Hier presenteren we de methodologie voor het beknopt beoordelen van autofagosoommarker LC3-II-niveaus in extracellulaire vesikels (EV's) door middel van immunoblotting. Analyse voor LC3-II-niveaus in EV's, autolysosoomvorming en omegasoomvorming suggereert de nieuwe rol van STX6 bij de afgifte van LC3-II-positieve EV's wanneer autofagosoom-lysosoomfusie wordt geremd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Evaluatie van LC3-II-afgifte via extracellulaire blaasjes in relatie tot de accumulatie van intracellulaire LC3-positieve blaasjes
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
(Macro)autofagie vertegenwoordigt een fundamentele cellulaire afbraakroute. In dit proces verzwelgen dubbelmembraanige blaasjes, bekend als autofagosomen, de cytoplasmatische inhoud en fuseren vervolgens met lysosomen voor afbraak. Naast de canonieke rol moduleren autofagie-gerelateerde genen ook een secretoire route waarbij ontstekingsmoleculen, weefselherstelfactoren en extracellulaire blaasjes (EV's) vrijkomen. Met name het proces van verspreiding van pathologische eiwitten tussen cellen, met name bij neurodegeneratieve ziekten die de hersenen en het ruggenmerg aantasten, onderstreept het belang van het begrijpen van dit fenomeen. Recent onderzoek suggereert dat het transactieve respons DNA-bindende eiwit 43 kDa (TDP-43), een belangrijke speler bij amyotrofische laterale sclerose en frontotemporale kwabdegeneratie, op een autofagie-afhankelijke manier wordt vrijgegeven via EV's verrijkt met de autofagosoommarker microtubuli-geassocieerde eiwitten 1A/1B lichte keten 3B-II (LC3-II), vooral wanneer autofagosoom-lysosoomfusie wordt geremd.
Om het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de vorming en afgifte van LC3-II-positieve EV's op te helderen, is het absoluut noodzakelijk om een toegankelijke en reproduceerbare methode vast te stellen voor het evalueren van zowel intracellulaire als extracellulaire LC3-II-positieve blaasjes. Deze studie presenteert een gedetailleerd protocol voor het beoordelen van LC3-II-niveaus via immunoblotting in cellulaire en EV-fracties verkregen door differentiële centrifugatie. Bafilomycine A1 (Baf), een remmer van autofagosoom-lysosoomfusie, dient als een positieve controle om de niveaus van intracellulaire en extracellulaire LC3-II-positieve blaasjes te verhogen. Tumorgevoeligheidsgen 101 (TSG101) wordt gebruikt als marker voor multivesiculaire lichamen. Door dit protocol toe te passen, wordt aangetoond dat siRNA-gemedieerde knockdown van syntaxine-6 (STX6), een genetische risicofactor voor sporadische ziekte van Creutzfeldt-Jakob, de LC3-II-niveaus verhoogt in de EV-fractie van cellen die met Baf worden behandeld, terwijl er geen significant effect is op de TSG101-niveaus. Deze bevindingen suggereren dat STX6 de extracellulaire afgifte van LC3-II via EV's negatief kan reguleren, met name onder omstandigheden waarin autofagosoom-lysosoomfusie is verstoord. Gecombineerd met gevestigde methoden voor het evalueren van autofagie, biedt dit protocol waardevolle inzichten in de rol van specifieke moleculen bij de vorming en afgifte van LC3-II-positieve EV's.
Inleiding
Transactiveringsrespons DNA-bindend eiwit 43 (TDP-43) is een wijdverbreid heterogeen nucleair ribonucleoproteïne dat betrokken is bij het reguleren van exon-splicing, gentranscriptie en mRNA-stabiliteit, allemaal van vitaal belang voor celoverleving 1,2. Bij neurodegeneratieve aandoeningen zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS) en frontotemporale kwabdegeneratie (FTLD) hoopt een nucleair eiwit TDP-43 zich abnormaal op in het cytoplasma. Deze verschuiving resulteert in een verlies van TDP-43-functie in de kern en een toxische functiewinst in het cytoplasma. Pathologische accumulatie van TDP-43 begint in specifieke regio's van de hersenen en het ruggenmerg en verspreidt zich op een prionachtige manier door deze gebieden, een proces dat nauw verband houdt met ziekteprogressie3. Het exacte mechanisme waarmee TDP-43-pathologie zich door de hersenen en het ruggenmerg verspreidt, blijft echter onbekend.
