Methodenartikel

Fluorescerende eindlabeling en inkapseling van lange RNA's voor FRET-TIRF-microscopie met één molecuul

DOI:

10.3791/67391

⸱

18 oktober 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Zurich

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft de tweekleurige labeling van lange RNA's op termini-posities en hun oppervlakte-immobilisatie via inkapseling in fosfolipideblaasjes voor FRET TIRF-microscopietoepassingen met één molecuul. De combinatie van deze technieken maakt nauwkeurige visualisatie en analyse van de RNA-dynamiek op het niveau van één molecuul mogelijk.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) blinkt uit in het bestuderen van dynamische biomoleculen door nauwkeurige observatie van hun conformationele veranderingen in de loop van de tijd mogelijk te maken. Om de RNA-dynamiek met smFRET te monitoren, ontwikkelden we een methode om RNA's aan hun uiteinden covalent te labelen met een FRET-paar fluoroforen. Deze directe eindetiketteringsstrategie richt zich op de activering van 5'-fosfaat door carbodiimide (EDC)/N-hydroxysuccinimide (NHS) en de 3'-ribose door periodaatoxidatie, die kan worden aangepast aan andere RNA's, ongeacht hun grootte en sequentie, om ze onafhankelijk van kunstmatige modificaties te bestuderen. Bovendien is de 5'-EDC/NHS-activering van algemeen belang voor alle nucleïnezuren met een 5'-fosfaat. Het gebruik van in de handel verkrijgbare chemicaliën elimineert de noodzaak om RNA-specifieke sondes te synthetiseren.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie vereist dat de oppervlakte-geïmmobiliseerde moleculen van belang zich binnen het vluchtige veld bevinden om te worden verlicht. Een geavanceerde manier om de RNA-moleculen binnen het vluchtige veld te houden, is door ze in te kapselen in fosfolipideblaasjes. Inkapseling profiteert van het beste van twee werelden, waarbij het molecuul aan het oppervlak wordt vastgemaakt en vrije diffusie van het molecuul mogelijk is. We zorgen ervoor dat elk blaasje slechts één RNA-molecuul bevat, waardoor beeldvorming met één molecuul mogelijk is. Na dual-end labeling en inkapseling van het RNA van belang, bieden smFRET-metingen een dynamisch en gedetailleerd beeld van RNA-gedrag.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) is een krachtige en gevoelige techniek voor het bestuderen van inter- en intramoleculaire interacties van biomoleculen op nanoschaal. Het is gebaseerd op de niet-stralingsenergieoverdracht van een geëxciteerd donormolecuul naar een nabijgelegen acceptormolecuul, die plaatsvindt over afstanden tussen 1 nm en 10 nm. De afstand tussen de donor- en acceptorkleurstoffen bepaalt de efficiëntie van deze energieoverdracht, waardoor FRET een hulpmiddel van onschatbare waarde is voor het bestuderen van moleculaire dynamica, conformationele veranderingen en interacties in een breed scala aan biologische systemen 1,2, waaronder RNA's. Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie heeft bewezen een krachtige techniek te zijn voor smFRET-onderzoek, omdat het selectief moleculen alleen in de buurt van het oppervlak verlicht, waardoor FRET-dynamiek van individuele moleculen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie mogelijk is. Voordat echter smFRET-TIRF-experimenten worden uitgevoerd, moet het betreffende molecuul eerst fluorescerend worden geëtiketteerd met een geschikt FRET-paar en vervolgens op het microscopieoppervlak worden geïmmobiliseerd. Het hier beschreven smFRET-TIRF-protocol werd gevalideerd met behulp van het wildtype groep II intron Sc.ai5γ van de mitochondriën van Saccharomyces cerevisiae, geflankeerd door zijn twee exonische sequenties (915 nucleotiden)3. Voor een gedetailleerder overzicht van fluorescerende etikettering groep II introns en hun immobilisatie voor smFRET TIRF-microscopie, zie onze review4.

Een ideale locatiespecifieke RNA-etiketteringsstrategie zou de nauwkeurige opname van donor- en acceptorkleurstoffen op vooraf bepaalde posities mogelijk maken zonder de structuur of functie van het RNA te veranderen, waardoor nauwkeurige en efficiënte FRET-metingen worden gegarandeerd. Dit is een uitdaging vanwege de chemische overeenkomsten tussen de vier nucleobasen, wat selectieve etikettering bemoeilijkt. Eindetikettering hecht donor- en acceptorkleurstoffen aan de RNA-uiteinden door zich te richten op het 5'-fosfaat en het 3'-ribose. Deze benadering biedt een minimaal invasieve benadering, terwijl het toch waardevolle inzichten biedt in structurele dynamiek en interacties. Het vermogen van groep II intron om zichzelf te splitsen in aanwezigheid van Mg2+ beperkt het gebruik van metaalion-afhankelijke enzymen. Hier presenteren we een benadering van lange en katalytisch actieve RNA's (ribozymen) die de behoefte aan enzymen of de synthese van gespecialiseerde sondes omzeilen.

Een gebruikelijke benadering om RNA-moleculen aan het oppervlak te binden voor TIRF-microscopie is om een biotinegroep covalent rechtstreeks aan het RNA te koppelen of om een biotinedragende antisense-oligonucleotide (ASO) te hybridiseren5,6,7. Deze directe immobilisatiemethode kan echter artefacten introduceren als gevolg van RNA-oppervlakte-interacties, wat mogelijk kan resulteren in verkeerd gevouwen RNA's8. Een elegante oplossing om deze immobilisatie-artefacten te verminderen, is het inkapselen van RNA in aan het oppervlak bevestigde fosfolipideblaasjesop nanoschaal 9,10,11. Deze blaasjes, met een diameter van ongeveer 100 nm, zijn verankerd aan het oppervlak via een biotine-streptavidine-koppeling12,13,14, waardoor het RNA vrij binnenin kan diffunderen en de uitwisseling van ionen over het lipidemembraan mogelijk is10. Na covalent labelen van een groot functioneel RNA3, presenteren we een aanpak om dergelijke RNA's in te kapselen in fosfolipideblaasjes door gevestigde protocollen voor oppervlaktepassivering en blaasjesinkapseling te combineren, aangepast om de RNA-functionaliteit te behouden 10,11,14. Deze dual-end labeling- en inkapselingsbenadering bereikt een hoge mate van mono-inkapseling van functionele RNA's voor smFRET TIRF-microscopie.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. RNA dubbele labeling

OPMERKING: Het volgende protocol beschrijft de plaatsspecifieke etikettering van RNA's met een FRET-paar fluoroforen door covalente hechting van een donorkleurstof (sCy3) aan het 5'-fosfaat en een acceptorkleurstof (Cy5) aan de 3'-ribose. Een katalytisch actief lang RNA, het groep II intron ribozym, wordt gekozen als het RNA van belang. Tabel 1 en Figuur 1 geven een overzicht van dit dual-end labelprotocol. Voer alle stappen met fluoroforen uit onder donkere omstandigheden.

