Methodenartikel

Opstelling van orthotope patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen voor hersentumoren met behulp van een stereotactisch apparaat

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67349

⸱

2 mei 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Cancer Institute Australia, Lowy Cancer Research Centre, UNSW Sydney, 2School of Clinical Medicine, Faculty of Medicine & Health, UNSW Sydney, 3Kid's Cancer Centre, Sydney Children's Hospital

In dit artikel

Samenvatting

De ontwikkeling van orthotope pediatrische hersentumormodellen vereist nauwgezette precisie, waarbij een stereotactisch apparaat wordt gebruikt om kankercellen nauwkeurig te implanteren. De hier gepresenteerde methodologie schetst de stappen die betrokken zijn bij het voorbereiden van hersentumorcellen, het uitvoeren van intracraniële injecties en het implementeren van een postoperatief monitoringsysteem om implantatie van hersentumoren te beoordelen.

Samenvatting

De ontwikkeling van klinisch relevante en betrouwbare modellen voor tumoren van het centrale zenuwstelsel (CZS) is van cruciaal belang geweest voor de vooruitgang op het gebied van neuro-oncologie. Een van de meest gebruikte technieken is de orthotope intracraniële injectie, een methode waarmee tumorgroei, -invasie en -verspreiding binnen een gecontroleerde omgeving kunnen worden onderzocht. Deze techniek omvat het transplanteren van tumorcellen uit een specifiek patiëntengebied naar de overeenkomstige anatomische plaats in een dier. Door dit te doen, bieden deze orthotope hersentumormodellen een uniek voordeel, omdat ze het biologische gedrag van kanker en de interacties met de hersenomgeving bij menselijke patiënten nauwkeuriger repliceren. Dit maakt ze vooral waardevol voor preklinische therapeutische tests, waarbij een sterke gelijkenis met het klinische scenario essentieel is voor het evalueren van mogelijke behandelingen. Dit protocol deelt ervaringen bij het ontwikkelen van patiënt-afgeleide xenotransplantaat (PDX)-modellen voor pediatrische hersentumoren, waaronder diffuus midline-glioom (DMG), glioblastoom (GBM), medulloblastoom en ependymoom. Deze methode schetst de procedure voor het uitvoeren van intracraniële stereotactische injecties bij muizen, waarbij de juiste targeting van de injectieplaats in de hersenen wordt gegarandeerd. Daarnaast beschrijven we het postprocedurele monitoringsysteem dat wordt gebruikt om tekenen van succesvolle tumorimplantatie te detecteren. Na de injectie van de tumor wordt een rigoureus controlesysteem geïmplementeerd om de dieren te observeren op tekenen van neurologische stoornissen, gedragsveranderingen en/of gewichtsverlies, die veel voorkomende indicatoren zijn van tumorprogressie. Dit systeem maakt tijdig ingrijpen mogelijk en levert kritische gegevens over de groeidynamiek van de tumor. Door deze modellen en protocollen te verfijnen, willen we de betrouwbaarheid en het translationele potentieel van preklinische studies verbeteren en bijdragen aan de ontwikkeling van effectievere behandelingen voor pediatrische CZS-tumoren.

Inleiding

Pediatrische tumoren van het centrale zenuwstelsel (CZS) zijn de meest voorkomende solide tumoren bij kinderen, bestaande uit ongeveer 20%-25% van de primaire pediatrische tumoren, met verschillende kenmerken van volwassen tumoren in termen van incidentie en respons op behandeling 1,2. Hoogwaardige gliomen (HGG's), zoals glioblastoom (GBM) en diffuus intrinsiek ponsglioom/diffuus middellijnglioom (DIPG/DMG), zijn bijzonder agressief, met sombere prognoses, en ondanks vooruitgang in behandelingsmodaliteiten blijven de overlevingspercentages laag 3,4,5. Medulloblastomen, goed voor bijna 20% van de pediatrische CZS-tumoren, hebben een hoge overlevingskans van 5 jaar bereikt met standaardtherapie, maar bepaalde subtypes vormen uitdagingen, vooral in terugvalscenario's 6,7. Ependymomen, die ongeveer 10% van de pediatrische CZS-tumoren uitmaken, vertonen gevarieerde prognoses, afhankelijk van moleculaire kenmerken en tumorlocatie, waarbij recidief aanzienlijke klinische uitdagingen met zich meebrengt 8,9. Inzicht in het moleculaire landschap en het ontwikkelen van orthotope hersentumor (BT)-modellen zijn veelbelovend voor het ontwikkelen van effectieve therapieën om de resultaten voor pediatrische patiënten te verbeteren.

Het ontwikkelen van klinisch relevante BT-modellen is van vitaal belang voor het bevorderen van neuro-oncologisch onderzoek en therapeutische ontdekkingen. Orthotope injecties met behulp van een stereotactisch apparaat zijn cruciaal in deze benadering, omdat ze de precieze plaatsing van tumorcellen in de hersenen mogelijk maken, waardoor de natuurlijke omgeving van hersentumoren nauwkeurig wordt nagebootst10. Deze methode verbetert de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van tumormodellen, waardoor nauwkeurigere studies van tumorbiologie en belangrijke kenmerken zoals invasie en angiogenese mogelijk worden, evenals de beoordeling van therapeutische interventies11. Het vermogen van het stereotactische apparaat om de exacte locatie en diepte van celinjecties te regelen, zorgt ervoor dat de tumorcellen consequent in de beoogde hersengebieden worden geplaatst, waardoor de validiteit van experimentele resultaten wordt verbeterd10. Subcutane modellen bieden een meer toegankelijke en kosteneffectieve optie voor de eerste screening van therapeutische middelen. In deze modellen worden tumorcellen onder de huid geïmplanteerd, waardoor de tumorgroei en behandelingsreacties eenvoudig kunnen worden gevolgd12. Hoewel ze niet in staat zijn om de complexe micro-omgeving van de hersenen na te bootsen, blijven subcutane modellen zeer waardevol voor high-throughput screening van geneesmiddelen en voorlopige werkzaamheidsevaluaties12,13.

Meerdere studies hebben de succesvolle ontwikkeling aangetoond van orthotope patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen (PDX's) uit hersentumormonsters, waaronder directe weefselimplantatie uit autopsie- of biopsiemonsters en primaire hersentumorculturen 11,14,15. Het is echter van cruciaal belang om te erkennen dat de intracraniële injectie van tumorgedissocieerd weefsel of tumorcellen niet altijd implantatie garandeert, waarbij de redenen voor falen niet volledig worden begrepen15. Interessant is dat HGG-biopsiemonsters de neiging hebben om een hoger slagingspercentage te vertonen in vergelijking met andere subtypes van hersentumoren. Bijvoorbeeld, He et al. toonde een slagingspercentage van 56% aan voor orthotope HGG-modellen, terwijl de studie van Brabetz et al. lagere implantatiepercentages rapporteerde, zoals respectievelijk 43% en 30%, voor andere pediatrische hersentumormonsters zoals ependymoom en medulloblastoom 11,14,16. Met name PDX-modellen voor hersentumoren vertonen een breed scala aan latentieperioden, variërend van 1 maand tot 11 maanden, waarbij latere implantaties een verminderd preklinisch nut vertonen. Ondanks hun vermogen om ziekten op moleculair niveau samen te vatten, zijn er enkele genomische verschillen tussen biopsieën en gevestigde modellen waargenomen 14,16.

