Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Validatie van de conjugatie van therapeutische middelen aan medische hulpmiddelen met een polyvinylalcoholcoating

913 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67358

⸱

29 november 2024

 ,  , 
1Department of Surgery, LSU Health Shreveport, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, LSU Health Shreveport

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het derivatiseren van medische hulpmiddelen met eiwittherapieën door eiwittherapieën te conjugeren aan een polyvinylalcoholmembraan dat op medische apparaten is gegoten. Conjugatie van op eiwitten gebaseerde therapieën maakt gelokaliseerde en geconcentreerde toediening mogelijk en is een kosteneffectieve benadering die veel lagere hoeveelheden geneesmiddelen vereist voor dosering, terwijl off-target effecten worden geminimaliseerd.

Samenvatting

Op eiwitten gebaseerde therapieën worden vaak beperkt door hun toedieningsweg en het onvermogen om ze te beperken tot hun plaats van werking. Een innovatieve benadering die we hebben ontwikkeld, is het covalent binden van eiwittherapieën aan medische hulpmiddelen, waardoor een meer gelokaliseerde en sterk geconcentreerde toediening van deze middelen op de beoogde plaats van werking mogelijk is. Deze studie heeft tot doel te evalueren of glucagon-achtig peptide-2 (GLP-2) covalent kan worden gebonden aan de vaginale expansiehuls (VES) en intestinale expansiehuls (IES) in klinisch relevante en meetbare hoeveelheden.

Expansiehulzen werden gecoat met polyvinylalcohol (PVA) en verknoopt met glutaaraldehyde/zwavelzuurdamp om een chemisch actief oppervlak te creëren dat in staat is aminehoudende therapieën zoals GLP-2 te binden. Een standaardcurve werd gemaakt door 250 μg, 100 μg, 50 μg, 25 μg en 0 μg GLP-2 te binden aan PVA-gecoate putjes van een plaat met 24 putjes. Er is een ELISA-standaard gemaakt met behulp van een anti-GLP-2-antilichaam tegen konijnen, gevolgd door een geit anti-konijn IgG alkalisch fosfatase secundair antilichaam plus een alkalisch fosfataseblauw microtitersubstraat. Colorimetrie (geel tot blauw bij 620 nm) was evenredig met de concentratie van GLP-2-gebonden antilichamen, waardoor de gebonden concentratie van GLP-2 op de PVA-gecoate hulzen kon worden berekend. De toevoeging van 50 μg GLP-2 aan IES/VES-apparaten bond gemiddeld 22,69 ± 9,32 μg/cm2 GLP-2 met een extern IES/VES-oppervlak (9,425cm2), wat aangeeft dat 44% van het toegevoegde GLP-2 geïmmobiliseerd was op de PVA-gecoate IES/VES-sleeves.

De huidige humane GLP-2-dosering is 50 μg/kg. Omdat elke sleeve 22 μg draagt, is dit ongeveer 44% van een systemische dosis in een enkel apparaat. Deze methodologie maakt het mogelijk om dramatisch lagere doses therapeutische middelen toe te voegen om hetzelfde effect te krijgen als systemische toediening van het GLP-2-medicijn, terwijl ook systemische effecten worden vermeden.

Inleiding

Van op eiwitten gebaseerde therapieën zoals enzymen, antilichamen, cytokines, hormonen en groeifactoren is aangetoond dat ze zeer effectief zijn bij de behandeling van verschillende ziekten1. Als we ons begrip van de toediening van deze therapeutische middelen verbeteren, kunnen we de biotechnologie voor het toepassen van deze stoffen als medicijnen/medische behandelingen aanzienlijk bevorderen. De werkzaamheid van eiwittherapieën wordt beperkt door hun biodistributie, kosten en off-target effecten. Er zijn verschillende benaderingen geprobeerd om de farmacokinetiek en farmacodynamiek van eiwittherapieën te verbeteren, waaronder PEGylering, glycosylering, lipidatie en fusie van andere eiwitten2. 'Targetability' is een ander punt van zorg, omdat de meeste van de huidige eiwittherapieën meerdere werkingsplaatsen hebben, wat resulteert in off-target effecten. In het bijzonder zou het richten van deze geneesmiddelen op de gewenste plaatsen de vereiste therapeutische dosis kunnen verlagen en bijwerkingen kunnen verminderen2. Als men de toediening van medicijnen zou kunnen beperken tot de beoogde plaats van werking, zou het mogelijk kunnen zijn om de behandeling radicaal te verbeteren en tegelijkertijd de ongewenste 'off-target' bijwerkingen van deze medicijnen te beperken.