Dag 0▪ Aliquot 50-75 μg RNA tot een totaal volume van 55 μL per buisje van 1,5 ml.
Dag 15′-Fosfaat activering
▪ Voeg 45 μL vers bereide EDC-NHS, pH 6,0-oplossing toe aan het RNA in ddH2O tot een eindvolume van 100 μL, meng goed en incubeer gedurende 4 uur bij 25 °C en 500 rpm.
▪ Zuiveringsronde 1: Nachtelijke EtOH-neerslag.
Dag 2▪ Sla het 5′-geactiveerde RNA neer, was en droog.
5′-Dye-opzetstuk
▪ Resuspenderen in 95 μL 100 mM MOPS, pH 7,5.
▪ Voeg 5 μL 2 mM amine-gefunctionaliseerde kleurstofoplossing toe.
▪ Meng goed en incubeer gedurende 16 uur bij 25 °C en 500 tpm.
Dag 3▪ Zuiveringsronde 2: EtOH-neerslag.
Dag 4▪ Sla het 5′-geactiveerde RNA neer, was en droog.
Blokkerende stap
▪ Resuspenderen in 100 μL van 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, en incuberen gedurende 2 uur bij 25 °C en 500 rpm.
▪ Zuiveringsronde 3: Centrifugale filtratie.
→ het 5′-gelabelde RNA te ontwijken.
Dag 53′-Periodieke oxidatie
▪ Incubeer het RNA met 20 mM NaIO4 in 50 mM NaOAc-buffer, pH 5,5 in een eindvolume van 100 μL gedurende 2 uur bij 25 °C en 500 tpm.
▪ Blus het overtollige periodaat: Voeg 30 μL 50% glycerol toe, meng goed en incubeer gedurende 30 minuten bij 25 °C en 500 tpm.
▪ Zuiveringsronde 4: Nachtelijke EtOH-neerslag.
Dag 6▪ Sla het 3′-geoxideerde RNA neer, was en droog.
3′-Kleurstof opzetstuk
▪ Resuspenderen in 95 μL 50 mM NaOAc, pH 6,0.
▪ Voeg 5 μL 2 mM hydrazide-gefunctionaliseerde kleurstofoplossing toe. Meng goed en incubeer gedurende 16 uur bij 25 °C en 500 tpm.
Dag 7▪ Zuiveringsronde 5: EtOH-neerslag.
Dag 8▪ Sla het gelabelde RNA neer, was en droog.
▪ Centrifugale filtratie.
→ Elute het dual-end gelabelde RNA.

Tabel 1: Samenvatting van het protocol voor RNA dual-end labeling. Klik hier om deze tabel te downloaden.