PDX-modellen dienen als onmisbare hulpmiddelen in de zoektocht naar nieuwe therapeutische strategieën tegen pediatrische BT's. Ze worden beschouwd als de gouden standaard voor het uitvoeren van onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen, aangezien de modellen de menselijke ziekte getrouw samenvatten in termen van tumorgroei, symptomen en farmacokinetiek van geneesmiddelen vanwege de aanwezigheid van de bloed-hersenbarrière (BBB). Onderzoek heeft op het gebied van pediatrisch hersenstamglioom aangetoond dat de behouden BBB-integriteit en het gebrek aan geneesmiddelpenetratie een kenmerk is dat leidt tot verminderde therapeutische werkzaamheid voor deze tumoren 17,18,19. De werkzaamheid kan echter worden waargenomen bij geselecteerde behandelingen die een adequate penetratie van het geneesmiddel aantonen, zoals epigenetische en metabole remmers17,20.

Deze studie presenteert een methode voor het uitvoeren van intracraniële injecties van hersentumorcellen bij immuungecompromitteerde dieren, gericht op het evalueren van implantatie voor PDX-ontwikkeling en/of het beoordelen van de werkzaamheid van therapeutische geneesmiddelen. Er worden ook uitgebreide hulpmiddelen geboden voor het monitoren van tumorprogressie totdat het ethische experimentele eindpunt is bereikt.

Protocol

Het hieronder beschreven protocol volgt de ethische richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van dieren zoals uiteengezet door de Universiteit van New South Wales, en alle procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee. Dierenwelzijn kreeg prioriteit en alles werd in het werk gesteld om het lijden van dieren die tijdens de intracraniële injectieprocedure werden gebruikt, tot een minimum te beperken.

1. Kweken voor uitbreiding van neurosfeervormende hersentumorculturen

OPMERKING: Specifieke vereisten kunnen variëren op basis van de hersenculturen die worden gebruikt. De volgende stappen schetsen een algemeen kweekprotocol voor primaire hersentumorcellen als neurosferen. Hersentumorculturen kunnen worden verkregen bij commerciële leveranciers of worden vastgesteld als primaire culturen uit hersentumorbiopten of autopsies van patiënten. De procedure voor het vaststellen van primaire culturen uit biopsie- of autopsiemonsters van patiënten wordt beschreven in gepubliceerde literatuur15,21.

  1. Plaats de gecryopreserveerde voorraadinjectieflacon in een waterbad van 37 °C totdat de inhoud is ontdooid. Veeg de externe oppervlakken van de injectieflacon af met 70% ethanol om steriliteit te garanderen.
  2. Bereid Neurosphere media voor op primaire hersentumorcellen zoals beschreven in Mayoh et al.21. Gebruik in een biologische veiligheidskast (BSC) een steriele pipet van 1 ml om de ontdooide cellen over te brengen in een steriele conische buis van 15 ml met 5 ml voorverwarmde neurosfeermedia.
  3. Centrifugeer de conische buis op 300 x g gedurende 3 minuten om de cellen te pelleteren. Gooi voorzichtig zoveel mogelijk van het bovenstaande weg met een pipet van 10 ml.
  4. Resuspendeer de celpellet in 10 ml of 25 ml neurosfeermedia. Plaats de celsuspensie in een T25- of T75-kolf, afhankelijk van het verwachte celaantal van de cryopreservatie. Doorgaans worden startcellen met een dichtheid van 5x 105 cellen in een T25-kolf geplaatst.
  5. Plaats de kolf in een broedmachine die is ingesteld op 37 °C met 5% CO2. Vervang de media 1x of 2x per week door verse media. U kunt ook groeifactoren en B27 aanvullen als dat nodig is, op basis van de groeisnelheid van de cellen.
  6. Zodra neurosferen zich in een T25-kolf hebben gevormd, kunnen ze worden geëxpandeerd in T75-kolven. Breng de inhoud van de T25-kolf met een pipet van 10 ml over in een conische buis van 15 ml. Observeer neurosferen onder een lichtmicroscoop en zodra ze voldoende groot zijn (ongeveer 500 μm), kunnen ze ook met het blote oog zichtbaar zijn.
  7. Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 3-5 min. Zuig het medium boven de celpellet op en laat ongeveer 1 ml in de buis.
  8. Piket de cellen voorzichtig 12x-15x op en neer met een pipet van 1 ml om de celpellet te dissociëren. Gebruik een celzeef (40 μm) om neurosferen te dissociëren tot een mengsel van één cel.
  9. Plaats de zeef op de bovenkant van een conische buis van 50 ml en voeg gedissocieerde sferoïden met een pipet van 10 ml toe aan de zeef. De meeste afzonderlijke cellen zullen het gaas in de buis brengen en klontermaterialen blijven op het gaas zitten.
  10. Tel cellen met een cellentelkamer. Beoordeel de levensvatbaarheid van de cellen door een gelijke hoeveelheid celsuspensie (bijv. 5 μL) te mengen met Trypan Blue (5 μL). Dode cellen zullen blauw lijken onder de lichtmicroscoop, terwijl levende cellen onbevlekt blijven.
  11. Bereken de celdichtheid als volgt:
    Celconcentratie = gemiddeld aantal cellen per rooster × verdunningsfactor/volume van één rooster (ml). Het rastervolume van een standaard celtelkamer is 0,0001 ml.
  12. Om cellen te laten passeren, suspendeert u 1 x 106 cellen in 25 ml verse, verwarmde media in een T75-kolf. Zodra de cellen in een T75-kolf zijn geplaatst, incubeer je ze bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde broedmachine totdat de neurosferen groeien.
  13. Om hersentumorcellen te cryopreserveren, resuspendeert u 1 x 106 cellen in 1 ml cryopreservatieoplossing en plaatst u deze een nacht in een vriescontainer met gecontroleerde snelheid en bewaart u deze bij -80 °C. Plaats gecryopreserveerde voorraden in een tank met vloeibare stikstof van -180 °C voor langdurige opslag.
    OPMERKING: Het cryopreservatiemedium bestaat uit 90% foetaal kalfsserum en 10% dimethylsulfoxide (DMSO).

2. Voorbereiding van hersentumorcellen voor intracraniële injectie

OPMERKING: Hoewel het volgende protocol de voorbereiding van gekweekte cellen uit gevestigde of kortetermijnculturen voor intracraniële injectie schetst, kan het ook worden aangepast voor andere celtypen, waaronder vers gedissocieerd weefsel van menselijke hersentumoren22,23.

