Evaluatie van LC3-II-afgifte via extracellulaire blaasjes in relatie tot de accumulatie van intracellulaire LC3-positieve blaasjes

Samenvatting

Hier presenteren we de methodologie voor het beknopt beoordelen van autofagosoommarker LC3-II-niveaus in extracellulaire vesikels (EV's) door middel van immunoblotting. Analyse voor LC3-II-niveaus in EV's, autolysosoomvorming en omegasoomvorming suggereert de nieuwe rol van STX6 bij de afgifte van LC3-II-positieve EV's wanneer autofagosoom-lysosoomfusie wordt geremd.

Samenvatting

(Macro)autofagie vertegenwoordigt een fundamentele cellulaire afbraakroute. In dit proces verzwelgen dubbelmembraanige blaasjes, bekend als autofagosomen, de cytoplasmatische inhoud en fuseren vervolgens met lysosomen voor afbraak. Naast de canonieke rol moduleren autofagie-gerelateerde genen ook een secretoire route waarbij ontstekingsmoleculen, weefselherstelfactoren en extracellulaire blaasjes (EV's) vrijkomen. Met name het proces van verspreiding van pathologische eiwitten tussen cellen, met name bij neurodegeneratieve ziekten die de hersenen en het ruggenmerg aantasten, onderstreept het belang van het begrijpen van dit fenomeen. Recent onderzoek suggereert dat het transactieve respons DNA-bindende eiwit 43 kDa (TDP-43), een belangrijke speler bij amyotrofische laterale sclerose en frontotemporale kwabdegeneratie, op een autofagie-afhankelijke manier wordt vrijgegeven via EV's verrijkt met de autofagosoommarker microtubuli-geassocieerde eiwitten 1A/1B lichte keten 3B-II (LC3-II), vooral wanneer autofagosoom-lysosoomfusie wordt geremd.

Om het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de vorming en afgifte van LC3-II-positieve EV's op te helderen, is het absoluut noodzakelijk om een toegankelijke en reproduceerbare methode vast te stellen voor het evalueren van zowel intracellulaire als extracellulaire LC3-II-positieve blaasjes. Deze studie presenteert een gedetailleerd protocol voor het beoordelen van LC3-II-niveaus via immunoblotting in cellulaire en EV-fracties verkregen door differentiële centrifugatie. Bafilomycine A1 (Baf), een remmer van autofagosoom-lysosoomfusie, dient als een positieve controle om de niveaus van intracellulaire en extracellulaire LC3-II-positieve blaasjes te verhogen. Tumorgevoeligheidsgen 101 (TSG101) wordt gebruikt als marker voor multivesiculaire lichamen. Door dit protocol toe te passen, wordt aangetoond dat siRNA-gemedieerde knockdown van syntaxine-6 (STX6), een genetische risicofactor voor sporadische ziekte van Creutzfeldt-Jakob, de LC3-II-niveaus verhoogt in de EV-fractie van cellen die met Baf worden behandeld, terwijl er geen significant effect is op de TSG101-niveaus. Deze bevindingen suggereren dat STX6 de extracellulaire afgifte van LC3-II via EV's negatief kan reguleren, met name onder omstandigheden waarin autofagosoom-lysosoomfusie is verstoord. Gecombineerd met gevestigde methoden voor het evalueren van autofagie, biedt dit protocol waardevolle inzichten in de rol van specifieke moleculen bij de vorming en afgifte van LC3-II-positieve EV's.

Inleiding

Transactiveringsrespons DNA-bindend eiwit 43 (TDP-43) is een wijdverbreid heterogeen nucleair ribonucleoproteïne dat betrokken is bij het reguleren van exon-splicing, gentranscriptie en mRNA-stabiliteit, allemaal van vitaal belang voor celoverleving ^1,2. Bij neurodegeneratieve aandoeningen zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS) en frontotemporale kwabdegeneratie (FTLD) hoopt een nucleair eiwit TDP-43 zich abnormaal op in het cytoplasma. Deze verschuiving resulteert in een verlies van TDP-43-functie in de kern en een toxische functiewinst in het cytoplasma. Pathologische accumulatie van TDP-43 begint in specifieke regio's van de hersenen en het ruggenmerg en verspreidt zich op een prionachtige manier door deze gebieden, een proces dat nauw verband houdt met ziekteprogressie³. Het exacte mechanisme waarmee TDP-43-pathologie zich door de hersenen en het ruggenmerg verspreidt, blijft echter onbekend.

TDP-43 wordt uitgescheiden via extracellulaire blaasjes (EV's) en verhoogde niveaus van TDP-43 worden gedetecteerd in het plasma en de cerebrospinale vloeistof (CSF) van ALS- en FTLD-TDP-patiënten ^4,5,6. CSF van patiënten gediagnosticeerd met ALS en FTLD induceert intracellulaire mislokalisatie en aggregatie van endogene TDP-43 in menselijke glioomcellen⁷. TDP-43 dat extracellulair via EV's wordt vrijgegeven, kan dus de cel-tot-cel verspreiding van TDP-43-pathologie bemiddelen.

