Methodenartikel

Confocale microscopieanalyse van eiwitsortering naar plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

DOI:

10.3791/67378

⸱

1 november 2024

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de selectie van optimale plasmodesmale markers voor confocale microscopie-gebaseerde analyses van eiwit gericht op plasmodesmata tijdens virus-plasmodesmata interacties of plasmodesmaal transport.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plasmodesmata zijn vliezige nanoporiën die het cytoplasma van aangrenzende plantencellen verbinden en de cel-naar-cel handel van voedingsstoffen, macromoleculen en binnendringende virussen mogelijk maken. Plasmodesmata spelen een fundamentele rol bij de regulatie van intercellulaire communicatie en dragen bij aan de ontwikkeling van planten, omgevingsreacties en interacties met virale pathogenen. Het ontdekken van plasmodesmale lokalisatie van plantaardige of virale eiwitten kan nuttige functionele informatie over het eiwit opleveren en is belangrijk voor het begrijpen van de mechanismen van plant-virusinteracties. Om deze studies te vergemakkelijken, beschrijven we een protocol voor confocale microscopie-gebaseerde analyse van verschillende plasmodesmale targeting-eiwitten om de beste plasmodesmale marker te selecteren voor het bestuderen van de virus-plasmodesmata-interacties of plasmodemaal transport. Concreet worden de analyses van deze gebeurtenissen geïllustreerd aan de hand van het cel-tot-cel bewegingseiwit (MP) van het Turnip vein-clearing virus (TVCV), het Arabidopsis Plasmodesmata-Localized Protein 5 (PDLP5) en Plasmodesmata Callose-Binding Protein 1 (PDCB1). De plasmodesmale lokalisatiegegevens van het eiwit worden parallel geanalyseerd met de globale visualisatie van plasmodesmata met behulp van anilineblauwkleuring van de bemonsterde weefsels. Deze benaderingen kunnen gemakkelijk worden aangepast om de plasmodesmale lokalisatie van cellulaire of pathogene eiwitten in planta te analyseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plasmodesmata (PD) spelen een fundamentele rol bij het beheersen van de ontwikkeling van planten, omgevingsreacties en interacties met virale pathogenen door de regulatie van intercellulaire communicatie 1,2. PD wordt aanvankelijk gevormd tijdens cytokinese, waarbij honderden PD's tussen de twee dochtercellen in de nieuwe cel worden ingebracht, waardoor de kanalen voor cel-tot-celcommunicatie worden geleverd 3,4. PD is een membraanrijke structuur, die het van endoplasmatisch reticulum (ER) afgeleide membraan, een trans-PD-desmotubule, bevat in het centrale deel van de poriën die worden bekleed door het plasmamembraan 3,4. Vergelijkende proteomische benaderingen identificeerden talrijke PD-functionele eiwitten, waaronder β-1,3-glucanasen (BG's), callosesynthasen (CALS's), plasmodesmata-gelokaliseerde eiwitten (PDLP's), callose-bindende eiwitten (PDCB's), multi C2-domeinen transmembraanregio-eiwitten (MCTP's)3 en leucine-rijke repeatreceptor-achtige kinasen (RLK)5. Onlangs ontwikkelden Kirk et al. een tool genaamd plasmodesmata in silico proteome 1 (PIP1), die het mogelijk maakte om nieuwe PD-eiwitten te voorspellen in 22 plantensoorten6. PD varieert in permeabiliteit en structuur tijdens de ontwikkeling van de plant en reactie op verschillende stressfactoren. Callose (β-1,3-glucaan) afzetting en hydrolyse in het nekgebied rond de PD is een van de algemeen bekende mechanismen van PD-regulatie7.