  1. Breng in een bioveiligheidskast de cellen en het kweekmedium voorzichtig met een serologische pipet over van de weefselkweekkolf in een conische buis van 50 ml.
  2. Centrifugeer de conische buis op 300 x g gedurende maximaal 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuig met een pipet van 25 ml het medium boven de pellet op, zodat er ongeveer 0,5 ml in de buis blijft.
  3. Piket de cellen voorzichtig 10x op en neer met een pipet van 1 ml om de celpellet te dissociëren. Tel cellen met behulp van trypanblauw en een hemocytometer.
  4. Zodra het gewenste celgetal in een nieuwe tube is verdeeld, wordt 2x met PBS gewassen door de cellen opnieuw te suspenderen en ze gedurende 5 minuten bij 4 °C te pelleteren op 300 x g .
    OPMERKING: het aantal cellen kan worden bepaald zoals beschreven. Als er bijvoorbeeld 10 dieren moeten worden geïnjecteerd met een celdichtheid van 200.000 cellen, dan is het minimum aantal benodigde cellen 2 x 106.
  5. Verwijder tijdens de laatste wasbeurt zoveel mogelijk PBS. Plaats de celpellet en het 50 μL extracellulaire matrix (ECM) hydrogel aliquot voorzichtig op ijs.
    OPMERKING: De ECM-hydrogel kan met behulp van 4 °C gekoelde pipetten worden voorverdeeld in porties van 50 μL op ijs en worden bewaard bij -80 °C totdat deze nodig is. ECM-hydrogel kan tijdelijk op ijs worden bewaard om langzaam te ontdooien voor later experimenteel gebruik.
  6. Meng de celpellet met de ECM-hydrogel voor injectie, met als doel deze stap zo snel mogelijk te voltooien voordat met intracraniële injecties wordt begonnen. Gebruik als standaardprocedure 2 μL van de suspensie met 200.000 cellen gesuspendeerd in ECM-hydrogel.
    OPMERKING: Als intracraniële injecties langer dan 2-3 uur duren, moet een nieuwe voorraad cellen worden aangemaakt, omdat langdurige incubatie op ijs de levensvatbaarheid van de cellen kan verminderen. Het is mogelijk om intracraniaal tot 1.000.000 cellen te injecteren en in volumes tot 10 μL; dit vereist echter dat de cellen opnieuw worden gesuspendeerd in PBS in plaats van ECM-hydrogel en met een zeer lage injectiesnelheid worden toegevoegd.

3. Opstelling van stereotactische en anesthesieapparatuur

NOTITIE: De onderstaande procedure kan enigszins variëren, afhankelijk van de fabrikant van de stereotactische apparatuur en het type anesthesie dat de voorkeur heeft.

  1. Begin de BSC door het oppervlak eerst te ontsmetten met polysorbaat 20 wasmiddel en het 10 minuten te laten staan. Veeg het oppervlak vervolgens af met 80% ethanol. Voordat u het in de BSC-kap plaatst, veegt u elk apparaat af met 80% ethanol (vermijd bevochtiging van elektrische ingangen).
  2. Plaats de grondplaat in de BSC-kap volgens afbeelding 1, met de neuskegel aan de rechterkant (voor rechtshandige gebruikers). Zorg ervoor dat de XYZ-manipulatoren al op de grondplaat zijn bevestigd en vastzitten.
  3. Sluit de digitale displayconsole aan op de ingang aan de achterkant van de grondplaat en steek de voedingskabel in de meegeleverde voeding in de BSC-kap (zie afbeelding 1). Deze console registreert de coördinaten van de bewegingen van de XYZ-manipulator.
  4. Zet de koolstoffilterbus (voor anesthesie) en de verdovingstoevoer vast op de twee kleppen op het afneembare neusstuk. Schuif het neuskegelstuk op het montagegedeelte en draai de schroef vast op het stereotactische apparaat.
  5. Bevestig de oorstangen aan hun respectievelijke houders aan weerszijden van het montagegedeelte en zet ze op hun plaats vast door de schroeven vast te draaien die aan de houders zijn bevestigd. Oorstangen kunnen worden afgedekt met gaasjes of isolatietape.
  6. Plaats het operatiebed in het apparaat en pas de hoogte aan zodat deze is uitgelijnd met de oorstangen, die het dier op zijn plaats houden. Wikkel het operatiebed in met een meetkussen om het dier warm te houden.
  7. Sluit het verwarmingskussen aan op het elektriciteitsnet en plaats het onder het dier om de warmte vast te houden tijdens de anesthesieprocedure.
  8. Plaats in de BSC-kap steriele wattenstaafjes, pipetpunten van 20 μl, oogzalf, individueel verpakte isopropanoldoekjes, chirurgische lijm en een pipet van 20 μl. Bevochtig een gaasje met 80% ethanol en leg er een steriele tang en een scalpel op.
  9. Reinig de glazen microspuit door deze 5x te spoelen in koude 80% ethanol en vervolgens in koude 0,9% zoutoplossing.
  10. Sluit voor boordoeleinden de boormotor aan op de voeding en monteer de boor op de XYZ-manipulator, waarbij u zorgt voor een goede pasvorm door deze stevig vast te schroeven.
  11. Vervang het booronderdeel door de houder van de glazen microspuit voor celinjectiedoeleinden. Verwijder de boor door de schroef op de XYZ-manipulator los te draaien en terug te plaatsen door de spuithouder. Zorg ervoor dat de schroef is vastgedraaid voordat u de glazen injectiespuit uitlijnt met het eerder geboorde gat.
  12. Na gebruik van het stereotactische apparaat demonteert u alle componenten en ontsmet u ze met 80% ethanol voordat u ze opbergt in een schone opbergdoos of stofvrije kast. Gooi alle scherpe voorwerpen veilig en op de juiste manier weg in een daarvoor bestemde naaldencontainer.

4. Intracraniële injectie

OPMERKING: Intracraniële injecties kunnen worden uitgevoerd bij zowel mannelijke als vrouwelijke muizen, hoewel vrouwelijke muizen over het algemeen de voorkeur hebben, omdat ze minder vatbaar zijn voor wondcomplicaties veroorzaakt door agressie bij mannetjes. De procedure wordt meestal uitgevoerd bij muizen van 7-10 weken oud, waardoor er voldoende tijd is voor de ontwikkeling van de tumor. Meestal worden dieren gerandomiseerd in groepen van 4-6 per kooi. Immuungecompromitteerde stammen zoals BALB/c Nude, NOD-SCID en NSG worden vaak gebruikt voor de ontwikkeling van van patiënten afgeleide xenotransplantaten (PDX), omdat hun immuundeficiënte status tumorimplantatie en -groei ondersteunt24. Hoewel dit protocol het gebruik van isofluraan voor anesthesie-inductie specificeert, kunnen alternatieve anesthetica zoals ketamine en xylazine ook worden gebruikt25. Als isofluraan niet wordt gebruikt, kunnen stappen met betrekking tot de anesthesiekamer en aanverwante apparatuur worden weggelaten uit de procedure.