TDP-43 wordt uitgescheiden via extracellulaire blaasjes (EV's) en verhoogde niveaus van TDP-43 worden gedetecteerd in het plasma en de cerebrospinale vloeistof (CSF) van ALS- en FTLD-TDP-patiënten 4,5,6. CSF van patiënten gediagnosticeerd met ALS en FTLD induceert intracellulaire mislokalisatie en aggregatie van endogene TDP-43 in menselijke glioomcellen7. TDP-43 dat extracellulair via EV's wordt vrijgegeven, kan dus de cel-tot-cel verspreiding van TDP-43-pathologie bemiddelen.
Autofagie is een goed bewaard gebleven cellulair afbraakmechanisme waarbij ongewenste stoffen worden ingesloten in blaasjes met dubbel membraan, bekend als autofagosomen, die worden gemarkeerd door LC3. Deze autofagosomen versmelten met lysosomaal geassocieerd membraanproteïne 1 (LAMP1)-positieve lysosomen om autolysosomen (LC3+/LAMP1+) te vormen, wat leidt tot de afbraak van hun inhoud8. Histologische analyses geven aan dat autofagosomen die insluitsels overspoelen, zich ophopen in de neuronen van sporadische ALS-patiënten. Sommige causale genen van familiale ALS en FTLD-TDP zijn gekoppeld aan de regulatie van autofagie 10,11,12. Deze bevindingen suggereren dat autofagie wordt onderdrukt bij ALS- en FTLD-TDP-patiënten.
De vorige studie gaf aan dat TDP-43 wordt uitgescheiden via EV's die positief zijn voor de autofagosoommarker LC3-II wanneer autofagosoom-lysosoomfusie wordt geremd13. Ontregeling van de autofagie-lysosoomroute kan niet alleen de intracellulaire accumulatie van TDP-43 veroorzaken, maar ook de extracellulaire afgifte van TDP-43 via EV's14. Het blijft echter onbekend hoe LC3-II-positieve EV's vrijkomen en hoe significant dit is bij de verspreiding van TDP-43-pathologie.
EV's worden ingedeeld in grote EV's (100 tot 1000 nm in diameter), die worden geproduceerd door het ontluiken van het celoppervlak, en kleine EV's (50 tot 150 nm in diameter), die worden geproduceerd door het ontluiken van endosomale membranen naar het binnenste van het endosoom (bekend als exosomen) en het Golgi-apparaat. Om grote en kleine EV's gescheiden in te zamelen, voeren we sequentiële centrifugatie uit en verzamelen we pellets door centrifugatie bij respectievelijk 20.000 × g en 110.000 × g. De P1 EV-fractie (pellets van 20.000 × g ) is bereid om grote EV's in te zamelen en de P2 EV-fractie (110.000 × g pellets) is bereid om kleine EV's in te zamelen15. De methodologie voor het beoordelen van LC3-II-niveaus in grote en kleine EV's die zijn afgeleid van sequentiële centrifugatie door immunoblotting is stabiel en reproduceerbaar16. Naast het analyseren van LC3-II-niveaus in EV's, verbetert het analyseren van autolysosoom- en omegasoomvorming het begrip van hoe ontregeling van autofagie leidt tot het vrijkomen van LC3-II-positieve EV's. Hier toont de huidige studie de onderdrukkende rol aan van syntaxine 6 (STX6), een SNARE-eiwit, dat de beweging van transportblaasjes naar doelmembranen17 bevordert, bij de afgifte van LC3-II-positieve EV's wanneer autofagosoom-lysosoomfusie wordt geremd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van de cel-, P1- en P2 EV-fractie uit het gekweekte medium van HeLa-cellen
- Bereiding van de P1 en P2 EV fractie uit het gekweekte medium van HeLa-cellen
- Dag 1
- Tel de cellen met behulp van een cellenteller en zaai 1 ×10 6 cellen op een plaat van 6 cm met een kweekmedium bestaande uit DMEM High Glucose, 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
- Dag 2 (optioneel)
- Bereid 20 μM siRNA-oplossing voor.
- Meng 100 μL gereduceerd serummedium en 3 μL siRNA in een buisje met lage retentie om oplossing A te bereiden.