figure-protocol-1
Figuur 1: De experimentele stroom van dual-end labeling door zich te richten op de 5'-fosfaat en de 3'-ribose suiker. Het 5'-fosfaat wordt geactiveerd met behulp van EDC in aanwezigheid van NHS en wordt vervolgens gekoppeld aan de amine-gefunctionaliseerde kleurstof. Het 3'-dioldeel van RNA wordt door periodaatactiviteit geoxideerd tot dialdehyde, dat verder reageert met de hydrazide-gefunctionaliseerde kleurstof. Voor dual-end labeling is het belangrijk om te beginnen met de 5'-labeling om cross-labeling te voorkomen, gevolgd door 3'-labeling met een tussenliggende blokkeringsstap. Afkortingen: EDC = carbodiimide; NHS = N-hydroxysuccinimide; MOPS = 3-morfolinopropaan-1-sulfonzuur; NaOAc = natriumacetaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. 5'-end labeling: gericht op het 5'-fosfaat door EDC/NHS-activering
    OPMERKING: Deze 5'-labelmethode is niet alleen van toepassing op RNA, maar op elk enkelstrengs nucleïnezuur dat een 5'-fosfaat bevat. De specificiteit van de reactie wordt bepaald door pH-afhankelijkheid, waardoor alleen het 5'-fosfaat plaatsspecifiek kan worden aangevallen, ondanks de aanwezigheid van meerdere fosfaten in de RNA-ruggengraat. Bij pH 6,0 is de unieke reactiviteit van het 5'-fosfaat ten opzichte van carbodiimiden te danken aan de specifieke protoneringstoestand, waarbij twee zuurstofatomen worden gedeprotoneerd en één geprotoneerd blijft. Dit maakt het 5'-fosfaat reactief, terwijl de volledig gedeprotoneerde ruggengraatfosfaten niet-reactief blijven, waardoor selectieve labeling van het 5'-uiteinde via EDC/NHS-targeting mogelijk is.
    1. Bereid de EDC-NHS-NaOAc, pH 6.0-oplossing voor. Meng 1,5 mg EDC en 2,0 mg NHS per aliquot in 35 μL ddH2O en 10 μL 0,5 M NaOAc, pH 6,0 (pH aangepast met ijsazijn).
    2. Aliquot het RNA van belang om ongeveer 50-75 μg RNA per buis te hebben in 55 μL ddH2O. Voeg 45 μL van het EDC-NHS-NaOAc, pH 6.0-mengsel toe aan het RNA en bereik een totaal volume van 100 μL met de eindconcentraties van 78 mM EDC, 174 mM NHS en 50 mM NaOAc, pH 6.0. Incubeer gedurende 4 uur bij 25 °C terwijl u schudt bij 500 tpm.
      OPMERKING: Hier komt 70 μg overeen met 250 pmol van een in vitro getranscribeerd 915 nt RNA en 2,5 μM in het uiteindelijke reactievolume van 100 μL.
    3. Zuiveringsronde 1: Zuivering van het 5'-fosfaat-geactiveerde RNA door EtOH-precipitatie.
    4. Bereid een 2 mM gesulfoneerde cyanine3-amine (sCy3-amine) oplossing in water.
    5. Resuspendeer de geactiveerde RNA-pellet in 95 μL 100 mM 3-morfolinopropane-1-sulfonzuur (MOPS)-buffer, pH 7,5 (pH aangepast met NaOH). Voeg 5 μL 2 mM sCy3-amine oplossing toe aan het geactiveerde RNA. Koppel de fluorofoor aan het geactiveerde 5'-fosfaat door incubatie gedurende 16 uur bij 25 °C, terwijl het schudt bij 500 tpm.
      OPMERKING: Bewaar de MOPS-buffer bij 4 °C in het donker. NaOH wordt gekozen voor pH-aanpassing om het groep II intron ribozym inactief te houden. De fluorofoor moet ten minste 40 keer meer dan het RNA bevatten.
    6. Zuiveringsronde 2: Verhoog het volume door 200 μL ddH2O toe te voegen om de scheiding te verbeteren. Zuiver het 5'-fosfaat-gelabelde RNA door EtOH-precipitatie en herhaal totdat het supernatans kleurloos is (meestal zijn twee rondes nodig).
    7. Blokkeerstap: Resuspendeer het RNA in 100 μL 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, en incubeer gedurende 2 uur bij 25 °C en 500 rpm. Alleen voor 5'-end single-labeling slaat u de blokkeringsstap over, resuspendeert u het RNA in ddH2O en gaat u verder met stap 1.1.8. Voor de eenvoud moet u echter bij dubbele etikettering de 5'-end enkelvoudige gelabelde besturing pas na stap 1.1.9 scheiden.
      OPMERKING: Deze stap dient om de geactiveerde 5'-fosfaten die niet zijn gekoppeld aan een amine-gefunctionaliseerde fluorofoor te blokkeren door te reageren met een relatief kleinere primaire aminebron (bijv. Tris) om het risico van kruisetikettering met de hydrazide-gefunctionaliseerde fluorofoor die wordt gebruikt voor het 3'-end labelingprotocol te minimaliseren.
    8. Zuiveringsronde 3: Verwijder de vrije kleurstoffen door het gelabelde RNA te wassen door centrifugale filtratie met in totaal ten minste 10 ml ddH2O, en vervolgens te elueren in ddH2O.
      OPMERKING: De moleculaire afsnijding van het filter moet minder dan de helft van de grootte van het nucleïnezuur zijn. Buffer naar keuze kan worden gebruikt in plaats van ddH2O. Elution moet de instructies van de fabrikant volgen en ervoor zorgen dat het monster niet volledig droog wordt gesponnen.
    9. Bepaal de RNA- en geconjugeerde kleurstofconcentraties met behulp van UV-VIS-spectroscopie.
  2. 3'-end labeling: Gericht op de 3'-ribose door periodieke oxidatie
    1. Aliquot het 5'-end gelabelde RNA in ddH2O om ongeveer 50-75 μg RNA per buis in 90 μL te hebben. Als het elutievolume van de vorige stap hoog was, wat resulteerde in een lage concentratie, concentreer het RNA dan door de pellet te precipiteren en te resuspenderen in ddH2O. Voeg 5 μL 1,0 M NaOAc-buffer toe, pH 5,5 (overeenkomend met 50 mM NaOAc, pH 5,5 voor 100 μL reactievolume).
      OPMERKING: Net als bij het 5'-end single-gelabeld RNA, bereiden we routinematig 3'-end single-labeled RNA voor als controle. Om dit te doen, aliquot het niet-gelabelde RNA om ongeveer 50-75 μg RNA per buis te hebben in 86 μL ddH2O.
    2. Voeg 4 μl vers bereide 500 mM natriummetaperiodaat (NaIO4) bouillonoplossing toe (overeenkomend met 10 mM NaIO4 voor een reactievolume van 100 μl). Voeg voor 3'-end enkelvoudige etikettering 8 μL NaIO4-voorraadoplossing toe (overeenkomend met 20 mM NaIO4 voor een reactievolume van 100 μL). Meng grondig en incubeer gedurende 2 uur bij 25 °C terwijl het schudt op 500 tpm onder donkere omstandigheden, aangezien NaIO4 lichtgevoelig is.
      OPMERKING: Verander de volgorde van toevoeging niet en verleng de incubatietijd niet verder, aangezien dit kan leiden tot fotobleken van de bijgevoegde donorkleurstof. De gebruikte concentratie van NaIO4 wordt met de helft verlaagd voor dual-end labeling om het blussen van de reeds gehechte kleurstof aan het 5'-uiteinde te minimaliseren.
    3. Stop de reactie door 30 μL 50% glycerol toe te voegen. Incubeer gedurende 30 minuten bij 25 °C terwijl u schudt bij 500 tpm.
      OPMERKING: Glycerol dient als diol om het teveel aan periodaat te doven.
    4. Zuiveringsronde 4: Voeg 400 μL ijskoud EtOH-NaOAc-neerslagmengsel toe en voer ethanolprecipitatie uit.
    5. Resuspendeer de geoxideerde RNA-pellet in 95 μl 50 mM NaOAc, pH 6,0.
    6. Hydrazide-kleurstofopzetstuk: Bereid de fluorofooroplossing voor door enkele kristallen van Cyanine5-hydrazide (Cy5-hydrazide) op te lossen in DMSO en vervolgens te verdunnen met ddH2O tot een concentratie van 2 mM. Als de fluorofoor naar keuze in water oplosbaar is, bereid de oplossing dan voor in ddH2O. Voeg 5 μL 2 mM Cy5-hydrazideoplossing toe aan het geoxideerde RNA. Meng goed en incubeer gedurende 16 uur bij 25 °C terwijl je schudt op 500 tpm.
      OPMERKING: De fluorofoor moet ten minste 40 keer meer dan 40 keer meer van het RNA hebben.
    7. Zuiveringsronde 5: Zuiver het dual-end-gelabelde RNA (of 3'-end single gelabeld RNA) door EtOH-precipitatie en centrifugale filtratie, vergelijkbaar met respectievelijk stap 1.2.6 en 1.2.8, en elute in ddH2O.
    8. Bereken de RNA- en geconjugeerde kleurstofconcentraties door middel van UV-VIS-spectroscopie.
    9. Karakteriseer het gelabelde RNA met behulp van analytische op gel gebaseerde assays, ensemblefluorescentiespectroscopie (zie de sectie Representatieve resultaten ) en/of analytische HPLC zoals elders weergegeven3.

2. Voorbereiding van de microfluïdische kamer

OPMERKING: We raden aan om zes of acht kamers tegelijk te hanteren. Sonicatie wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven. Dit protocol beperkt het gebruik van organische oplosmiddelen, zoals aceton, om de oplosbaarheid van sporenonzuiverheden te voorkomen. Voor alternatieven, zie referenties 15,16.