Autofagie is een goed bewaard gebleven cellulair afbraakmechanisme waarbij ongewenste stoffen worden ingesloten in blaasjes met dubbel membraan, bekend als autofagosomen, die worden gemarkeerd door LC3. Deze autofagosomen versmelten met lysosomaal geassocieerd membraanproteïne 1 (LAMP1)-positieve lysosomen om autolysosomen (LC3⁺/LAMP1⁺) te vormen, wat leidt tot de afbraak van hun inhoud⁸. Histologische analyses geven aan dat autofagosomen die insluitsels overspoelen, zich ophopen in de neuronen van sporadische ALS-patiënten^. Sommige causale genen van familiale ALS en FTLD-TDP zijn gekoppeld aan de regulatie van autofagie 10,11,12. Deze bevindingen suggereren dat autofagie wordt onderdrukt bij ALS- en FTLD-TDP-patiënten.

De vorige studie gaf aan dat TDP-43 wordt uitgescheiden via EV's die positief zijn voor de autofagosoommarker LC3-II wanneer autofagosoom-lysosoomfusie wordt geremd¹³. Ontregeling van de autofagie-lysosoomroute kan niet alleen de intracellulaire accumulatie van TDP-43 veroorzaken, maar ook de extracellulaire afgifte van TDP-43 via EV's¹⁴. Het blijft echter onbekend hoe LC3-II-positieve EV's vrijkomen en hoe significant dit is bij de verspreiding van TDP-43-pathologie.

EV's worden ingedeeld in grote EV's (100 tot 1000 nm in diameter), die worden geproduceerd door het ontluiken van het celoppervlak, en kleine EV's (50 tot 150 nm in diameter), die worden geproduceerd door het ontluiken van endosomale membranen naar het binnenste van het endosoom (bekend als exosomen) en het Golgi-apparaat. Om grote en kleine EV's gescheiden in te zamelen, voeren we sequentiële centrifugatie uit en verzamelen we pellets door centrifugatie bij respectievelijk 20.000 × g en 110.000 × g. De P1 EV-fractie (pellets van 20.000 × g ) is bereid om grote EV's in te zamelen en de P2 EV-fractie (110.000 × g pellets) is bereid om kleine EV's in te zamelen¹⁵. De methodologie voor het beoordelen van LC3-II-niveaus in grote en kleine EV's die zijn afgeleid van sequentiële centrifugatie door immunoblotting is stabiel en reproduceerbaar¹⁶. Naast het analyseren van LC3-II-niveaus in EV's, verbetert het analyseren van autolysosoom- en omegasoomvorming het begrip van hoe ontregeling van autofagie leidt tot het vrijkomen van LC3-II-positieve EV's. Hier toont de huidige studie de onderdrukkende rol aan van syntaxine 6 (STX6), een SNARE-eiwit, dat de beweging van transportblaasjes naar doelmembranen¹⁷ bevordert, bij de afgifte van LC3-II-positieve EV's wanneer autofagosoom-lysosoomfusie wordt geremd.

