Methodenartikel

Een macrofaag-tumor sferoïde co-invasietest

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67374

⸱

24 januari 2025

 , 
1Institute for Medical Microbiology, Virology and Hygiene, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om de interactie van primaire humane monocyt-afgeleide macrofagen met een tumorsferoïde in een driedimensionale (3D) collageen I-matrix te onderzoeken, met de mogelijkheid om de impact van oplosbare en fysische eigenschappen van de micro-omgeving op celinvasie te vergelijken.

Samenvatting

De interactie van immuun- en kankercellen en hun respectieve impact op metastase is een belangrijk aspect van kankeronderzoek. Tot nu toe zijn er slechts enkele protocollen beschikbaar die een in vitro benadering van de in vivo situatie mogelijk maken. Hier presenteren we een nieuwe benadering voor het observeren van de impact van menselijke macrofagen op de invasiviteit van kankercellen, met behulp van tumorsferoïden van H1299 niet-kleincellige longcarcinoomcellen ingebed in een driedimensionale (3D) collageen I-matrix. Met deze co-cultivatie opstelling testten we de impact van kleine interfererende RNA (siRNA)-gebaseerde uitputting van regulerende factoren in macrofagen op de 3D-invasie van kankercellen uit de tumorsferoïde in vergelijking met controles. Deze methode maakt het mogelijk om verschillende parameters te bepalen, zoals het sferoïde gebied of het aantal binnendringende kankercellen, en zo verschillen in de invasie van kankercellen te detecteren. In dit artikel presenteren we de respectievelijke opzet, bespreken we de daaropvolgende analyse, evenals de voordelen en mogelijke valkuilen van deze methode.

Inleiding

Macrofagen zijn een belangrijk onderdeel van het aangeboren immuunsysteem en vertegenwoordigen de eerste verdedigingslinie bij veel pathologische aandoeningen, zoals infecties of het opruimen van celresten na verwondingen1. In de afgelopen decennia is de impact van immuuncellen op de progressie van kanker een aspect geweest van veel onderzoeken. Dienovereenkomstig is aangetoond dat macrofagen metastase kunnen vergemakkelijken door zich te associëren met primaire tumoren en tumor-geassocieerde macrofagen (TAM's) te worden2. Macrofagen kunnen hun expressieprofiel veranderen wanneer ze worden blootgesteld aan kankercellen, waardoor metastase uit het immuunsysteem ontsnapt3. Bovendien is aangetoond dat kankercellen defecten in de extracellulaire matrix (ECM) die door macrofagen worden gegenereerd, kunnen gebruiken om uit de primaire tumor te ontsnappen en dat hun gedrag ook wordt gemanipuleerd door de opname van uitgescheiden factoren, waaronder extracellulaire blaasjes (EV's)4,5. Dit samenspel van fysische en chemische aspecten vereist de ontwikkeling van nieuwe methoden om de impact van immuuncellen op de verspreiding van tumoren en de omringende micro-omgeving te karakteriseren.

Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om het gedrag van immuuncellen in de context van metastase in vivote bestuderen 6. Echter, zoals voor alle experimenten, inclusief dieren, is een vergunning voor dierproeven en een dierenfaciliteit nodig; Deze benaderingen vergen al veel ontwikkeling en voorbereiding. Bovendien is de analyse vaak ingewikkeld, vooral met betrekking tot beeldvorming van levende cellen, aangezien niet alle exemplaren toegankelijk zijn voor de meeste microscopische opstellingen. De ontwikkeling van nieuwe methoden om hypothesen eerst te testen in gekwalificeerde in vitro omstandigheden is ook noodzakelijk en opportuun, aangezien wetenschap en samenleving streven naar diervrij onderzoek om het aantal geofferde dieren te verminderen.