Veel pathogene microben, waaronder schimmels, bacteriën en virussen, kunnen de PD-dilatatie of -structuur manipuleren tijdens hun infectie 2,8,9. Magnaporthe oryzae, de veroorzaker van rijstontploffing, zet intracellulaire invasieve hyfen in om van cel naar cel te gaan via PD8. Een bacteriële ziekteverwekker Pseudomonas syringae pv. tomaat heeft een effectoreiwit HopO1-1 nodig voor intercellulaire beweging en verspreiding in de waardplant door interactie met en destabilisatie van PDLP7, waardoor de moleculaire flux in naburige cellen in Arabidopsis9 toeneemt. Plantenvirussen zijn echter veelzijdiger in het reguleren van PD tijdens hun intercellulaire overdracht, waarbij het virale bewegingseiwit (MP) de beweging van cel naar cel bevordert. Vanwege hun belangrijke functie bij het reguleren van de ontwikkeling en groei van planten, evenals hun interactie met plantpathogene microben, heeft PD de laatste jaren steeds meer aandacht gekregen. Bij Arabidopsis thaliana zijn er twee belangrijke typen functionele PD-eiwitten, PDLP's (1-8) en PDCB's (1-5), en veel van hen, bijvoorbeeld PDLP5 1,10,11, PDLP112, PDLP613, PDLP714 en PDCB115, bleken een rol te spelen bij het manipuleren van de PD-permeabiliteit door regulatie van callose-afzetting. Sommige PDLP's bleken echter een functionele redundantie te hebben, bijv. knock-outmutanten van pdlp1 en pdlp1,2 hadden geen invloed op de moleculaire handel, hoewel dubbele knock-outmutanten van pdlp1,3 en pdlp2,3 een verhoogde plasmodesmale permeabiliteit vertoonden16. Interessant is dat downregulatie/knock-out of overexpressie van PDLP5 alleen resulteert in een toename of afname van de plasmodesmale permeabiliteit, respectievelijk 1,17. Onlangs hebben Li et al. ontdekt dat PDLP5 en PDLP6 functioneren op verschillende celinterfaces13. Deze resultaten geven aan dat PDLP5 mogelijk niet-redundante functies heeft met andere PDLP's.

Vanwege de cruciale functie van PD in intercellulaire communicatie, hebben we een protocol ontwikkeld voor het inzetten van de plantaardige PD-eiwitten PDLP5 en PDCB1 en het virale cel-tot-cel bewegingseiwit (MP) van het raapader-opruimingsvirus (TVCV) als eenvoudige, handige en betrouwbare PD-markers voor celbiologische experimenten. Voor verdere verificatie werd de visualisatie van PD met behulp van anilineblauwkleuring van de bemonsterde weefsels parallel uitgevoerd. De protocollen die zijn beschreven voor PD-lokalisatie van PDLP5, PDCB1 en TVCV MP kunnen gemakkelijk worden aangepast om potentiële PD-lokalisatie van cellulaire of van ziekteverwekkers afgeleide eiwitten in levende planten te analyseren.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Plantengroei

  1. Kweek Nicotiana benthamiana zaden in natte grond in een gecontroleerde omgeving kamer bij 23 °C onder 16 uur licht en 8 uur donker.
  2. Breng na ongeveer 2 weken de zaailingen met de turfkorrels rond hun wortels voorzichtig over naar grotere potten en groei verder onder dezelfde omstandigheden gedurende 4-5 weken voor de agro-infiltratie-experimenten.
    OPMERKING: Gebruik de planten niet wanneer ze beginnen te bloeien, aangezien de ophoping van GFP zal afnemen in het bloeiwijzestadium18.

2. Vector constructie

  1. Gebruik PCR om de coderende sequenties van belang te amplificeren met Q5 High-Fidelity DNA Polymerase en kloon ze in de ingangsvector pDONR207 door de BP-reactie19 met behulp van een in de handel verkrijgbare BP Clonase-kit.
  2. Breng de doelgenen in de resulterende ingangsplasmiden over naar de bestemmingsvector pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1 door de LR-reactie19 met behulp van een in de handel verkrijgbare LR Clonase-kit om plasmiden te produceren met de EGFP-tag gefuseerd met de C-terminus van de doeleiwitten.
  3. Verifieer alle constructen door PCR en sequencing19.

