Dit protocol beschrijft de selectie van optimale plasmodesmale markers voor confocale microscopie-gebaseerde analyses van eiwit gericht op plasmodesmata tijdens virus-plasmodesmata interacties of plasmodesmaal transport.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Confocale microscopieanalyse van eiwitsortering naar plasmodesmata in Nicotiana benthamiana
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Plasmodesmata zijn vliezige nanoporiën die het cytoplasma van aangrenzende plantencellen verbinden en de cel-naar-cel handel van voedingsstoffen, macromoleculen en binnendringende virussen mogelijk maken. Plasmodesmata spelen een fundamentele rol bij de regulatie van intercellulaire communicatie en dragen bij aan de ontwikkeling van planten, omgevingsreacties en interacties met virale pathogenen. Het ontdekken van plasmodesmale lokalisatie van plantaardige of virale eiwitten kan nuttige functionele informatie over het eiwit opleveren en is belangrijk voor het begrijpen van de mechanismen van plant-virusinteracties. Om deze studies te vergemakkelijken, beschrijven we een protocol voor confocale microscopie-gebaseerde analyse van verschillende plasmodesmale targeting-eiwitten om de beste plasmodesmale marker te selecteren voor het bestuderen van de virus-plasmodesmata-interacties of plasmodemaal transport. Concreet worden de analyses van deze gebeurtenissen geïllustreerd aan de hand van het cel-tot-cel bewegingseiwit (MP) van het Turnip vein-clearing virus (TVCV), het Arabidopsis Plasmodesmata-Localized Protein 5 (PDLP5) en Plasmodesmata Callose-Binding Protein 1 (PDCB1). De plasmodesmale lokalisatiegegevens van het eiwit worden parallel geanalyseerd met de globale visualisatie van plasmodesmata met behulp van anilineblauwkleuring van de bemonsterde weefsels. Deze benaderingen kunnen gemakkelijk worden aangepast om de plasmodesmale lokalisatie van cellulaire of pathogene eiwitten in planta te analyseren.
Inleiding
Plasmodesmata (PD) spelen een fundamentele rol bij het beheersen van de ontwikkeling van planten, omgevingsreacties en interacties met virale pathogenen door de regulatie van intercellulaire communicatie 1,2. PD wordt aanvankelijk gevormd tijdens cytokinese, waarbij honderden PD's tussen de twee dochtercellen in de nieuwe cel worden ingebracht, waardoor de kanalen voor cel-tot-celcommunicatie worden geleverd 3,4. PD is een membraanrijke structuur, die het van endoplasmatisch reticulum (ER) afgeleide membraan, een trans-PD-desmotubule, bevat in het centrale deel van de poriën die worden bekleed door het plasmamembraan 3,4. Vergelijkende proteomische benaderingen identificeerden talrijke PD-functionele eiwitten, waaronder β-1,3-glucanasen (BG's), callosesynthasen (CALS's), plasmodesmata-gelokaliseerde eiwitten (PDLP's), callose-bindende eiwitten (PDCB's), multi C2-domeinen transmembraanregio-eiwitten (MCTP's)3 en leucine-rijke repeatreceptor-achtige kinasen (RLK)5. Onlangs ontwikkelden Kirk et al. een tool genaamd plasmodesmata in silico proteome 1 (PIP1), die het mogelijk maakte om nieuwe PD-eiwitten te voorspellen in 22 plantensoorten6. PD varieert in permeabiliteit en structuur tijdens de ontwikkeling van de plant en reactie op verschillende stressfactoren. Callose (β-1,3-glucaan) afzetting en hydrolyse in het nekgebied rond de PD is een van de algemeen bekende mechanismen van PD-regulatie7.
