Methodenartikel

In vitro Modellering van neurogenese van het syndroom van Down met behulp van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

DOI:

10.3791/67382

⸱

7 maart 2025

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Neurobiology Lab, National Centre for Cell Science, S.P. Pune University Complex, 2Regional Centre for Biotechnology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst een methodologie voor het recapituleren van door het syndroom van Down (DS) verminderde neurogenese met behulp van DS menselijke iPSC's. Het protocol identificeerde bifasisch celcyclusdefect als de oorzaak van verminderde neurogenese bij het syndroom van Down. Het biedt een robuust platform voor het begrijpen van cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de abnormale neurogenese geassocieerd met DS.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het syndroom van Down (DS), veroorzaakt door een extra kopie van chromosoom 21, is een belangrijke oorzaak van een verstandelijke beperking. Een van de belangrijkste factoren die bijdragen aan deze verstandelijke beperking is een verminderde neurogenese die wordt waargenomen vanaf de foetale stadia. Om deze neurologische ontwikkelingsafwijkingen te bestuderen, bieden door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) die worden gegenereerd met cellen verkregen van DS-patiënten een waardevol en relevant model. Hier wordt een uitgebreid protocol beschreven voor het recapituleren van DS-geïmpliceerde neurogenese waargenomen tijdens DS-foetale stadia. Dit protocol maakt gebruik van een paar DS-hiPSC's met drie kopieën van chromosoom 21 en de isogene euploïde hiPSC's met twee kopieën van chromosoom 21. Belangrijk is dat het hier beschreven protocol DS-gestoorde neurogenese recapituleert en ontdekte dat bifasisch celcyclusdefect, d.w.z. verminderde proliferatie van DS neurale voorlopercellen (NPC) tijdens de vroege fase van de neurogene fase gevolgd door verhoogde proliferatie van DS NPC tijdens de late fase van de neurogene fase, de oorzaak is van DS-verminderde neurogenese. Verhoogde proliferatie van DS NPC tijdens de late fase van de neurogene fase leidt tot vertraagde beëindiging van de celcyclus, waardoor verminderde aanmaak van post-mitotische neuronen uit DS NPC's ontstaat. Dit protocol omvat gedetailleerde stappen voor het onderhoud van hiPSC's, hun differentiatie in neurale lijnen die bifasisch celcyclusdefect vertonen tijdens de neurogene fase, en de daaropvolgende validatie van verminderde neurale differentiatie in DS-cellen. Door deze methodologie te volgen, kunnen onderzoekers een robuust experimenteel systeem creëren dat de neurologische ontwikkelingsstoornissen van DS nabootst, waardoor ze de specifieke veranderingen in de hersenontwikkeling veroorzaakt door trisomie 21 kunnen onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het syndroom van Down (DS), of trisomie 21, is de meest voorkomende chromosomale afwijking en de belangrijkste oorzaak van verstandelijke beperking (ID)1. Verminderde neurogenese tijdens de ontwikkeling van de DS-foetus is een van de oorzaken van een verstandelijke beperking bij DS2. Foetale studies bij menselijke DS tonen een vermindering van het gewicht en volume van de hersenen, verminderde neuronen, verhoogde astrocyten 3,4 en abnormale verdeling van neuronen in lagen II en IV 5,6. Bovendien is de tweede fase van de corticale ontwikkeling, d.w.z. het ontstaan van laminering, zowel vertraagd als ongeorganiseerd in DS7.

Neurologische ontwikkelingsdefecten bij DS zijn meestal bestudeerd met behulp van muizenmodellen van DS zoals Ts65Dn, Ts1Rhr en Ts1cje8. Deze muizenmodellen waren echter niet in staat om verschillende fenotypes die in DS-onderzoeken werden waargenomen volledig samen te vatten vanwege fysiologische en ontwikkelingsverschillen tussen muizen en mensen9, wat leidde tot mislukte klinische proeven10. De uitvinding van geïnduceerde pluripotente stamcellen11,12 bood de mogelijkheid om neurologische stoornissen van het syndroom van Down te modelleren met behulp van cellen die rechtstreeks afkomstig zijn van personen met DS. Eerdere pogingen om DS-neurologische ontwikkelingsdefecten te modelleren met behulp van menselijke iPSC's stuitten echter op inconsistente resultaten en konden neurologische ontwikkelingsdefecten die werden waargenomen in DS-foetale hersensecties niet volledig verklaren 13,14,15,16. Bijvoorbeeld, een rapport gepubliceerd door Shi et al. vond DS-gerelateerde fenotypes van Alzheimer, maar rapporteerde geen verschil in DS-neurogenese in vergelijking met euploïde controles15. Evenzo rapporteerden Weick et al. verminderde synaptische activiteit maar normale neurogenese bij DS in vergelijking met euploïde controles16. De normale neurogenese bij DS die in deze publicaties werd gerapporteerd, was echter niet consistent met observatie van DS foetale hersensecties. Later rapporteerde een rapport van Hibaoui et al. verminderde neurogenese bij DS, wat consistent was met de observatie van de DS foetale hersensectie14. Dit rapport en een ander recent rapport beschreven echter de verminderde proliferatie van DS NPC's als de oorzaak van verminderde neurogenese in DS 14,17. Alleen verminderde proliferatie van DS NPC's kon echter geen verklaring bieden voor de toename van astrogliale cellen en het vertraagde ontstaan van laminatie tijdens de ontwikkeling van de DS-foetale hersenen.