3. Agro-infiltratie

  1. Streep Agrobacterium tumefaciens EHA105-cellen met verschillende vectoren op LB-agarplaten en gedurende 2 dagen geïncubeerd onder 28 °C.
  2. Breng een enkele kolonie over in 2 ml LB-bouillon en incubeer een nacht bij 28 °C met agitatie (250 rpm).
  3. Verwijder 1 ml uit de nachtelijke cultuur, gevolgd door de toevoeging van 4 ml verse LB-bouillon en herkweek gedurende 1 uur onder dezelfde omstandigheden.
  4. Stel de bacteriële suspensie in op OD600 = 0,1 (OD600 = 0,2 voor co-expressie van twee eiwitten) met infiltratiebuffer (MgCl2, 10 mM; MES, 10 mM, pH 5,6).
  5. Meng verschillende bacteriële suspensies in een verhouding van 1:1 (v/v) om een uiteindelijke concentratie van OD600 = 0,1 te maken. (optioneel).
  6. Incubeer de bacteriële suspensie bij kamertemperatuur gedurende 3 uur met zachte beweging.
  7. Infiltreer het abaxiale oppervlak van de volledig uitgezette bladeren van verschillende planten met een naaldloze wegwerpspuit van 1 ml en markeer het geïnfiltreerde gebied (een donkerdere kleur dan het omringende, niet-geïnfiltreerde weefsel) met een waterdichte pen.
  8. Ga verder met het gedeelte Confocale microscopie van dit protocol (stap 5).
    OPMERKING: Andere stammen van Agrobacterium tumefaciens die geschikt zijn voor de transformatie van interessante plantensoorten kunnen ook worden gebruikt.

4. Aniline blauwe beits

  1. Voeg een aliquot van 200 μl 1% anilineblauw (in 50 mM kaliumfosfaatbuffer, pH 8,0) toe aan een microscoopglaasje20.
  2. Snijd het geïnfiltreerde gebied van ongeveer 0,5 cm × 0,5 cm, weg van de ader, met een mes weg en breng de bladweefselmonsters over in de anilineblauwoplossing (met de abaxiale kant naar boven) op het microscoopglaasje, en zorg ervoor dat de bladweefselmonsters zijn ondergedompeld in de anilineblauwoplossing en bedek deze vervolgens met een dekglas (22 mm x 50 mm).
  3. Plaats de microscoopglaasjes met de monsters in een exsiccator die is bevestigd aan een vacuümpomp en evacueer gedurende 2 minuten (<0.8 Pa), gevolgd door een langzame ontlading van de druk en incubatie in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Visualiseer het fluorescerende signaal van anilineblauw onder een confocale laserscanmicroscoop met compatibele software.
    OPMERKING: Hier is de anilineblauwkleuringsmethode van Huang et al.20 gebruikt. In een wijziging van deze techniek werd hetzelfde experiment uitgevoerd zonder de vacuümstap van 2 minuten, wat vergelijkbare resultaten opleverde en suggereerde dat vacuümdrogen niet essentieel is voor anilinekleuring. Ook kunnen de concentratie van de anilineblauwe vlek en de kleuringstijd variëren afhankelijk van de bron van het bladweefsel, enz.

5. Confocale microscopie

  1. Oogst twee bladeren van twee planten op verschillende tijdstippen na de infiltratie. Snijd de infiltratiezone met een mes in plakjes van ongeveer 0,5 cm × 0,5 cm van de ader.
    1. Plaats de weefselmonsters in een druppel steriel water (met de abaxiale kant naar boven) in het centrale deel van een microscoopglaasje en bedek ze met een afdekglas (22 mm x 50 mm) en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.
  2. Zorg ervoor dat de excitatiegolflengten voor de detectie van CFP-, GFP- en RFP-signalen respectievelijk 405 nm, 488 nm en 561 nm zijn, en dat de emissiefilters voor detectie 410-602 nm waren voor CFP en 400-602 nm voor EGFP en RFP, met het gaatje 1 AU en de Master Gain ingesteld op 769 V.
  3. Visualiseer het fluorescerende signaal van autofluorescerende tags in het geïnfiltreerde gebied met behulp van een confocale laserscanmicroscoop met compatibele software op 1 dag, 2 dagen, 3 dagen, 5 dagen, 7 dagen en 10 dagen na de infiltratie.
    1. Gebruik een 10x objectieflens en GFP-filters om cellen met het fluorescerende signaal te lokaliseren en schakel vervolgens over naar een 40x objectieflens voor visualisatie van subcellulaire lokalisatie en beeldopname.
  4. Verzamel 20 afbeeldingen voor elke aandoening, met behulp van ten minste twee onafhankelijke biologische replicaten.
  5. Score: PD-lokalisatie van het geteste eiwit op basis van het diagnostische puntvormige uiterlijk van het signaal aan de periferie van de cel:21,22.
    OPMERKING: Bij het detecteren van de subcellulaire lokalisatie van een onbekend eiwit wordt het gebruik van ten minste drie planten aanbevolen.