  1. Reiniging
    1. Boor met een diamantboormachine vier gaten in de kwartsgeleiders volgens het schema in figuur 2A om twee kanalen te vormen.
      OPMERKING: Hoewel ze gemakkelijker kunnen breken tijdens het boren, zijn glasplaatjes een kosteneffectief alternatief voor kwartsobjectglaasjes voor objectieve-TIRF-microscopieopstellingen waarbij het dekglaasje het beeldvormingsoppervlak is (Figuur 2B). Dit is geen optie voor op prisma gebaseerde TIRF-opstellingen, waarbij het microscopieglaasje het beeldvormingsoppervlak is als gevolg van achtergrondfluorescentie.
      OPMERKING: U kunt ook de gebruikte microfluïdische kamers16 recyclen. Dompel hiervoor de gebruikte kamers een nacht onder in aceton (wikkel de Coplin-kleurpot in aluminiumfolie om verdamping te minimaliseren) in de zuurkast en sonificeer daarna gedurende 5 minuten. Demonteer de kamer en gooi de dekglaasjes en de stickers weg. Als de demontage niet onmiddellijk werkt, sonificeer de kamer dan nog 10 minuten in aceton. Ga verder met stap 2.1.2.
    2. Plaats de geboorde kwartsglaasjes en ongeveer twee keer zoveel dekglaasjes (omdat ze gemakkelijk kunnen breken) in een glazen Coplin-kleurpotje met deksel. Spoel 3x met ddH2O. Sonicaat in ddH2O gedurende 5 min, spoel daarna 3x met ddH2O.
    3. Sonicaat in 10% laboratoriumglaswerk reinigingsoplossing (zie Materiaaltabel) gedurende 30 minuten bij 50 °C. Spoel minimaal 3x met ddH2O tot de wasmiddelbelletjes verdwenen zijn. Sonicaat in ddH2O gedurende 5 min. Spoel 3x met ddH2O.
    4. Sonicaat in 1 M KOH-oplossing gedurende 30 minuten en laat dan een nacht staan. Spoel 3x af met ddH2O. Sonicaat in ddH2O gedurende 5 min. Spoel 3x met ddH2O.
      OPMERKING: Hoewel corrosie als gevolg van overmatige incubatie een punt van zorg is dat eerder door Chandradoss et al.15 naar voren is gebracht, raden we deze lange incubatie aan die het mogelijk maakt om Piranha-etsen te vermijden.
    5. Droog de objectglaasjes en dekglaasjes af met N2(g).
    6. Behandel de gedroogde glaasjes en dekglaasjes gedurende 30 minuten met zuurstofplasmareiniger volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Aminosilanisatie
    1. Bereid de 3% APTES-EtOH-oplossing door 288,5 ml absolute EtOH, 1,5 ml ddH2O en 9 ml (3-aminopropyl)triethoxysilaan (APTES) grondig te mengen in een erlenmeyer van 500 ml.
    2. Doe de schone objectglaasjes en dekglaasjes in een Coplin-kleurpotje, dompel ze onder in de 3% APTES-EtOH-oplossing, sonificeer gedurende 1 minuut en incubeer gedurende 30 minuten.
    3. Spoel 3x met absolute EtOH, daarna 3x met ddH2O.
    4. Droog de objectglaasjes en dekglaasjes onder stroom N2(g).
  3. Oppervlaktepassivering en biotinylering
    1. Bereid een vochtige doos voor door een leeg pipetpuntdoosje tot de helft te vullen met ddH2O. Plaats de objectglaasjes in de doos, met de te behandelen kant naar boven.
    2. Bereid het bPEG-mPEG-mengsel vers in een steriel schone microcentrifugebuis van 1,5 ml door voorzichtig 2 mg biotine-polyethyleenglycol-succinimidylvaleraat 5000 (biotine-PEG-SVA) en 80 mg methoxypolyethyleenglycol-succinimidylvaleraat (mPEG-SVA) te mengen in 640 μL 100 mM natriumbicarbonaat (NaHCO3) buffer, pH 8,3. Centrifugeer het bPEG-mPEG-mengsel bij 16.000 × g gedurende 1 minuut om eventuele luchtbellen te verwijderen.
    3. Verwijder voorzichtig het supernatans en voeg een druppel van 30 μL toe aan het midden van het objectglaasje om beide kanalen te bedekken. Plaats een extra druppel aan één kant van de dia om een extra gePEGyleerd dekglaasje te hebben, omdat ze gemakkelijk breken, en het is handig om een reserve te hebben. Dek ten slotte de druppel af met een schoon dekglaasje, sluit de vochtige doos en voer de PEGylatie 's nachts uit onder donkere omstandigheden.
    4. Spoel de PEG-gepassiveerde en gebiotinyleerde objectglaasjes en dekglaasjes grondig af met ddH2O. Let op de verandering in de hydrofobiciteit van de behandelde oppervlakken. Droog onder N2(g) stroom.
  4. Assemblage van microfluïdische kamers
    1. Knip een dubbelzijdige sticker om de kanalen te maken. Bevestig de sticker op de dia en zorg ervoor dat deze het interessegebied bedekt. Plaats het dekglaasje er voorzichtig op en lijn het zo uit dat de gePEGyleerde oppervlakken naar elkaar toe wijzen.
    2. Plaats elke geassembleerde kamer in een centrifugebuis van 50 ml en vul de buisjes met N2(g) en bewaar ze maximaal 1 maand bij -20 °C.

figure-protocol-2
Figuur 2: FRET-TIRF-microscopie met één molecuul. (A) Microfluïdische kamer voor TIRF-beeldvorming. (B) FRET-gelabeld RNA wordt ingekapseld in een gebiotinyleerd fosfolipidenblaasje en geïmmobiliseerd op een met steptavidine gecoat glasoppervlak. Dit houdt het betreffende molecuul binnen het vluchtige veld (grijsgradiënt), dat wordt gecreëerd door het invallende licht dat volledig wordt gereflecteerd onder de kritische hoek in TIRF-microscopie. Hier worden beide fluoroforen vervolgens opgewonden met het ALEX-schema. Afkortingen: FRET = Förster Resonance Energy Transfer; TIRF = Fluorescentie van totale interne reflectie; ALEX = alternatieve laserexcitatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Inkapseling van fosfolipideblaasjes

  1. Bereiding van lipidencake
    NOTITIE: Behandel chloroform altijd onder een zuurkast.
    1. Prik met een steriele naald gaatjes in het deksel (van binnen naar buiten) van steriel schone microcentrifugebuisjes van 2,0 ml, zoals weergegeven in afbeelding 3A.
    2. Bereid de 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-cap biotinyl (bPE) stockoplossing door ten minste 2 mg bPE op te lossen in de juiste hoeveelheid chloroform tot een eindconcentratie van 1 mg/ml.
    3. Bereid de 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DMPC) stockoplossing door ten minste 10 mg DMPC op te lossen in de juiste hoeveelheid chloroform tot een eindconcentratie van 10 mg/ml.
    4. Bereid het bPE-DMPC-mengsel (met behoud van de verhouding 1:99 w/w) door 100 μl bPE en 990 μl DMPC-bouillonoplossingen te mengen. Verdeel 109 μL van het bPE-DMPC-mengsel per buisje van 2 ml.
    5. Plaats een kartonnen celscheidingsinzet van een opbergdoos voor microbuisjes in een Schlenk-kolf en dient als buishouder. Plaats met een lang pincet de buisjes met het lipidenmengsel in de buishouder in een Schlenk-kolf van 500 ml (Figuur 3B).
      NOTITIE: Zorg ervoor dat ze rechtop staan en niet gekanteld zijn.
    6. Verdamp de chloroform onder een laag debiet van N2(g) 's nachts (of gedurende ten minste 2 uur totdat het oplosmiddel volledig is verdampt).
    7. Dicht de buizen af met Parafilm om de gaten af te dekken. Bewaar de lipidenkoeken maximaal 1 maand bij -20 °C.
  2. RNA-inkapseling
    1. Bereid de volgende buffers en oplossingen voor door de K+- en Mg2+- concentraties aan te passen aan het biologische systeem van belang.
      1. Bereid de 5x standaard buffer voor (5x SB): 2,5 M KCl, 400 mM MOPS; pas de pH aan naar 6,9 met KOH, steriel filter, en bewaar bij 4 °C in het donker (resp. 1x SB: 500 mM KCl, 80 mM MOPS, pH 6,9).
      2. Bereid de antiknipperbuffer (AB) voor: 100 mM MgCl2, Trolox, 1x SB, steriel filter en bewaar maximaal 1 week bij 4 °C in het donker.
        OPMERKING: Gebruik een spatelpunt van Trolox voor het uiteindelijke volume van 10 ml, vortex om te mengen en pas de pH aan.
    2. Monteer de extruder met behulp van een membraan van 100 nm polycarbonaat (PC) en een afvoerschijf van 10 mm polyester (PE), breng de spuit en de membranen in evenwicht met AB en verwarm tot 30 °C (of in wezen boven de DMPC-glasovergangstemperatuur van 24 °C).
    3. Meng 5 μL 1 μM dual-end gelabeld RNA en 45 μL AB (tot een totaal volume van 50 μL).
    4. Hydrateer de lipidenkoek met deze RNA-oplossing. Meng bij 30 °C gedurende 5 minuten door te schudden op 1.400 tpm en vervolgens gedurende 15 minuten op 700 tpm. Centrifugeer gedurende 2 minuten op 13.000 g en breng het supernatans voorzichtig over in een nieuwe buis.
    5. Verdun het monster met 250 μl AB.
    6. Vul de spuit met de RNA-lipide suspensie. Extrudeer 35x bij 30 °C op een verwarmingsblok om het dual-end-gelabelde RNA in te kapselen in fosfolipideblaasjes met een diameter van 100 nm.
      OPMERKING: De grootteverdeling van blaasjes na gebruik van de extruder kan worden gevalideerd door dynamische lichtverstrooiing (DLS), zoals weergegeven in referentie11.