Veel pathogene microben, waaronder schimmels, bacteriën en virussen, kunnen de PD-dilatatie of -structuur manipuleren tijdens hun infectie 2,8,9. Magnaporthe oryzae, de veroorzaker van rijstontploffing, zet intracellulaire invasieve hyfen in om van cel naar cel te gaan via PD8. Een bacteriële ziekteverwekker Pseudomonas syringae pv. tomaat heeft een effectoreiwit HopO1-1 nodig voor intercellulaire beweging en verspreiding in de waardplant door interactie met en destabilisatie van PDLP7, waardoor de moleculaire flux in naburige cellen in Arabidopsis9 toeneemt. Plantenvirussen zijn echter veelzijdiger in het reguleren van PD tijdens hun intercellulaire overdracht, waarbij het virale bewegingseiwit (MP) de beweging van cel naar cel bevordert. Vanwege hun belangrijke functie bij het reguleren van de ontwikkeling en groei van planten, evenals hun interactie met plantpathogene microben, heeft PD de laatste jaren steeds meer aandacht gekregen. Bij Arabidopsis thaliana zijn er twee belangrijke typen functionele PD-eiwitten, PDLP's (1-8) en PDCB's (1-5), en veel van hen, bijvoorbeeld PDLP5 1,10,11, PDLP112, PDLP613, PDLP714 en PDCB115, bleken een rol te spelen bij het manipuleren van de PD-permeabiliteit door regulatie van callose-afzetting. Sommige PDLP's bleken echter een functionele redundantie te hebben, bijv. knock-outmutanten van pdlp1 en pdlp1,2 hadden geen invloed op de moleculaire handel, hoewel dubbele knock-outmutanten van pdlp1,3 en pdlp2,3 een verhoogde plasmodesmale permeabiliteit vertoonden16. Interessant is dat downregulatie/knock-out of overexpressie van PDLP5 alleen resulteert in een toename of afname van de plasmodesmale permeabiliteit, respectievelijk 1,17. Onlangs hebben Li et al. ontdekt dat PDLP5 en PDLP6 functioneren op verschillende celinterfaces13. Deze resultaten geven aan dat PDLP5 mogelijk niet-redundante functies heeft met andere PDLP's.
Vanwege de cruciale functie van PD in intercellulaire communicatie, hebben we een protocol ontwikkeld voor het inzetten van de plantaardige PD-eiwitten PDLP5 en PDCB1 en het virale cel-tot-cel bewegingseiwit (MP) van het raapader-opruimingsvirus (TVCV) als eenvoudige, handige en betrouwbare PD-markers voor celbiologische experimenten. Voor verdere verificatie werd de visualisatie van PD met behulp van anilineblauwkleuring van de bemonsterde weefsels parallel uitgevoerd. De protocollen die zijn beschreven voor PD-lokalisatie van PDLP5, PDCB1 en TVCV MP kunnen gemakkelijk worden aangepast om potentiële PD-lokalisatie van cellulaire of van ziekteverwekkers afgeleide eiwitten in levende planten te analyseren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Plantengroei
- Kweek Nicotiana benthamiana zaden in natte grond in een gecontroleerde omgeving kamer bij 23 °C onder 16 uur licht en 8 uur donker.
- Breng na ongeveer 2 weken de zaailingen met de turfkorrels rond hun wortels voorzichtig over naar grotere potten en groei verder onder dezelfde omstandigheden gedurende 4-5 weken voor de agro-infiltratie-experimenten.
OPMERKING: Gebruik de planten niet wanneer ze beginnen te bloeien, aangezien de ophoping van GFP zal afnemen in het bloeiwijzestadium18.
2. Vector constructie
- Gebruik PCR om de coderende sequenties van belang te amplificeren met Q5 High-Fidelity DNA Polymerase en kloon ze in de ingangsvector pDONR207 door de BP-reactie19 met behulp van een in de handel verkrijgbare BP Clonase-kit.
- Breng de doelgenen in de resulterende ingangsplasmiden over naar de bestemmingsvector pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1 door de LR-reactie19 met behulp van een in de handel verkrijgbare LR Clonase-kit om plasmiden te produceren met de EGFP-tag gefuseerd met de C-terminus van de doeleiwitten.
- Verifieer alle constructen door PCR en sequencing19.
3. Agro-infiltratie
- Streep Agrobacterium tumefaciens EHA105-cellen met verschillende vectoren op LB-agarplaten en gedurende 2 dagen geïncubeerd onder 28 °C.
- Breng een enkele kolonie over in 2 ml LB-bouillon en incubeer een nacht bij 28 °C met agitatie (250 rpm).
- Verwijder 1 ml uit de nachtelijke cultuur, gevolgd door de toevoeging van 4 ml verse LB-bouillon en herkweek gedurende 1 uur onder dezelfde omstandigheden.
- Stel de bacteriële suspensie in op OD600 = 0,1 (OD600 = 0,2 voor co-expressie van twee eiwitten) met infiltratiebuffer (MgCl2, 10 mM; MES, 10 mM, pH 5,6).
- Meng verschillende bacteriële suspensies in een verhouding van 1:1 (v/v) om een uiteindelijke concentratie van OD600 = 0,1 te maken. (optioneel).