  1. Weeg en bewaak het algehele welzijn van de dieren vóór de intracraniële procedure. Dien een pijnstiller toe aan de dieren, één kooi per keer (bijv. buprenorfine 0,05 mg/kg, intraperitoneaal) gedurende maximaal 1 uur voordat met de intracraniële injectie wordt begonnen.
  2. Stel anesthesieapparatuur in volgens de richtlijnen die bij het instrument zijn geleverd. Voordat u met de procedure begint, moet u ervoor zorgen dat de verdamper minstens voor de helft vol is. Zorg ervoor dat de zuurstoftoevoer open is.
  3. Als dieren een vacht hebben, kan deze de dag voor de intracraniële ingreep of gelijktijdig worden verwijderd. Verwijder de vacht van de operatieplaats bij de dorsum of muizenschedel met een elektrische tondeuse of een scheermes.
  4. Breng het dier over naar de anesthesie-inductiekamer. Zorg ervoor dat de debietmeter bij de anesthesiemachine is ingesteld op een debiet van 1 l/min en dat de zuurstofregelaar tussen 40-50 psi staat. Zorg ervoor dat een gemiddelde anesthesie wordt gehandhaafd door te controleren of de spieren ontspannen zijn en of reflexen afwezig zijn.
  5. Bewaak de reactie van het dier op prikkels en observeer de beweging van de borstwand om een gelijkmatige ademhaling te garanderen. Als intracraniële injecties langer dan 10 minuten duren, controleer dan de temperatuur met een rectale sonde en een temperatuurbewakingssysteem en volg de puls met behulp van een pulsoximeter
  6. Monteer het dier op het stereotactische apparaat en zorg ervoor dat de voortanden in de incisiestang zijn bevestigd en dat de neuskegel het dier op zijn plaats heeft vastgezet.
  7. Desinfecteer het hoofd van de muis met een met jodium doordrenkt wattenstaafje en vervolgens een isopropanoldoekje. Breng hoornvliesoogzalf aan op beide ogen om uitdroging tijdens de operatie te voorkomen.
  8. Begin met de incisie aan de basis van het cerebellum en breid deze uit over de schedel tot het middelpunt, waarbij u een kleine snee van ongeveer 1 cm lang maakt langs het bovenste aspect van de schedel.
  9. Span de huid tussen de oren aan om de schedel bloot te leggen en zet het hoofd vast door de oorstangen aan te spannen. Maak het schedeloppervlak schoon en droog het af met een wattenstaafje.
  10. Bevestig de boor op het stereotactische frame en lokaliseer de bregma (of lambdoïde structuur) met behulp van de boor.
    OPMERKING: Specifieke stereotactische coördinaten worden geselecteerd op basis van het anatomische gebied dat nodig is voor het implantatieonderzoek. Deze precieze coördinaten kunnen worden ontleend aan gepubliceerde literatuur of worden bepaald met behulp van bronnen zoals de atlas Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates26 , waardoor een nauwkeurige targeting voor succesvolle implantatie wordt gegarandeerd.
  11. Zodra de coördinaten zijn vastgesteld, gebruikt u een boor om voorzichtig een klein braamgat in het bot te maken op de aangewezen plaats van diffuus middellijnglioom (DMG): X = +0,5, Y = -5,5, Z = -3,1 van bregma; Supratentoriale hersentumor (GBM of ependymoom): X = +1,5, Y = +1, Z = -3 van bregma; Infratentoriale hersentumor (medulloblastoom, ependymoom): X = +2, Y = - 2, Z = -2 van lambdoïde structuur.
  12. Resuspendeer de cellen meerdere keren met een pipet en vermijd luchtbellen. Zuig 2 μL van het celmengsel op in een voorgewassen koude glazen microspuit. Bevestig de spuit aan het stereotactische frame en stel de naald in op de punt van de schedel.
  13. Injecteer de cellen binnen 30 s in het geboorde gebied en droog eventuele gerefluxte celsuspensie tijdens de injectie.
    OPMERKING: Aangezien de cellen in ECM-hydrogel zijn gesuspendeerd, moet de injectie snel genoeg plaatsvinden zodat de celsuspensie niet stolt in de spuit. Variërende celdichtheden kunnen worden gebruikt om verschillende implantatiesnelheden te beoordelen, waarbij hogere celdichtheden over het algemeen leiden tot snellere implantatie van de tumor.
  14. Laat de spuit 1 minuut op zijn plaats om terugstroming te voorkomen en laat de ECM-hydrogel bezinken. Verwijder de spuit en veeg de wond af met een isopropanoldoekje. Gebruik indien nodig huidlijm of wondklemmen om de incisie af te dichten.
  15. Plaats het dier in liggende positie in een schone herstelkooi met een warmtelamp of op een verwarmingskussen om warm te blijven tot herstel. Houd het dier continu in de gaten totdat het uit zichzelf begint te bewegen en daarna regelmatig totdat het normaal gedrag vertoont.
  16. Als blijkt dat een dier een eerder verzegelde wond heeft die tijdens het herstel opnieuw is geopend, verdoof het dier dan opnieuw, maak de wond schoon met een isopropanoldoekje om eventuele resterende lijm te verwijderen en zet deze vervolgens opnieuw vast met nietjes.

5. Postoperatieve monitoring voor implantatie

  1. Begin na de intracraniële injectie met het monitoren van muizen 5 dagen per week (of meer indien nodig). Zorg voor nazorg, zoals zaden of papperig voedsel, gedurende de eerste paar weken na de intracraniële injectie. Houd dieren zorgvuldig in de gaten op mogelijke wondopeningen.
    LET OP: Als de wonden van vrouwelijke dieren worden afgeknipt, blijven ze in de kattenbak, omdat ze zelden agressie vertonen. Voor mannelijke dieren zorgen we voor twee iglo's in de kooi en extra verrijking om agressie te verminderen. In het zeldzame geval dat agressie optreedt en leidt tot het opnieuw openen van wonden, worden de wonden opnieuw vastgezet met nietjes en wordt de agressor uit de groep verwijderd en apart gehuisvest.
  2. Noteer algemene welzijnsparameters zoals gewichtsverlies, activiteitsniveau, houding, tekenen van uitdroging en vachtconditie op het controleblad.
  3. Noteer op het controleblad intermitterende, milde of ernstige neurologische symptomen zoals het kantelen van het hoofd, ataxie en/of cirkelgedrag.
  4. Identificeer neurologische symptomen als volgt:
    1. Observeer en categoriseer het volgende als intermitterende symptomen: Hoofdkanteling: 1-2 keer waargenomen tijdens een inspectie van 5 minuten, algemeen welzijn bevredigend. Ataxie: 1-2 keer waargenomen tijdens een inspectie van 5 minuten; algeheel welzijn bevredigend. Cirkelen: 1-2 keer waargenomen tijdens een inspectie van 5 minuten; algeheel welzijn bevredigend. Gedrag: Muizen vertonen normaal gedrag, zijn in staat om voedsel/water te bereiken en te klimmen.
    2. Observeer en categoriseer het volgende als milde symptomen: Hoofd kantelen: Regelmatig weergegeven tijdens een inspectie van 5 minuten, algemeen welzijn bevredigend. Ataxie: Regelmatig tentoongesteld tijdens een inspectie van 5 minuten, algemeen welzijn bevredigend. Cirkelen: Regelmatig weergegeven tijdens een inspectie van 5 minuten, algemeen welzijn bevredigend. Gedrag: Muizen kunnen een gegolfde vacht of een droge huid hebben, maar kunnen nog steeds normaal gedrag vertonen, zich voeden en klimmen.
    3. Observeer en categoriseer de volgende symptomen als : Hoofd kantelen: Continu weergegeven tijdens inspectie, bijna 90° kantelen, gegolfde vacht, minder actief. Ataxie: Continu vertoond tijdens inspectie, dronken bewegingen, gegolfde vacht, minder actief. Cirkelen: Continu weergegeven tijdens de inspectie, gegolfde vacht, minder actief. Gedrag: Muizen kunnen een zeer gegolfde vacht of een droge huid hebben. Ze kunnen een gewichtsverlies van meer dan 15% vertonen. Geef dieren in dit stadium zaden of papperig voer.
  5. Bepaal het humane eindpunt voor de muizen wanneer ze een van de volgende klinische symptomen vertonen die wijzen op tumorgroei die hun welzijn beïnvloedt: gewichtsverlies van 20% of meer ten opzichte van hun oorspronkelijke gewicht, ernstig kantelen van het hoofd, ernstige ataxie, ernstig cirkelen, lethargie of moeizame ademhaling. Euthanaseer de muizen in dit stadium op humane wijze met behulp van CO2 -verstikking.