In recent gepubliceerd werk werd een humaan iPSC-gebaseerd DS-gehandicapt neurogenesemodel ontwikkeld dat verminderde neurogenese aantoont. Dit model toonde aan dat verminderde neurogenese bij DS te wijten is aan bifasische celcyclusdefecten tijdens de neurogene fase (de fase waarin neurale voorlopercellen worden gegenereerd uit pluripotente stamcellen). Tijdens de eerste fase in de neurogene fase vertonen DS NPC's een verminderde proliferatie in vergelijking met isogene euploïde neurale cellen, gevolgd door een verhoogde proliferatie van DS NPC's in vergelijking met isogene euploïde cellen in de late fase van het neurogene stadium18.

In dit manuscript is een stapsgewijs gedetailleerd protocol beschreven voor de differentiatie van hiPSC's met het syndroom van Down en zijn isogene euploïde hiPSC's in corticale neuronen. Het algemene doel van deze methode is om een gedetailleerd, stapsgewijs protocol te bieden voor het differentiëren van een paar DS hiPSC's en zijn isogene euploïde hiPSC's in corticale neuronen met een focus op het modelleren van de neurogenesedefecten geassocieerd met DS. Dit protocol is ontworpen om een robuust en reproduceerbaar systeem te bieden voor het onderzoeken van de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan afwijkingen die DS-verminderde neurogenese veroorzaken.

De grondgedachte achter de ontwikkeling van dit protocol is om de differentiatie van pluripotente stamcellen in corticale neuronen mogelijk te maken door gebruik te maken van principes van ontwikkelingsneurobiologie, waardoor de identificatie van fenotypes die ontstaan als gevolg van ziekte/stoornis mogelijk wordt. Het was gericht op een minimalistische benadering van neurale differentiatie van iPSC's door verbindingen zoals cAMP of DAPT te vermijden, die ziektefenotypes kunnen maskeren die ontstaan als gevolg van defecten in respectievelijk het Ca++ -kanaal of de NOTCH-route. Evenzo werd het gebruik van ascorbinezuur, BDNF en GDNF ook vermeden, wat andere neurologische ziektegerelateerde fenotypes kan maskeren door neurogenese te versterken.

De voordelen van deze techniek ten opzichte van alternatieve methoden liggen in het bieden van een robuuste recapitulatie van neurologische fenotypes die worden waargenomen in DS foetale hersensecties. Merk op dat het op menselijke iPSC gebaseerde systeem, in vergelijking met muismodellen, verschillen tussen soorten elimineert, wat een relevanter model biedt voor het bestuderen van mensspecifieke neurologische ontwikkelingsprocessen9 , maar tot nu toe is het er niet in geslaagd om DS-gestoorde neurogenese te recapituleren die wordt waargenomen in DS-foetale stadia. Verder vermindert het gebruik van isogene paren van hiPSC's de variabiliteit en verbetert het de betrouwbaarheid van waargenomen fenotypische verschillen. Dit protocol zal van bijzonder belang zijn voor onderzoekers die neurologische ontwikkelingsstoornissen en menselijke neurogenese bestuderen. Het is vooral relevant voor diegenen die mensspecifieke aspecten van DS willen modelleren of voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het ontwikkelen van therapeutische interventies gericht op de neurogenesedefecten die verband houden met trisomie 21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het volgende protocol werd gevolgd met twee paren van het syndroom van Down en de isogene euploïde menselijke iPSC's. Eén paar werd gegenereerd met behulp van de retrovirale gemedieerde toedieningsmethode van herprogrammering19, en een tweede paar (NSi003-A en NSi003-B) werd gegenereerd met behulp van de niet-integrerende Sendai-virustoedieningsmethode20. Het protocol bestaat in grote lijnen uit twee fasen: de neurogene fase (fase 1) en de neurale differentiatiefase (fase 2). Verder worden in de neurogene fase twee fasen waargenomen op basis van de verschillen in de proliferatie van het syndroom van Down en isogene euploïde cellijnen, d.w.z. de vroege en late fase. De details van de reagentia, media en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. HiPSC's met het syndroom van Down en isogene euploïde hiPSC's kweken en onderhouden