6. Analyse van de gegevens

  1. Gebruik Fiji-software om kanalen te splitsen en voeg de schaalbalk toe aan de afbeeldingen voor visualisatie.
  2. Gebruik Fiji-software om kanalen te splitsen voordat u de gemiddelde grijswaardenwaarde voor elke afbeelding meet om de GFP- (voor MP, PDCB1 en PDLP5) of CFP-fluorescentie-intensiteit (voor anilineblauwkleuring) op verschillende tijdstippen te beoordelen.
  3. Gebruik Fiji-software om kanalen te splitsen voordat de beelden van GFP (voor MP, PDCB1 en PDLP5) of CFP (voor anilineblauwkleuring) worden genormaliseerd. De oppervlakte van het beeld werd gemeten en de PD-puncta werden handmatig geteld. Het aantal PD-puncta per 100 μm2 werd berekend.
  4. Gebruik tweerichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest23 om de P-waarden tussen de verschillende steekproeven en verschillende tijdstippen te bepalen met statistische en grafische software.
    OPMERKING: Voor een eenkanaals fluorescentiebeeld vertegenwoordigt de grijswaardenwaarde van elke pixel de fluorescentie-intensiteit van dat punt24. Hier werd de gemiddelde grijswaardenwaarde gebruikt om de fluorescentie-intensiteit van elk monster op verschillende tijdstippen te beoordelen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om studies van de PD-functie in de plantenfysiologie en interacties met pathogenen te vergemakkelijken, werden drie eenvoudige en betrouwbare referentie-eiwitten ontwikkeld voor PD-lokalisatie. Twee cellulaire PD-eiwitten en een van ziekteverwekkers afgeleid MP-eiwit gecodeerd door het plantaardig tobamovirus TVCV werden geselecteerd. De subcellulaire lokalisatie van deze eiwitten werd gevisualiseerd met behulp van een autofluorescerende reporter EGFP die was gefuseerd met de C-terminus van elk eiwit. In een alternatieve benadering werd PD gevisualiseerd met behulp van anilineblauwkleuring van de PD-geassocieerde callose-afzettingen. De experimenten toonden aan dat zowel PDLP5 als MP punctuele PD-lokalisatie vertoonden, waarbij MP ook gelokaliseerd was in de celkern (Figuur 1A), zoals eerder opgemerkt25. Daarentegen leek PDCB1 zich te verdelen tussen PD en ER (Figuur 1A). Voor onderzoekers die minder ervaring hebben met het interpreteren van de subcellulaire lokalisatie van GFP-gelabelde eiwitten, illustreert figuur 1A ook het karakteristieke nucleocytoplasmische patroon van EGFP dat tot expressie komt in plantencellen. Om het ER-signaal van PDCB1 te bevestigen, hebben we PDCB1 samen met een ER-marker tot expressie gebracht en ontdekten dat het PDCB1-signaal het signaal van de ER-marker overlapte (Figuur 1B). Om de efficiëntie van de PD-lokalisatie van de geteste eiwitten te beoordelen, werd het percentage cellen dat het fluorescerende signaal tot expressie bracht en PD-lokalisatie van dit signaal vertoonde, berekend (Tabel 1).