- Incubeer de bacteriële suspensie bij kamertemperatuur gedurende 3 uur met zachte beweging.
- Infiltreer het abaxiale oppervlak van de volledig uitgezette bladeren van verschillende planten met een naaldloze wegwerpspuit van 1 ml en markeer het geïnfiltreerde gebied (een donkerdere kleur dan het omringende, niet-geïnfiltreerde weefsel) met een waterdichte pen.
- Ga verder met het gedeelte Confocale microscopie van dit protocol (stap 5).
OPMERKING: Andere stammen van Agrobacterium tumefaciens die geschikt zijn voor de transformatie van interessante plantensoorten kunnen ook worden gebruikt.
4. Aniline blauwe beits
- Voeg een aliquot van 200 μl 1% anilineblauw (in 50 mM kaliumfosfaatbuffer, pH 8,0) toe aan een microscoopglaasje20.
- Snijd het geïnfiltreerde gebied van ongeveer 0,5 cm × 0,5 cm, weg van de ader, met een mes weg en breng de bladweefselmonsters over in de anilineblauwoplossing (met de abaxiale kant naar boven) op het microscoopglaasje, en zorg ervoor dat de bladweefselmonsters zijn ondergedompeld in de anilineblauwoplossing en bedek deze vervolgens met een dekglas (22 mm x 50 mm).
- Plaats de microscoopglaasjes met de monsters in een exsiccator die is bevestigd aan een vacuümpomp en evacueer gedurende 2 minuten (<0.8 Pa), gevolgd door een langzame ontlading van de druk en incubatie in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Visualiseer het fluorescerende signaal van anilineblauw onder een confocale laserscanmicroscoop met compatibele software.
OPMERKING: Hier is de anilineblauwkleuringsmethode van Huang et al.20 gebruikt. In een wijziging van deze techniek werd hetzelfde experiment uitgevoerd zonder de vacuümstap van 2 minuten, wat vergelijkbare resultaten opleverde en suggereerde dat vacuümdrogen niet essentieel is voor anilinekleuring. Ook kunnen de concentratie van de anilineblauwe vlek en de kleuringstijd variëren afhankelijk van de bron van het bladweefsel, enz.
5. Confocale microscopie
- Oogst twee bladeren van twee planten op verschillende tijdstippen na de infiltratie. Snijd de infiltratiezone met een mes in plakjes van ongeveer 0,5 cm × 0,5 cm van de ader.
- Plaats de weefselmonsters in een druppel steriel water (met de abaxiale kant naar boven) in het centrale deel van een microscoopglaasje en bedek ze met een afdekglas (22 mm x 50 mm) en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.
- Zorg ervoor dat de excitatiegolflengten voor de detectie van CFP-, GFP- en RFP-signalen respectievelijk 405 nm, 488 nm en 561 nm zijn, en dat de emissiefilters voor detectie 410-602 nm waren voor CFP en 400-602 nm voor EGFP en RFP, met het gaatje 1 AU en de Master Gain ingesteld op 769 V.
- Visualiseer het fluorescerende signaal van autofluorescerende tags in het geïnfiltreerde gebied met behulp van een confocale laserscanmicroscoop met compatibele software op 1 dag, 2 dagen, 3 dagen, 5 dagen, 7 dagen en 10 dagen na de infiltratie.
- Gebruik een 10x objectieflens en GFP-filters om cellen met het fluorescerende signaal te lokaliseren en schakel vervolgens over naar een 40x objectieflens voor visualisatie van subcellulaire lokalisatie en beeldopname.
- Verzamel 20 afbeeldingen voor elke aandoening, met behulp van ten minste twee onafhankelijke biologische replicaten.
- Score: PD-lokalisatie van het geteste eiwit op basis van het diagnostische puntvormige uiterlijk van het signaal aan de periferie van de cel:21,22.
OPMERKING: Bij het detecteren van de subcellulaire lokalisatie van een onbekend eiwit wordt het gebruik van ten minste drie planten aanbevolen.
6. Analyse van de gegevens
- Gebruik Fiji-software om kanalen te splitsen en voeg de schaalbalk toe aan de afbeeldingen voor visualisatie.
- Gebruik Fiji-software om kanalen te splitsen voordat u de gemiddelde grijswaardenwaarde voor elke afbeelding meet om de GFP- (voor MP, PDCB1 en PDLP5) of CFP-fluorescentie-intensiteit (voor anilineblauwkleuring) op verschillende tijdstippen te beoordelen.
