Methode om het metabolisme in lymfoïde cellen te bestuderen met behulp van chemie om de opname van puromycine te meten door middel van flowcytometrie

Samenvatting

Het protocol toont een op flowcytometrie gebaseerde methode die gebruik maakt van chemie om het energiemetabolisme in cellen te bestuderen.

Samenvatting

Bij antigeenstimulatie ondergaan naïeve T-cellen een snelle proliferatie en expansie tot effector-T-cellen. Metabolisme speelt een belangrijke rol bij het genereren van biomassa die nodig is voor deze snel prolifererende cellen en voor het genereren van moleculen die nodig zijn voor effector T-celdifferentiatie en -functie, die de uitkomst van de adaptieve immuunrespons bij infectie of kanker beïnvloeden. Naïeve T-cellen herprogrammeren hun metabolisme na antigene stimulatie om de aanmaak van ATP te verhogen, die nodig is om hun groei, biosynthese en effectorfuncties te ondersteunen. ATP kan in een cel worden gegenereerd door de mitochondriale-oxidatieve fosforyleringsroute (OXPHOS) of door de glycolytische route. Omdat het grootste deel van de ATP die in een delende, groeiende cel wordt gegenereerd, wordt opgebruikt voor de synthese van eiwitten, is eiwitsynthese gebruikt als surrogaat voor ATP-niveaus. Eiwitsynthese kan worden gemeten door de opname van puromycine, dat de 3′ adenosine nabootst van een tRNA geladen met een gemodificeerd tyrosine en leidt tot spontane beëindiging van de eiwittranslatie. Metabole remmers zoals 2-deoxyglucose (2DG), dat de glycolytische route blokkeert, en oligomycine (O), dat complex 5 van de elektronentransportketen (ETC) blokkeert, kunnen worden gebruikt om de afhankelijkheden van cellulaire ATP-generatie op deze twee routes te bestuderen in combinatie met evaluatie van eiwitsynthese in een methode genaamd SCENITH. We beschrijven hier een variatie op deze methode die de incorporatie van puromycine detecteert door middel van flowcytometrie met behulp van chemie. Deze methode om het metabolisme te bestuderen is relatief eenvoudig en kan worden gebruikt voor het evalueren van zeldzame celpopulaties, evenals patiëntmonsters, door middel van flowcytometrie.

Inleiding

In de afgelopen jaren is er een groeiende waardering voor de belangrijke rol van metabolisme bij de regulatie van T-cellen. Cellulair metabolisme reguleert veel kritieke functies in lymfocyten, waaronder klonale expansie van pathogeenspecifieke T-cellen en hun differentiatie in subsets van effectorcellen, die een verscheidenheid aan effectormoleculen synthetiseren, waaronder inflammatoire cytokines en cytolytische granzymen die nodig zijn om ziekteverwekkers te doden¹. De studie van het T-celmetabolisme is daarom belangrijk voor zowel de evaluatie van de normale T-celfunctie als voor de ontwikkeling van potentiële therapieën.

Naïeve T-cellen zijn metabolisch in rust en vertrouwen voor hun energiebehoeften op katabool metabolisme en oxidatieve fosforylering (OXPHOS) ^1,2. Bij activering van de T-celreceptor (TCR) ondergaan T-cellen een snelle metabolische herprogrammering, deels gedreven door de opregulatie van nutriëntentransporters op het oppervlak van de cellen, die de opname van glucose en meerdere aminozuren, waaronder glutamine, uit de omgeving verhogen. Deze bouwstenen van voedingsstoffen worden vervolgens in anabole routes gebruikt om macromoleculen te maken die bijdragen aan cellulaire groei en de verhoogde energiebehoefte ondersteunen die gepaard gaat met verhoogde celgroei en -deling ^1,2,3. Metabole herprogrammering in geactiveerde T-cellen maakt de cellen afhankelijker van aërobe glycolyse en glutaminolyse voor hun energiebehoeften ^1,2,3. Bij TCR-stimulatie speelt de opname van voedingsstoffen ook een cruciale rol bij het activeren van stroomafwaartse moleculaire routes³. De opname van aminozuren en de verhoogde lokale aminozuurconcentratie activeren bijvoorbeeld mTORC1-signalering⁴. Omgekeerd vermindert het verminderen van de beschikbaarheid van intracellulaire aminozuren de mTORC1-signaleringsroute 2,3,5,6,7. Metabolisme en cellulaire functie zijn dus nauw met elkaar verbonden in een effector-T-cel.