Protocol

1. Bereiding van de cel-, P1- en P2 EV-fractie uit het gekweekte medium van HeLa-cellen

1. Bereiding van de P1 en P2 EV fractie uit het gekweekte medium van HeLa-cellen
   1. Dag 1
      1. Tel de cellen met behulp van een cellenteller en zaai 1 ×^{10 6} cellen op een plaat van 6 cm met een kweekmedium bestaande uit DMEM High Glucose, 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
   2. Dag 2 (optioneel)
      1. Bereid 20 μM siRNA-oplossing voor.
      2. Meng 100 μL gereduceerd serummedium en 3 μL siRNA in een buisje met lage retentie om oplossing A te bereiden.
      3. Meng 100 μl gereduceerd serummedium en 5 μl transfectiereagens in een buisje met lage retentie om oplossing B te bereiden.
      4. Meng oplossing A en oplossing B en incubeer het mengsel vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
      5. Voeg het mengsel van oplossingen A en B toe aan het medium dat wordt gebruikt voor het kweken van HeLa-cellen. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
   3. Dag 3
      1. Was de cellen met PBS en stel ze bloot aan 500 μL 0,25% trypsine en 1 mM EDTA-oplossing bij 37 °C met 5% CO₂ en gecontroleerde vochtigheid gedurende 5 minuten.
      2. Voeg 2,5 ml van het kweekmedium toe aan de cellen en gebruik een Pasteur-transferpipet met een pipetpunt van 200 μl eraan bevestigd om een eencellige suspensie te bereiden.
      3. Tel de cellen met behulp van een cellenteller en zaai 1 × 10⁶ cellen op een plaat van 10 cm. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
         OPMERKING: Het is noodzakelijk om ten minste 1 × 10⁶ cellen voor te bereiden om EV's te verzamelen uit het kweekmedium dat nodig is voor immunoblotting-analyse.
   4. Dag 4
      1. Bereid een kweekmedium voor (zie stap 1.1.1.1) dat een van beide vehiculum (DMSO) of 100 nM Bafilomycine A1 (Baf) bevat.
      2. Stel de cellen bloot aan het medium dat vehiculum of 100 nM Baf bevat en incubeer ze bij 37 °C met 5% CO₂ en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
   5. Dag 5
      1. Verzamel al het kweekmedium van de plaat van 10 cm, doe het in een buisje van 15 ml en centrifugeer het gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 3.000 × g om celresten te verwijderen.
         OPMERKING: De resterende cellen in de plaat van 10 cm worden gebruikt in paragraaf 1.2.1.
      2. Voor de isolatie van de P1 EV-fractie brengt u het supernatans na centrifugatie bij 3.000 × g over in een centrifugatiebuis en centrifugeert u het vervolgens bij 20.000 × g bij 4 °C gedurende 1 uur.
      3. Voor de isolatie van de P2 EV-fractie brengt u het supernatans na centrifugatie bij 20.000 × g over in een ultracentrifugebuis en centrifugeert u het vervolgens bij 110.000 × g bij 4 °C gedurende 1 uur.
      4. Nadat u het overtollige vocht in de buis hebt weggeveegd met een laboratoriumdoekje, resuspendeert u de resterende pellets in de centrifugatiebuis in 50 μL 2x monsterbuffer [2,5% SDS, 125mM Tris-HCl-buffer (pH 6,8), 30% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol, 0,4% Broomfenol Blauw] om de P1 EV-fractie te bereiden.
      5. Verwijder het supernatans door te decanteren, veeg het overtollige vocht in de buis weg met een laboratoriumdoekje en resuspendeer vervolgens de resterende pellets in de ultracentrifugatiebuis in 50 μL 2x monsterbuffer om de P2 EV-fractie voor te bereiden.
      6. Incubeer de P1 en P2 EV fracties bij 100 °C op een warmteblok gedurende 10 min.
         OPMERKING: Schud de buizen niet na het centrifugeren bij 20.000 × g en 110.000 × g om te voorkomen dat de resterende pellets per ongeluk worden weggegooid. Nadat u de buis hebt gekanteld om het supernatant over te brengen, houdt u de positie van de buis vast om te voorkomen dat de pellet opnieuw in het resterende supernatans wordt ondergedompeld.
2. Bereiding van de celfractie uit gekweekte HeLa-cellen
   1. Dag 5
      1. Na het overbrengen van het kweekmedium van de plaat van 10 cm in een buisje van 15 ml, wast u de cellen in de schaal van 10 cm met PBS en stelt u ze bloot aan 2 ml 0,25% trypsine en 1 mM EDTA-oplossing bij 37 °C met 5% CO₂ en gecontroleerde vochtigheid gedurende 5 minuten.
      2. Voeg 8 ml groeimedium toe aan de cellen en gebruik vervolgens een Pasteur-transferpipet met een pipetpunt van 200 μl om de cellen te pipetteren en een eencellige suspensie te bereiden.
      3. Breng de celsuspensie over in een buisje van 15 ml en centrifugeer deze bij 1.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
      4. Verwijder het supernatans met een aspirator, voeg PBS toe aan de celpellet en centrifugeer vervolgens bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      5. Verwijder de PBS met behulp van een aspirator en sonificeer de celpellet in 1 ml A68-buffer [10 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,5, 0,8 M NaCl, 1 mM ethyleenglycol bis(β-aminoethylether)-N,N,N,N-tetraazijnzuur (EGTA)] met 1% sarkosyl.
      6. Meet de eiwitconcentratie van het cellysaat met behulp van een BCA-eiwittestkit.
      7. Meng 300 μL van het cellysaat met 100 μL 4x monsterbuffer en incubeer het mengsel bij 100 °C op een warmteblok gedurende 10 minuten om de celfractie voor te bereiden.

2. Immunoblotting analyse

1. Afzonderlijke equivalente hoeveelheden eiwitten in de monsters door SDS-PAGE¹⁸.
2. Breng de gescheiden eiwitten over op polyvinylideendifluoride (PVDF) membranen.
3. Na het overbrengen de membranen 20 minuten met het blokkeringsmiddel blokkeren.
4. Incubeer het geblokkeerde membraan 's nachts met het aangegeven primaire antilichaam in Tris-buffer met 10% (v/v) kalfsserum bij RT.
5. Was het membraan met Tris-buffer gedurende 5 s en incubeer het vervolgens gedurende 2 uur met een biotine-geconjugeerd secundair antilichaam bij RT.
6. Was het membraan gedurende 5 s met Tris-buffer en incubeer het vervolgens gedurende 1 uur met Tris-buffer met 0,4% (v/v) oplossingen A en oplossing B uit de kit bij RT.
7. Was het membraan met PBS en incubeer het vervolgens met PBS met 0,04% (w/v) diaminobenzidine, 0,8% (w/v) NiCl 2,6H ₂O en 0,3% (v/v) H₂O₂ voor colorimetrische detectie van banden.
   OPMERKING: Voor de detectie van signalen is een chemiluminescentiemethode ook acceptabel.
8. Digitaliseer het beeld van het membraan door een scanner en onderwerp het aan densitometrie-analyse met behulp van Fiji.
   1. Open de gedigitaliseerde afbeelding met Fiji en converteer de RGB-kleurenafbeelding naar een 8-bits afbeelding door te klikken op Afbeelding | Soort | 8-bits.
   2. Klik op het rechthoekgereedschap en pas de grootte van de rechthoek aan door deze te slepen om de banden te omringen. Identificeer de band die moet worden geanalyseerd door te klikken op Analyseren | Gels | Selecteer Eerste rijstrook.
   3. Plaats de rechthoek op de tweede en de volgende banden en identificeer de banden voor analyse door te klikken op Analyseren | Gels | Selecteer Volgende rijstrook.
   4. Nadat u de uiteindelijke band hebt herkend, meet u de densitometrie over de rechthoek door te klikken op Analyseren | Gels | Plot rijstroken.
   5. Omring het signaalgebied van de band met een rechte lijn, klik op het staafgereedschap en klik in het gebied om de signaalintensiteit van de band te berekenen.