- Meng 100 μl gereduceerd serummedium en 5 μl transfectiereagens in een buisje met lage retentie om oplossing B te bereiden.
- Meng oplossing A en oplossing B en incubeer het mengsel vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Voeg het mengsel van oplossingen A en B toe aan het medium dat wordt gebruikt voor het kweken van HeLa-cellen. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
- Dag 3
- Was de cellen met PBS en stel ze bloot aan 500 μL 0,25% trypsine en 1 mM EDTA-oplossing bij 37 °C met 5% CO2 en gecontroleerde vochtigheid gedurende 5 minuten.
- Voeg 2,5 ml van het kweekmedium toe aan de cellen en gebruik een Pasteur-transferpipet met een pipetpunt van 200 μl eraan bevestigd om een eencellige suspensie te bereiden.
- Tel de cellen met behulp van een cellenteller en zaai 1 × 106 cellen op een plaat van 10 cm. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
OPMERKING: Het is noodzakelijk om ten minste 1 × 106 cellen voor te bereiden om EV's te verzamelen uit het kweekmedium dat nodig is voor immunoblotting-analyse.
- Dag 4
- Bereid een kweekmedium voor (zie stap 1.1.1.1) dat een van beide vehiculum (DMSO) of 100 nM Bafilomycine A1 (Baf) bevat.
- Stel de cellen bloot aan het medium dat vehiculum of 100 nM Baf bevat en incubeer ze bij 37 °C met 5% CO2 en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
- Dag 5
- Verzamel al het kweekmedium van de plaat van 10 cm, doe het in een buisje van 15 ml en centrifugeer het gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 3.000 × g om celresten te verwijderen.
OPMERKING: De resterende cellen in de plaat van 10 cm worden gebruikt in paragraaf 1.2.1. - Voor de isolatie van de P1 EV-fractie brengt u het supernatans na centrifugatie bij 3.000 × g over in een centrifugatiebuis en centrifugeert u het vervolgens bij 20.000 × g bij 4 °C gedurende 1 uur.
- Voor de isolatie van de P2 EV-fractie brengt u het supernatans na centrifugatie bij 20.000 × g over in een ultracentrifugebuis en centrifugeert u het vervolgens bij 110.000 × g bij 4 °C gedurende 1 uur.
- Nadat u het overtollige vocht in de buis hebt weggeveegd met een laboratoriumdoekje, resuspendeert u de resterende pellets in de centrifugatiebuis in 50 μL 2x monsterbuffer [2,5% SDS, 125mM Tris-HCl-buffer (pH 6,8), 30% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol, 0,4% Broomfenol Blauw] om de P1 EV-fractie te bereiden.
- Verwijder het supernatans door te decanteren, veeg het overtollige vocht in de buis weg met een laboratoriumdoekje en resuspendeer vervolgens de resterende pellets in de ultracentrifugatiebuis in 50 μL 2x monsterbuffer om de P2 EV-fractie voor te bereiden.
- Incubeer de P1 en P2 EV fracties bij 100 °C op een warmteblok gedurende 10 min.
OPMERKING: Schud de buizen niet na het centrifugeren bij 20.000 × g en 110.000 × g om te voorkomen dat de resterende pellets per ongeluk worden weggegooid. Nadat u de buis hebt gekanteld om het supernatant over te brengen, houdt u de positie van de buis vast om te voorkomen dat de pellet opnieuw in het resterende supernatans wordt ondergedompeld.
- Verzamel al het kweekmedium van de plaat van 10 cm, doe het in een buisje van 15 ml en centrifugeer het gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 3.000 × g om celresten te verwijderen.
- Dag 1
- Bereiding van de celfractie uit gekweekte HeLa-cellen
- Dag 5
- Na het overbrengen van het kweekmedium van de plaat van 10 cm in een buisje van 15 ml, wast u de cellen in de schaal van 10 cm met PBS en stelt u ze bloot aan 2 ml 0,25% trypsine en 1 mM EDTA-oplossing bij 37 °C met 5% CO2 en gecontroleerde vochtigheid gedurende 5 minuten.
- Voeg 8 ml groeimedium toe aan de cellen en gebruik vervolgens een Pasteur-transferpipet met een pipetpunt van 200 μl om de cellen te pipetteren en een eencellige suspensie te bereiden.