In een recente publicatie7 hebben we de impact van primaire menselijke macrofagen op de invasiviteit van binnendringende kankercellen uit een tumorsferoïde onderzocht. Voor dit doel hebben we een op collageen I gebaseerde macrofaag-tumor sferoïde co-invasietest opgezet. In deze context wilden we de rol van snelle recyclageroutes van de membraan-type 1 matrix metalloproteïnase (MT1-MMP) in macrofagen ophelderen. We testten macrofagen die uitgeput waren voor het super processieve kinesine KIF16B, dat we hebben geïdentificeerd als een belangrijke aanjager van MT1-MMP-recycling, en hun impact op de invasieve mogelijkheden van H1299-groen fluorescerend eiwit (GFP) cellen van een vaste sferoïde. KIF16B-verarmde macrofagen vertonen verlaagde niveaus van het membraangebonden MT1-MMP op hun oppervlak, terwijl de H1299-cellen zelf onbehandeld waren.

Voor zover wij weten, is er geen vergelijkbare methode beschreven die volledige beeldvorming en analyse van macrofaag-tumor-sferoïde co-invasie mogelijk maakt. Hoewel we ons in onze recente publicatie7 hebben gericht op de analyse van individueel migrerende cellen op afstand van de sferoïde, maakt de test meerdere verdere onderzoeken mogelijk, zoals het aantal binnendringende strengen, eiwitten die betrokken zijn bij de interactie tussen kankercellen en macrofagen, de hoeveelheid collageen I-afbraak of andere sferoïde eigenschappen zoals de lengte van de omtrek.

Protocol

Dit protocol omvat het gebruik van primaire menselijke macrofagen die zijn afgeleid van donorbloedmonsters. Volgens de ethische richtlijnen van het Universitair Medisch Centrum Hamburg-Eppendorf werden bloedmonsters verzameld en werden donoren gecompenseerd. Verdere verwerking van de monsters werd uitgevoerd volgens de gegeven veiligheidsrichtlijnen (bijv. behandeling van niet-geteste monsters). Het werken met primaire menselijke macrofagen in deze studie is door Ärztekammer Hamburg, Duitsland, als onbetwistbaar beoordeeld.

1. Generatie van H1299 tumorsferoïden in een steigervrije benadering (3 dagen van tevoren)

  1. Kweek kankercellen in een incubator van 37 °C met 5% CO2 in 25cm 2-celkweekkolven (zie materiaaltabel) met kankercelmedium (Dulbecco's gemodificeerd adelaarsmedium [DMEM] + 1% penicilline-streptomycine [pen-streptokokken] + 10% foetaal runderserum [FBS] + 0,1 mM niet-essentiële aminozuren + 2 mM L-glutamine) tot 80% samenvloeiing.
  2. Was de cellen één keer met Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) en maak ze los door gedurende 2 minuten 1 ml trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (0,25%, fenolrood) toe te voegen. Stop de enzymatische reactie door 2 ml kankercelmedia toe te voegen en controleer het loslaten onder een lichtmicroscoop.
    LET OP: Het is belangrijk dat de kankercellen gescheiden zijn en dat er geen clusters van kankercellen aanwezig zijn.
  3. Breng de celsuspensie over in een reactiebuis van 15 ml en centrifugeer deze gedurende 5 minuten bij 245 x g . Verwijder daarna de trypsineoplossing door te pipetteren of een pomp te gebruiken, was de pellet vervolgens door 5 ml DPBS toe te voegen en centrifugeer ze opnieuw onder dezelfde omstandigheden.
  4. Resuspendeer de pellet in 5 ml kankercelmedium en tel de cellen, bijvoorbeeld met een Neubauer-kamer. Breng 8.000 H1299-GFP-cellen over in een ultralage hechtingsplaat met 96 putjes (zie materiaaltabel) in een eindvolume van 25 μL kankercelmedium.
  5. Incubeer de kamer gedurende 3 dagen in de broedmachine bij 37 °C en 5% CO2 . Controleer de sferoïden onder de microscoop op uniformiteit. Beschouw geen sferoïden met een lagere dichtheid of niet-gehechte individuele kankercellen voor verdere experimenten.