6. Oogsten van hersenen

  1. Zorg ervoor dat het dier op humane wijze wordt geëuthanaseerd door CO2 -verstikking of cervicale dislocatie.
  2. Maak een incisie in de middellijn van 2 cm langs de hoofdhuid met behulp van een schaar of een scalpel. Scheid de huid voorzichtig en pel deze terug om de schedel bloot te leggen.
  3. Maak met een fijne schaar of een scalpel een voorzichtige incisie van 2 cm langs de middellijn van de schedel. Wrik de schedel voorzichtig open met een tang en werk van de achterkant van het hoofd naar de neus.
  4. Blijf langs de zijkanten van de schedel snijden en zorg ervoor dat het hersenweefsel eronder niet wordt beschadigd. Zodra de schedel volledig is geopend, maakt u de hersenen voorzichtig los van de hersenzenuwen en bloedvaten met behulp van een tang en een schaar.
  5. Til de hersenen voorzichtig uit de schedelholte, beginnend vanaf de achterkant en naar voren. Bewaar de hersenen onder de juiste omstandigheden op basis van de vereisten van latere experimentele procedures, zoals snel invriezen of fixeren. Immunohistochemische analyse van hersenen kan variëren tussen verschillende laboratoria. Een typische workflow voor proliferatieve celmarker KI67 wordt beschreven in gepubliceerde literatuur20.

Resultaten

Orthotope injecties met behulp van een stereotactisch apparaat zijn essentieel geworden voor het ontwikkelen van hersentumormodellen. Deze techniek maakt het mogelijk om tumorcellen nauwkeurig en reproduceerbaar te plaatsen, wat cruciaal is voor het genereren van consistente en betrouwbare gegevens in neuro-oncologisch onderzoek. De succesvolle implementatie van orthotope injecties is sterk afhankelijk van de nauwkeurige opstelling van stereotactische apparatuur, die doorgaans een stereotactisch frame, een digitale micromanipulator voor nauwkeurige bewegingen, een injectiespuit en een anesthesiesysteem omvat om het dier te immobiliseren (Figuur 1A,B). Het gebruik van een glazen microspuit maakt de intracraniële injectie van kleine hoeveelheden mogelijk, meestal tussen 2-5 μL. Goed onderhoud en regelmatig wassen zijn essentieel om de opbouw van biologisch materiaal te voorkomen, dat de injectie kan blokkeren (Figuur 1C).

De procedure voor intracraniële injectie van hersentumorcellen met behulp van stereotactische apparatuur bij muizen omvat verschillende belangrijke stappen. Ten eerste wordt de muis verdoofd om tijdens de procedure stil en comfortabel te blijven. Typische signalen die aangeven dat het dier verdoofd is, zijn onder meer de afwezigheid van beweging en reflexen bij het knijpen in de teen, evenals de aanwezigheid van een regelmatig ademhalingspatroon. Vervolgens wordt de muis in een stereotactisch frame geplaatst, waarbij het hoofd in een vaste positie wordt vastgezet (Figuur 2A). Aan de hand van oriëntatiepunten op de schedel, zoals bregma en lambda, worden precieze coördinaten voor injectie bepaald. Er wordt een kleine incisie gemaakt in de hoofdhuid en er wordt een braamgat door de schedel geboord op de gekozen coördinaten (Figuur 2B). Een micro-injectienaald die aan de stereotactische arm is bevestigd, wordt door het braamgat ingebracht om de tumorcellen in het gewenste hersengebied (cortex, cerebellum of hersenstam; Figuur 2C). Zorgvuldige bewaking en aanpassing van de naaldpositie zorgen voor een nauwkeurige targeting. Na injectie wordt de naald langzaam teruggetrokken en wordt de incisie gesloten (Figuur 2D). De verzegelde wond zal naar verwachting binnen twee weken na intracraniële injectie genezen.

Na intracraniële injectie moeten de dieren zorgvuldig worden gecontroleerd op het algehele welzijn en de ontwikkeling van neurologische symptomen, die vaak wijzen op tumorprogressie (aanvullende tabel 1). Doorgaans kunnen dieren een licht gewichtsverlies ervaren tijdens de 1e week na de injectie (tot 10% van hun hoogste gewicht), wat doorgaans stabiliseert zodra de injectieplaatsen aan het einde van de 2eweek volledig zijn afgesloten. Over het algemeen vertonen dieren een gestage gewichtstoename en behouden ze een goede algehele gezondheid totdat tumorprogressie optreedt. De manifestatie van neurologische symptomen varieert afhankelijk van factoren zoals het type hersentumor, de injectieplaats en de diersoort. Corticale gliomen of ependymomen kunnen zich bijvoorbeeld presenteren met progressief gewichtsverlies en mogelijke vergroting van de voorhersenen, terwijl hersenstamgliomen en medulloblastomen symptomen kunnen vertonen zoals ataxie en het kantelen van het hoofd, vooral bij immuungecompromitteerde dieren (Figuur 3A). Bovendien kan cirkelgedrag worden waargenomen bij dieren met hersenstamtumoren, vooral bij NSG- of NOD/SCID-stammen. De progressie van neurologische symptomen valt vaak samen met geleidelijk gewichtsverlies. Goede maatregelen na de verzorging, zoals het verstrekken van waterflessen met lange sproeiers of het aanbieden van zacht voer (papperige voerkorrels) of zaden, zijn essentieel om het welzijn van de dieren te ondersteunen. Bij het bereiken van het experimentele eindpunt en de daaropvolgende humane euthanasie van de dieren, kunnen mogelijke veranderingen in de hersenen zichtbaar worden, waaronder vergroting op de injectieplaats en/of de aanwezigheid van hemorragische gebieden (Figuur 3B).

Kaplan-Meier-grafieken worden vaak gebruikt om de overlevingsresultaten van diermodellen van hersentumoren weer te geven. Ze bieden een visuele weergave van de overlevingskans in de loop van de tijd na intracraniële injectie of behandelingen tegen kanker. Deze grafieken dienen als cruciale hulpmiddelen voor het analyseren en presenteren van overlevingsgegevens in preklinische onderzoeksomgevingen15,27. We voerden intracraniële injecties uit met medulloblastoom celcultuur D425 met verschillende celdichtheden in het cerebellum. Alle dieren die intracraniaal werden geïnjecteerd, ontwikkelden tumoren. Onze resultaten gaven aan dat hogere celdichtheden, met name 50.000 en 100.000 cellen per muis, sneller transplanteerden dan 10.000 cellen per muis (Figuur 4). Bovendien injecteerden we intracraniaal van de patiënt afgeleide hooggradige glioom (HGG) cellen in de cortex en de hersenstam om de totale overleving en het patroon van tumorgroei, evenals immunohistochemische kenmerken, op deze verschillende locaties te vergelijken. Ongeacht de locatie werden alle dieren geïnjecteerd met intracraniaal ontwikkelde tumoren. De kweek van HGG-cellen werd uitgevoerd volgens het protocol dat is beschreven in de stappen 1.1 tot en met 1.10. De voorbereiding van de cellen voor intracraniële injectie werd uitgevoerd zoals beschreven in de stappen 2.1 tot en met 2.6, terwijl de intracraniële injectieprocedure werd gevolgd volgens de methode die wordt beschreven in de stappen 4.1 tot 4.1627. Wanneer ze in de cortex werden geïnjecteerd, vertoonden HGG-cellen een mediane overleving van ongeveer 25 dagen na intracraniële injectie (Figuur 5A). De dieren werden gemonitord zoals beschreven in de stappen 5.1 tot en met 5.4. Deze dieren vertoonden geen neurologische symptomen, maar vertoonden wel progressief gewichtsverlies. Dieren werden op humane wijze geëuthanaseerd bij het bereiken van het humane eindpunt zoals beschreven in stap 5.5. Hersenen werden geoogst volgens het protocol dat is beschreven in stap 6.1 tot 6.5 en verzonden voor verdere analyse27. Immunohistochemische analyse onthulde een grote tumormassa met een hoge kern met bewijs van verhoogde vascularisatie (Figuur 5B) en veel proliferatieve Ki67-cellen (Figuur 5C). Wanneer ze in de hersenstam werden geïnjecteerd, vertoonden HGG-cellen een mediane overleving van ongeveer 26 dagen na intracraniële injectie (Figuur 5D). Immunohistochemische analyse wees op een grote tumormassa in het gebied van de 4e ventrikel/bovenste pons, evenals leptomeningeale infiltratie in de laterale ventrikel (Figuur 5E). Verdere immunohistochemische analyse wees op veel proliferatieve cellen in de hersenstam en andere geïnfiltreerde gebieden (Figuur 5F). Dit experiment benadrukt dat het injecteren van dezelfde tumorcellen op verschillende anatomische locaties geen invloed heeft op de tumorgroeisnelheid, hoewel er enkele verschillen in het groeipatroon worden waargenomen.