figure-protocol-3
Figuur 3: Bereiding van lipidenkoek. (A) De doppen van de buis worden geprikt om verdamping van het oplosmiddel mogelijk te maken. (B) Buisjes met het lipidenmengsel worden in een Schlenk-kolf geplaatst en de chloroform wordt verdampt om een lipidenkoek te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. smFRET-TIRF-microscopie

  1. Oppervlakte immobilisatie
    1. Bereid de volgende buffers en oplossingen voor.
      1. Bereid de suiker-antiknipperbuffer (SAB): 1% D-glucose (w/v) voor in AB, steriel filter, en bewaar bij 4 °C in het donker gedurende maximaal 1 week.
      2. Bereid de 100x OSS voor: 100x Oxygen scavenging system (OSS): 3 mg glucoseoxidase (overeenkomend met 1,7 E), 10 μL catalase (overeenkomend met 22 E) in 90 μL van 1x SB, bewaren bij 4 °C in het donker gedurende maximaal 1 week.
      3. Bereid de beeldvormingsbuffer (IB) vers voor door 198 μL SAB en 2 μL 100x OSS-oplossing te mengen.
    2. Laat de microfluïdische kamer op kamertemperatuur komen. Spoel de kamer 2x door met 200 μL 1x SB.
    3. Vul de kamer met 50 μL 20 μL/ml streptavidine-oplossing en incubeer gedurende 5 minuten.
    4. Spoel de kamer met 200 μL 1x SB en vervolgens met 100 μL AB.
    5. Immobiliseer het ingekapselde RNA op het oppervlak door 75 μL blaasjessuspensie toe te voegen en gedurende 10 minuten te incuberen.
    6. Spoel de kamer met 200 μL vers bereide IB en incubeer gedurende 5 minuten.
    7. De kamer is nu klaar voor data-acquisitie (Figuur 2B). Om verdamping tijdens lange metingen te voorkomen, dicht u de gaten af zoals weergegeven in figuur 2A. Als lekken van kanaal naar kanaal van belang zijn, dicht dan het ongebruikte kanaal af voordat u het oppervlakte-immobilisatieprotocol start.
      OPMERKING: We raden aan om blancometingen uit te voeren als kwaliteitscontrole voor de reinheid van de microfluïdische kamers en fosfolipideblaasjes tegen fluorescentieverontreinigingen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren de plaatsspecifieke enkelvoudige en dubbele fluorescerende labeling van het 915-nt RNA van belang, het gistmitochondriale Sc.ai5γ groep II-intron, geflankeerd door exonische sequenties. Het FRET-fluorofoorpaar wordt aan de RNA-uiteinden gepositioneerd via EDC/NHS-activering van het 5'-fosfaat en periodieke oxidatie van de 3'-ribose, gevolgd door de respectieve kleurstofaanhechtingen. Vervolgens hebben we de RNA-kleurstofconjugaten geverifieerd door middel van fluorescerende gelelektroforese, zoals weergegeven in figuur 4A. De co-migratie van RNA en de fluoroforen op de agarosegel bevestigt de succesvolle etikettering. Vervolgens, zoals weergegeven in figuur 4B, werd ensemblefluorescentiespectroscopie gebruikt om het dubbel gelabelde groep II-intron te karakteriseren. Energieoverdracht, d.w.z. FRET, werd waargenomen bij excitatie van de donorkleurstof, wat de dubbele etikettering van het RNA bewees. Met name het vouwen van het groep II-intron RNA in aanwezigheid van metaalionen leidde, in overeenstemming met de afstandsafhankelijke aard van FRET, tot een toename van de FRET-efficiëntie, zoals blijkt uit de afname van de donoremissie (groene pijl) en een overeenkomstige toename van de acceptoremissie (rode pijl). Dit geeft aan dat deze FRET-etikettering de conformationele veranderingen van het ribozym bijhoudt.