  1. Feeder plating voor hiPSC's
    OPMERKING: De kwaliteit en dichtheid van de feeder zijn uiterst belangrijk voor een goede kwaliteit van de menselijke iPSC-cultuur.
    1. Voeg 2 ml 0,1% gelatine toe om een plaat met 6 putjes gedurende ten minste 1-2 uur bij 37 °C te bedekken voordat u deze bezaait met feedercellen.
    2. Bewaar de met gelatine beklede plaat ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur in de celkweekkap voordat u de cellen plateert.
    3. Warme embryonale fibroblast (MEF) media van muizen die moeten worden gebruikt voor heropleving in een kralenbad/waterbad.
    4. Doseer 5 ml MEF-media in een centrifugebuis van 15 ml.
    5. Haal een flesje toevoercellen uit de tank met vloeibare stikstof (LN2-tank).
      OPMERKING: Feedercellen werden verkregen door E13.5 embryonale fibroblasten van muizen te behandelen met 10 μg/ml Mitomycine C gedurende 3 uur, gevolgd door 2-3 keer wassen met DPBS18. Feedercellen kunnen direct worden gebruikt of worden ingevroren in een LN2-tank voor toekomstig gebruik. Alle muizen werden gebruikt na goedkeuring door de Institutional Animal Ethics Committee.
    6. Houd de injectieflacon in het waterbad met behulp van een drijvend rek op 37 °C totdat er een klein stukje ijs overblijft.
    7. Neem de injectieflacon in de bioveiligheidskast en steriliseer deze met alcohol voordat u deze in de bioveiligheidskast plaatst.
    8. Voeg druppel voor druppel 1 ml warme MEF-media toe (zie materiaaltabel).
    9. Haal de media voorzichtig uit de injectieflacon en giet druppel voor druppel in een centrifugebuis van 15 ml met MEF-media.
    10. Centrifugeer 5 minuten bij kamertemperatuur bij 200 x g.
    11. Zuig het bovenstaande op met behulp van een vacuümaspiratiesysteem (VAS).
    12. Voeg 1 ml MEF medium toe en pipetteer voorzichtig 3-4 keer op en neer.
    13. Meet het celgetal met behulp van een hemocytometer. Dode cellen werden uitgesloten met behulp van Trypan Blue.
    14. Plaat 3.1-3.3 x 105 levende feedercellen per putje van een plaat met 6 putjes of 2 x 106 cellen per plaat met 6 putjes in MEF-medium.
    15. Bewaar de plaat in de CO2 -incubator 's nachts op 37 °C met een luchtvochtigheid van 85%. Schud de plaat in de CO2 -incubator 2-3 keer van voren naar achteren en zijwaarts om een homogene verdeling van de voedingscellen te bereiken.
  2. Herleving van hiPSC's met het syndroom van Down en isogene euploïde hiPSC's
    OPMERKING: Verwarm het benodigde volume hiPSC-media in een parelbad van 37 °C.
    Humaan geïnduceerd pluripotente stamcellen (hiPSC) revivalmedium: Voeg vers 25 ng/ml basisfibroblastgroeifactor (bFGF) en 10 μM rockremmer (RI) (Y-27632 2HCl) toe aan hiPSC-medium.
    1. Verwijder MEF-media uit de feeders en spoel de feeders één keer door voorzichtig 1 ml/putje warme DMEM/F12 aan de zijkanten van de put toe te voegen. Zuig het medium op en voeg 2 ml/goed warm hiPSC revival medium toe. Laat de plaat minstens 2 uur in de broedmachine staan voordat u hiPSC's plateert.
    2. Haal een flesje hiPSC's eruit.
    3. Bewaar de injectieflacon op een drijvend rek in een waterbad van 37 °C totdat er een klein stukje ijs overblijft.
    4. Voordat u de injectieflacon in de bioveiligheidskast neemt, steriliseert u deze met 70% alcohol.
    5. Voeg 1 ml warm hiPSC revival medium toe.
    6. Haal de media voorzichtig uit de injectieflacon en giet druppel voor druppel in een centrifugebuis van 15 ml met 5 ml hiPSC's revivalmedia.
    7. Centrifugeer 2 minuten bij kamertemperatuur bij 100 x g.
    8. Zuig het bovenstaande op met behulp van VAS en maak de pellet los door zachtjes op de buis te tikken.
    9. Giet 500 μL hiPSC-medium met 10 μM RI en giet over de toevoerplaat met hiPSC-revivalmedium. Label de plaat met de naam van de cel, het passagenummer, de naam van de onderzoeker en de datum.
    10. Observeer de hiPSC-kolonies onder een omgekeerde microscoop met een vergroting van 4x; Er moeten klompjes cellen zijn.
    11. Terwijl u de plaat in de CO2 -incubator houdt, schudt u de plaat 2-3 keer aan de voorkant en aan de zijkant om een homogene verdeling van de cellen te bereiken. Verstoor de plaat gedurende 24 uur niet.
    12. De volgende dag zien sommige kolonies er misschien uit als vastgeplakt aan feeders, en sommige zouden drijven. Voeg zonder media op te zuigen verse hiPSC's toe aangevuld met 25 ng/ml bFGF en 10 μM RI.
    13. Op de tweede dag na de heropleving zouden de meeste kolonies aan de oppervlakte worden gehecht. Vervang het volledige medium door hiPSC-medium met 25 ng/ml bFGF. In de komende dagen zullen hiPSC-kolonies zichtbaar zijn.