2. Preparaat van primaire menselijke macrofagen uit bloedmonsters van donoren

  1. Als donorbloedmonsters niet onmiddellijk worden gebruikt voor celisolatie, bewaar ze dan bij 4 °C, met schudden.
  2. Breng 20 ml bloed over van een transfusiezak in een reactiebuis van 50 ml.
  3. Bereid vervolgens een nieuwe buis van 50 ml voor en voeg 15 ml lymfocytenscheidingsmedium (LSM) toe.
  4. Voeg voorzichtig de 20 ml bloed toe aan elke LSM-bevattende buis zonder te mengen en centrifugeer deze 30 minuten bij 450 x g bij 4 °C.
  5. Maak in de tussentijd een nieuwe tube van 50 ml klaar en voeg 10 ml koud Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium toe.
  6. Breng na het centrifugeren de dichte, witte fase ("buffy coat") in de bloedhoudende buis over in de voorbereide RPMI-bevattende buis en tel het volume op tot 50 ml met koude RPMI.
  7. Centrifugeer de suspensie bij 450 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi het bovenstaande weg.
  8. Resuspendeer de cellen in 10 ml koud RPMI.
  9. Centrifugeer het mengsel opnieuw bij 450 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet opnieuw in 50 ml RPMI.
  10. Centrifugeer het monster opnieuw bij 450 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant weg en resustrier de celpellet in 1,5 ml koude monocytenbuffer (0,5% humaan serumalbumine + 5 mM EDTA in 25 ml DPBS).
  11. Leg de celsuspensie op ijs, voeg 250 μL anti-CD14-microbeads toe en incubeer gedurende 15 minuten op ijs.
  12. Bereid een scheidingskolom voor door toevoeging van een filter aan een magnetisch scheidingsrek en voeg 900 μl monocytbuffer toe voor evenwicht.
  13. Giet de celsuspensie op het filter en laat het door de zwaartekracht in een afvoerbuis stromen.
  14. Was de kolom, die de cellen bevat die aan de magnetische kralen zijn gebonden, door 1 ml monocytenbuffer toe te voegen.
  15. Maak een verse buis van 50 ml met 20 ml RPMI klaar en plaats de afvoerslang onder de kolom terug.
  16. Voeg 3 ml monocytenbuffer toe aan de kolom, verwijder deze uit het magnetische rek en bevestig de stempel.
  17. Druk de cellen in de voorbereide buis van 50 ml en vul deze tot 30 ml volume met RPMI.
  18. Tel de cellen (bijv. met behulp van een Neubauer-telkamer) onder een lichtmicroscoop en pas het celaantal aan door RPMI toe te voegen tot 2 x 106 cellen/ml.
  19. Zaai 1 ml van de celsuspensie in elk putje van een kamer met 6 putjes en incubeer de plaat gedurende 2-4 uur bij 37 °C en 5% CO2.
  20. Controleer of de cellen goed hechtten en vervang het RPMI door 1,5 ml monomedium (20% humaan serum + 1% pen-streptokokken in RPMI).
  21. Vervang het medium na 24 uur incubatie. Onder deze omstandigheden differentiëren monocyten binnen 6 dagen tot macrofagen.

3. Voorbereiding van macrofagen

  1. Maak op de dag van het experiment de macrofagen los met een geschikte hoeveelheid accutase voor de individuele kweekomstandigheden. Gebruik bijvoorbeeld 500 μL accutase als de cellen in een schaaltje met 6 putjes worden gezaaid. Incubeer de cellen ongeveer 40 minuten in de oplossing, was ze één keer met 2 ml DPBS en tel ze met een Neubauer-kamer.
  2. Verdun voor één sferoïde het gewenste aantal macrofagen in 40 μL collageen I meng (2,5 mg/ml rattenstaartcollageen I) en meng ze door de reactiebuis kort te vortexen. In de uitgevoerde experimenten hebben 200.000 cellen/ml een detecteerbaar verschil aangetoond bij de invasie van kankercellen. Bewaar de collageen-cel-mix op ijs, want deze begint snel te polymeriseren bij kamertemperatuur (RT).

4. Opzet van de co-invasietest

OPMERKING: Afhankelijk van het formaat van de beeldvormingskamer, het doel van de analyse of de respectieve beeldvormingsopstelling, moet de tumorsferoïde mogelijk worden overgebracht van de ultralage hechtingsplaat en moeten de waarden voor collageen en media worden aangepast. In de volgende stappen wordt de opstelling beschreven voor één monster in een μ-dia met 15 putjes.