figure-results-1
Figuur 4: Karakterisering van de RNA-kleurstofconjugaten. (A) Analytische gelgebaseerde analyse van enkelvoudig en dubbel fluorescerend gelabeld RNA toont de co-migratie van de kleurstoffen met het RNA op een 2% agarosegel. Co-lokalisatie van de fluoroforen in het dubbel gelabelde monster wordt aangegeven door de gele band in het samengevoegde beeld (onder) van de Cy3 (boven, groen) en Cy5 (midden, rood) kanalen, gevisualiseerd onder respectievelijk 532 nm en 635 nm verlichting. Baan 1: 5'-sCy3 alleen gelabeld RNA, baan 2: 3'-Cy5 alleen gelabeld RNA en baan 3: dual-end (5'-sCy3 en 3'-Cy5) gelabeld RNA. (B) Ensemblefluorescentiespectroscopie bevestigt dubbele labeling. Energieoverdracht bij excitatie door de donor (λex = 515 nm, λem = 670 nm) verifieert dat beide kleurstoffen met succes aan het RNA zijn gekoppeld. De grijze curve vertegenwoordigt het emissieprofiel van het prekatalytische RNA, terwijl de zwarte curve een verhoogde FRET-efficiëntie laat zien in het gevouwen groep II-intron-RNA (geïncubeerd met 500 mM KCl bij 70 °C gedurende 3 minuten, afgekoeld tot 42 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door de toevoeging van 100 mM MgCl2). Deze figuur is een bewerking van Ahunbay et al.3 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Met het fluorescerend dual-labeled wild-type groep II intron in de hand, zijn we nu gepositioneerd om de dynamiek ervan op het niveau van één molecuul te onderzoeken. Eenmaal ingekapseld in fosfolipideblaasjes, wordt het gelabelde RNA geïmmobiliseerd op een microscopieoppervlak met zeer lage oppervlaktedichtheden om een resolutie van één molecuul voor smFRET-TIRF te bereiken. Zoals te zien is in figuur 5A, kunnen meerdere individuele moleculen tegelijkertijd worden gevolgd. TIRF-microscopie maakt het mogelijk om de FRET-efficiëntie en de veranderingen ervan in de loop van de tijd in realtime te monitoren. Figuur 5B illustreert de statische en dynamische FRET-sporen van één molecuul van het gelabelde en ingekapselde RNA. Een typisch dynamisch spoor vertoont anticorrelatie tussen donor- en acceptorsignalen die de FRET-efficiëntie fluctueren. Wanneer de acceptoremissie bij donorexcitatie toeneemt, neemt de donoremissie dienovereenkomstig af, wat wijst op een dynamische verandering in de afstand tussen de kleurstoffen. Deze anticorrelatie suggereert conformationele veranderingen in het RNA-molecuul.

figure-results-2
Figuur 5: Zeer dynamisch gedrag van groep II intron RNA onthuld door smFRET. Het dual-end gelabelde groep II intron RNA is ingekapseld in een fosfolipideblaasje en geïmmobiliseerd op het oppervlak voor beeldvorming met een op objectieven gebaseerde TIRF-microscoop. (A) Samengevoegd beeld van individueel gelabelde RNA-moleculen die donoremissie (sCy3, groen) en acceptoremissie (Cy5, rood) vertonen bij excitatie van 532 nm. (B) De typische smFRET-trajecten van (links) een statisch RNA-molecuul waarbij de donor- en acceptorintensiteiten niet fluctueren in de tijd en (rechts) een dynamisch RNA-molecuul, waar de donor- en acceptorintensiteiten anticorreleren, met FRET-efficiëntie in geel. Enkelvoudige moleculen worden gelokaliseerd en geanalyseerd met behulp van MASH-FRET17. Directe excitatie, doorbloeding en γ-factorcorrecties worden toegepast. Afkortingen: smFRET = single-molecule Förster Resonance Energy Transfer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRET op het niveau van één molecuul is uniek omdat het de observatie en analyse van individuele moleculen mogelijk maakt, waardoor de heterogeniteit van monsters wordt onthuld en voorbijgaande toestanden worden vastgelegd die kunnen worden verdoezeld in ensemblemetingen 1,2. Het observeren van individuele RNA-moleculen met behulp van smFRET biedt inzichten met hoge resolutie in hun vouwroutes en dynamiek. Dit protocol beschrijft de chemische dual-end labeling van RNA en de immobilisatie van het oppervlak via inkapseling van fosfolipideblaasjes, die samen het volgende mogelijk maken dynamische conformationele veranderingen mogelijk te volgen via smFRET-TIRF-microscopie.

Het bestuderen van RNA-dynamica is een voortdurend groeiend vakgebied met de behoefte aan nieuwe locatiespecifieke fluorescerende labelstrategieën. We labelen de RNA-uiteinden door het 5'-fosfaat te richten op carbodiimiden en de 3'-ribosesuiker op periodaat. Deze benaderingen zijn eerder beschreven (5'-end18,19 en 3'-end 19,20,21,22), maar zijn niet eerder toegepast op een RNA van vergelijkbare grootte als het wild-type Sc.ai5γ groep II intron ribozym, dat optimalisatie vereiste. Carbodiimide (bijv. EDC) activering van het 5'-fosfaat is omkeerbaar. Daarom werd imidazol gebruikt om onomkeerbaar te reageren met het tussenproduct O-acylisoureum om een zeer reactief fosforimidazolide te vormen 19,20. Het is nu echter bekend dat carbodiimiden bij een hogere pH nucleobasen kunnen wijzigen, met name guanines en uracils, wat onlangs heeft geleid tot hun gebruik als structurele sonderingsmiddelen 23,24.

Om kruisreactiviteit te voorkomen, is het van cruciaal belang om het geactiveerde RNA uit de EDC te zuiveren voordat de pH wordt verhoogd tot 7,5 voor de kleurstofkoppelingsstap. Toen we echter een zuiveringsstap introduceerden tussen de activering en het kleurstofopzetstuk25, verkregen we zeer lage opbrengsten. Analoog kunnen bij eiwitetikettering oppervlakte-toegankelijke lysineresiduen worden geactiveerd met carbodiimiden. In plaats van imidazol, dat de omkering van de activering voorkomt, wordt echter routinematig NHS gebruikt. We hebben deze strategie ook overgenomen, waarbij we het fosforimidazolide-tussenproduct hebben vervangen door een NHS-fosfaattussenproduct. Op deze manier bereikten we een pH-regeling en een verhoogde etiketteringsdichtheid bij lagere temperaturen en kortere incubatietijden, d.w.z. 25 °C gedurende 4 uur vergeleken met 37 °C gedurende 16 uur. Deze 5'-labelstrategie is ontwikkeld voor RNA en kan worden toegepast op elk ander enkelstrengs nucleïnezuur met een 5'-fosfaat.

De 5'-fosfaatactivering en 3'-ribose-oxidatie sloten elkaar uit, omdat de chemie niet orthogonaal is. Om deze uitdaging te overwinnen en cross-labeling te voorkomen, zijn we begonnen met het 5'-uiteinde, gevolgd door een blokkeringsstap om de geactiveerde maar niet gelabelde sites te blokkeren voordat we verder gingen met het 3'-eindlabelen. Tijdens het oxideren van het 3'-diol kan een teveel aan natriummetaperiodaat (NaIO4) de reeds gehechte fluorofoor aan het 5'-uiteinde doven. Daarom hebben we de concentratie van NaIO4 die wordt gebruikt voor enkelvoudige etikettering verlaagd van 20 mM naar 10 mM.