De grote toename van de biomassa die nodig is voor snel delende T-cellen vereist de opregulatie van eiwitsynthese/translatie⁸. Eiwitsynthese kan in een cel worden gekwantificeerd door de opname van puromycine⁹ te bestuderen, een tyrosyl-tRNA-nabootser die de translatie blokkeert door langwerpige polypeptideketens op te nemen, te markeren en vrij te geven van translerende ribosomen⁹. Eiwittranslatie is een proces dat sterk afhankelijk is van energie; inderdaad, het grootste deel van het ATP dat wordt gegenereerd bij het delen, groeien van cellen wordt gebruikt voor de synthese van eiwitten. Eiwitsynthese is dus gebruikt als surrogaatmeting voor cellulair ATP¹⁰. Om ATP te genereren, vertrouwen cellen gewoonlijk op glycolyse en/of de mitochondriale OXPHOS-route¹¹. Glycolyse genereert twee ATP-moleculen per glucosemolecuul. De OXFOS-route genereert 36 ATP's per glucose^12,13, maar glycolyse kan ATP sneller genereren¹⁴. Snel delende geactiveerde T-cellen, zoals kankercellen, zijn dus sterk afhankelijk van de glycolytische route voor het genereren van ATP.

De afhankelijkheid van een cel van elke metabole route kan worden bestudeerd door het gebruik van specifieke remmers. De glycolytische routeremmer 2-Deoxyglucose (2-DG), een glucose-analoog, werkt als een concurrerende remmer voor het glycolytische enzym hexokinase¹⁵. 2-DG wordt door hexokinase gefosforyleerd tot 2DG-fosfaat (2DG-P). 2DG-P kan niet verder worden gemetaboliseerd door fosfohexose-isomerase, dat normaal gesproken glucose-6-fosfaat (G-6-P) omzet in fructose-6-fosfaat¹⁶. 2DG-P wordt daarom gevangen en hoopt zich op in de cellen, wat leidt tot remming van de glycolyse en uitputting van cellulaire ATP, waardoor de eiwitsynthese wordt geblokkeerd¹⁷. Op een vergelijkbare manier kan de afhankelijkheid van cellen van de mitochondriale OXPHOS-route worden bestudeerd met behulp van oligomycine, dat zich bindt aan het protonkanaal van ATP-synthase van de elektronentransportketen (ETC)¹⁸, waardoor de mitochondriale ATP-synthese wordt geblokkeerd (Figuur 1). Het gebruik van deze remmers in combinatie met een evaluatie van de eiwitsynthese kan een beeld geven van de metabolische toestand van cellen en is gebruikt in een krachtige eencellige methode die bekend staat als SCENITH en die de opname van piromycine evalueert met behulp van flowcytometrie¹⁰. De beschikbaarheid van SCENITH-reagentia kan echter beperkend zijn. Andere veelgebruikte technieken voor het evalueren van glycolyse en OXPHOS zijn onder meer Seahorse-extracellulaire fluxanalyses, waarvoor grotere celaantallen nodig zijn, wat experimenteel misschien niet haalbaar is. In dit artikel beschrijven we een alternatieve methode voor het evalueren van de opname van puromycine met behulp van een in de handel verkrijgbaar Click-it chemiereagens. Het gemak van deze methode maakt een snelle evaluatie mogelijk van de metabole toestand van lymfocyten, inclusief zeldzame celpopulaties en patiëntenmonsters.

Protocol

Veeteelt en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met het goedgekeurde protocol G98-3 door het Animal Use and Care Committee van het National Human Genome Research Institute, NIH, en het goedgekeurde protocol LISB 22E door het National Institute of Allergy and Infectious Diseases Animal Care and Use Committee, NIH. Mannelijke C57Bl/6J-muizen in de leeftijd van 6-12 weken, gefokt en gehuisvest in specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden, werden gebruikt voor de huidige studie. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met vrouwelijke muizen. Menselijk volbloed werd verkregen van de NIH Blood Bank onder het door het NIH Clinical Center IRB goedgekeurde protocol 99-CC-0168 Verzameling en distributie van bloedcomponenten van gezonde donoren voor gebruik in vitro onderzoek. Van alle proefpersonen werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki.