- Breng de celsuspensie over in een buisje van 15 ml en centrifugeer deze bij 1.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het supernatans met een aspirator, voeg PBS toe aan de celpellet en centrifugeer vervolgens bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verwijder de PBS met behulp van een aspirator en sonificeer de celpellet in 1 ml A68-buffer [10 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,5, 0,8 M NaCl, 1 mM ethyleenglycol bis(β-aminoethylether)-N,N,N,N-tetraazijnzuur (EGTA)] met 1% sarkosyl.
- Meet de eiwitconcentratie van het cellysaat met behulp van een BCA-eiwittestkit.
- Meng 300 μL van het cellysaat met 100 μL 4x monsterbuffer en incubeer het mengsel bij 100 °C op een warmteblok gedurende 10 minuten om de celfractie voor te bereiden.
- Dag 5
2. Immunoblotting analyse
- Afzonderlijke equivalente hoeveelheden eiwitten in de monsters door SDS-PAGE18.
- Breng de gescheiden eiwitten over op polyvinylideendifluoride (PVDF) membranen.
- Na het overbrengen de membranen 20 minuten met het blokkeringsmiddel blokkeren.
- Incubeer het geblokkeerde membraan 's nachts met het aangegeven primaire antilichaam in Tris-buffer met 10% (v/v) kalfsserum bij RT.
- Was het membraan met Tris-buffer gedurende 5 s en incubeer het vervolgens gedurende 2 uur met een biotine-geconjugeerd secundair antilichaam bij RT.
- Was het membraan gedurende 5 s met Tris-buffer en incubeer het vervolgens gedurende 1 uur met Tris-buffer met 0,4% (v/v) oplossingen A en oplossing B uit de kit bij RT.
- Was het membraan met PBS en incubeer het vervolgens met PBS met 0,04% (w/v) diaminobenzidine, 0,8% (w/v) NiCl 2,6H 2O en 0,3% (v/v) H2O2 voor colorimetrische detectie van banden.
OPMERKING: Voor de detectie van signalen is een chemiluminescentiemethode ook acceptabel. - Digitaliseer het beeld van het membraan door een scanner en onderwerp het aan densitometrie-analyse met behulp van Fiji.
- Open de gedigitaliseerde afbeelding met Fiji en converteer de RGB-kleurenafbeelding naar een 8-bits afbeelding door te klikken op Afbeelding | Soort | 8-bits.
- Klik op het rechthoekgereedschap en pas de grootte van de rechthoek aan door deze te slepen om de banden te omringen. Identificeer de band die moet worden geanalyseerd door te klikken op Analyseren | Gels | Selecteer Eerste rijstrook.
- Plaats de rechthoek op de tweede en de volgende banden en identificeer de banden voor analyse door te klikken op Analyseren | Gels | Selecteer Volgende rijstrook.
- Nadat u de uiteindelijke band hebt herkend, meet u de densitometrie over de rechthoek door te klikken op Analyseren | Gels | Plot rijstroken.
- Omring het signaalgebied van de band met een rechte lijn, klik op het staafgereedschap en klik in het gebied om de signaalintensiteit van de band te berekenen.
3. Analyse van het aantal autofagosomen en autolysosomen
- Dag 1
- Tel het aantal HeLa-cellen met behulp van een cellenteller en zaai 1 ×10 5 HeLa-cellen die LAMP1-GFP en mCherry-LC3 tot expressie brengen op een schaal van 3,5 cm. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
- Dag 2 (optioneel)
- Voer de stappen beschreven in paragraaf 1.1.2 uit in schalen van 3.5 cm.
- Dag 3
- Gooi het kweekmedium van de schaaltjes van 3,5 cm weg.
- Was de cellen met PBS, stel ze bloot aan 400 μl 0,25% trypsine en 1 mM EDTA-oplossing en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 en gecontroleerde vochtigheid gedurende 5 minuten.
- Voeg 1,6 ml van het groeimedium toe aan de cellen en pipetteer ze met een Pasteur-transferpipet om een eencellige suspensie te bereiden.
- Tel het aantal cellen met behulp van de cellenteller en zaai 1 ×10 4 cellen op een dekglaasje met 8 kamers. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
OPMERKING: Twee putjes van het dekglaasje met kamer zijn voorbereid voor respectievelijk controle- en STX6-knockdown-cellen, na een DMSO- of Baf-behandeling zoals beschreven in paragraaf 3.4.2.