3. Analyse van het aantal autofagosomen en autolysosomen

1. Dag 1
   1. Tel het aantal HeLa-cellen met behulp van een cellenteller en zaai 1 ×^{10 5} HeLa-cellen die LAMP1-GFP en mCherry-LC3 tot expressie brengen op een schaal van 3,5 cm. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
2. Dag 2 (optioneel)
   1. Voer de stappen beschreven in paragraaf 1.1.2 uit in schalen van 3.5 cm.
3. Dag 3
   1. Gooi het kweekmedium van de schaaltjes van 3,5 cm weg.
   2. Was de cellen met PBS, stel ze bloot aan 400 μl 0,25% trypsine en 1 mM EDTA-oplossing en incubeer bij 37 °C met 5% CO₂ en gecontroleerde vochtigheid gedurende 5 minuten.
   3. Voeg 1,6 ml van het groeimedium toe aan de cellen en pipetteer ze met een Pasteur-transferpipet om een eencellige suspensie te bereiden.
   4. Tel het aantal cellen met behulp van de cellenteller en zaai 1 ×^{10 4} cellen op een dekglaasje met 8 kamers. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
      OPMERKING: Twee putjes van het dekglaasje met kamer zijn voorbereid voor respectievelijk controle- en STX6-knockdown-cellen, na een DMSO- of Baf-behandeling zoals beschreven in paragraaf 3.4.2.
4. Dag 4
   1. Bereid het groeimedium zonder fenolrood (DMEM zonder fenolrood, 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine), dat ofwel vehiculum (DMSO) ofwel 100 nM Baf opgelost in DMSO bevat.
   2. Vervang het kweekmedium door het medium zonder fenolrood, dat ofwel medium ofwel 100 nM Baf bevat, en incubeer gedurende 4 uur.
      OPMERKING: Om het effect van Baf op het aantal autofagosoomen en autolysoomen te beoordelen, bereidt u met vehiculum behandelde cellen voor als controles.
   3. Kleur de kernen met 0,33 μg/ml Hoechst 33342 gedurende 30 minuten vóór de observatie.
   4. Voer live celbeeldvorming uit met behulp van een 60x objectieflens op een confocale lasermicroscoop en leg tien verschillende frames vast.
      1. Open de samengevoegde RGB-afbeelding in Fiji en splits deze in de respectievelijke rode, groene en blauwe afbeeldingscomponenten door op Afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen.
      2. Stel een constante drempelwaarde in voor de rode en groene signalen in elke afbeelding door te klikken op Afbeelding | Aanpassen | Drempelwaarde voor elk experiment.
      3. Tel het aantal gebieden dat positief is voor rode of groene signalen door te klikken op Analyseren | Analyseer deeltjes. Vink het vakje Samenvatten aan en klik op OK. Noteer de waarden van de telling om autofagosoom- en lysosoom-geassocieerde blaasjes te identificeren.
      4. Als u de groene afbeelding over de rode afbeelding wilt leggen, stelt u de overdrachtsmodus in op EN door te klikken op Bewerken | Controle bij plakken. Kopieer de groene afbeelding en plak deze vervolgens op de rode afbeelding om ze samen te voegen, waarbij u gebieden markeert die positief zijn voor zowel rode als groene signalen.
      5. Als u autolysosoomgetallen wilt identificeren, telt u het aantal gebieden dat positief is voor zowel rode als groene signalen door te klikken op Analyseren | Analyseer deeltjes. Vink het vakje Samenvatten aan, klik op OK en noteer de waarden in de sectie Telling om blaasjes te identificeren die verband houden met autofagosomen en lysosomen.
   5. Deel het totale aantal autolysosomen en autofagosomen door het totale aantal cellen om het aantal autolysosomen en autofagosomen per cel te berekenen.
      OPMERKING: Tel ten minste 35 cellen in elk van de drie onafhankelijke experimenten.