      OPMERKING: Het duurt minstens een week voordat hiPSC's zijn herleefd en kolonies hebben gemaakt met gladde, goed gedefinieerde randen, uniforme celmorfologie en een dicht koloniecentrum.
  3. Passaging hiPSC's met het syndroom van Down en isogene euploïde hiPSC's op feeders
    OPMERKING: Alle reagentia moeten warm zijn voordat u begint. Vermijd overmatig pipetteren van cellen. Ga heel voorzichtig om met cellen.
    1. Passage hiPSC's wanneer de meeste kolonies in elkaar beginnen over te gaan of wanneer er te veel gedifferentieerde kolonies ontstaan. Over het algemeen moet het splitsen binnen 5-7 dagen na de eerste passage worden uitgevoerd.
    2. Breng een dag voor het splitsen een flesje feeders nieuw leven in.
    3. Spoel de feeders één keer met 1 ml/putje warme DMEM/F12 en voeg 2 ml/putje warme hiPSC's medium toe, aangevuld met 25 ng/ml bFGF. Laat de plaat minstens 2 uur in de CO2 -incubator bij 37 °C staan voordat u de hiPSC's uitplat.
    4. Observeer de plaat met hiPSC's voor gedifferentieerde kolonies en verwijder de gedifferentieerde kolonie door te schrapen met een pipet van 200 μl onder een stereomicroscoop.
    5. Was één keer aan hiPSC's met 1 ml/goed warme DMEM/F12.
    6. Giet 1 ml/putje 1 mg/ml collagenaseoplossing. Houd de plaat 8-10 minuten in de broedmachine en observeer vervolgens onder een omgekeerde microscoop naar de losse randen van kolonies.
    7. Zuig het collagenase op en spoel 2 keer DMEM/F12 schoon. Voeg vervolgens 1 ml/well hiPSC Medium toe.
    8. Snijd de kolonies voorzichtig horizontaal en verticaal 8-10 keer in een putje met behulp van de punt van een spuit van 2 ml. Observeer de kolonies onder een omgekeerde microscoop om te controleren of de meeste kolonies op de juiste grootte zijn gesneden.
    9. Als de kolonies voldoende zijn gesneden, tilt u de kolonies voorzichtig op met behulp van een cellifter.
    10. Piket de kolonies in het putje voorzichtig met een tip van 1 ml, 5-8 keer, afhankelijk van de grootte van de kolonies.
    11. Verzamel alle cellen in een centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur bij 100 x g.
    12. Zuig het bovenstaande voorzichtig op met een pipet, maak de celpellet los door zachtjes op de buis te tikken en voeg 200 μL hiPSC-medium toe met 25 ng/ml bFGF en 10 μM RI. Pipetteer 2-3 keer met de 200 μL pipet en voeg 300 μL meer hiPSC medium toe met 25 ng/ml bFGF en 10 μM RI.
    13. Plaat deze cellen nu voorzichtig over de feeders met hiPSC-medium + 25 ng/ml bFGF. Een put kan worden opgesplitst in 1:2 of 1:3, afhankelijk van het aantal aanwezige kolonies na het verwijderen van gedifferentieerde kolonies. Label de plaat met de naam van de cel, het passagenummer, de naam van de onderzoeker en de datum.
    14. Terwijl u de plaat in de CO2 -incubator houdt, schudt u de plaat 2-3 keer aan de voorkant en aan de zijkant om een homogene verdeling van de cellen te bereiken.
    15. De volgende dag een zachte wasbeurt geven met warme DMEM/F12 en 2,5 ml hiPSC medium toevoegen met 25 ng/ml bFGF.
  4. Bevriezing van het syndroom van Down hiPSC's en isogene euploïde hiPSC's uit feeders
    OPMERKING: Overpipetteren van humane iPSC's moet worden vermeden tijdens de bevriezingsprocedure.
    1. Splits hiPSC's wanneer ze zich nog in hun logfase bevinden, d.w.z. 4-5 dagen na passage.
    2. Observeer de plaat met hiPSC's voor gedifferentieerde kolonies en verwijder de gedifferentieerde kolonies met behulp van een pipet van 200 μl onder een stereomicroscoop.
    3. Was één keer aan hiPSC's met 1 ml/goed warme DMEM/F12.
    4. Voeg 1 ml/putje 1 mg/ml collagenaseoplossing toe. Houd de plaat 8-10 minuten in de broedmachine en kijk dan onder een omgekeerde microscoop of er randen van kolonies zijn.
    5. Zuig het collagenase op en spoel 2 keer DMEM/F12 schoon. Voeg vervolgens 1 ml/well hiPSC Medium toe.
    6. Til de kolonies voorzichtig op met behulp van een cellifter.
    7. Piket de kolonies in het putje voorzichtig 5-8 keer met een tip van 1 ml, afhankelijk van de grootte van de kolonies.
    8. Verzamel alle cellen in een centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur bij 100 x g.
    9. Zuig het bovenstaande voorzichtig op met een pipet, maak de celpellet los door zachtjes op de buis te tikken en voeg 1 ml hiPSC-medium toe zonder antibioticum aangevuld met 25 ng/ml bFGF volgens het aantal putjes. Doseer cellen in cryovials.
    10. Voeg hiPSC Medium zonder antibioticum aangevuld met 25 ng/ml bFGF en 20% DMSO toe aan de cryovials om een eindconcentratie van 10% DMSO te bereiken.
    11. Zet de cryovials in een ijzig bad met een isopropanolbad om langzaam in te vriezen.
    12. Houd de vorst een nacht op -80 °C. Breng de injectieflacons de volgende dag over naar de LN2-tank.