We raden aan om met meerdere aliquots parallel te werken in plaats van de reacties op te schalen. Dit protocol vereist meerdere ethanol (EtOH) precipitatiestappen. Als u met meerdere aliquots parallel werkt, bereidt u een neerslagmengsel voor (30 ml 100% absolute EtOH en 1 ml 3 M NaOAc, pH 5,2). NaCl wordt niet gebruikt vanwege de lage oplosbaarheid in EtOH. Precipiteer het RNA met 3,1 vol. van dit mengsel door nachtelijke incubatie bij -20 °C, gevolgd door centrifugeren. Was de RNA-pellet twee keer met 500 μL ijskoude 70% EtOH, centrifugeer na elke keer op 4 °C en droog onder vacuüm. EtOH-precipitatie maakt gebruik van de onoplosbaarheid van het RNA en de oplosbaarheid van de vrije kleurstoffen in 70% ethanol. Centrifugale filtratie verwijdert effectief vrije kleurstoffen vanwege hun aanzienlijke verschil in grootte van RNA en vergemakkelijkt de bufferuitwisseling, waardoor zouten worden geëlimineerd. Naast EtOH-precipitatie- en centrifugale filtratiemethoden kunnen vrije kleurstoffen ook worden verwijderd met behulp van gelextractie en/of chromatografietechnieken (bijv. HPLC); De schaal moet echter dienovereenkomstig worden aangepast. Draai geen lange RNA's om te resuspenderen, omdat dit mechanische afschuiving kan veroorzaken26. Het optimale moment om het protocol te pauzeren is wanneer het RNA is gepelleteerd. We gebruiken DNA-buizen met een lage binding om het herstel van nucleïnezuren te verbeteren. Hoewel het uiteindelijke reactievolume 100 μL is, wordt de voorkeur gegeven aan buisjes van 1,5 ml (en niet met een lager volume) voor een betere zuivering door EtOH-precipitatie.

Nadat de niet-gereageerde vrije kleurstoffen waren verwijderd door precipitatie en centrifugale filtratie, bevestigden we de etikettering door middel van fluorescerende gelelektroforese (Figuur 4A), UV-VIS-spectroscopie, analytische HPLC3. Het is echter belangrijk op te merken dat deze methoden geen onderscheid kunnen maken tussen een RNA-molecuul dat zowel fluoroforen draagt als een mengsel van RNA's, elk gelabeld met een enkele kleur. Evenzo kunnen ze niet worden gebruikt om te bepalen of een RNA-molecuul meerdere fluoroforen van dezelfde kleur draagt. Massaspectrometrie kan niet worden gebruikt vanwege beperkingen in de grootte. Ensemble3 - en FRET-spectroscopieën met één molecuul bevestigen de etikettering van dubbele fluorescentie, zoals weergegeven in figuren 4B en 5B. De stoichiometrie van 0,5 (sCy3 tot Cy5 verhouding van 1:1) in smFRET-experimenten bevestigt de gelijke conjugatie van de twee fluoroforen. Een punt van zorg was de dubbele etikettering aan het 3'-einde door beide aldehyden te labelen in plaats van de voorgestelde cyclisatie. Het ontbreken van soorten met een stoichiometrie van 0,25 (sCy3 tot Cy5 verhouding van 1:2) in smFRET-experimenten suggereert dat de kleurstofaanhechting de aanhechting van een tweede kleurstof sterisch belemmert en verhindert.

Met deze dubbele fluorescerende labeling kunnen FRET-signaalveranderingen worden toegeschreven aan structurele herschikkingen tijdens RNA-vouwing en katalyse. Om fluorescerend gelabeld RNA binnen het vluchtige veld te houden voor TIRF-beeldvorming met één molecuul, heeft inkapseling de voorkeur boven directe oppervlaktetethering. Deze aanpak omvat het vangen van individuele RNA-moleculen in lipide dubbellagen van blaasjes, waardoor een gecontroleerde omgeving wordt gecreëerd die bevorderlijk is voor het observeren van hun dynamisch gedrag. Het beschreven protocol verrijkt de mono-inkapseling, zoals fotobleken in één stap aantoont11. Om de vouwing en functie van RNA te begrijpen, is het overbruggen van de in vitro en in vivo kloof essentieel27. Moleculaire verdringingsmiddelen kunnen de omstandigheden in cellen nabootsen om RNA-katalyse te verbeteren door groep II-introns 7,28. Als alternatief creëert inkapseling beperkte micro-omgevingen die RNA-vouwing bevorderen29, waardoor ons begrip van de structuur en dynamiek van RNA dichter bij een realistische cellulaire context komt.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiële steun van de Swiss National Science Foundation [200020_192153 aan RKOS], de UZH Forschungskredit [FK-20-081 aan EA], de UZH Stiftung für wissenschaftliche Forschung [aan RKOS en SZP], Graduate Research Campus (GRC) Short Grant [2024__SG_092 aan EA], de Graduate School of Chemical and Molecular Sciences Zurich (CMSZH) en de Universiteit van Zürich wordt dankbaar erkend.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RNA labeling
1.5 mL DNA LoBind tubes Eppendorf 30108035
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC-HCl of EDC)Thermo Scientific11844071Pierce EDC, No-Weigh Format. Bewaar bij  -20 °C
3-morfolinopropaan-1-sulfonzuur (MOPS)Sigma-Aldrich69947BioUltra, voor moleculaire biologie, ≥99.5% (titratie)
Azijnzuur (glazuur)Sigma-Aldrich1.00063100%, watervrij voor analyse EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Centrifugeerfiltratie-eenheid SartoriusVS0132Vivaspin 500, MWCO 50.000, PES, 500 μL
Cyanine5 hydrazide (Cy5-hydrazide)Lumiprobe230705 mg, CAS-nummer 1427705-31-4 
Dimethylsulfoxide (DMSO)New England Biolabs12611PMolecuulbiologiekwaliteit
EthanolVWR Chemicals20821.296PAbsoluut ≥99,8%
GlycerolSigma-AldrichG5516voor moleculaire biologie, ≥99.0%
Zoutzuur (HCl)Sigma-Aldrich1.00317rookzuur 37%, voor analyse EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur
N-hydroxysuccinimide (NHS)Sigma-Aldrich13067298%
Natriumacetaat (NaOAc) Sigma-AldrichS8750watervrij, ReagentPlus, ≥99.0%
Natriummetaperiodaat (NaIO4)Thermo Fisher Scientific, Life Technologies20504Pierce productlijn
Sulfo-Cyanine3 amine (sCy3-amine)Lumiprobe213C05 mg, CAS-nummer 2183440-43-7
Tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris)Biosolve200923Molecuulbiologiekwaliteit
Kamervoorbereiding
3-aminopropyl)triethoxysilaan (APTES) Sigma-Aldrich44014099%
AcetonSigma-Aldrich1.00014voor analyse EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Biotine-polyethyleenglycol-succinimide valeraat (biotine-PEG-SVA, bPEG) en Methoxypolyethyleenglycol-succinimide valeraat (mPEG-SVA)Laysan Bio, Inc.BIO-PEG-SVA, MW 5.000 en MPEG-SVA, MW 5.000 - Combo Kit
DekglasjesCarl RothH876.224 x 24 mm, 0.13-0.16 mm dikte
Deconex 11 universeelBorer Chemie AG17416492Reinigingsoplossing voor laboratoriumglaswerk
Diamantgecoate kernboorCrystalite Corporation1 mm dikte
Diamantborer
EthanolVWR Chemicals20821.296PAbsoluut ≥99,8%
Glazen Coplin-kleefpot met deksel
BeeldruimteGrace Bio-Labs654008SecureSeal, 8 putjes,  9 mm × 0.12 mm
ZuurstofplasmareinigerZepto OneDiener
Kaliumhydroxide (KOH)Sigma-AldrichP9541voor moleculaire biologie, ≥99.0%
KwartsglazenG. Finkenbeiner, Inc.7.5 x 2.5 cm, 1 mm dikte
Natriumbicarbonaat (NaHCO3) Sigma-AldrichS6297BioXtra, 99.5-100.5%
Bereiding van lipidecake
16:0 Biotinyl Cap PE, bPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(cap biotinyl) (natriumzout), C53H98N4O11PNaS)Avanti Polar Lipids870277P1 jaar stabiel bij -20 °C
14:0 PC, DMPC (1,2-dитеtradecanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine of 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine, C36H72NO8P)Avanti Polar Lipids850345P
2.0 mL microcentrifugebuizen, Safe-LockEppendorf0030120094Autoclaveer voor sterilisatie
500 mL Schlenk-kolf
ChloroformMerck1.02445voor analyse EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Parafilm
Oppervlakte-immobilisatie via encapsulatie
(±)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromaan-2-carbonzuur (Trolox®)Thermo Fischer53188-07-197%
3-morfolinopropaan-1-sulfonzuur (MOPS)Sigma-Aldrich69947BioUltra, voor moleculaire biologie, ≥99.5% (titratie). Bewaren bij +4 °C in het donker.
Zelfklevende verzegelingstabsGrace Bio-Labs 629200
CatalaseSigma-Aldrich9001-05-2, C30uit runderlever, waterige suspensie, 10.000-40.000 eenheden/mg eiwit
D-glucoseSigma-AldrichG7528≥99.5