1. Naïeve CD4⁺ T-celisolatie en -kweek in de muis

1. Zuiver naïeve CD4⁺ T-cellen door negatieve selectie uit gepoolde eencellige suspensies van muizenmilt of lymfeklieren van mannelijke muizen van 6 tot 12 weken oud met behulp van een magnetisch celscheidingssysteem volgens het protocol van de fabrikant.
2. Kweekcellen (zoals hieronder beschreven) in IMDM-media die L-alanyl-L-glutaminedipeptide bevatten en aangevuld met 10% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine, 100 E/ml penicilline, 100 E/ml streptomycine en 0,05 mM 2-β-mercaptoethanol.
3. Co-cultuur naïeve CD4 T-cellen in een verhouding van 1:8 met mitomycine-C behandelde T-verarmde splenocyten (hieronder beschreven) als APC's in platen met 48 putjes onder niet-gepolariseerde (1 μg/ml anti-CD3 [kloon 2C11] en 3 μg/ml anti-CD28 [kloon 37.51]), en Th0-condities (1 μg/ml anti-CD3, 3 μg/ml anti-CD28, 10 μg/ml anti-IFNg [kloon XMG1.2], anti-IL-12 [kloon C17.8] en anti-IL-4 [kloon 11B11]) gedurende 72 uur bij 37 °C. Zet culturen op met behulp van 1 x 10⁶ APC's en 0,13 x 10⁶ naïeve CD4 T-cellen per putje van een plaat met 48 putjes (Materiaaltabel)
4. Generatie van met mitomycine C-behandelde T-verarmde splenocyten als APC's: Kortom, kleur een eencellige suspensie van de muizenmilt met FITC-geconjugeerde CD4- en CD8-antilichamen. Label de cellen vervolgens magnetisch met Anti-FITC Microbeads (zie Materiaaltabel). Selecteer vervolgens, met behulp van een magnetisch celscheidingssysteem volgens het protocol van de fabrikant, de APC's negatief uit T-cellen. Behandel de APC's vervolgens met 50 μg/ml Mitomycine C gedurende 40 minuten bij 37 °C incubator, gevolgd door 3x wassen met 1x PBS.

2. Isolatie en cultuur van menselijke PBMC's

1. Isoleer PBMC's uit volbloed met behulp van lymfocytenscheidingsmedia en volgens het protocol van de fabrikant (zie materiaaltabel).
2. Kweek PBMC's in RPMI-media aangevuld met 2 mM L-glutamine, 0,01 M HEPES, 1 mM natriumpyruvaat, 1% niet-essentiële aminozuren, 100 E/ml penicilline en streptomycine, 0,05 mM 2-β-mercaptoethanol en 5% humaan serum.
3. Kweek 1 x 10⁶ PBMC's per putje van een plaat met 96 putjes met U-bodem met 5 μg/ml fytohemagglutinine-L (PHA-L) gedurende 18-24 uur bij 37 °C.

3. Metabole test

OPMERKING: Het is belangrijk om alle cellen, remmers [Oligomycine (O), 2-Deoxyglucose (2-DG), DMSO (Co)] en O-propargyl-puromycine (OPP) reagens zo dicht mogelijk bij 37 °C te houden. Verdeel de cellen, remmers en OPP-reagens uit op 96 platen met U-bodem en laat de platen zoveel mogelijk in een incubator van 37 °C staan. Aliquot-remmers 2-DG en O in kleinere volumes om meerdere vries-dooi te voorkomen.