4. Analyse voor de vorming van omegasomen

1. Dag 1
   1. Tel het aantal HeLa-cellen met behulp van een cellenteller en zaai 1 ×^{10 5} cellen op een schaal van 3,5 cm. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
2. Dag 2 (optioneel)
   1. Voer de stappen uit die worden beschreven in paragraaf 1.1.2.
3. Dag 3
   1. Bereid een eencellige suspensie voor zoals beschreven in de stappen 3.3.1-3.3.2.
   2. Tel de cellen met behulp van de cellenteller en zaai 1 ×^{10 5} cellen op een schaal van 3,5 cm. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
4. Dag 4
   1. Meng 1 μg pEGFP-C1-hAtg13, 3 μl van het DNA-transfectiereagens en 100 μl gereduceerd serummedium in een buisje met lage retentie. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten en voeg het dan toe aan het gekweekte medium.
   2. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
5. Dag 5
   1. Probeer de cellen te trypsiniseren zoals beschreven in de stappen 3.3.1-3.3.2.
   2. Voeg 2,5 ml van het groeimedium toe aan de cellen. Pipeteer het mengsel met een pasteur-transferpipet om een eencellige suspensie te bereiden.
   3. Tel de cellen met behulp van de cellenteller en zaai 1 × 10⁴ cellen op een dekglaasje met 8 kamers. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
6. Dag 6
   1. Volg de stappen 3.4.1-3.4.4 om live beeldvorming van de cellen uit stap 4.5.3 uit te voeren met behulp van een confocale lasermicroscoop. Leg tien verschillende frames met afbeeldingen vast.
      1. Volg stappen 3.4.4.1-3.4.4.3 om de samengevoegde RGB-afbeeldingen op te splitsen in de respectievelijke rode, groene en blauwe beeldcomponenten, een constante drempel in te stellen voor de groene signalen in elke afbeelding en de GFP-signaalintensiteit te bepalen. Noteer de waarden uit de sectie Totale oppervlakte om de signaalintensiteit van GFP-ATG13 te bepalen.
      2. Deel de totale signaalintensiteit door het aantal onderzochte cellen om de signaalintensiteit per cel te berekenen.
         OPMERKING: Tel ten minste 34 cellen in elk van de drie onafhankelijke experimenten.

Resultaten

Zoals aangetoond in eerdere studies, verhoogde Baf-behandeling de niveaus van TSG101 (P1: P < 0,01, P2: P = 0,012, zoals bepaald door tweerichtings-ANOVA in EZR¹⁹) en LC3-II (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, zoals bepaald door tweerichtings-ANOVA in EZR¹⁹) in de EV-rijke fractie. Met name verhoogde Baf-behandeling ook de niveaus van STX6 (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, zoals bepaald door tweerichtings-ANOVA in EZR¹⁹) in de EV-fractie (Figuur 1A), wat suggereert dat STX6 een onderdeel van EV's kan zijn. Prolifererend celnucleair antigeen (PCNA) werd niet waargenomen in de EV-fractie. Immunoblotting van STX6 in de celfractie onthulde dat STX6-niveaus met de helft daalden met de siRNA-knockdown (Figuur 1B). STX6 knockdown had geen invloed op de TSG101-niveaus in de cel- en EV-fracties onder zowel voertuig- als Baf-behandelde omstandigheden (Figuur 1C). STX6 knockdown verhoogde echter de LC3-II-niveaus in de celfractie onder de met het medium behandelde toestand, maar niet onder de met Baf behandelde toestand. STX6 knockdown verhoogde ook de LC3-II-niveaus in de EV-fractie onder de met Baf behandelde toestand (Figuur 1D). Deze bevindingen suggereren dat de methoden die worden gebruikt om LC3-II in EV's te detecteren door middel van immunoblotting voldoende gevoelig zijn, zelfs als de knockdown-efficiëntie niet substantieel is. Bovendien geven deze resultaten aan dat STX6 knockdown het aantal intracellulaire autofagosoomen verhoogt en de extracellulaire afgifte van autofagosoom-geassocieerde blaasjes verbetert onder Baf-behandeling.

Om verder te onderzoeken of STX6 knockdown het aantal intracellulaire autofagosomen en autolysoomen beïnvloedt, werden autofagosomen en lysosomen gevisualiseerd met behulp van de autofagosoommarker mCherry-LC3 en de lysosoommarker LAMP1-GFP. Confocale beeldvorming van levende cellen toonde GFP- en mCherry-positieve blaasjes in HeLa-cellen die LAMP1-GFP en mCherry-LC3 tot expressie brengen (Figuur 2A). Autolysosomen werden geïdentificeerd als GFP- en mCherry-positieve blaasjes, terwijl autofagosomen werden geïdentificeerd als GFP-negatieve en mCherry-positieve blaasjes. STX6 knockdown verhoogde het aantal autofagosomen en autolysosomen onder de met het voertuig behandelde toestand (Figuur 2B,C). STX6 knockdown had echter geen invloed op het aantal autofagosoomen en autolysoomen onder de met Baf behandelde aandoening (Figuur 2B,C).

Om te bepalen of de toename van het aantal intracellulaire autofagosomen als gevolg van STX6-knockdown het gevolg was van verbeterde autofagosoomvorming, werd omegasoomvorming, een proces dat nodig is voor autofagosoomvorming, onderzocht met behulp van de omegasoommarker GFP-ATG13-signaalintensiteit. Confocale beeldvorming van levende cellen leverde een geassembleerd beeld van GFP-ATG13 op, wat wijst op de vorming van omegasomen (Figuur 3A). STX6 knockdown verminderde de GFP-ATG13-signaalintensiteit (P = 0,023, zoals bepaald door tweerichtings-ANOVA in EZR¹⁹). Hoewel STX6 knockdown geen significante invloed had op de GFP-ATG13-signaalintensiteit onder de met het voertuig behandelde toestand, verminderde het het signaal aanzienlijk onder met Baf behandelde omstandigheden (Figuur 3B). Gezamenlijk geven deze bevindingen aan dat STX6 knockdown de afgifte van LC3-II-positieve blaasjes verhoogt die verband houden met de accumulatie van autofagosoom-geassocieerde blaasjes.