Er worden momenteel meerdere medische hulpmiddelen gebruikt die therapieën bevatten, zoals medicijnafgevende stents met een antiproliferatieve geneesmiddelcoating die clopidogrel, vincristine en vinblastine bevat om restenose en de noodzaak van herhaalde revascularisatie na hartkatheterisatie3 te helpen voorkomen. Bovendien zijn biologisch afbreekbare geneesmiddelafgevende ureterstents met paclitaxel, doxorubicine, gemcitabine en andere antiproliferatieve middelen gemaakt om urotheelcarcinoom van de bovenste luchtwegen 4 te helpenbehandelen. Naarmate deze stents verslechteren, worden de antitumorgeneesmiddelen lokaal op een gecontroleerde manier vrijgegeven, waardoor de toediening van het geneesmiddel wordt verlengd zonder dat er extra dosering nodig is4. Deze methodologie zorgt voor het langetermijneffect van de antitumorgeneesmiddelen op de beoogde plaats van werking, terwijl ook de noodzaak van systemische blootstelling wordt voorkomen, de werking van het geneesmiddel op niet-tumorcellen wordt beperkt en de toxiciteit van het geneesmiddel wordt verminderd. Ook kan de biologisch afbreekbare aard van de stent de noodzaak van een procedure voor het verwijderen van de stent voorkomen4.

Kortedarmsyndroom (SBS) is een andere aandoening waarbij het gebruik van op eiwitten gebaseerde therapieën bij patiënten een significante verbetering heeft laten zien5. SBS kan via verschillende mechanismen optreden, maar resulteert in een ontoereikende darmlengte, wat leidt tot malabsorptie en ondervoeding. Therapieën, zoals glucagon-achtig peptide 2 (GLP-2) analogen, kunnen worden gebruikt voordat wordt overgegaan tot chirurgische behandeling van deze aandoening5. Humaan GLP-2, een systemisch voedingspeptidehormoon, wordt in de distale dunne darm en de dikke darm geproduceerd door L-type endocriene cellen. GLP-2 induceert proliferatie van intestinale cryptecellen, bevordert het herstel van beschadigd slijmvlies, remt apoptose van darmepitheelcellen en verbetert de intestinale bloedtoevoer5. GLP-2-analogen, zoals teduglutide, zijn goedgekeurd voor patiënten van 1 jaar of ouder voor de behandeling van SBS om de natuurlijke darmaanpassing te helpen vergroten6. Natuurlijk kan darmaanpassing jaren duren en resulteert in vertraagde maaglediging om de absorptietijd te verlengen en een grotere diameter door darmverwijding om het absorptieoppervlak te vergroten7. GLP-2-analogen hebben dezelfde farmacologische activiteit als de natuurlijke GLP-2, terwijl ze een stabielere structuur hebben, waardoor een langere halfwaardetijd en een sterkere affiniteit met doelen5 mogelijk is. Momenteel bedragen de jaarlijkse kosten van teduglutide $ 295,000 en is de dosering voor patiënten 0.05 mg/kg per dag5. Bijwerkingen van teduglutide zijn misselijkheid, braken, diarree, buikpijn, gewichtsverlies, gastro-intestinale poliepen en verhoogde groei van bestaande tumoren5.

Eerder heeft ons lab aangetoond dat de inzet van een intestinale expansiehuls (IES) (Figuur 1) in staat was om een onmiddellijke verlenging van 36,2% van de dunne darm ex vivo en een verlenging van 30,2% van de dunne darm te produceren na een inzet van een maand in vivo 6,8. Dit apparaat zou een therapie kunnen worden voor SBS-patiënten die de parenterale voedingsafhankelijkheid zou kunnen verkorten. De mogelijkheid om therapieën te bioconjugeren naar het IES-apparaat zou de capaciteit van afleidingsenterogenese verder kunnen verbeteren door de darmslijmvliesgroeiagonist GLP-2 aan het apparaat toe te voegen. Polyvinylalcohol (PVA)-membranen zijn hydrofiele polymeren die kunnen worden bereid door PVA in water op te lossen, het op een structurele drager te gieten en vervolgens te verknopen met glutaaraldehyde met zwavelzuur als katalysator9. Van deze hydrogel-nanodeeltjes is aangetoond dat ze potentieel hebben als medicijnafgiftesystemen door middel van medicijndiffusie, zwelling van de hydrogelmatrix en chemische reactiviteit van het medicijn/matrix10. PVA is door de FDA goedgekeurd voor klinisch gebruik bij mensen vanwege de uitstekende biocompatibiliteit en veiligheid11. PVA-polymerisatie resulteert in terminale groepen die bioconjugatie mogelijk maken12.