Voor de identificatie van subcellulaire lokalisatie door gebruik te maken van referentie-eiwitten, is het nuttig om de tijdschaal van de expressie van het referentie-eiwit en mogelijke veranderingen van de lokalisatie ervan te begrijpen. Figuur 2 toont dergelijke kinetiek voor MP, PDLP5 en PDCB1 wanneer PD zelf werd gevisualiseerd door anilineblauwkleuring. Zowel MP als PDLP5 begonnen zich al één dag na infiltratie (dpi) op te hopen bij PD, en deze accumulatie bereikte een schijnbaar maximum bij 2 dpi, en bleef nog 5 dagen stabiel, waarna de signaalintensiteit afnam, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van eiwitafbraak. Het tijdsverloop van de PDCB1 subcellulaire sortering was complexer: voor de eerste 3 dpi vertoonde PDCB1 een vergelijkbaar sterk ER-signaal, dat de PD-specifieke signaallokalisatie bijna volledig verdoezelde, terwijl bij 5 dpi dit laatste signaal meer uitgesproken werd (Figuur 2), zij het in minder cellen. Interessant is dat de opkomst van het duidelijke PD-lokalisatiepatroon van PDCB1 na 5 dpi samenviel met aanzienlijk minder cellen die het EGFP-signaal vertoonden (aanvullende figuur 1). PDLP5 en MP kunnen dus functioneren als PD-referentie-eiwitten met weinig achtergrond in de meeste andere cellulaire compartimenten, met een optimaal visualisatietijdvenster van 2-5 dpi. PDCB1 daarentegen is niet zo geschikt als een PD-marker.

Vervolgens werd geverifieerd dat de PD-markers hun subcellulaire lokalisatiespecificiteit behouden in aanwezigheid van andere PD-eiwitten. Daartoe werd MP-EGFP of PDLP5-EGFP samen tot expressie gebracht met een PD-lokaliserende26 MP van een ander plantenvirus, het tabaksmozaïekvirus (TMV) gelabeld met CFP. Figuur 3 laat zien dat in beide gevallen de co-expressie eiwitten een duidelijk PD-lokalisatiepatroon vertoonden. Evenzo detecteerde PD-specifieke histologische anilineblauwkleuring van de MP-EGFP- of PDLP5-EGFP-expressieve weefsels geen interferentie met de PD-lokalisatie van de EGFP- en anilineblauwsignalen (Figuur 3).

PD-lokalisatiestudies hebben vaak baat bij een meer kwantitatieve schatting van de algehele expressie en het PD-signaal van het referentie-eiwit. Deze kwantificeringsbenadering wordt geïllustreerd in figuur 4 en figuur 5. Voor de kwantificering van de algemene expressie werd de signaalintensiteit van PDLP5 en MP gemeten. Beide eiwitten vertoonden sterke signalen op alle visualisatietijdstippen tijdens de periode van 10 dpi, met een maximale signaalintensiteit van 3 dpi voor PDLP5 en van 2 dpi voor MP (Figuur 4). Er waren geen statistisch significante verschillen in signaalintensiteit tussen PDLP5 en MP op een van de visualisatietijdstippen. De PDCB1-signaalintensiteit vertoonde grotere fluctuaties tussen tijdstippen, waarbij het sterkste signaal werd waargenomen bij 7 dpi (Figuur 4), hoewel het op dit moment moeilijk was om statistisch significante gegevens te verzamelen vanwege de schaarste aan expressieve cellen. De eerste 3 dpi vertegenwoordigen dus de optimale timing voor het detecteren van PDCB1-expressie. Zoals verwacht vertoonden anilineblauwkleuringsmonsters een stabieler signaal dan de tijdelijk tot expressie gebrachte eiwitten (Figuur 4).