Figuur 1: Immunoblottingresultaten van de cel-, P1- en P2-fracties van HeLa-cellen getransfecteerd met controle- of STX6-siRNA onder vehiculum- of Baf-behandeling. HeLa-cellen werden gedurende 24 uur na transfectie met controle- of STX6-siRNA behandeld met vehiculum (DMSO) of 100 nM Baf. De fracties van de cel, P1 (20.000 × g pellet) en P2 (110.000 × g pellet) werden geïsoleerd. (A) Representatieve immunoblotting-afbeeldingen van elke fractie met STX6, TSG101, LC3 en PCNA. (B-D) Densitometrische analyse voor (B) STX6, (C) TSG101 en (D) LC3-II werd uitgevoerd op basis van de immunoblot-beelden. Signaalintensiteiten werden genormaliseerd naar de controle- of STX6-siRNA-getransfecteerde cellen die werden behandeld met vehiculum of Baf. De staafdiagrammen geven gemiddelde waarden ± S.E.M. weer (n = 3). * geeft P < 0,05 aan door een tweezijdige ongepaard t-toets in Excel. Afkortingen: STX6 = syntaxine 6; Baf = bafilomycine A1; DMSO = dimethylsulfoxide; TSG101 = tumorgevoeligheidsgen 101; LC3 = microtubuli-geassocieerde eiwitten 1A/1B lichte keten 3B; PCNA = prolifererend celkernantigeen; S.E.M. = standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Confocale beeldanalyse van HeLa-cellen die Lamp1-GFP en mCherry-LC3 tot co-expressie brengen, getransfecteerd met controle- of STX6-siRNA onder de met vehiculum en Baf behandelde toestand. (A) Confocale beelden van HeLa-cellen die stabiel LAMP1-GFP en mCherry-LC3 tot expressie brengen, werden getransfecteerd met controle- of STX6-siRNA gedurende 48 uur, gevolgd door blootstelling aan DMSO of 400 nm Baf gedurende 4 uur. Schaalbalk = 20 μm. (B,C) Qunatificatie van (B) autofagosomen (LAMP1-GFP negatieve en mCherry-LC3 positieve punten) en (C) autolysosomen (LAMP1-GFP en mCherry-LC3 dubbel-positieve punten) werd uitgevoerd met behulp van Fiji-software. Gegevens in de staafdiagrammen worden weergegeven als gemiddelde waarden ± S.E.M. (N = 3). * geeft P < 0,05 aan, gebaseerd op een tweezijdige ongepaarde t-toets in Excel. Afkortingen: Lamp1 = lysosomaal geassocieerd membraaneiwit 1; LC3 = microtubuli-geassocieerde eiwitten 1A/1B lichte keten 3B; STX6 = syntaxine 6; Baf = bafilomycine A1; GFP = groen fluorescerend eiwit; S.E.M. = standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Confocale beeldvorming van HeLa-cellen die GFP-ATG13 tot expressie brengen, getransfecteerd met controle- of STX6-siRNA en onderworpen aan vehiculum- of Baf-behandeling. (A) HeLa-cellen werden getransfecteerd met controle- of STX6-siRNA , gevolgd door pEGFP-C1-hAtg13-transfectie en behandeld met DMSO of 400 nM Baf gedurende 4 uur. Schaalbalk = 20 μm. (B) Relatieve signaalintensiteiten werden bepaald door het signaal in elke toestand te normaliseren naar dat van controle-siRNA-getransfecteerde cellen die met Baf werden behandeld. Het staafdiagram toont de gegevens als gemiddelden ± S.E.M. (N = 3). * geeft P < 0,05 aan door de tweezijdige ongepaarde t-toets in Excel. Afkortingen: hAtg13 = humaan autofagie-gerelateerd gen 13; STX6 = syntaxine 6; Baf = bafilomycine A1; DMSO = dimethylsulfoxide; S.E.M. = standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Immunoblot-analyse van de cel-, P1- en P2-fracties van HeLa-cellen getransfecteerd met controle-siRNA en behandeld met Baf. HeLa-cellen werden getransfecteerd met controle-siRNA en gedurende 24 uur blootgesteld aan 100 nM Baf. Vervolgens werden fracties bereid: cel, P1 (pellet van 20.000 × g ) en P2 (pellet van 110.000 × g ). Representatieve immunoblot-beelden van ULK1 en PCNA, met hun niveaus in elke fractie ter vergelijking. Afkortingen: Baf = bafilomycine A1; ULK1 = unc-51 zoals autofagie activerend kinase 1; PCNA = prolifererend celkernantigeen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De immunoblotting-studie onthulde LC3-II- en TSG101-niveaus in de cellulaire fractie, de microvesikelrijke P1 EV-fractie en de exosoomrijke P2 EV-fractie. Live-cell beeldvorming werd gebruikt om autofagosomen, autolysosomen en omegasomen te onderzoeken, waardoor inzicht werd verkregen in de vraag of STX6 knockdown autofagie beïnvloedt. Deze gecombineerde resultaten suggereren dat STX6 knockdown de afgifte van LC3-II-positieve EV's beïnvloedt, mogelijk gekoppeld aan ontregeling van de autofagieroute. Een belangrijk voordeel van deze methode is de mogelijkheid om onderscheid te maken tussen grote en kleine EV's die afkomstig zijn van verschillende bronnen. Flowcytometrieanalyse met behulp van specifieke markers voor microvesikels, exosomen of het Golgi-apparaat kan verder verduidelijken hoe STX6-knockdown de afgifte van LC3-II-positieve blaasjes beïnvloedt.