- Dag 4
- Bereid het groeimedium zonder fenolrood (DMEM zonder fenolrood, 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine), dat ofwel vehiculum (DMSO) ofwel 100 nM Baf opgelost in DMSO bevat.
- Vervang het kweekmedium door het medium zonder fenolrood, dat ofwel medium ofwel 100 nM Baf bevat, en incubeer gedurende 4 uur.
OPMERKING: Om het effect van Baf op het aantal autofagosoomen en autolysoomen te beoordelen, bereidt u met vehiculum behandelde cellen voor als controles. - Kleur de kernen met 0,33 μg/ml Hoechst 33342 gedurende 30 minuten vóór de observatie.
- Voer live celbeeldvorming uit met behulp van een 60x objectieflens op een confocale lasermicroscoop en leg tien verschillende frames vast.
- Open de samengevoegde RGB-afbeelding in Fiji en splits deze in de respectievelijke rode, groene en blauwe afbeeldingscomponenten door op Afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen.
- Stel een constante drempelwaarde in voor de rode en groene signalen in elke afbeelding door te klikken op Afbeelding | Aanpassen | Drempelwaarde voor elk experiment.
- Tel het aantal gebieden dat positief is voor rode of groene signalen door te klikken op Analyseren | Analyseer deeltjes. Vink het vakje Samenvatten aan en klik op OK. Noteer de waarden van de telling om autofagosoom- en lysosoom-geassocieerde blaasjes te identificeren.
- Als u de groene afbeelding over de rode afbeelding wilt leggen, stelt u de overdrachtsmodus in op EN door te klikken op Bewerken | Controle bij plakken. Kopieer de groene afbeelding en plak deze vervolgens op de rode afbeelding om ze samen te voegen, waarbij u gebieden markeert die positief zijn voor zowel rode als groene signalen.
- Als u autolysosoomgetallen wilt identificeren, telt u het aantal gebieden dat positief is voor zowel rode als groene signalen door te klikken op Analyseren | Analyseer deeltjes. Vink het vakje Samenvatten aan, klik op OK en noteer de waarden in de sectie Telling om blaasjes te identificeren die verband houden met autofagosomen en lysosomen.
- Deel het totale aantal autolysosomen en autofagosomen door het totale aantal cellen om het aantal autolysosomen en autofagosomen per cel te berekenen.
OPMERKING: Tel ten minste 35 cellen in elk van de drie onafhankelijke experimenten.
4. Analyse voor de vorming van omegasomen
- Dag 1
- Tel het aantal HeLa-cellen met behulp van een cellenteller en zaai 1 ×10 5 cellen op een schaal van 3,5 cm. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
- Dag 2 (optioneel)
- Voer de stappen uit die worden beschreven in paragraaf 1.1.2.
- Dag 3
- Bereid een eencellige suspensie voor zoals beschreven in de stappen 3.3.1-3.3.2.
- Tel de cellen met behulp van de cellenteller en zaai 1 ×10 5 cellen op een schaal van 3,5 cm. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
- Dag 4
- Meng 1 μg pEGFP-C1-hAtg13, 3 μl van het DNA-transfectiereagens en 100 μl gereduceerd serummedium in een buisje met lage retentie. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten en voeg het dan toe aan het gekweekte medium.
- Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
- Dag 5
- Probeer de cellen te trypsiniseren zoals beschreven in de stappen 3.3.1-3.3.2.
- Voeg 2,5 ml van het groeimedium toe aan de cellen. Pipeteer het mengsel met een pasteur-transferpipet om een eencellige suspensie te bereiden.
- Tel de cellen met behulp van de cellenteller en zaai 1 × 104 cellen op een dekglaasje met 8 kamers. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
- Dag 6
- Volg de stappen 3.4.1-3.4.4 om live beeldvorming van de cellen uit stap 4.5.3 uit te voeren met behulp van een confocale lasermicroscoop. Leg tien verschillende frames met afbeeldingen vast.