IES/VES-apparaten zijn 3 cm lang met een uitwendig oppervlak van 9.425cm2 dat in staat is om te gieten met PVA-membranen. Deze PVA-membranen kunnen worden gebioconjugeerd met GLP-2 om lokale en geconcentreerde toediening van therapeutische middelen mogelijk te maken. Het verlagen van de vereiste dosis van het geneesmiddel en het omzeilen van de noodzaak van systemische toediening, waardoor negatieve off-site effecten van de behandeling worden vermeden. Dit kan helpen de kosten van deze dure medicijnen te verlagen door minder dosering te vereisen, en de vertraagde afgifte van het medicijn kan de doseringsfrequentie verlagen, waardoor de kosten verder worden verlaagd. Het coaten van het IES-apparaat met GLP-2 kan de vereiste doseringen verlagen, patiënten geld besparen, systemische toediening vermijden, negatieve effecten van de behandeling voorkomen en een continue toediening van het geneesmiddel op de doelplaats behouden. Dit rapport evalueert de mate waarin een therapeutisch eiwit, zoals GLP-2, covalent kan worden gebonden aan medische apparaten zoals IES/VES-apparaten in fysiologisch betekenisvolle hoeveelheden om het lokale voordeel van deze geneesmiddelen te bieden en tegelijkertijd off-target effecten te vermijden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Secties 1 en 2 worden tegelijkertijd ingevuld. Het coaten met PVA en het verknopen van het PVA-membraan moet tegelijkertijd worden gedaan voor zowel de expansiehulzen als de 24-putsplaat. Hierdoor kunnen ze tegelijkertijd klaar zijn om de standaardcurve te creëren met de plaat met 24 putjes om absorptie te gebruiken om de GLP-2-concentratie van elke huls te berekenen.

1. Het creëren van GLP-2 gecoate IES- en VES-apparaten

  1. Maak de 5% PVA-oplossing door 5 g PVA toe te voegen aan 100 ml gedeïoniseerd water. Om te helpen oplossen, overweeg je om op een kookplaat te roeren. Maak vervolgens de 1 mg/ml GLP-2-oplossing door 1 mg GLP-2 toe te voegen aan 1 ml gedeïoniseerd water.
  2. Span darmexpansiehulzen en vaginale expansiehulzen voor over een glazen pipet, waarbij de uiteinden worden gestabiliseerd met plastic pipetten die zijn gesneden om strak op de glazen pipet rond de vooraf gecontracteerde hulzen te passen.
  3. Verf de vooraf gecontracteerde hoezen met de premade 5% PVA met behulp van een klein penseel. Na het schilderen van een laag PVA, laat u de mouwen 10 minuten drogen bij kamertemperatuur (RT) en schildert u vervolgens nog een laag voor in totaal 5 PVA-lagen op elke mouw.
  4. Nadat de 5elaag is opgedroogd, plaatst u de voorgecontracteerde mouwen in een exsiccator onder een chemische veiligheidskap zodat ze bij RT kunnen verknopen. Start de verknoping door 3 ml 25% glutaaraldehyde en 3 ml 94%-98% zwavelzuur toe te voegen om open bekers in de exsiccator te scheiden zodat de dampen kunnen reageren en de PVA-membranen op de hulzen kunnen verknopen.
  5. Nadat u de hulzen 48 uur in de kamer hebt vernet, haalt u ze uit de kamer en laat u de glutaaraldehyde gedurende 15 minuten van de hulzen verdampen.
  6. Voeg vervolgens 50 μl van de 1 mg/ml GLP-2-oplossing toe door voorzichtig op elke huls te pipetteren. Laat dit 30 minuten drogen bij RT voordat u de vooraf gecontracteerde hulzen van de glazen pipet verwijdert en elke huls aan de respectievelijke put op de plaat met 24 putjes toevoegt.