  1. Was eerst de sferoïde door 300 μL DPBS toe te voegen. Knip de punt van een blauwe pipetpunt van 1 ml af en neem de sferoïde op met DPBS. Nadat de aspiratie van de sferoïde zich in de punt heeft genesteld, duwt u de pipet kort naar de bodem van de beeldvormingskamer om de tumor-sferoïde door oppervlaktespanning over te brengen.
    OPMERKING: Het is belangrijk op te merken dat de wrijving aan niet-gewijzigde uiteinden de integriteit van de sferoïde kan verstoren.
  2. Verwijder resterende DPBS die met de sferoïde zijn overgebracht zoveel mogelijk door te pipetteren.
  3. Voeg snel 40 μL collageen I/macrofaagmix (zie stap 3.4) toe aan de beeldvormingskamer die de H1299-GFP-sferoïde bevat.
  4. Breng de plaat over in een celincubator en incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2 onder vochtige omstandigheden om het collageenmengsel volledig te polymeriseren.
  5. Voeg na polymerisatie voorzichtig 25 μL kankercelmedia toe aan elk putje en incubeer de plaat gedurende 3 dagen in de incubator onder de eerder beschreven omstandigheden. Bekijk indien nodig het levende monster met een laserscanmicroscoop op de gewenste tijdstippen.

5. Extra fixatie en kleuring

  1. Om immunofluorescentiekleuring uit te voeren, fixeert u de macrofagen en H1299-GFP-sferoïden in de collageen I-matrix. Verwijder eerst voorzichtig het bovenstaande uit elk monster met een pomp zonder de matrix aan te raken.
    OPMERKING: Om vernietiging van het monster te voorkomen, kan het bovenstaande ook worden verwijderd door handmatig te pipetteren zonder gebruik te maken van een pomp.
  2. Voeg 50 μL 3,7% formaldehyde in DPBS toe aan elk putje en incubeer de monsters gedurende 5 minuten op ijs. Verwijder daarna de fixeeroplossing en voeg er opnieuw 50 μL verse fixeeroplossing aan toe. Deze stap is belangrijk om een gelijkmatiger formaldehydegehalte in de put te bereiken. Incubeer de monsters een nacht bij 4 °C.
    OPMERKING: Afhankelijk van de hoeveelheid collageen die ik meng, kunnen de incubatietijden oplopen tot enkele uren.
  3. Verwijder het fixeermiddel de volgende dag en was de monsters door herhaalde verwijdering van ten minste twee keer DPBS, afhankelijk van het volume van de beeldkamer. Incubeer ze kort gedurende 5 minuten op ijs op een shaker voordat u de DPBS verwijdert door te pipetteren. De monsters zijn nu klaar om gekleurd te worden.
  4. Kleur de monsters door een 1:100-mengsel van 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) (1 mg/ml, om kernen te kleuren) en falloïdine 568 (om F-actine te kleuren) toe te voegen in DPBS gedurende ten minste 30 minuten en was ze twee keer met DPBS voordat ze worden beeldvorming.

6. Beeldvorming en analyse van verschillende parameters van tumorgroei

OPMERKING: De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd voor beeldvormingsmonsters met vaste levende cellen.