De PD-puncta gevormd door PDLP5 en MP werden vervolgens gekwantificeerd. PDLP5 vertoonde een stabiel aantal PD-puncta gedurende de observatieperiode, zonder statistisch significante verschillen tussen twee van de geteste tijdstippen (Figuur 5). Het hoogste aantal PD puncta gevormd door MP werd gedetecteerd bij 2 dpi en ze bleven relatief stabiel tot het einde van de observatieperiode. Vergelijking van het aantal PD puncta tussen PDLP5 en MP bracht geen statistisch significante verschillen aan het licht op de meeste bemonsteringsmomenten (Figuur 5). Het aantal PD puncta gekleurd met anilineblauw bleef ook stabiel, hoewel het licht daalde bij 10 dpi. De nummers van PD puncta versierd met anilineblauw, PDLP5 of MP waren vergelijkbaar met elkaar met statistische significantie (figuur 5), in overeenstemming met de PD-specificiteit van deze markers. Het aantal PD-puncta voor PDCB1 werd niet geanalyseerd omdat het PD-signaal op eerdere tijdstippen werd verduisterd door het ER-signaal en op latere tijdstippen slechts in een relatief klein aantal cellen werd waargenomen (zie figuur 2).

figure-results-1
Figuur 1: Plasmodesmata (PD) lokalisatie van TVCV MP, PDLP5 en PDCB1 transiënt tot expressie gebracht in Nicotiana benthamiana en anilineblauwe kleuring van PD. (A) PD-lokalisatie van MP-EGFP, PDLP5-EGFP en PDCB1-EGFP en anilinekleuring. Het EGFP-signaal is groen, het anilineblauwe signaal is blauw en plastide autofluorescentie is rood. (B) Co-expressie van MP-EGFP, PDLP5-EGFP en PDCB1-EGFP met de endoplasmatisch reticulum (ER) marker gelabeld met mRFP. Beelden werden opgenomen 2 dagen na infiltratie (dpi) en zijn enkelvoudige confocale secties die representatief zijn voor twee onafhankelijke experimenten (N = 20 beelden van 2 planten). Het EGFP-signaal is groen, het mRFP-signaal is paars en plastide autofluorescentie is rood. Gele pijlen geven PDCB1 aan gelokaliseerd op de ER. Schaalbalken = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Tijdsverloop van PD-lokalisatie van TVCV MP, PDLP5 en PDCB1 voorbijgaand tot expressie gebracht in Nicotiana benthamiana en van anilineblauwkleuring van PD. De beelden werden opgenomen met 2 dpi en zijn enkelvoudige confocale secties die representatief zijn voor twee onafhankelijke experimenten (N = 20 beelden van 2 planten voor alle systemen, behalve 7 dpi en 10 dpi voor PDCB1-EGFP, waarin minder cellen het signaal vertoonden). Het EGFP-signaal is groen en het anilineblauwe signaal is blauw. Schaalbalken = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: TVCV MP en PDLP5 behouden hun PD-lokalisatie na co-expressie met een PD-lokaliserende TMV MP en co-kleuring met anilineblauw. De beelden werden opgenomen met 2 dpi en zijn enkele confocale secties die representatief zijn voor N ≥ 10 beelden van 4-6 planten. Het EGFP-signaal is groen, het CFP-signaal en het anilineblauwe signaal zijn blauw en de plastide autofluorescentie is rood. Schaalbalken = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Tijdsverloop van fluorescentie-intensiteit van TVCV MP, PDLP5 en PDCB1 voorbijgaand tot expressie gebracht in Nicotiana benthamiana en anilineblauwe PD-kleuring. Kwantitatieve gegevens werden verzameld uit de experimenten die worden beschreven in figuur 2. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van het gemiddelde van meerdere experimenten. De afzonderlijke gegevenspunten worden aangegeven als het gemiddelde voor elke meting. Verschillen tussen gemiddelde waarden beoordeeld door tweerichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest zijn statistisch significant voor de P-waarden. *P < 0,05, **P < 0,01 en ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, niet statistisch significant. Blauwe balken, anilinekleuring; lichtgroene balken, MP-EGFP, donkergroene balken, PDLP5-EGFP; gele balken, PDCB1-EGFP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Tijdsverloop van PD puncta-vorming door TVCV MP en PDLP5 transiënt uitgedrukt in Nicotiana benthamiana en door anilineblauwkleuring van PD. Kwantitatieve gegevens werden verzameld uit de experimenten die worden beschreven in figuur 2. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van het gemiddelde van meerdere experimenten. De afzonderlijke gegevenspunten worden aangegeven als het gemiddelde voor elke meting. Verschillen tussen gemiddelde waarden beoordeeld door tweerichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest zijn statistisch significant voor de P-waarden. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Blauwe balken, anilinekleuring; lichtgroene balken, MP-EGFP, donkergroene balken, PDLP5-EGFP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Proef I
Totaal aantal cellenCellen met PD-lokalisatieCellen met gemengd signaalCellen met PD-lokalisatie (%)
Aniline blauw40404100
MP-EGFP40404100
PDCB1-EGFP403387.5
PDLP5-EGFP40400100
Proef II
Totaal aantal cellenCellen met PD-lokalisatieCellen met gemengd signaalCellen met PD-lokalisatie (%)
Aniline blauw40408100
MP-EGFP4039897.5
PDCB1-EGFP40123130
PDLP5-EGFP4039297.5

