 om monsters voor NGS te bewaren.

8. Voorbereiding van genomisch DNA voor sequencing van de volgende generatie

OPMERKING: Om een adequate dekking te behouden, moet genomisch DNA (gDNA) worden geïsoleerd uit ten minste 33 × 10⁶ CART-cellen. Bovendien moet het geheel van het gDNA van 33 × 10⁶ CART-cellen worden voorbereid voor sequentiebepaling.

1. Isoleer gDNA uit bevroren celpellets met behulp van een gDNA-isolatiekit.
2. Zuiver het gDNA door ethanolprecipitatie.
   1. Prechill 100% EtOH tot -20 °C.
   2. Aliquot elueerde DNA gelijkmatig in verschillende microcentrifugebuisjes (200-250 μL). Aan elk aliquoot toevoegen: twee volumes 100% EtOH (500 μl voor 250 μl aliquot of 400 μl voor 200 μl); 0,1 volume 3 M natriumacetaat (25 μl voor 250 μl aliquoot of 20 μl voor 200 μl); en 1 μL 20 mg/ml glycogeen. Incubeer de monsters een nacht bij -20 °C.
   3. Draai de monsters op de tweede dag gedurende 20 minuten op 13.000 × g om het neergeslagen DNA te pelleteren. Verwijder de supernatant. Was de pellets met 1 ml 70% EtOH door gedurende 10 minuten te centrifugeren op 7.500 × g .
   4. Verwijder resterende EtOH volledig. Laat de korrels 30-45 minuten drogen.
   5. Resuspendeer de pellets in 50 μL steriel water.
3. Bereid gDNA voor op NGS.
   OPMERKING: NGS-primers voor deze CRISPR-bibliotheek die gRNA's amplificeren met Illumina-adaptersequenties zijn ontworpen in een eerdere publicatie²⁷. Door voor elk monster een andere reverse primer te gebruiken, wordt elk monster van een barcode voorzien en kunnen monsters tijdens de sequencing worden samengevoegd.
   1. Bereid de monsters voor op PCR met het volgende reactiemengsel (totaal volume = 50 μL): high-fidelity PCR-mastermix, 2x: 25 μL; gepoold sjabloon-DNA, 0,5 μg: 1 μL; NGS-bibliotheek voorwaartse primer, 10 μM: 1,25 μL; NGS-bibliotheek omgekeerde primer, 10 μM: 1,25 μL; DNasevrij water: 21,5 μL.
   2. Voer PCR uit met de volgende cyclusomstandigheden: cyclus 1: denatureren bij 98 °C gedurende 3 min; cycli 2-23: Denatureren 98 °C gedurende 10 s, gloeien bij 63 °C gedurende 10 s, verlengen bij 72 °C gedurende 25 s; cyclus 24: verleng bij 72 °C gedurende 2 min.
   3. Verzamel de PCR-reacties voor elk monster en zuiver het PCR-product met een PCR-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant.
   4. Laat 3 μg van het PCR-product voor elk monster op een agarosegel van 2% (m/v) lopen.
   5. Verwijder het PCR-product (~260-270 bp) uit de gel door het DNA uit de gel te extraheren met behulp van een gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar de geëxtraheerde monsters bij -20 °C.
   6. Voer next-generation sequencing (NGS) uit met de samples. Streef naar meer dan 500 lezingen per gRNA in de bibliotheek.

9. Analyse van de resultaten van de sequentiebepaling

1. Gebruik het MAGeCK-VISPR-platform²⁸ om NGS te analyseren. Gebruik de standaardinstellingen voor het MAGeCK-MLE-algoritme (Maximum Likelihood Estimation). De uitvoerbestanden voorbereiden voor analyse:
   1. Voer FASTQC uit om de kwaliteit van het sequentiebestand^{te evalueren 31}.
   2. Voeg sequencing-bestanden met gekoppelde uiteinden samen voor elk voorbeeld met bbmerge³².
   3. Analyseer de monsters in het MAGeCK-VISPR-platform met het MAGeCK-MLE-algoritme. Normaliseer voor de MAGeCK-MLE-analyse alle gRNA-tellingen naar de lijst van 1,000 niet-gerichte gRNA's.
   4. Beoordeel de kwaliteit van sequentiebestanden door GC-inhoud, basiskwaliteit, sequentie-lezingen en toegewezen leesbewerkingen te evalueren.
   5. Beoordeel het succes van de selectieve drukfase van de CRISPR-screening door veranderingen in de Gini-index, clustering van hoofdcomponentenanalyse (PCA) en routes die verband houden met de lijst van negatief geselecteerde genen³² te evalueren.
   6. Ondervraag de belangrijkste hits door literatuuronderzoek uit te voeren en trajectanalyses uit te voeren.