Een beperking van de immunoblottingstudie is echter dat het onduidelijk blijft of de waargenomen toename van LC3-II-niveaus in de EV-fractie na STX6-knockdown onder Baf-behandeling te wijten is aan een verhoogd aantal LC3-II-positieve blaasjes die vrijkomen of een toename van LC3-II-niveaus per EV. Om onderscheid te maken tussen deze mogelijkheden, kan het tellen van blaasjes met behulp van nanodeeltjesvolganalyse of flowcytometrie-analyse helpen bepalen of het aantal LC3-II-positieve blaasjes verhoogd is of dat LC3-II-niveaus per blaasje verhoogd zijn.

Een cruciale stap in het protocol is de fractionering van het gekweekte medium om de EV-fractie voor te bereiden. EV's worden waargenomen als kleine pellets in de centrifugatiebuis. Om een vergelijkbare EV-fractie te bereiden, is het belangrijk om het supernatans na het centrifugeren zorgvuldig over te brengen of weg te gooien om te voorkomen dat de eiwitconcentratie van de EV-pellets wordt verdund. Om contaminatie van de celfractie in de EV-fractie te onderzoeken, werden de niveaus van een cytoplasmatisch eiwit, unc-51-achtige autofagie activerende kinase 1 (ULK1), en een nucleair eiwit, PCNA, vergeleken tussen de fracties in deze studie (aanvullende figuur S1). De eiwitconcentratie in de celfractie weerspiegelt over het algemeen het aantal cellen, maar de cellulaire eiwitconcentratie wordt beïnvloed door celcyclusstadia²⁰ of verstoringen in proteostase²¹. Autofagie is cruciaal voor het behoud van proteostase²². Ontregeling van autofagie door STX6 knockdown of Baf-behandeling kan de eiwitconcentratie veranderen, ongeacht het aantal cellen.

STX6 knockdown wordt bereikt door siRNA-transfectie en overexpressie van GFP-ATG13 wordt bereikt via DNA-transfectie. De efficiëntie van transfectie wordt beïnvloed door het celtype, de dichtheid en het aantal. Efficiënte uitlijning van siRNA-sequenties kan ook van invloed zijn op de knockdown-efficiëntie. Aanpassingen zijn nodig wanneer de transfectie-efficiëntie laag is.

De huidige resultaten geven aan dat STX6 knockdown de niveaus van de autofagosoommarker LC3-II in de EV-fractie verhoogde onder Baf-behandelde omstandigheden, maar geen invloed had op de niveaus van TSG101. Dit suggereert dat STX6 de afgifte van blaasjes afkomstig van autofagosomen onderdrukt, maar niet van MVB's, wanneer autofagosoom-lysosoomfusie wordt geremd.

STX6 knockdown verhoogde ook cellulaire LC3-II-niveaus onder groeiomstandigheden, wat suggereert dat STX6 autofagie reguleert. Inderdaad, STX6 knockdown verhoogde het aantal autofagosomen en autolysosomen, terwijl het de vorming van omegasomen niet verbeterde. Rijping van autolysosomen veroorzaakt autofagische lysosoomreformatie²³. Het is mogelijk dat STX6 het rijpingsproces van autolysosomen bemiddelt, en het functieverlies ervan kan het aantal onrijpe autolysosomen verhogen, wat leidt tot ontregeling van autofagosoom-lysosoomfusie als gevolg van onderdrukking van autofagische lysosoomreformatie.

Baf-behandeling verhoogde de STX6-niveaus in de EV-fractie, zelfs wanneer de expressie ervan werd gedownreguleerd. Eerdere studies suggereerden dat autofagosoom-geassocieerde blaasjes worden vrijgegeven als EV's wanneer de lysosomale functie wordt geremd^13,14. Van STX6 is bekend dat het zich lokaliseert in autofagosoom-geassocieerde blaasjes, zoals Groep A Streptococcus (GAS)-bevattende autofagosoom-achtige vacuolen²⁴. Daarom kan STX6 gelokaliseerd zijn in autofagosoom-geassocieerde blaasjes die vrijkomen als EV's wanneer autofagosoom-lysosoomfusie wordt geremd.