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eitan, L., et al. FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices. Elife. 10, e60416(2021).
  2. Taekjip, H., et al. Fluorescence resonance energy transfer at the single-molecule level. Nat Rev Methods Primers. 4, 22(2024).
  3. Ahunbay, E., Steffen, F. D., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. Chemical dual end-labeling of large ribozymes. Methods Mol Biol. 2439, 191-204 (2022).
  4. Ahunbay, E., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. Group II Introns: Highly structured yet dynamic. Chimia (Aarau). 77 (4), 235-241 (2023).
  5. Steiner, M., Karunatilaka, K. S., Sigel, R. K. O., Rueda, D. Single-molecule studies of group II intron ribozymes. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (37), 13853-13858 (2008).
  6. Karunatilaka, K. S., Solem, A., Pyle, A. M., Rueda, D. Single-molecule analysis of Mss116-mediated group II intron folding. Nature. 467 (7318), 935-939 (2010).
  7. Paudel, B. P., Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O., Rueda, D. S. Optimal molecular crowding accelerates group II intron folding and maximizes catalysis. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (47), 11917-11922 (2018).
  8. Saha, R., Verbanic, S., Chen, I. A. Lipid vesicles chaperone an encapsulated RNA aptamer. Nat Commun. 9 (1), 2313(2018).
  9. Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in surface-tethered lipid vesicles as a new tool for single biomolecule spectroscopy. J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
  10. Cisse, I., Okumus, B., Joo, C., Ha, T. Fueling protein DNA interactions inside porous nanocontainers. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (31), 12646-12650 (2007).
  11. Zelger-Paulus, S., Hadzic, M. C. A. S., Sigel, R. K. O., Börner, R. Encapsulation of fluorescently labeled RNAs into surface-tethered vesicles for single-molecule FRET studies in TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 2331, 1-16 (2020).
  12. Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic. Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).
  13. Ishitsuka, Y., Okumus, B., Arslan, S., Chen, K. H., Ha, T. Temperature-independent porous nanocontainers for single-molecule fluorescence studies. Anal Chem. 82 (23), 9694-9701 (2010).
  14. Liu, B., Mazouchi, A., Gradinaru, C. C. Trapping single molecules in liposomes: surface interactions and freeze-thaw effects. J Phys Chem B. 114 (46), 15191-15198 (2010).
  15. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J Vis Exp. (86), e50549(2014).
  16. Paul, T., Myong, S. Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements. STAR Protoc. 3 (1), 101152(2022).
  17. Hadzic, M. C. A. S., Kowerko, D., Börner, R., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. Detailed analysis of complex single molecule FRET data with the software MASH. Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues IX. Farkas, D. L., Nicolau, D. V., Leif, R. C. SPIE 971119, (2016).
  18. Chu, B. C., Wahl, G. M. Le Orgel. Derivatization of unprotected polynucleotides. Nucleic Acids Res. 11 (18), 6513-6529 (1983).
  19. Qin, P. Z., Pyle, A. M. Site-specific labeling of RNA with fluorophores and other structural probes. Methods. 18 (1), 60-70 (1999).
  20. Whitfeld, P. R. A method for the determination of nucleotide sequence in polyribonucleotides. Biochem J. 58 (3), 390-396 (1954).
  21. Zamecnik, P. C., Stephenson, M. L., Scott, J. F. Partial purification of soluble RNA. Proc Natl Acad Sci USA. 46 (6), 811-822 (1960).
  22. Proudnikov, D., Mirzabekov, A. Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling. Nucleic Acids Res. 24 (22), 4535-4542 (1996).
  23. Wang, P. Y., Sexton, A. N., Culligan, W. J., Simon, M. D. Carbodiimide reagents for the chemical probing of RNA structure in cells. RNA. 25 (1), 135-146 (2019).
  24. Mitchell, D., et al. In vivo RNA structural probing of uracil and guanine base-pairing by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC). RNA. 25 (1), 147-157 (2019).
  25. Rinaldi, A. J., Suddala, K. C., Walter, N. G. Native purification and labeling of RNA for single molecule fluorescence studies. Methods Mol Biol. 1240, 63-95 (2015).
  26. Liu, T., Patel, S., Pyle, A. M. Making RNA: Using T7 RNA polymerase to produce high yields of RNA from DNA templates. Methods in Enzymology. , Academic Press. (2023).
  27. Leamy, K. A., Assmann, S. M., Mathews, D. H., Bevilacqua, P. C. Bridging the gap between in vitro and in vivo RNA folding. Q Rev Biophys. 49, e10(2016).
  28. Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O. Mimicking the in vivo Environment--The Effect of Crowding on RNA and Biomacromolecular Folding and Activity. Chimia. 69 (4), 207-212 (2015).
  29. Peng, H., Lelievre, A., Landenfeld, K., Müller, S., Chen, I. A. Vesicle encapsulation stabilizes intermolecular association and structure formation of functional RNA and DNA. Curr Biol. 32 (1), 86-96.e6 (2022).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RNA endlabelingRNA inkapselingfluorescente labelingfosfolipide vesikelsRNA vouwingsdynamiekcovalente FRET labelingoppervlakte immobilisatieRNA vesikelinkapseling

Gerelateerde artikelen