- Volg stappen 3.4.4.1-3.4.4.3 om de samengevoegde RGB-afbeeldingen op te splitsen in de respectievelijke rode, groene en blauwe beeldcomponenten, een constante drempel in te stellen voor de groene signalen in elke afbeelding en de GFP-signaalintensiteit te bepalen. Noteer de waarden uit de sectie Totale oppervlakte om de signaalintensiteit van GFP-ATG13 te bepalen.
- Deel de totale signaalintensiteit door het aantal onderzochte cellen om de signaalintensiteit per cel te berekenen.
OPMERKING: Tel ten minste 34 cellen in elk van de drie onafhankelijke experimenten.
- Volg de stappen 3.4.1-3.4.4 om live beeldvorming van de cellen uit stap 4.5.3 uit te voeren met behulp van een confocale lasermicroscoop. Leg tien verschillende frames met afbeeldingen vast.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Zoals aangetoond in eerdere studies, verhoogde Baf-behandeling de niveaus van TSG101 (P1: P < 0,01, P2: P = 0,012, zoals bepaald door tweerichtings-ANOVA in EZR19) en LC3-II (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, zoals bepaald door tweerichtings-ANOVA in EZR19) in de EV-rijke fractie. Met name verhoogde Baf-behandeling ook de niveaus van STX6 (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, zoals bepaald door tweerichtings-ANOVA in EZR19) in de E...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De immunoblotting-studie onthulde LC3-II- en TSG101-niveaus in de cellulaire fractie, de microvesikelrijke P1 EV-fractie en de exosoomrijke P2 EV-fractie. Live-cell beeldvorming werd gebruikt om autofagosomen, autolysosomen en omegasomen te onderzoeken, waardoor inzicht werd verkregen in de vraag of STX6 knockdown autofagie beïnvloedt. Deze gecombineerde resultaten suggereren dat STX6 knockdown de afgifte van LC3-II-positieve EV's beïnvloedt, mogelijk gekoppeld aan ontr...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben met de inhoud van dit artikel.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door financiering aan Y.T. van de Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI [Grant Number 23K06837] (Tokio, Japan) en Takeda Science Foundation (Osaka, Japan). De auteurs waarderen Dr. David C. Rubinsztein (Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge, UK) voor het leveren van HeLa-cellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.25 % Trypsin EDTA | Fujifilm Wako | 201-16945 | |
| 10 cm Dish | Thermo Fisher Scientific | 150464 | |
| 15 mL Tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 200 μL Pipette Tip | Nippon Genetics | FG-301 | pipetting |
| 2-Mercaptoethanol | Nacalai Tesque | 21417-52 | een materiaal voor monster bufferoplossing |
| 3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Nacalai Tesque | 11009-41 | een materiaal voor DAB oplossing |
| 3.5 cm Dish | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| 6 cm Dish | TrueLine | TR4001 | |
| Aluminium Block Thermostatic Baths (dry thermobaths) | EYELA | 273860 | |
| Aspirator | SANSYO | SAP-102 | oplossing inademen |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Bafilomycin A1 | Adipogen | BVT-0252 | |
| Biotin-conjugated Goat Anti-rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | 2e antilichaam voor immunoblotting |
| Biotin-conjugated Horse Antimouse IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-2000 | 2e antilichaam voor immunoblotting |
| Blocking One | Nacalai Tesque | 03953-95 | een materiaal voor immunoblotting |
| Bromophenol Blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | een materiaal voor monster bufferoplossing |
| Calf Serum | cytiva | SH30073.03 | |
| CanoScan LiDE 220 | Canon | CSLIDE220 | Scanner |
| Centrifuge 5702 R | eppendolf | 5703000039 | |
| Counting Slides Dual Chamber | Bio-Rad | 1450015J | celtelling |
| Digital Sonifier 450 | BRANSON | ||
| Dimethyl Sulfoxide | nacalai tasque | 09659-14 | voertuig |
| DMEM High Glucose | Nacalai Tesque | 08458-45 | kweekmedium |
| DMEM without Phenol Red | Nacalai Tesque | 08489-45 | kweekmedium |
| EGTA | Dojindo | 348-01311 | een materiaal voor A68 oplossing |
| Excel | Microsoft | version 16.16.27 | statistische analyse |
| EZR | Referentie nr. 24 | version 1.68 | statistische analyse |
| FBS | Sigma | 173012 | Kweekmedium |
| Fiji | NIH | Beeldanalysetool | |
| Glycerol | Nacalai Tesque | 09886-05 | een materiaal voor monster bufferoplossing |
| Hoehst33342 | Dojindo | H342 | |
| Hydrogen Peroxide | Fujifilm Wako | 080-0186 | een materiaal voor DAB oplossing |
| Kimwipe S-200 | NIPPON PAPER CRECIA | 62011 | reinigingsdoek |
| Low Retention Tube | Nippon Genetics | FG-MCT015CLB | siRNA en DNA transfectie |
| LSM780 Confocal Laser Microscope | Carl Zeiss | ||
| Monoclonal Mouse Anti-LC3 Antibody | MBL | M186-3 | 1e antilichaam voor immunoblotting |
| Nickel(II) Chloride Hexahydrate | Fujifilm Wako | 149-01041 | een materiaal voor DAB oplossing |