  1. Gebruik voor de waarneming van de tumor-sferoïde een omgekeerde laserscanmicroscoop die is uitgerust met een 10x-objectief waarmee een z-stack van ongeveer het onderste derde deel van de sferoïde kan worden afgebeeld.
    OPMERKING: Vanwege de dikte van het monster kan een 2-fotonenmicroscoop ook voordelig zijn. Voor een optimale identificatie van individuele cellen kan een hoger laservermogen en een hogere belichtingstijd nodig zijn.
  2. Combineer na de acquisitie de stapels door z-projectie met behulp van Fiji, wat ImageJ-software is (Fiji). Verwerk verder het resulterende kanaal van het H1299-GFP-signaal door een automatische drempel toe te passen (bijv. Huang auto-drempel) en verwijder resterende ruis door het beeld te ontspikkelen, afhankelijk van de hoeveelheid achtergrond en signaalintensiteit.
  3. Meet de sferoïde parameters met behulp van Fiji.
    1. Gebied: Meet de sferoïde grootte met de toverstok .
    2. Perimeter: Neem de omtrek op in de meetinstellingen.
    3. Diameter: Neem de diameter van de feret op in de meetinstellingen.
    4. Circulariteit: Neem de vormdescriptoren op in de meetinstellingen.
  4. Meet de individuele kankercelparameters met behulp van Fiji.
    1. Meet het aantal binnendringende cellen.
      1. Kies de centrale sferoïde met het gereedschap Toverstaf en verwijder het signaal. Hierdoor worden zowel de sferoïde als alle verbonden signalen van cellen, die nog aan de sferoïde vastzitten, uit de analyse verwijderd.
      2. Gebruik daarna de tool Deeltjes analyseren of kwantificeer alle resterende individuele signalen.
        OPMERKING: Het resultaat is het aantal binnendringende kankercellen. Bovendien kan het resultaat ook het representatieve gebied laten zien dat door de kankercellen wordt bedekt en worden geïnterpreteerd als collectieve invasie of eencellige invasie, afhankelijk van de grootte van het gebied. Om het aantal binnendringende kankercellen verder te valideren, kon een masker van de geanalyseerde deeltjes boven het DAPI-kanaal worden gelegd en konden kernen worden geteld.
  5. Evalueer de resultaten verder met behulp van een statistisch programma zoals GraphPad Prism of Microsoft Excel.
    OPMERKING: Het is aangetoond dat dit protocol zowel robuust als flexibel is. Het is meer dan 50 keer in ons laboratorium gebruikt, altijd met primaire menselijke macrofagen van ten minste 3 donoren, om rekening te houden met de variabiliteit van donoren. In zijn huidige vorm is aangetoond dat het protocol leidt tot een slagingspercentage van 90-95%. Omdat de opzet echter complex is, kunnen variërende resultaten ook een uitkomst zijn, aangezien de interactie van macrofagen voor elke sferoïde individueel is. Het wordt dus aangeraden om het experiment ten minste 3 keer uit te voeren met 5 sferoïden om een statistisch significant resultaat te krijgen.

Resultaten

Figuur 1 toont een H1299-GFP-sferoïde die is afgebeeld op de respectievelijke incubatiedagen in een collageen I-matrix. Een respectievelijke helderveldafbeelding, genomen op dag 0, toont ook de primaire menselijke macrofagen die samen met de sferoïde zijn gekweekt. Het representatieve beeld dat op dag 3 van het experiment is opgenomen, wordt na verwerking vergroot. Er worden verschillende parameters aangegeven die kunnen worden geanalyseerd, waaronder het aantal binnendringende cellen, plaatsen van collectieve invasie en sferoïde perimeter. De bijgevoegde tabel toont de resultaten van deze afbeelding. Het aantal gedetecteerde signalen komt overeen met de visuele indruk. Er zijn geen verstoringen van de centrale sferoïde zichtbaar, wat wijst op daadwerkelijke invasie van individuele kankercellen in plaats van cellen die zijn afgeleid van sferoïde puin. De resultaten van verschillende sferoïden en aandoeningen kunnen nu worden vergeleken via statistische analyse.