figure-results-1
Figuur 1: Representatieve beelden van de stereotactische opstelling voor intracraniële injectie van hersentumorcellen. (A) Het anesthesieapparaat wordt meestal naast de BSC-kap geplaatst, waardoor dubbele toediening van anesthesie aan zowel de inductiekamer als het stereotactische apparaat noodzakelijk is. (B) wasstation voor glazen microspuiten en stereotactische houder; De spuit moet na elke intracraniële injectie worden gespoeld met zoutoplossing, ethanol en vervolgens water. (C) Stereotactische opstelling in de BSC-kap, ter illustratie van de anesthesiekamer, boormachine, stereotactisch apparaat, stereotactische coördinatenconsole, wattenstaafjes, scalpel, pincet, pipet en uiteinden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatieve beelden van intracraniële injectie die wordt uitgevoerd op een immuungecompromitteerde muis. (A) Verdoofd dier gepositioneerd in een verdovingskegel. (B) incisie in de huid, gevolgd door het vastzetten van de huid aan elke kant met oorstangen. (C) Glazen microspuit die bovenop het geboorde gat voor injectie wordt geplaatst. (D) De huid vormt een Mohawk-stijl als deze eenmaal is gelijmd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Mogelijke neurologische symptomen waargenomen na implantatie van hersentumorcellen. (A) Dier dat een kanteling van het hoofd vertoont na intracraniële injectie van DMG-cellen in de hersenstam. (B) Vergroting van de rechter corticale hemisfeer met de injectiezijde die tumorvorming onthult. Het dier werd geïnjecteerd met ependymoomcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Implantatie van de medulloblastoomcultuur D425 bij verschillende celdichtheden. Medulloblastoomcellen werden intracraniaal geïnjecteerd met behulp van stereotactische apparatuur met een dichtheid van 10.000 cellen in 2 μL ECM-hydrogel, 50.000 cellen en 100.000 cellen. Dieren werden gecontroleerd op progressief gewichtsverlies en werden op humane wijze geëuthanaseerd zodra ze 20% onder hun hoogste geregistreerde gewicht waren gevaren. De mediane overleving voor dieren die met 10.000 cellen werden geïnjecteerd was 29 dagen, terwijl de mediane overleving voor dieren die werden geïnjecteerd met hogere celdichtheden van 50.000 en 100.000 cellen respectievelijk 17,5 dagen en 15 dagen was. Alle dieren die in deze studie werden geïnjecteerd, ontwikkelden met succes tumoren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Representatieve overlevingscurves en histologische analyse van NSG-dieren die intracraniaal worden geïnjecteerd met HGG-cellen in de cortex en hersenstam. Ongeveer 100.000 HGG-cellen (passage 3) werden met behulp van stereotactische apparatuur geïnjecteerd in 2 μL ECM-hydrogel. Dieren werden gecontroleerd op progressief gewichtsverlies en op humane wijze geëuthanaseerd zodra ze 20% onder hun hoogste geregistreerde gewicht waren gekomen. Er werden geen neurologische symptomen waargenomen voor dit subtype van de hersentumor. (A) De mediane overleving van dieren met HGG-cellen die in de cortex zijn geïnjecteerd, is ongeveer 25 dagen na de injectie (N=2). (B) H&E-kleuring van de cortex toont een gebied met een hoge kern met verhoogde vascularisatie, aangegeven door de aanwezigheid van rode bloedcellen. (C) Het tumor-getransplanteerde gebied in de cortex vertoont een hoog niveau van proliferatieve cellen, zoals blijkt uit KI67-kleuring. (D) De mediane overleving van dieren met HGG-cellen die in de hersenstam zijn geïnjecteerd, is ongeveer 26 dagen na de injectie (N=2). Alle dieren die in deze studie werden geïnjecteerd, ontwikkelden met succes tumoren. (E) H&E-kleuring van de hersenstam toont een gebied met een hoge kern met tumorinfiltratie waargenomen in de leptomeninges in de laterale ventrikel. (F) Het tumor-getransplanteerde gebied in de hersenstam vertoont een hoog niveau van proliferatieve cellen, zoals blijkt uit KI67-kleuring. De zwarte schaalbalk in de hoofdafbeeldingen geeft 2 mm aan, terwijl de vergrote ingevoegde afbeeldingen 20 μm aangeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Controleformulier dat wordt gebruikt voor de inspectie van postintracraniële injecties van dieren en mogelijke behandeling met middelen tegen kanker. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Hoewel de intracraniële injectietechniek die in deze studie wordt beschreven, een robuuste methode biedt voor het opzetten van orthotope patiënt-afgeleide xenotransplantaat (PDX)-modellen voor pediatrische hersentumoren, moeten verschillende gebieden worden verbeterd. Een benadering om de techniek te verbeteren, is het optimaliseren van het bereidingsproces voor tumorcellen. Dit omvat het verfijnen van de materialen die worden gebruikt voor de implantatie van de tumorcellen. Hoewel ECM-hydrogel wordt beschouwd als de gouden standaard, kan het gebruik van hydrogels die zijn samengesteld uit componenten die meer lijken op die van de hersenen of tumor-ECM de overleving en implantatie van BT-cellen verbeteren. Deze aanpak komt vooral ten goede aan tumortypes met langere implantatieperioden, zoals medulloblastomen en ependymomen. Het is bijvoorbeeld aangetoond dat collageen een cruciale rol speelt bij de groei van medulloblastoom van groep 3, terwijl laminine het SHH-type medulloblastoom28 ondersteunt. Bovendien kan de stijfheid van de ECM ook de tumorgroei beïnvloeden. Hooggradige glioblastomen vertonen bijvoorbeeld een hogere stijfheid in hun kern in vergelijking met normaal hersenweefsel, wat de groei en overleving van tumoren kan ondersteunen29. Door de ECM-samenstelling en stijfheid aan te passen aan de specifieke vereisten van verschillende tumortypes, kunnen de implantatie en groei van PDX-modellen aanzienlijk worden verbeterd.