2. Het maken van de GLP-2 gecoate 24-well plaat

  1. Om de standaardcurve van GLP-2 aan de PVA te binden, pipeteert u 50 μL 5% PVA op de bodem van 18 van de voor gebruik bestemde putjes van een plaat met 24 putjes. Laat 6 putjes leeg om de IES- en VES-apparaten vast te houden (3 voor elk type apparaat).
  2. Laat de laag PVA een nacht drogen op de 24-wells plaat in een oven bij 120 °C.
  3. Plaats de plaat met 24 putjes in een exsiccator onder een chemische veiligheidskap zodat de PVA 48 uur lang kan verknopen bij RT. Start de verknoping door 3 ml 25% glutaaraldehyde en 3 ml 94%-98% zwavelzuur toe te voegen om open bekers te scheiden, zodat de dampen in de kamer kunnen reageren om de PVA op de plaat met 24 putjes te verknopen.
  4. Na 48 uur verknopen, verwijdert u de plaat met 24 putjes uit de kamer en laat u het glutaaraldehyde gedurende 15 minuten van de plaat verdampen.
  5. Maak vervolgens een concentratiegradiënt door 250 μL, 100 μL, 50 μL, 25 μL en 0 μL 1 mg/ml GLP-2-oplossing toe te voegen aan hun geëtikte putjes, waardoor de plaat met 24 putjes ontstaat met 3 putjes voor elke concentratie GLP-2 (250 μg, 100 μg, 50 μg, 25 μg en 0 μg) en 3 putjes voor elk type huls (IES en VES).

3. Creatie van standaardcurve en onderscheidende huls GLP-2-concentratie

  1. Nadat de respectieve GLP-2-verdunningen aan de putjes zijn toegevoegd en de met medicijnen beklede hulzen aan de putjes zijn toegevoegd, wordt de plaat een nacht in de koelkast bewaard bij 4 °C om geneesmiddelbinding mogelijk te maken.
  2. Voeg de volgende dag 2 ml 1 mg/ml melkpoeder in gedeïoniseerde waterblokkerende oplossing toe aan elk putje gedurende 1 uur. Was na het blokkeren elk putje 3 keer met PBS gedurende 5 minuten per wasbeurt.
  3. Maak de anti-GLP-2-antilichaamoplossing voor konijnen door 40 μL anti-GLP-2-antilichaam voor konijnen toe te voegen aan 50 ml gedeïoniseerd water. Voeg vervolgens 2 ml GLP-2-antilichaamoplossing voor konijnen toe aan elk putje op de plaat met 24 putjes en zet een nacht in de koelkast bij 4 °C.
  4. Was na incubatie van primaire antilichamen elk putje nog 3x met PBS gedurende 5 minuten per wasbeurt. Maak de alkalische fosfatase tegen konijnen geproduceerd in een oplossing van secundair antilichaam voor geiten door 20 ml secundair antilichaam toe te voegen aan 40 ml gedeïoniseerd water. Voeg vervolgens 2 ml secundaire antilichaamoplossing toe aan elk putje en laat het 2 uur staan bij RT.
  5. Zuig de secundaire antilichaamoplossing op en was ze goed met nog een 3x PBS-wasbeurt gedurende elk 5 minuten. Voeg vervolgens het alkalische fosfataseblauwe microtitersubstraat toe aan elk putje.
  6. Laat de alkalische fosfatase die aan het secundaire antilichaam is geconjugeerd, gedurende 20 minuten bij RT met het substraat reageren. Naarmate de reactie vordert, moet u letten op de kleur van de oplossing die verandert van geel naar blauw.
  7. Stop de reactie door 200 μl oplossing uit elk putje te pipetteren en doe het in een plaat met 96 putjes waarop hetzelfde label is aangebracht als de plaat met 24 putjes. Zodra het reagens van de plaat met 24 putjes is verwijderd met het PVA-membraan geconjugeerd aan het alkalische fosfatase-enzym, stopt de reactie en verandert de kleur niet.
  8. Lees de plaat met 96 putjes af met behulp van een absorptiemicroplaatlezer op een golflengte van 620 nm om de standaardcurve te genereren en de concentratie van GLP-2 op de PVA-gecoate hulzen te berekenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol beschrijft het coaten en verknopen van IES- en VES-apparaten met PVA om de conjugatie van GLP-2 mogelijk te maken. Figuur 2 toont de standaardcurve die wordt gegenereerd om de concentratie van GLP-2 op elk apparaat te bepalen. Figuur 3 toont de GLP-2-concentratie van elk IES- en VES-apparaat en de concentratie van de putten die voor de standaardcurve zijn gebruikt. De sleeves hadden een gemiddelde GLP-2-concentratie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We presenteren hier een methodologie om op eiwitten gebaseerde therapieën, zoals GLP-2, te binden aan PVA-gecoate en verknoopte medische hulpmiddelen. De concentratie van het gebonden GLP-2 werd bepaald door het creëren van een standaard GLP-2-concentratiecurve op PVA-gecoate platen met 24 putjes door de toevoeging van anti-GLP-2-antilichaam voor konijnen, alkalisch alkalisch fosfatase tegen geiten tegen konijnen en alkalisch fosfataseblauw microtitersubstraat. Het secundaire antilichaam...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Jonathan Steven Alexander en Christen J. Boyer hebben het patent US10537659B2, 3D-geprinte medische hulpmiddelen en activeringsmethoden voor polyvinylalcohol (2017). De overige auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door R. Keith White, MD, via het Department of Surgery John C. McDonald Chair Fund, W. Reid Grimes, MD voor financiering via het Department of Surgery Whitney Boggs Endowed Professorship Fund en LSU LIFT2-beurs, HSCS-2022-LIFT-002.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Peroxidase antibody produced in goatSigma-AldrichA0545-1ML
BluePhos Microwell Substrate KitSera Care5120-0059
GenClone 25-107, 24-Well Cell Culture Plates Flat Bottom Wells, TC Treated, 100 Plates/UnitGenesee Scientific 25-107
GLP-2 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (3K3P5)Invitrogen MA5-42869
Glucagon-like Peptide-2 (GLP-2) (1-33), ratEchelon Biosciences195262-56-7
Glutaraldehyde, 25% Aqueous SolutionSigma-Aldrich111-30-8
Nalgene Polypropylene Desiccator with StopcockThermoFisher Scientific5310-0250
Poly(vinyl alcohol)Sigma-Aldrich9002-89-5
Sulfuric Acid (TraceMetal Grade), Fisher ChemicalFischer ScientificA510-P212