figure-results-1
Figuur 1: Representatieve resultaten. (Bovenste paneel) H1299-GFP sferoïde afgebeeld op dag 0, dag 1, dag 2 en dag 3 van de incubatie in een collageen I-matrix. (Paneel linksmidden) Een helderveldbeeld van de sferoïde met de gecocultureerde primaire menselijke macrofagen. (Paneel midden rechts) Een representatief beeld verkregen op dag 3 vergroot na verwerking, met de verschillende parameters die kunnen worden geanalyseerd (sferoïde omtrek in rood; handmatig getraceerd voor een betere visualisatie). (Onderste paneel) De resultaten verkregen uit de afbeelding op het paneel rechtsmidden. Opmerking: Macrofagen zijn niet zichtbaar, omdat alleen het GFP-kanaal is opgenomen om het gedrag van kankercellen op te helderen. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De invasie van kankercellen blijft een belangrijk maar onderbelicht onderwerp in de context van het mede-invasie van immuuncellen zoals macrofagen. Collectieve en individuele invasie van kankercellen zijn kritieke processen tijdens metastase en het is aangetoond dat ze de overlevingskans van kankerpatiënten verlagen vanwege de veelheid aan plagen van verschillende organen 8,9. In vivo studies zijn complex en zijn beperkt tot laboratoria met toegang tot dierenhuisvesting. Bovendien is het ook moeilijk om in vivo omstandigheden te controleren of om specifieke aspecten te manipuleren. Daarom blijft de nood aan een toegankelijker systeem essentieel om basisvragen in de eerste onderzoekslijn te beantwoorden.

Met de hier gepresenteerde methode hebben we een manier ontwikkeld waarop i) immuuncellen en ii) het gedrag van kankercellen, iii) groei en ontwikkeling van een vaste sferoïde, en iv) de impact van cellen in de omringende tumormicro-omgeving (TME) op ECM-componenten verder kan worden geanalyseerd. Het kan worden gebruikt om de impact van gemodificeerde (bijv. uitgeput voor specifieke regulatoren door siRNA-behandeling) macrofagen op de invasiviteit van individuele kankercellen van een vaste sferoïde te vergelijken. Of de fysieke herschikking van de TME of uitgescheiden factoren de belangrijkste oorzaak is van het waargenomen gedrag van kankercellen, is momenteel onduidelijk en moet in meer detail worden geanalyseerd.

Daarnaast kunnen ook de kankercellen zelf worden gemanipuleerd, bijvoorbeeld door siRNA-behandeling of knock-out van specifieke regulatoren. Bovendien kan de analyse worden verbeterd door het aantal getelde kernen binnen het geïdentificeerde celprofiel te vergelijken om een nauwkeurigere bepaling van binnendringende kankercellen mogelijk te maken.

We hebben deze test gebruikt om de impact van macrofagen in de TME op de invasie van tumorcellen te bepalen. Er moet echter ook worden opgemerkt dat tumorcellen waarschijnlijk de activiteit van macrofagen beïnvloeden, mogelijk via uitgescheiden factoren in de media. Het zou dus ook een waardevolle inspanning zijn om veranderingen in de macrofagen te identificeren, zoals veranderde polarisatiestatus (M1 vs. M2) door immunofluorescentiekleuring met behulp van respectieve antilichamen. In het verleden heeft de vergelijking tussen cellen die in monolagen groeien en cellen die in een 3D-omgeving worden gekweekt, aanzienlijke verschillen in hun expressieprofielen laten zien10.

Bovendien zou fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) van macrofaagsubpopulaties en hun integratie in de experimentele procedure leerzaam kunnen zijn. Last but not least zou een meer gedetailleerde beeldvorming van de contactgebieden waar macrofagen interageren met kankercellen of het sferoïde oppervlak van de tumor kunnen leiden tot de identificatie van verdere mechanismen die relevant zijn voor 3D-invasie en -interactie.

Van belang dat niet volledig kan worden gecontroleerd, is de precieze positionering van de sferoïde in het midden van de put na de toevoeging van het collageenmengsel. De hoeveelheid collageen onder de sferoïde is bijzonder moeilijk te reguleren. Hier zijn andere methoden ontwikkeld om een nauwkeurige positionering van de sferoïde mogelijk te maken, bijvoorbeeld op agarosevormen met hogere monsternummers11. Aangezien de afgifte van cytokinen echter een veelvoorkomend mechanisme is, worden alle sferoïden in deze multi-sferoïde test blootgesteld aan uitgescheiden factoren en is het aantal immuuncellen dat op een enkele sferoïde inwerkt moeilijk te controleren.