| N-Lauroylsarcosine Sodium Salt | Nacalai Tesque | 20117-12 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | siRNA en DNA transfectie |
| pEGFP-C1-hAtg13 | Addgene | 22875 | |
| Penicillin/Streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Kweekmedium |
| Pierce BCA Protein Assay Kits | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-PCNA Antibody | BioAcademia | 70-080 | 1e antilichaam voor immunoblotting |
| Polyclonal Rabbit Anti-syntaxin 6 Antibody | ProteinTech | 10841-1-AP | 1e antilichaam voor immunoblotting |
| Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 Antibody | ProteinTech | 28283-1-AP | 1e antilichaam voor immunoblotting |
| Polyclonal Rabbit Anti-ULK1 Antibody | ProteinTech | 20986-1-AP | 1e antilichaam voor immunoblotting |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Milliore | IPVH00010 | een materiaal voor immunoblotting |
| R | R development core team | version 4.4.1 | statistische analyse |
| RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778 | siRNA transfectiereagens |
| siRNA STX6 | Thermo Fisher Scientific | HSS115604 | siRNA voor transfectie |
| Sodium Chloride | Nacalai Tesque | 31320-05 | een materiaal voor Tris buffer en A68 oplossing |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fujifilm Wako | 192-13981 | een materiaal voor monster bufferoplossing |
| SPARK Microplate Reader | TECAN | ||
| Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC | Thermo Fisher Scientific | 12935300 | siRNA transfectie |
| Sucrose | Fujifilm Wako | 193-00025 | een materiaal voor A68 oplossing |
| TC20 Automated Cell Counter with Thermal Printer | Bio-Rad | 1450109J1 | celtelling |
| Thermobath | TOKYO RIKAKIKAI | MG-3100 | incubatie |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | DNA transfectiereagens |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio | MIR2300 | DNA transfectiereagens |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Nacalai Tesque | 35406-75 | een materiaal voor Tris buffer, monster buffer en A68 oplossing |
| Trypan Blue Dye 0.40% | Bio-Rad | 1450021 | celtelling |
| Ultra-Clear Open-Top Tube, 16 x |
Referenties
- Tanaka, Y., Hasegawa, M. Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43. Prion. 10 (4), 283-289 (2016).
- Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. The era of cryptic exons: Implications for als-ftd. Mol Neurodegener. 18 (1), 16(2023).
- Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy. Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).
- Chatterjee, M., et al. Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als. Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).
- Kasai, T., et al. Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als. Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).
- Iguchi, Y., et al. Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43. Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).
- Ding, X., et al. Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure. Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).
- Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).
- Sasaki, S. Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).
- Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
- Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).
- Tanaka, Y., et al. Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice. Acta Neuropathol Commun. 2, 78(2014).
- Tanaka, Y., et al. Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43. J Biol Chem. 299 (11), 105272(2023).
- Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy. Autophagy Rep. 3 (1), (2024).
- Ratajczak, M., Ratajczak, J. Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future. Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).
- Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux. Biochem Biophys Rep. 38, 101705(2024).
- Dingjan, I., et al. Endosomal and phagosomal snares. Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).
- Tanaka, Y., et al. Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes. Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).
- Kanda, Y. Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics. Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).
- Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).
- Plate, L., et al. Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation. eLife. 5, e15550(2016).
- Mizushima, N. The role of mammalian autophagy in protein metabolism. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 83 (2), 39-46 (2007).
- Nanayakkara, R., et al. Autophagic lysosome reformation in health and disease. Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).
- Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes. Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