1. Maak een 2 M (20x) voorraadoplossing van 2-DG en een 40 μM (40x) voorraadoplossing van O. Verdun voor OPP 1 μL OPP in 49 μL medium zodat de concentratie 400 μM is - dit is de 20x voorraadoplossing.
2. Zorg ervoor dat alle andere componenten van de OPP-eiwitsynthesekit (zie Tabel met materialen) op kamertemperatuur (RT) zijn voordat u met het experiment begint.
3. Bereid 1x OPP-reactiebuffer voor door een aliquot uit de Component C-fles 1:10 te verdunnen met gedeïoniseerd water. Bewaar de resterende 1x oplossing na gebruik bij 2-8 °C.
4. Zaad 0,1-2 x 10⁶ cellen per putje van een plaat met 96 putjes met ronde bodem voor elke toestand (Co / DG / O / DGO) in 100 μL volledige IMDM (voor CD4 T-cellen van muizen) of volledige RPMI (voor menselijke PBMC's) of een compleet medium naar keuze. Bewaar de plaat zoveel mogelijk in de broedmachine.
5. Voeg 1x remmers uit stockoplossingen (5 μL 20x DG, Co) (2,5 μL 40x O) toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C, 5% CO₂. De uiteindelijke concentraties op cellen zijn 100 mM DG en 1 μM O. Meng de remmers voorzichtig met de cellen met een pipet. Voor het gemak kunt u de remmers in een plaat met 96 putjes verwijderen en cellen aan de remmers toevoegen en goed mengen door een paar keer op en neer te pipetteren.
6. Voeg in het DGO-monster 1x DG (5 μL) toe, meng voorzichtig met een pipet en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C, 5% CO₂. Voeg vervolgens 1x O (2,5 μL) toe, pipetteer een paar keer en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C, 5% CO₂.
7. Zonder de remmers uit te spoelen, voegt u 5 μL OPP uit de 20x (400 μM) stockoplossing toe aan elk monster zodat de concentratie in de cellen 20 μM is, pipetteer meerdere keren op en neer en incubeer 30 minuten bij 37 °C, 5% CO₂. Voor het gemak kunt u OPP aliquot op een plaat met 96 putjes uitbrengen, cellen met remmers aan het OPP-reagens toevoegen en goed mengen.
   OPMERKING: Voor minder metabolisch actieve cellen en cellen die direct ex vivo zijn geïsoleerd, verlengt u de incubatietijd na toevoeging van OPP. De incubatietijd met OPP moet voor elk celtype worden gestandaardiseerd.
8. Voeg na incubatie met OPP 100-150 μL ijskoude FACS-buffer toe (2% FBS en 1 mM EDTA in 1x PBS). Centrifugeren bij 750 x g gedurende 2 minuten bij 4°C. Gooi het bovenstaande weg en herhaal de wasstap.
9. Kleur cellen met geschikte oppervlaktemarkers, anti-muis CD4-antilichaam (gebruikt bij 1/200 verdunning) of anti-humaan CD4-antilichaam (gebruikt bij 1/50 verdunning), levend/dood reagens (gebruikt bij 1/600 verdunning), in aanwezigheid van Fc Block (gebruikt bij 1/200 verdunning). Incubeer 25-30 minuten bij 4 °C in het donker.
10. Was de plaat met 150-200 μL FACS-buffer en centrifugeer op 750 x g gedurende 2 minuten op 4 °C. Veeg voorzichtig op de plaat om de supernatant weg te gooien en herhaal vervolgens de wasstap. In dit stadium worden de cellen op het oppervlak gekleurd.
11. Resuspendeer de cellen in 1% PFA in PBS, meng goed en incubeer gedurende 10-15 minuten bij 4 °C. Beschermen tegen licht.
12. Wassen met FACS Buffer en centrifugeren op 750 x g gedurende 2 minuten op 4 °C en herhalen wassen.
13. Resuspendeer de celpellet in 200 μL koude 1x saponinepermeabilisatiebuffer (0,1% (wt/vol) saponine + 3% FBS in 1x PBS). Incubeer bij RT, beschermd tegen licht gedurende 5-15 minuten. De cellen zijn op dit moment gefixeerd en permeabiliseerd.
14. Bereid 1x OPP-reactiebufferadditief (component E) door de 10x-oplossing 1:10 te verdunnen in gedeïoniseerd water. Bereid deze oplossing vers en gebruik deze op dezelfde dag.
15. Bereid de OPP-reactiecocktail volgens tabel 1. Gebruik de reactiecocktail binnen 15 minuten na bereiding.
16. Centrifugeer de monsters uit stap 3.13 gedurende 2 minuten bij 750 x g . Gooi het bovenstaande weg. Was de cellen 2x met 200 μL 1x Saponine permeabilisatiebuffer. Draai en gooi het supernatant weg.
17. Voeg 50-100 μL OPP-reactiecocktail (bereid in stap 3.12) toe aan elk putje en meng goed. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT, beschermd tegen licht. Draai de platen vervolgens op 750 x g of 2 minuten op 4 °C. Gooi het bovenstaande weg.
18. Resuspendeer de pellet in 200 μl 1x saponinepermeabilisatiebuffer en centrifugeer de monsters bij 750 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Gooi het bovenstaande weg.
19. Resuspendeer in 50 μL reactiespoelbuffer (component F) per putje en centrifugeer 2 minuten bij 750 x g bij 4°C. Resuspendeer de gekleurde cellen in 200 μl FACS-buffer.
20. Analyseer monsters door middel van flowcytometrie (zie aanvullende figuur 1) op dezelfde dag, of bewaar de cellen in het donker bij 4 °C en analyseer ze de volgende dag.