Enkele recente studies hebben waardevolle inzichten opgeleverd in de behandeling van tumormonsters bij patiënten en de ontwikkeling van PDX-modellen. Tsoli et al. benadrukten dat directe implantatie van DMG-weefsel doorgaans resulteert in hogere implantatiesnelheden dan primaire culturen15. Smith et al. vestigden 37 PDX-modellen door middel van intracraniële injectie van hersentumorbiopten of autopsiemonsters, waarbij een algemeen slagingspercentage van 43% werd gerapporteerd, waarbij HGG's het hoogste implantatiepercentage vertoonden (100%), gevolgd door medulloblastomen (45%) en ependymomen (25%). De latentie van de tumor varieerde sterk, van 1 tot 11 maanden, waarbij agressievere tumoren sneller entalden11. Daarentegen rapporteerden Brabetz et al. een lager algemeen slagingspercentage van 30%, waarbij HGG's een implantatiepercentage van 31% vertoonden en lagere percentages voor medulloblastomen (37%) en ependymomen (17%)16. Ondanks deze verschillen bevestigden de laatste twee onderzoeken van Smith et al. en Brabetz et al. dat de PDX-modellen over het algemeen de tumoren van de patiënt recapituleerden op immunohistochemisch en moleculair niveau, hoewel er kleine genomische discrepanties werden waargenomen tussen de oorspronkelijke tumormonsters en de gevestigde modellen. Deze bevindingen onderstrepen de uitdagingen bij het ontwikkelen van representatieve PDX-modellen en benadrukken de variabiliteit in implantatiesucces tussen tumortypen11,16.

Een belangrijke beperking van de orthotope benadering is het onvermogen om de tumorgrootte nauwkeurig te meten, tenzij een beeldvormingssysteem wordt gebruikt, zoals Xenogen Imaging, als de tumorcellen zijn gelabeld met luciferase of Magnetic Resonance Imaging (MRI). Het labelen van tumorcellen met luciferase zou een oplossing kunnen bieden door bioluminescente beeldvorming mogelijk te maken om implantatie te bevestigen en tumorprogressie niet-invasief te volgen. Deze methode zou het vermogen verbeteren om de respons op de behandeling dynamisch te volgen, waardoor een nauwkeurigere evaluatie van de therapeutische werkzaamheid wordt geboden17,30. Een alternatieve methode is het gebruik van MRI-technologie; De detecteerbaarheid van tumoren is echter afhankelijk van hun grootte. Grotere tumoren worden gemakkelijker geïdentificeerd, wat vaak op het experimentele eindpunt ligt, en de detectie kan ook variëren afhankelijk van het subtype van de tumor, waarbij GBM gemakkelijker kan worden gedetecteerd dan diffuse gliomen27,31. Vooral bij diffuse gliomen leidt de aanwezigheid van een intacte bloed-hersenbarrière (BBB) tot een gebrek aan contrastversterking. Bij GBM kunnen lekkend vaatstelsel en de aanwezigheid van oedeem echter het contrast tussen het tumorweefsel en het omringende gezonde hersenweefsel versterken, wat mogelijk kan helpen bij het detectieproces. Over het algemeen zijn contrasterende middelen nodig om de detectie te verbeteren 30,31,32. Alternatieve beeldvormingstechnieken zoals diffusiegewogen beeldvorming (DWI) en vloeistofverzwakt inversieherstel (FLAIR) worden soms gebruikt om de detectie van niet-versterkende tumorgebieden te verbeteren. Deze methoden hebben echter ook hun beperkingen en bieden niet altijd een nauwkeurige afbakening van tumorgrenzen33. Amide Proton Transfer-weighted (APTw) beeldvorming is een niet-invasieve MRI-techniek die diffuse gliomen detecteert door de uitwisseling van eiwit-waterprotonen te volgen, wat helpt bij het beoordelen van tumoren. Hoewel het veelbelovend is, wordt het geconfronteerd met uitdagingen zoals gevoeligheid voor artefacten en is het nog niet aangepast voor beeldvorming van kleine dieren, waardoor de bredere toepassing ervan wordt beperkt34.

Een ander cruciaal aspect waarmee rekening moet worden gehouden bij het gebruik van orthotope BT PDX-modellen voor onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen, is de BBB-integriteit in de gebruikte PDX-modellen. De permeabiliteit van de BBB heeft een aanzienlijke invloed op de afgifte van geneesmiddelen en de werkzaamheid bij de behandeling van hersentumoren. De gehandhaafde BBB-integriteit in hersenstamgliomen resulteert bijvoorbeeld vaak in een slechte penetratie van geneesmiddelen, waardoor de effectiviteit van systemische therapieën wordt beperkt17. Aan de andere kant is bij medulloblastomen van groep 3 waargenomen dat de BBB-integriteit heterogeen is op MRI-beeldvorming, en op dezelfde manier werd vastgesteld dat deze lek was in de van de patiënt afgeleide xenotransplantaat (PDX)-modellen35. Daarom is het karakteriseren van de BBB-status - of deze nu intact of lek is - in elk PDX-model essentieel voor het ontwerpen van geschikte therapeutische strategieën en het nauwkeurig interpreteren van de resultaten van onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen.

Over het algemeen biedt de geschetste intracraniële injectieprocedure een robuuste aanpak voor het opstellen van BT PDX-modellen en het uitvoeren van werkzaamheidsstudies voor therapeutische middelen. Voortdurende verfijningen, in combinatie met een uitgebreid begrip van deze modellen, zullen hun bruikbaarheid vergroten en de ontwikkeling van therapeutische interventies voor pediatrische BT-patiënten vergemakkelijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken de patiënten, clinici en onderzoekers van het Sydney Children's Hospital Network, het Sydney Children's Tumor Bank Network en het Zero Childhood Cancer Program voor het genereus verstrekken van de essentiële monsters voor het vaststellen van deze methodologie. Children's Cancer Institute Australia is verbonden aan de University of New South Wales Sydney en het Sydney Children's Hospital Network. Dit protocol komt voort uit onderzoeksinspanningen die worden ondersteund door subsidies van de National Health and Medical Research Council (Synergy Grant #2019056, Leadership Grant APP2017898 aan DZ) en Cancer Institute New South Wales Program Grant (TPG2037 aan DZ en MT), evenals steun van het Levi's Project, The Kids Cancer Project, The Cure Starts Now, DIPG Collaborative, Cure Brain Cancer Foundation, de Robert Connor Dawes Foundation en de Benny Wills Foundation.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Verdovingsmiddel (bijv. Isofluraan)Merck792632
100% EthanolMerck459844
70% ethanolNANAMaak 70% ethanol van 100% ethanol door het te verdunnen met steriel water
80% ethanolNANAMaak 80% ethanol van 100% ethanol door het te verdunnen met steriel water
Klevende microscoopglaasjesMerckZ681156
Pijnstiller (Buprenorfine 0,3 mg/mL)JuroxNA
KoolstoffilterbusVet Equip931401
Conische buisjes 15 mL (Falcon)Fisher Scientific14-959-53A
Conische buisjes 50 mL (Falcon)Fisher Scientific14-432-22
DMSOMerck472301
OorstavenKopf1921
ECM-hydrogel (Matrigel, Corning)MerckE1270
Ogendentstelp (Poly Visc)ChemistDirect 719986
Foetaal kalfsserumMerckF0926
Glazen microspruitHamilton7002
Isopropanol-doekjesMedisaSUL_LWMS-1
KI67-antilichaamAbcamab209897
MicrocentrifugebuisjesEppendorf211-2130
Microboortje  0,028”Kopf8170
Micro-injectie-eenheidKopf5004
PBSMerckP4474
Pipet 10mLCorningCLS4488
Pipet 1mL Eppendorf3123000063
Pipet 200uLEppendorf3123000055
Pipet 20uLEppendorf3123000098
Pipet 25mLCorningCLS4489
Pipetpunt 1mLCorningCLS4868
Pipetpunt 200uLCorningCLS4860
Polysorbaat 20-detergens (F10SC)Health and HygieneG3070
Pulsoximeter (MouseSTAT)Kent ScientificSPO2-MSE
Riodine (Povidon-jodium)MerckY0000466
Scalpel (wegwerp)MedisaSUL_SCALPEL
Huidelijms VetbondMedisa3M_1469SB
Stereotactisch instrument voor kleine dieren met digitale displayconsole Kopf940
Stereotactische boor Kopf1474
Temperatuurbewakingssysteem Harvard Apparatus55-7020
TrypanblauwMerck93595