Tabel 1: Efficiëntie van PD-lokalisatie.

Aanvullende figuur 1: PD-lokalisatie van TVCV MP, PDLP5 en PDCB1 transiënt tot expressie gebracht in Nicotiana benthamiana. Beelden werden opgenomen met 5 dpi (A), 7 dpi (B) en 10 dpi (C). Het EGFP-signaal is groen en de plastide autofluorescentie is rood. Schaal balken = 20 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elk celbiologisch onderzoek van de intercellulaire communicatie van planten en het transport van cel naar cel tijdens de normale ontwikkeling en morfogenese van planten, evenals tijdens interacties tussen plant en ziekteverwekkers, vereist de detectie en monitoring van de sortering van eiwitten - zowel endogene als pathogeengecodeerde - naar intercellulaire verbindingen van planten, de plasmodesmata (PD). Deze experimenten zouden aanzienlijk worden vergemakkelijkt door het gebruik van referentie-eiwitten, of ze nu endogeen zijn of afkomstig van ziekteverwekkers, die getrouw en consistent lokaliseren naar PD, deze structuren versieren en visualiseren. Aan deze behoefte wordt hier voldaan door drie bekende PD-lokaliserende eiwitten te selecteren: Arabidopsis PDLP5 en PDCB1, en MP van de tobamovirale ziekteverwekker TVCV. Deze eiwitten werden op hun C-termini gelabeld met de autofluorescerende reporter EGFP, en het vermogen van de resulterende fusie-eiwitten om te sorteren naar PD werd bepaald aan de hand van hun voorbijgaande expressie in bladeren van Nicotiana benthamiana en confocale microscopieanalyses van de tot expressie gebrachte weefsels. Voor algemene visualisatie van PD in deze weefsels werd de standaard anilineblauwkleuringsmethode gebruikt.

Aangenomen wordt dat plantenvirale MP's in twee hoofdgroepen vallen met betrekking tot hun effecten op de PD-structuur en -integriteit: MP's die de PD-permeabiliteit omkeerbaar en zonder enige structurele veranderingen in PD verhogen en MP's die PD afschermen door hun structuur te wijzigen. MP's van tobamovirussen, zoals TVCV, behoren tot de eerste groep MP-groep, waardoor ze worden gepositioneerd als aantrekkelijke markers van PD voor subcellulaire lokalisatiestudies27,28.

Deze experimenten positioneerden PDLP5-EGFP en MP-EGFP als betrouwbare en reproduceerbare biologische markers van PD, met een efficiëntie van PD-detectie die vergelijkbaar is met die van de anilineblauwe kleurstof. De PD-lokalisatie van PDLP5-EGFP en MP-EGFP werd gedetecteerd gedurende de gehele observatieperiode van 10 dpi, met de optimale tijd voor het waarnemen van het karakteristieke PD-lokalisatiepatroon tussen 2 dpi en 3 dpi. Hoewel expressie van de 35S-promotor kan resulteren in post-transcriptionele uitschakeling van het tot expressie gebrachte gen, gebeurt dit vaak na langdurige expressie in stabiel getransformeerde transgene planten. Aan de andere kant is het gebruik van deze sterke constitutieve promotor belangrijk voor de gemakkelijke detectie van het markereiwit. Als de expressie van het referentie-eiwit na 7-10 dpi afneemt, moeten kortere perioden, d.w.z. 2-3 dpi, worden gebruikt. Significante verschillen in het algehele subcellulaire lokalisatiepatroon tussen PDLP5 en MP werden hier niet gedetecteerd, behalve dat MP zich naast PD ook in de celkern ophoopte. Omgekeerd wordt PDCB1 niet aanbevolen voor gebruik als PD-marker op zich vanwege de complexiteit van het subcellulaire lokalisatiepatroon, dat substantiële lokalisatie naar het ER omvat.