- Gebruik Fiji-software om kanalen te splitsen voordat de beelden van GFP (voor MP, PDCB1 en PDLP5) of CFP (voor anilineblauwkleuring) worden genormaliseerd. De oppervlakte van het beeld werd gemeten en de PD-puncta werden handmatig geteld. Het aantal PD-puncta per 100 μm2 werd berekend.
- Gebruik tweerichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest23 om de P-waarden tussen de verschillende steekproeven en verschillende tijdstippen te bepalen met statistische en grafische software.
OPMERKING: Voor een eenkanaals fluorescentiebeeld vertegenwoordigt de grijswaardenwaarde van elke pixel de fluorescentie-intensiteit van dat punt24. Hier werd de gemiddelde grijswaardenwaarde gebruikt om de fluorescentie-intensiteit van elk monster op verschillende tijdstippen te beoordelen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om studies van de PD-functie in de plantenfysiologie en interacties met pathogenen te vergemakkelijken, werden drie eenvoudige en betrouwbare referentie-eiwitten ontwikkeld voor PD-lokalisatie. Twee cellulaire PD-eiwitten en een van ziekteverwekkers afgeleid MP-eiwit gecodeerd door het plantaardig tobamovirus TVCV werden geselecteerd. De subcellulaire lokalisatie van deze eiwitten werd gevisualiseerd met behulp van een autofluorescerende reporter EGFP die was gefuseerd met de C-terminus ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Elk celbiologisch onderzoek van de intercellulaire communicatie van planten en het transport van cel naar cel tijdens de normale ontwikkeling en morfogenese van planten, evenals tijdens interacties tussen plant en ziekteverwekkers, vereist de detectie en monitoring van de sortering van eiwitten - zowel endogene als pathogeengecodeerde - naar intercellulaire verbindingen van planten, de plasmodesmata (PD). Deze experimenten zouden aanzienlijk worden vergemakkelijkt door het gebruik van re...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.
Dankbetuigingen
Het werk in het VC-laboratorium werd ondersteund door subsidies van NIH (R35GM144059), NSF (MCB 1913165 en IOS 1758046) en BARD (IS-5276-20) aan VC. De financiers hadden geen rol in het onderzoeksontwerp, de gegevensverzameling en -interpretatie, of de beslissing om te publiceren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| ABT AC 1 phase motor | BRANDTECH | ABF63/4C-7RQ | |
| Agrobacterium tumefaciens EHA105 | |||
| Contamination control | CCI | ||
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | #11789020 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | #11791020 | |
| GraphPad Prism 8.0.1. | GraphPad Software Inc. | ||
| Image J | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | ||
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 900 | |
| Nicotiana benthamiana | Plant species | ||
| pDONR207 | Invitrogen | #12213013 | |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | #M0491S |
Referenties
- Lee, J., et al. A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis. The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).
- Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection. Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).
- Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. Plasmodesmata: Channels under pressure. Annu Rev Plant Biol. 75, 21(2024).
- Maule, A. J. Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis. Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
- Fernandez-Calvino, L., et al. Arabidopsis plasmodesmal proteome. PLoS One. 6 (4), e18880(2011).
- Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species. BMC Biol. 20, 128(2022).
- Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis. The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Aung, K., et al. Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues. The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).
- Cui, W., Lee, J. Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress. Nat Plants. 2 (5), 160(2016).
- Liu, N. J., et al. Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis. Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).
- Caillaud, M. C., et al. The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition. PLoS Pathog. 10 (11), e1004496(2014).
- Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. The Plant Cell. , (2024).
- Chen, X., et al. Arabidopsis PDLP7 modulated plasmodesmata function is related to BG10-dependent glucosidase activity required for callose degradation. Sci Bull. , (2024).
- Simpson, C., Thomas, C., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. The Plant Cell. 21 (2), 581-594 (2009).
- Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLoS Biol. 6 (1), e7(2008).
- Lim, G., et al. Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants. Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).
- Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).
- Walhout, A. J. M., et al. GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
- Huang, C., et al. dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins. The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).
- Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
- Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA. mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).
- Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice. Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).
- Erkkilä, M. T., et al. Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study. J Biophotonics. 12 (6), e201800378(2019).
- Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection. J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).
- Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein. mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).
- Kumar, G., Dasgupta, I. Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far. Microorganisms. 9 (4), 695(2021).
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