De verspreiding van TDP-43-pathologie is nauw verbonden met de progressie van ALS en FTLD-TDP³. Hoewel het onduidelijk blijft hoe TDP-43-pathologie zich door de hersenen en het ruggenmerg verspreidt, kan de EV-route de verspreiding ervan bemiddelen. Eerdere studies hebben aangetoond dat ontregeling van de autofagie-lysosoomroute resulteert in het vrijkomen van LC3-II-positieve EV's die TDP-43 bevatten¹³. De huidige studie suggereert een rol voor STX6 bij het reguleren van EV-afgifte wanneer autofagosoom-lysosoomfusie wordt geremd. De methodologie voor het beoordelen van LC3-II-niveaus in de cel- en EV-fracties door middel van immunoblotting zou nuttig moeten zijn in toekomstige studies.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.25 % Trypsin EDTA	Fujifilm Wako	201-16945
10 cm Dish	Thermo Fisher Scientific	150464
15 mL Tube	Thermo Fisher Scientific	339650
200 μL Pipette Tip	Nippon Genetics	FG-301	pipetting
2-Mercaptoethanol	Nacalai Tesque	21417-52	een materiaal voor monster bufferoplossing
3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Nacalai Tesque	11009-41	een materiaal voor DAB oplossing
3.5 cm Dish	Thermo Fisher Scientific	150460
6 cm Dish	TrueLine	TR4001
Aluminium Block Thermostatic Baths (dry thermobaths)	EYELA	273860
Aspirator	SANSYO	SAP-102	oplossing inademen
Avanti JXN-30	Beckman Coulter	B34193
Bafilomycin A1	Adipogen	BVT-0252
Biotin-conjugated Goat Anti-rabbit IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-1000	2e antilichaam voor immunoblotting
Biotin-conjugated Horse Antimouse IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-2000	2e antilichaam voor immunoblotting
Blocking One	Nacalai Tesque	03953-95	een materiaal voor immunoblotting
Bromophenol Blue	Nacalai Tesque	05808-61	een materiaal voor monster bufferoplossing
Calf Serum	cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Canon	CSLIDE220	Scanner
Centrifuge 5702 R	eppendolf	5703000039
Counting Slides Dual Chamber	Bio-Rad	1450015J	celtelling
Digital Sonifier 450	BRANSON
Dimethyl Sulfoxide	nacalai tasque	09659-14	voertuig
DMEM High Glucose	Nacalai Tesque	08458-45	kweekmedium
DMEM without Phenol Red	Nacalai Tesque	08489-45	kweekmedium
EGTA	Dojindo	348-01311	een materiaal voor A68 oplossing
Excel	Microsoft	version 16.16.27	statistische analyse
EZR	Referentie nr. 24	version 1.68	statistische analyse
FBS	Sigma	173012	Kweekmedium
Fiji	NIH		Beeldanalysetool
Glycerol	Nacalai Tesque	09886-05	een materiaal voor monster bufferoplossing
Hoehst33342	Dojindo	H342
Hydrogen Peroxide	Fujifilm Wako	080-0186	een materiaal voor DAB oplossing
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER CRECIA	62011	reinigingsdoek
Low Retention Tube	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	siRNA en DNA transfectie
LSM780 Confocal Laser Microscope	Carl Zeiss
Monoclonal Mouse Anti-LC3 Antibody	MBL	M186-3	1e antilichaam voor immunoblotting
Nickel(II) Chloride Hexahydrate	Fujifilm Wako	149-01041	een materiaal voor DAB oplossing
N-Lauroylsarcosine Sodium Salt	Nacalai Tesque	20117-12
Optima XE-90 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-070	siRNA en DNA transfectie
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
Penicillin/Streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Kweekmedium
Pierce BCA Protein Assay Kits	Thermo Fisher Scientific	23225
Polyclonal Rabbit Anti-PCNA Antibody	BioAcademia	70-080	1e antilichaam voor immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-syntaxin 6 Antibody	ProteinTech	10841-1-AP	1e antilichaam voor immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 Antibody	ProteinTech	28283-1-AP	1e antilichaam voor immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-ULK1 Antibody	ProteinTech	20986-1-AP	1e antilichaam voor immunoblotting
Polyvinylidene Difluoride Membrane	Milliore	IPVH00010	een materiaal voor immunoblotting
R	R development core team	version 4.4.1	statistische analyse
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	siRNA transfectiereagens
siRNA STX6	Thermo Fisher Scientific	HSS115604	siRNA voor transfectie
Sodium Chloride	Nacalai Tesque	31320-05	een materiaal voor Tris buffer en A68 oplossing
Sodium Dodecyl Sulfate	Fujifilm Wako	192-13981	een materiaal voor monster bufferoplossing
SPARK Microplate Reader	TECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC	Thermo Fisher Scientific	12935300	siRNA transfectie
Sucrose	Fujifilm Wako	193-00025	een materiaal voor A68 oplossing
TC20 Automated Cell Counter with Thermal Printer	Bio-Rad	1450109J1	celtelling
Thermobath	TOKYO RIKAKIKAI	MG-3100	incubatie
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	DNA transfectiereagens
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR2300	DNA transfectiereagens
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Nacalai Tesque	35406-75	een materiaal voor Tris buffer, monster buffer en A68 oplossing
Trypan Blue Dye 0.40%	Bio-Rad	1450021	celtelling
Ultra-Clear Open-Top Tube, 16 x