2. Neuronale differentiatie

OPMERKING: Bereiding van Feeder-Conditioned Medium (FCM): Gebruik een T-75-kolf en plaats 4 x 106 feedercellen per kolf. Voeg de volgende dag 40 ml hiPSC-medium toe met 4 ng/ml bFGF. Verzamel gedurende 7 dagen. Bewaar elke tube voor dagelijks gebruik bij -20 °C gedurende maximaal 1 maand. Bestrijk een schaaltje van 15 cm met 10 ml 0,1% gelatine bij 37 °C gedurende ten minste 2 uur alvorens de cellen te dissociëren. Smeer een plaat met 6 putjes in met hESC-gekwalificeerde basaalmembraanmatrix (hierna "gekwalificeerde matrix" genoemd) 1 dag voor het dissociëren van cellen. Voeg bij het dissociëren van cellen in het hele protocol 10 μM RI toe aan de celloslatingsoplossing (zie materiaaltabel), DPBS en platingmedia (FCM aangevuld met 25 ng/ml bFGF). Bereid vers feeder-geconditioneerd medium (FCM) voor elke differentiatie. Vermijd overmatig pipetteren van hiPSC's.

  1. Day In vitro (DIV) 2: Maken van enkelvoudige cellen en zaaien van hiPSC's voor neurodifferentiatie
    1. Voeg 10 μM RI toe aan hiPSC-media aangevuld met 25 ng/ml bFGF, DPBS, celonthechtingsoplossing en Feeder Conditioned Medium aangevuld met 25 ng/ml bFGF. Verwarm al deze reagentia tot 37 °C.
    2. Neem een plaat met 6 putjes iPSC's op feeders, verwijder gedifferentieerde kolonies en voeg verse hiPSC-media toe, aangevuld met 25ng/ml bFGF en 10 μM RI. Bewaar de plaat 2 uur in de broedmachine.
    3. Haal de iPSC-plaat er na 2 uur uit en was één keer met DPBS zonder Ca++ en Mg++.
    4. Voeg 1 ml/putje celloslatingsoplossing toe (+ 10 μM RI) en bewaar de plaat 12-14 minuten in de CO2 -incubator.
    5. Bekijk de cellen na 12-14 minuten onder een omgekeerde microscoop; De meeste cellen beginnen los te komen van de plaat. Als er nog enkele cellen vastzitten, tik dan voorzichtig vanaf de zijkanten op de plaat.
    6. Verdun de oplossing voor celloslating door toevoeging van 3 ml/putje DPBS met Ca++ en Mg++ (+ 10 μM RI). Gebruik een pipet van 5 ml om 2-3 keer voorzichtig te pipetteren, waarbij u luchtbellen vermijdt om klonten te breken.
    7. Haal de cellen door een zeef van 40 μM.
    8. Verzamel de cellen in een centrifugebuis van 50 ml.
    9. Centrifugeer 5 minuten bij kamertemperatuur bij 200 x g en zuig media voorzichtig aan met VAS.
    10. Resuspendeer de cellen in 10 ml hiPSC-medium (+ 25 ng/ml bFGF + 10 μM RI). Voeg cellen toe aan een schaal van 15 cm van 15 cm met 0,1% gelatine om de feeders te verwijderen, aangezien feeders een preferentiële hechting hebben op het met gelatine beklede oppervlak in vergelijking met hiPSC's.
    11. Verzamel na 1,5 uur voorzichtig de media met cellen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 200 x g. Zuig media aan met behulp van VAS.
    12. Resuspendeer de cellen in 1 ml FCM (+ 25 ng/ml bFGF + 10 μM RI) en meet het aantal cellen.
    13. Maak met behulp van FCM (+ 25 ng/ml bFGF + 10 μM RI) celsuspensie van 30.000-50.000 cellen/ml en zaad 5 ml celsuspensie/60 mm plaat of 2 ml/putje van 6-putjesplaat of 500 μl/putje van 24-putjesplaat. Platen moeten worden gecoat met een gekwalificeerde matrix (zie Materiaaltabel).
  2. DIV 0: (~48 uur later): Verander feeder-geconditioneerd medium naar NPC-media (DDM + B27 zonder vitamine A + N2) (zie de materiaaltabel).