4. Analyse van de metabole bepaling

1. Meet de opname van puromycine (OPP) als surrogaat voor eiwitsynthese onder de volgende voorwaarden: 1) controleconditie (Co); 2) in cellen waar de glycolytische route wordt geblokkeerd door 2-DG; 3) in cellen waar de mitochondriale OXPHOS-route wordt geblokkeerd door O; en 4) in cellen waar zowel de glycolytische als de mitochondriale routes worden geblokkeerd door remmers (DGO), door de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van OPP te evalueren (Figuur 2).
2. Analyseer de afhankelijkheid van cellen van een bepaalde route door te kijken naar de MFI van OPP in elke toestand. Evalueer de MFI direct als een maat voor eiwitsynthese. Bereken de glucoseafhankelijkheid, glycolytische capaciteit, vetzuuroxidatie (FAO) en aminozuuroxidatie (AAO) capaciteit en mitochondriale afhankelijkheid volgens¹⁰.

Resultaten

Naïeve CD4⁺ T-cellen werden geïsoleerd uit de milt en lymfeklieren van muizen en gedurende 72 uur gedifferentieerd tot Th0 of niet-gepolariseerde (NP) lijnen. Cellen werden geoogst na 0 uur, 48 uur en 72 uur kweek, en OPP-opname werd gemeten door te kijken naar de MFI van de OPP. Naïeve CD4⁺ T-cellen waren minder synthetisch dan de geactiveerde T-cellen, zoals gezien door de MFI van OPP (Figuur 3). Naïeve cellen waren gedeeltelijk afhan...

Discussie

Dit artikel biedt een methode om het metabolisme in lymfoïde cellen te bestuderen door middel van flowcytometrie, gebaseerd op SCENITH-technologie, maar met behulp van chemische etikettering van opgenomen puromycine. Hoewel we ons hebben gericht op lymfocyten, kan dit protocol worden aangepast om het metabolisme in elk celtype te bestuderen. Deze methode is ook voordelig om het metabolisme te bestuderen in zeldzame populaties van cellen en patiëntenmonsters, waar andere technieken, zoals...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher	21985-023
Alexa Fluor 488 anti-Puromycin Antibody	Biolegend	381506	Gebruikte verdunning: 1/100
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357422	Gebruikte verdunning: 1/50
BD Horizon BUV737 Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	612761	Gebruikte verdunning: 1/200
Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488 Protein Synthesis Assay Kit	Thermo Fisher	C10456
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630080
Human Serum	Millipore Sigma	H4522
IMDM, GlutaMAX Supplement, 500 ml	Thermo Fisher	31980030
InVivoMAb anti-mouse CD28, Clone: 37.51	BioXcell	BE0015-1
InVivoMAb anti-mouse CD3ε, Clone: 145-2C11	BioXcell	BE0001-1
InVivoMAb anti-mouse IFNγ, Clone: XMG1.2	BioXcell	BE0055
InVivoMAb anti-mouse IL-12 p40, Clone: C17.8	BioXcell	BE0051
InVivoMAb anti-mouse IL-4, Clone: 11B11	BioXcell	BE0045
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher	25030081
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, voor 405 nm excitatie	Thermo Fisher	L34966	Gebruikte verdunning: 1/600
LSM lymfocytenscheidingsmedium	MP Biomedicals	50494X
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Thermo Fisher	11140050
Mitomycin C van Streptomyces caespitosus	Sigma	M0503-10X2MG
Naive CD4 Isolation Kit, muis	Miltenyi Biotec	130-104-453
Paraformaldehyde 16% waterige oplossing EM-kwaliteit	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (1X), pH 7.4, 500 mL	Quality Biologicals	114-058-101
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL). 100mL	Thermo Fisher	15140122
Phytohemagglutinine-L (PHA-L)	Millipore Sigma	11249738001
Premium Grade Foetaal Rundserum (FBS)	Avantor	97068-085
RPMI 1640 Medium, geen glutamine	Thermo Fisher	21870076
Saponine	Thermo Fisher	A18820.22
Natrium Pyruvaat (100 mM)	Thermo Fisher	11360070