Resultaten

Om genen en routes te ondervragen die kunnen worden bewerkt om de CART-celactiviteit op een onbevooroordeelde manier te verbeteren, hebben we een in vitro genoombrede CRISPR-knockoutscreening ontworpen (Figuur 1). Deze zeef heeft twee fasen: een productiefase van CART-cellen en een selectieve drukfase. In de productiefase van CART-cellen worden eerst ten minste 110 × 10⁶ T-cellen geïsoleerd uit gezonde donor-PBMC's en geactiveerd met CD3<...

Discussie

Genbewerking is een krachtig hulpmiddel geworden bij zowel het begrijpen van de mechanismen van resistentie tegen therapieën als bij het ontwerpen van nieuwe CART-celtherapieën om de levensduur en activiteit van CART-cellen te verbeteren 16,17,26. Hoewel sommige strategieën voor het bewerken van genen verbeteringen hebben laten zien in de activiteit van CART-cellen, zowel in preklinische modelle...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
293T cells	ATCC	CRL-3216	Cellen gebruikt voor lentivirus productie
Biotin ProteinL Antibody	GenScript	M00097	anti-kappa ketting antilichaam voor CAR detectie
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A7906
Carbenicillin disodium salt	Millipore Sigma	C1389-1G	Carbenicillin antibioticum
CD4 Isolation Beads	Miltenyi Biotec	130-045-101
CD8 Isolation Beads	Miltenyi Biotec	130-045-201
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28	Gibco	40203D
Cytoflex	Beckman Coulter	NC2279958
DNase-Free Water	Invitrogen	AM9937
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)	Corning	10-017-CV
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
EasySep Human T Cell Isolation Kit	STEMCELL Technologies	17951RF	Negatieve isolatie kit
Endura Electrocompetent Cells	Biosearch Technologies	60242-1	Electrocompetent cellen met herstelmedium
Ethanol	Millipore Sigma	E7023
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35-010-CV
GeCKO v2 CRISPR Knockout Pooled Library A	AddGene	1000000048	CRISPR bibliotheek plasmide
Gene Pulser II	Bio-Rad	165-2105	Electroporator
Glycogen	Millipore Sigma	10901393001
JeKo-1	ATCC	CRL-3006	CD19+ doelcellen
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	L3000075	Transfectiereagens kit met een transfectiereagens (Lipofectamine 3000 Reagens) en een neutraal co-lipide reagens (p3000)
LIVE/DEAD Aqua	Invitrogen	L34966
Lymphoprep	STEMCELL Technologies	7851	Dichtheidsgradiënt medium
Machery-Nagel NucleoBond Xtra Maxi Kits	ThermoFisher Scientific	12748412	Maxi-prep kit
NEBNext High-Fidelity 2X PCR MasterMix	New England BioLabs	M0541S	High fidelity PCR mastermix
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070	Medium met verminderd serum
pCMVR8.74	AddGene	22036	Lentivirale verpakkingsplasmide
Pennicillin-streptomycin-glutamine (100X)	Life Technologies	10378-016
pMD2.G	AddGene	12259	VSV-G envelop expresserend plasmide
Pooled Human AB Serum	Innovative Research	ISERABHI
Puromycin	Millipore Sigma	P8833
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Gek extractie kit
Qucik-DNA Midiprep Plus Kit	Zymo Research	D4075	Kit gebruikt om gDNA te isoleren
RoboSep-S	STEMCELL Technologies	21000	Geautomatiseerde celafscheider
Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI)	Gibco	21870092
SepMate-50	STEMCELL Technologies	85450	Dichtheidsgradiënt scheidingsbuis
Sodium Acetate	Invitrogen	AM9740
Sodium Azide	Fisher Scientific	71448-16
Streptavidin Antibody (PE)	BioLegend	405203	Secundair antilichaam gebruikt voor CAR detectie
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096
Ultracentrifuge (Optima XPN-80)	BeckmanCoulter	A99839
Vacuum Filter Systems, 0.22 µm	ThermoFisher Scientific	567-0020
Vacuum Filter Systems, 0.45 µm	ThermoFisher Scientific	165-0045
X-VIVO 15 Serum-Free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q	Hematopoietisch celmedium