  3. DIV 2: Voeg om de dag NPC-medium toe met 0,125 μM Dorsomorfine tot DIV 18.
  4. DIV 18: Voeg NPC-media toe zonder Dorsomorphin en vul elke andere dag aan tot DIV 28.
  5. DIV 28-30: Het maken van enkelvoudige cellen en het zaaien van NPC's voor Fase 2
    1. Op DIV 28 verwijdert u de plaat (met NPC's) en vervangt u de media door NPC-media (+ 10 μM RI). Plaats de plaat 2 uur in de CO2 -broedmachine.
    2. Zuig na 2 uur de media op en was één keer met DPBS (zonder Ca++ en Mg++).
    3. Voeg 1 ml/putje celloslatingsoplossing toe (+ 10 μM RI) en houd de plaat 14 minuten in de incubator.
    4. Bekijk na 14 minuten de cellen 4x onder een omgekeerde microscoop. De meeste cellen beginnen los te komen van de plaat. Als er nog enkele cellen vastzitten, tik dan voorzichtig vanaf de zijkanten op de plaat.
    5. Verdun de oplossing voor celloslating door 3 ml/putje DPBS met Ca++ en Mg++ (+ 10 μM RI) toe te voegen. Gebruik een pipet van 5 ml om 2-3 keer voorzichtig te pipetteren, waarbij u luchtbellen vermijdt om klonten te breken.
    6. Passeer door de zeef van 40 μM die op een centrifugebuis van 50 ml is geplaatst.
    7. Centrifugeer 5 minuten bij kamertemperatuur bij 200 x g. Zuig media voorzichtig aan met behulp van VAS.
    8. Resuspendeer de cellen in DDM + B27 met vitamine A (+ 10 μM RI).
    9. Tel de levende cellen met behulp van trypan blauw met een hemocytometer.
    10. Zaai 50.000 cellen/putje op een gekwalificeerde matrix-gecoate plaat (1x) van de plaat met 48 putjes.
  6. DIV 33: Verander medium naar neuraal differentiatiemedium (zie de Materialentabel). Vervang het medium elke 5 dagen. Blijf media aanvullen tot DIV 85/90.

3. Immunocytochemie (ICC)

OPMERKING: Voeg in alle stadia voldoende buffer toe om cellen te bedekken en voorkom uitdroging van de put tijdens het aanzuigen tijdens de wasfase.

  1. Verwijder de gedifferentieerde celplaat buiten het celkweekgebied.
  2. Zuig de media op en geef een DPBS-wasbeurt.
  3. Voeg voor fixatie 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) toe aan de cellen. Dek de plaat af met aluminiumfolie en plaats deze 30 minuten op een rocker shaker op 37 °C.
  4. Zuig PFA op en geef drie wasbeurten van elk 15 minuten met DPBS (zonder Ca++ en Mg++).
  5. Voeg blokkeerbuffer (3% BSA + 5% ezelserum (of sera van gastheerdier met secundair antilichaam) + 0,2% Triton-X in DPBS) toe gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  6. Voeg 250 μl/putje primaire antilichamen [Ki67 (verdunning 1:100), TUBB3 (verdunning 1:500), PAX6 (1:100)] toe en incubeer een nacht bij 4 °C op een tuimelschakelaar. Verdunning gebeurde in een blokkerende oplossing.
  7. Driemaal wassen met DPBS na incubatie van primaire antilichamen.
  8. Voeg 250 μL/putje secundair antilichaam toe (verdund 1: 250 in 3% BSA + 0,2% Triton-X in DPBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  9. Was 3 keer met DPBS na incubatie van secundaire antilichamen.
  10. Voeg DAPI (1:1000 verdunning van 5 mg/ml bouillon in DPBS) toe gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Was drie keer met DPBS. Laat de laatste wasbeurt in de kweekplaat zitten en observeer onder de microscoop.