Een fundamentele beperking van dit protocol is het vermogen van kankercellijnen om uniforme sferoïden te vormen, en is dus alleen van toepassing op een subset van cellijnen. MeWo-melanoomcellen vormen bijvoorbeeld ongelijke, plaatachtige 3D-structuren, maar geen uniforme sferoïden.

Er moet ook worden opgemerkt dat de test in hoge mate aanpasbaar is, aangezien veel van de kenmerken ervan kunnen worden gewijzigd, zoals het ECM-materiaal, het celaantal of door specifieke factoren zoals cytokinen aan het supernatant toe te voegen. Het zou daarom zeer geschikt moeten zijn voor initiële in vitro studies van de interactie tussen kankercellen en immuuncellen en kan worden afgestemd op de specifieke onderzoeksvraag die momenteel wordt behandeld.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen concurrerende belangen bestaan.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Andrea Mordhorst bedanken voor de uitstekende technische ondersteuning en celcultuur en Martin Aepfelbacher voor de voortdurende ondersteuning. Het werk aan de invasie van macrofagen in het SL-lab wordt ondersteund door Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC877/B13; LI925/13-1).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 µ-Slide Angiogenesis ibidi81506
AccutaseInvitrogen00-4555-56
Alexa Fluor 568 Phalloidin ThermoFisher ScientificA12380
CD14 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-050-201
CO2 IncubatorBinder
Collagen I Rat Tail Corning354236
DAPIAppliChem
DMEM (1x) + GlutaMAXGibco31966-021
DPBSAnprotecMS01Y71003
FBSBio&CellFBS. S 0613
Fiji NIHImageJ 2 Version: 2.3.0/1.53s
Formaldehyde 37% 252549-500mlSigma-Aldrich
H1299-GFP cell line
Human serum albuminSigma-AldrichA5843
Leica TCS SP8 XLeica
l-glutamine Gibco25030-024
Lymphocyte Seperation Medium (LSM) 1077PromoCellC-44010
MS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-201
nonessential amino-acids Sigma-Aldrich11140050
Pen StrepGibco15140-122
RPMI-1640 Gibco81275-034
TC-Platte 96 Well, BIOFLOAT, R SARSTEDT83,39,25,400
VORTEX-GENE 2 Scientific Industries

Referenties

  1. Lendeckel, U., Venz, S., Wolke, C. Macrophages: shapes and functions. ChemTexts. 8 (2), 12(2022).
  2. Dallavalasa, S., et al. The role of tumor associated macrophages (TAMs) in cancer progression, chemoresistance, angiogenesis and metastasis - Current status. Curr Med Chem. 28 (39), 8203-8236 (2021).
  3. Pan, Y., Yu, Y., Wang, X., Zhang, T. Tumor-associated macrophages in tumor immunity. Front Immunol. 11, 583084(2020).
  4. Boutilier, A. J., Elsawa, S. F. Macrophage Polarization States in the Tumor Microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (13), 6995(2021).
  5. Wenzel, E. M., et al. Intercellular transfer of cancer cell invasiveness via endosome-mediated protease shedding. Nat Commun. 15 (1), 1277(2024).
  6. Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).
  7. Hey, S., Wiesner, C., Barcelona, B., Linder, S. KIF16B drives MT1-MMP recycling in macrophages and promotes co-invasion of cancer cells. Life Sci Alliance. 6 (11), e202302158(2023).
  8. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).
  9. Shi, X., et al. Mechanism insights and therapeutic intervention of tumor metastasis: latest developments and perspectives. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 192(2024).
  10. Li, G. N., Livi, L. L., Gourd, C. M., Deweerd, E. S., Hoffman-Kim, D. Genomic and morphological changes of neuroblastoma cells in response to three-dimensional matrices. Tissue Eng. 13 (5), 1035-1047 (2007).
  11. Lin, Y. N., et al. Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture. J Vis Exp. 160, e61392(2020).

Herprints en machtigingen

Tags

Invasie van tumorsferoïden3D-collageenmatrixinvasie van kankercellenmacrofaagdepletiesmall interfering RNAprimaire menselijke macrofagenlaser-scanmicroscopiecelco-cultivatie
Een macrofaag-tumor sferoïde co-invasietest
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.