Referenties

  1. Mueller, S., Chang, S. Pediatric brain tumors: current treatment strategies and future therapeutic approaches. Neurotherapeutics. 6 (3), 570-586 (2009).
  2. Packer, R. J. Brain tumors in children. Arch Neurol. 56 (4), 421-425 (1999).
  3. Paugh, B. S., et al. Integrated molecular genetic profiling of pediatric high-grade gliomas reveals key differences with the adult disease. J Clin Oncol. 28 (18), 3061-3068 (2010).
  4. MacDonald, T. J., Aguilera, D., Kramm, C. M. Treatment of high-grade glioma in children and adolescents. Neuro Oncol. 13 (10), 1049-1058 (2011).
  5. Rutka, J. T. Malignant brain tumours in children : Present and future perspectives. J Korean Neurosurg Soc. 61 (3), 402-406 (2018).
  6. Cho, Y. J., et al. Integrative genomic analysis of medulloblastoma identifies a molecular subgroup that drives poor clinical outcome. J Clin Oncol. 29 (11), 1424-1430 (2011).
  7. Thomas, A., Noel, G. Medulloblastoma: optimizing care with a multidisciplinary approach. J Multidiscip Healthc. 12, 335-347 (2019).
  8. Pajtler, K. W., et al. Molecular classification of ependymal tumors across all CNS compartments, histopathological grades, and age groups. Cancer Cell. 27 (5), 728-743 (2015).
  9. Thorp, N., Gandola, L. Management of ependymoma in children, adolescents and young adults. Clin Oncol. 31 (3), 162-170 (2019).
  10. Upton, D. H., Ziegler, D. S., Tsoli, M. Development of orthotopic patient-derived xenograft models of pediatric intracranial tumors. Methods Mol Biol. 2806, 75-90 (2024).
  11. Smith, K. S., et al. Patient-derived orthotopic xenografts of pediatric brain tumors: a St. Jude resource. Acta Neuropathol. 140 (2), 209-225 (2020).
  12. Akter, F., et al. Pre-clinical tumor models of primary brain tumors: Challenges and opportunities. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1875 (1), 188458(2021).
  13. Stribbling, S. M., Ryan, A. J. The cell-line-derived subcutaneous tumor model in preclinical cancer research. Nat Protoc. 17 (9), 2108-2128 (2022).
  14. He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nat Commun. 12 (1), 4089(2021).
  15. Tsoli, M., et al. International experience in the development of patient-derived xenograft models of diffuse intrinsic pontine glioma. J Neurooncol. 141 (2), 253-263 (2019).
  16. Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nat Med. 24 (11), 1752-1761 (2018).
  17. Khan, A., et al. Dual targeting of polyamine synthesis and uptake in diffuse intrinsic pontine gliomas. Nat Commun. 12 (1), 971(2021).
  18. Chen, Y., et al. Preclinical evaluation of protein synthesis inhibitor omacetaxine in pediatric brainstem gliomas. Neurooncol Adv. 6 (1), vdae029(2024).
  19. Ung, C., et al. Doxorubicin-loaded gold nanoarchitectures as a therapeutic strategy against diffuse intrinsic pontine glioma. Cancers (Basel). 13 (6), 1278(2021).
  20. Ehteda, A., et al. Dual targeting of the epigenome via FACT complex and histone deacetylase is a potent treatment strategy for DIPG. Cell Rep. 35 (2), 108994(2021).
  21. Mayoh, C., et al. High-throughput drug screening of primary tumor cells identifies therapeutic strategies for treating children with high-risk cancer. Cancer Res. 83 (16), 2716-2732 (2023).
  22. Lin, G. L., Monje, M. A Protocol for rapid post-mortem cell culture of diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). J Vis Exp. (121), e55360(2017).
  23. Whitehouse, J. P., et al. In vivo loss of tumorigenicity in a patient-derived orthotopic xenograft mouse model of ependymoma. Front Oncol. 13, 1123492(2023).
  24. Hermans, E., Hulleman, E. Patient-derived orthotopic xenograft models of pediatric brain tumors: In a mature phase or still in its infancy. Front Oncol. 9, 1418(2019).
  25. Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4 (11), 1670-1680 (2009).
  26. Paxinos, G., Franklin, K. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 5th edn, Academic Press. (2019).
  27. Tsoli, M., et al. Integration of genomics, high throughput drug screening, and personalized xenograft models as a novel precision medicine paradigm for high risk pediatric cancer. Cancer Biol Ther. 19 (12), 1078-1087 (2018).
  28. Yang, H., et al. Roles and interactions of tumor microenvironment components in medulloblastoma with implications for novel therapeutics. Genes Chromosomes Cancer. 63 (4), e23233(2024).
  29. Kondapaneni, R. V., et al. Glioblastoma mechanobiology at multiple length scales. Biomater Adv. 160, 213860(2024).
  30. Mahmoudian, E., Jahani-Asl, A. Establishing brain tumor stem cell culture from patient brain tumors and imaging analysis of patient-derived xenografts. Methods Mol Biol. 2736, 177-192 (2024).
  31. Oudin, A., Moreno-Sanchez, P. M., Baus, V., Niclou, S. P., Golebiewska, A. Magnetic resonance imaging-guided intracranial resection of glioblastoma tumors in patient-derived orthotopic xenografts leads to clinically relevant tumor recurrence. BMC Cancer. 24 (1), 3(2024).
  32. Bauer, S., Wiest, R., Nolte, L. P., Reyes, M. A survey of MRI-based medical image analysis for brain tumor studies. Phys Med Biol. 58 (13), R97-R129 (2013).
  33. Lasocki, A., Gaillard, F. Non-contrast-enhancing tumor: A new frontier in glioblastoma research. AJNR Am J Neuroradiol. 40 (5), 758-765 (2019).
  34. Nichelli, L., Zaiss, M., Casagranda, S. APT weighted imaging in diffuse gliomas. BJR Open. 5 (1), 20230025(2023).
  35. Genovesi, L. A., et al. Patient-derived orthotopic xenograft models of medulloblastoma lack a functional blood-brain barrier. Neuro Oncol. 23 (5), 732-742 (2021).

Herprints en machtigingen

Tags

Orthotope hersentumorintracraniële injectiepediatrische hersentumordiffuus midline glioombloed-hersenbarrièretumor-engraftmentneurosfeer-kweekimmunohistochemische analyse
Opstelling van orthotope patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen voor hersentumoren met behulp van een stereotactisch apparaat
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.