4. Beeldacquisitie en -analyse

  1. Maak foto's met de fluorescentiemicroscoop met een resolutie van 20x.
  2. Leg beelden vast van Ki67, evenals TUBB3-kleuringsbeelden met een excitatiefilter van 540 nm, PAX6 met een excitatiefilter van 488 nm en DAPI-beelden met een excitatiefilter van 358 nm.
  3. Leg afbeeldingen vast uit tien verschillende willekeurige velden voor analyse.
  4. Analyseer ICC-beelden met behulp van ImageJ-software.
  5. Voer voor TUBB3- en PAX6-analyse drempelwaarden uit voor alle beelden voor respectievelijk de rode en groene signalen en de intensiteit van het blauwe signaal voor DAPI. De gemiddelde intensiteit van de rode pixels van TUBB3 en groene pixels van PAX6 werd genormaliseerd met de gemiddelde intensiteit van de blauwe pixels van DAPI.
  6. Tel voor Ki67-analyse de cellen met behulp van de geautomatiseerde cellentellerfunctie in de ImageJ-software. Normaliseer het aantal Ki67-positieve cellen met het aantal DAPI-positieve cellen.
  7. Voer statistische analyse uit met behulp van statistieken en grafische software door de twee groepen te vergelijken met behulp van ongepaarde t-tests. De gegevens moeten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. Een p-waarde van minder dan 0,05 wordt als statistisch significant beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gesingulariseerde menselijke iPSC's werden gezaaid op gekwalificeerde matrix-gecoate schalen als eencellige suspensies, en differentiatie werd geïnitieerd door bFGF te verwijderen. Om niet-ectodermale differentiatie te remmen, werd Dorsomorfine, een BMP-signaleremmer, toegevoegd van DIV 2-1821. Voor verdere differentiatie van voorlopercellen vanaf het neurogene stadium werden eencellige suspensies gedurende nog eens 6-10 weken met lage dichtheid opnieuw geplateerd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit werk wordt een efficiënt ongericht monolaag corticaal neurodifferentiatieprotocol beschreven voor een isogeen paar euploïde hiPSC's en DS hiPSC's. Omdat de cellen als monolagen worden gekweekt, worden ze meer blootgesteld aan kweekomstandigheden, wat niet in dezelfde mate mogelijk is als het gebruik van embryoïde lichamen voor het differentiëren van iPSC's, die over het algemeen in andere protocollen worden gebruikt14,16. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflict om bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken Prof. Stuart H. Orkin voor het verstrekken van een paar Down syndroom en isogene euploïde hiPSC's. De auteurs zijn ook dankbaar voor het National Centre for Cell Science (BRIC-NCCS), Pune, voor het verstrekken van de financiering om dit werk uit te voeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MEF medium:
DMEM High GlucoseGibco11965-092
FBSVWR97068-08510% final concentration
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
β-MercaptoethanolGibco21985-0231X final concentration
hiPSC medium:
Knockout DMEM/F12Gibco 12660-012
Knockout Serum Replacement (KOSR)Gibco10828-02820% final concentration
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
β-Mercaptoethanol (1000X)Gibco21985-0231X final concentration
DDM medium:
Knockout DMEM/F12Gibco 12660-012
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
Albumax (10%)Invitrogen 11020-0210.5 X of 10% Albumax is final concentration
NPC medium:
DDM medium
N2 SupplementGibco 175020481X final concentration
B-27 Supplement (50X), minus vitamin AGibco 125870101X final concentration
Neural Differentiation medium (ND):
DDM medium1/2 of volume
Neurobasal MediumGibco 21103-0491/2 of volume
N2 SupplementGibco 175020480.5 X final concentration
B-27 Supplement (50X)Gibco 175040440.5 X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X of Neurobasal medium
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X of Neurobasal medium
Antibodies and reagents for immunostaining:
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G4%
DPBS, no calcium, no magnesiumSigma-AldrichD5652
Triton-X-100 SolutionSigma-AldrichX100-500ML0.20%
BSAHycloneA7979-50ML1.00%
Purified anti-tubulin β-3 (TUBB3) (TUJ1)BioLegend8012021:500 dilution
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa fluor 594 conjugateLife Tech Invitrogen A212031:250 dilution
Purified Mouse-Anti-Human Ki67BD Pharmingen5506091:100 dilution
Purified anti-PAX6BioLegends9013021:100 dilution
Alexa fluor 488 Donkey (anti-rabbit)Life Tech Invitrogen A212061:250 dilution
DAPI Solution (5 mg/mL)SigmaD95421:1000 dilution
Others
Cell detachment solution (Accutase) Gibco A11105-01Ready to use working solution
Rock inhibitor (RI) Sellechckem Y2763210 mM/ml final concentration
Dorsomorphin Sellechckem S73060.125 nM/ml final concentration
DPBS with calcium and magnisium (DPBS+ Ca, Mg)Gibco 14040133Ready to use working solution
DPBS without calcium and magnisiumGibco 14190136Ready to use working solution
Gelatin Type ASigma G2500-100G0.10%
hESC-qualified basement membrane matrix (Matrigel GFR) Corning 3562301 mg stock vial diluted 1:240
Trypsin 0.05%Gibco25300054
Trypan BlueGibco15250-0610.40%
Basic Fibrablast Growth Factor (bFGF)Peprotech 100-18B25 ng/ml final concentration
Collagenase Gibco 17104-0191mg/ml final concentration