Het gemak waarmee het EGFP-fluorescentiesignaal werd gedetecteerd, hing ook af van het groeistadium van de plant; met name in N. benthamiana werd de laagste accumulatie van EGFP-signalen opgemerkt in het bloeiwijzestadium18.

Deze studie was gericht op het ontwikkelen van de PD-lokalisatiemarkers die maximaal exclusief zijn voor andere subcellulaire compartimenten. Het gebruik ervan als referentie voor de lokalisatie van eiwitten van belang met aanvullende subcellulaire lokalisatiemogelijkheden moet dus worden gecombineerd met de expressie van andere subcellulaire markers, zoals die specifiek zijn voor het ER, mitochondriën, plasmamembraan, enz. In dit geval moet bij de berekening van de uiteindelijke concentratie van agro-infiltratieculturen, d.w.z. OD600 van de vloeibare culturen, rekening worden gehouden met de opname van extra Agrobacterium-cellen voor de expressie van deze markers. Het spreekt voor zich dat de celconcentratie en de groeitijden van de plant moeten worden aangepast voor maximale expressie en detectie van PD-lokalisatiepatronen in andere plantensoorten.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk in het VC-laboratorium werd ondersteund door subsidies van NIH (R35GM144059), NSF (MCB 1913165 en IOS 1758046) en BARD (IS-5276-20) aan VC. De financiers hadden geen rol in het onderzoeksontwerp, de gegevensverzameling en -interpretatie, of de beslissing om te publiceren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ABT AC 1 phase motorBRANDTECH ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.GraphPad Software Inc.
Image JNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscopeZeissLSM 900
Nicotiana benthamianaPlant species
pDONR207Invitrogen#12213013
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNEB#M0491S

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, J., et al. A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis. The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).
  2. Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection. Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).
  3. Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. Plasmodesmata: Channels under pressure. Annu Rev Plant Biol. 75, 21(2024).
  4. Maule, A. J. Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis. Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  5. Fernandez-Calvino, L., et al. Arabidopsis plasmodesmal proteome. PLoS One. 6 (4), e18880(2011).
  6. Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species. BMC Biol. 20, 128(2022).
  7. Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis. The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).
  8. Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
  9. Aung, K., et al. Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues. The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).
  10. Cui, W., Lee, J. Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress. Nat Plants. 2 (5), 160(2016).
  11. Liu, N. J., et al. Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis. Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).
  12. Caillaud, M. C., et al. The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition. PLoS Pathog. 10 (11), e1004496(2014).
  13. Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. The Plant Cell. , (2024).
  14. Chen, X., et al. Arabidopsis PDLP7 modulated plasmodesmata function is related to BG10-dependent glucosidase activity required for callose degradation. Sci Bull. , (2024).
  15. Simpson, C., Thomas, C., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. The Plant Cell. 21 (2), 581-594 (2009).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLoS Biol. 6 (1), e7(2008).
  17. Lim, G., et al. Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants. Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).
  18. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).
  19. Walhout, A. J. M., et al. GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  20. Huang, C., et al. dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins. The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).
  21. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  22. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA. mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).
  23. Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice. Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).
  24. Erkkilä, M. T., et al. Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study. J Biophotonics. 12 (6), e201800378(2019).
  25. Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection. J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).
  26. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein. mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).
  27. Kumar, G., Dasgupta, I. Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far. Microorganisms. 9 (4), 695(2021).
  28. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Confocal MicroscopyProtein LocalizationPlasmodesmata AnalysisNicotiana BenthamianaCell To Cell MovementAniline Blue StainingAgrobacterium InfiltrationPlasmodesmata TargetingEndoplasmic Reticulum LocalizationViral Movement Protein

Gerelateerde artikelen