Referenties

  1. Conner, K. P., Devanaboyina, S. C., Thomas, V. A., Rock, D. A. The biodistribution of therapeutic proteins: Mechanism, implications for pharmacokinetics, and methods of evaluation. Pharmacol Ther. 212, 107574(2020).
  2. Ebrahimi, S. B., Samanta, D. Engineering protein-based therapeutics through structural and chemical design. Nat Commun. 14 (1), 2411(2023).
  3. Senst, B., Goyal, A., Basit, H., Borger, J. Drug Eluting Stent Compounds. , StatPearls Pubs. Treasure Island, FL. (2024).
  4. Shan, H., et al. Advances in drug delivery via biodegradable ureteral stent for the treatment of upper tract urothelial carcinoma. Front Pharmacol. 11, 224(2020).
  5. Zhu, C., Li, Y. An updated overview of glucagon-like peptide-2 analog trophic therapy for short bowel syndrome in adults. J Int Med Res. 50 (3), 3000605221086145(2022).
  6. Clayton, S., et al. Self-expanding intestinal expansion sleeves (IES) for short gut syndrome. Pediatr Surg Int. 38 (1), 75-81 (2022).
  7. Rosete, B. E., Wendel, D., Horslen, S. P. Teduglutide for pediatric short bowel syndrome patients. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 15 (7), 727-733 (2021).
  8. Novel Intestinal Expansion Sleeve (IES): promoting distraction enterogenesis in a live animal model. Colvin, J. C., et al. 39th Southern Biomedical Engineering Conference, , (2023).
  9. Kim, K. J., Lee, S. B., Han, N. W. Kinetics of crosslinking reaction of PVA membrane with glutaraldehyde. Korean J Chem Eng. 11 (1), 41-47 (1994).
  10. Hamidi, M., Azadi, A., Rafiei, P. Hydrogel nanoparticles in drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 60 (15), 1638-1649 (2008).
  11. Chong, S. F., Smith, A. A., Zelikin, A. N. Microstructured, functional PVA hydrogels through bioconjugation with oligopeptides under physiological conditions. Small. 9 (6), 942-950 (2013).
  12. Jensen, B. E., Dávila, I., Zelikin, A. N. Poly(vinyl alcohol) physical hydrogels: Matrix-mediated drug delivery using spontaneously eroding substrate. J Phys Chem B. 120 (26), 5916-5926 (2016).
  13. Teduglutide for short bowel syndrome. Aust Prescr. 43 (2), 72-73 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Polyvinylalcoholcoatingeiwitgebaseerde therapieënglucagonachtig peptide-2expandeerbare sleeve-apparatencovalente drugbindingELISA-colorimetriecrosslinkingreactiegelokaliseerde drugtoedieningcoating van medische hulpmiddelen
Validatie van de conjugatie van therapeutische middelen aan medische hulpmiddelen met een polyvinylalcoholcoating
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.