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chapman, R. S., Hesketh, L. J. Behavioral phenotype of individuals with Down syndrome. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 6 (2), 84-95 (2000).
  2. Haydar, T. F., Reeves, R. H. Trisomy 21 and early brain development. Trends Neurosci. 35 (2), 81-91 (2012).
  3. Wisniewski, K. E. Down syndrome children often have brain with maturation delay, retardation of growth, and cortical dysgenesis. Am J Med Genet Suppl. 7, 274-281 (1990).
  4. Guidi, S., et al. Neurogenesis impairment and increased cell death reduce total neuron number in the hippocampal region of fetuses with Down syndrome. Brain Pathol. 18 (2), 180-197 (2008).
  5. Lott, I. T. Neurological phenotypes for Down syndrome across the life span. Prog Brain Res. 197, 101-121 (2012).
  6. Stagni, F., Giacomini, A., Emili, M., Guidi, S., Bartesaghi, R. Neurogenesis impairment: An early developmental defect in Down syndrome. Free Radic Biol Med. 114, 15-32 (2018).
  7. Golden, J. A., Hyman, B. T. Development of the superior temporal neocortex is anomalous in trisomy 21. J Neuropathol Exp Neurol. 53 (5), 513-520 (1994).
  8. Gupta, M., Dhanasekaran, A. R., Gardiner, K. J. Mouse models of Down syndrome: Gene content and consequences. Mamm Genome. 27 (11-12), 538-555 (2016).
  9. Wu, Y., West, N. R., Bhattacharyya, A., Wiseman, F. K. Cell models for Down syndrome-Alzheimer's disease research. Neuronal Signal. 6 (1), NS20210054(2022).
  10. Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. Am J Hum Genet. 103 (6), 829-857 (2018).
  11. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  12. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  13. Briggs, J. A., et al. Integration-free induced pluripotent stem cells model genetic and neural developmental features of Down syndrome etiology. Stem Cells. 31 (3), 467-478 (2013).
  14. Hibaoui, Y., et al. Modeling and rescuing neurodevelopmental defect of Down syndrome using induced pluripotent stem cells from monozygotic twins discordant for trisomy 21. EMBO Mol Med. 6 (2), 259-277 (2014).
  15. Shi, Y., et al. A human stem cell model of early Alzheimer's disease pathology in Down syndrome. Sci Transl Med. 4 (124), 124ra29(2012).
  16. Weick, J. P., et al. Deficits in human trisomy 21 iPSCs and neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9962-9967 (2013).
  17. Meharena, H. S., et al. Down syndrome-induced senescence disrupts the nuclear architecture of neural progenitors. Cell Stem Cell. 29 (1), 116-130.e7 (2022).
  18. Sharma, V., et al. Biphasic cell cycle defect causes impaired neurogenesis in Down syndrome. Front Genet. 13, 1007519(2022).
  19. Maclean, G. A., et al. Altered hematopoiesis in trisomy 21 as revealed through in vitro differentiation of isogenic human pluripotent cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (43), 17567-17572 (2012).
  20. Nehra, S., Sharma, V., Umrani, M., Singhal, N. Generation of integration-free Down syndrome and isogenic euploid human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 67, 103041(2023).
  21. Yu, P. B., et al. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nat Chem Biol. 4 (1), 33-41 (2008).
  22. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15 (3), 477-486 (2012).
  23. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
  24. Gaspard, N., et al. Generation of cortical neurons from mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 4 (10), 1454-1463 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neurale progenitorcellenbifasische celcyclusneurale differentiatietrisomie 21TUBB3 positieve neuronenPAX6 positieve cellencelcyclusdefectverstandelijke beperking

Gerelateerde artikelen