Methodenartikel

Glycomics-geleide glycoproteomics vergemakkelijkt uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen

DOI:

10.3791/67405

⸱

7 februari 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Natural Sciences, Faculty of Science and Engineering, Macquarie University, 2Institute for Glyco-core Research (iGCORE), Nagoya University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de glycomics-geleide glycoproteomics-methode, een geïntegreerde omics-technologie die uitgebreide inzichten biedt in het heterogene glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen die nodig zijn om de glycobiologie van kankers beter te begrijpen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glycosylering is een veel voorkomende en structureel diverse eiwitmodificatie die een breed scala aan tumorigene processen beïnvloedt. Massaspectrometrie-gedreven glycomics en glycoproteomics zijn naar voren gekomen als krachtige benaderingen om respectievelijk vrijgekomen glycanen en intacte glycopeptiden te analyseren, en bieden een beter begrip van het heterogene glycoproteoom in de micro-omgeving van de tumor (TME). Dit protocol beschrijft de glycomics-geleide glycoproteomics-methode, een geïntegreerde omics-technologie, die eerst gebruik maakt van poreuze grafitized carbon-LC-MS/MS-gebaseerde glycomics om de glycaanstructuren en hun kwantitatieve verdeling in de glycome van tumorweefsels, celpopulaties of lichaamsvloeistoffen die worden onderzocht, op te helderen. Dit maakt een vergelijkende glycomics-analyse mogelijk om veranderde glycosylering in patiëntengroepen, ziektestadia of aandoeningen te identificeren, en, belangrijker nog, dient om de stroomafwaartse glycoproteomics-analyse van hetzelfde monster (en) te verbeteren door een bibliotheek van bekende glycaanstructuren te creëren, waardoor de zoektijd naar gegevens en de verkeerde identificatiesnelheid van glycoproteïnen worden verkort. Met de nadruk op N-glycoproteoomprofilering, worden de monstervoorbereidingsstappen voor de glycomics-geleide glycoproteomics-methode in dit protocol beschreven en worden de belangrijkste aspecten van de gegevensverzameling en -analyse besproken. De glycomics-geleide glycoproteomics-methode biedt kwantitatieve informatie over de glycoproteïnen die aanwezig zijn in de TME en hun glycosyleringsplaatsen, plaatsbezetting en plaatsspecifieke glycaanstructuren. Representatieve resultaten worden gepresenteerd van in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde tumorweefsels van patiënten met colorectale kanker, wat aantoont dat de methode gevoelig en compatibel is met weefselsecties die vaak in biobanken worden aangetroffen. Glycomics-geleide glycoproteomics biedt daarom een uitgebreid beeld van de heterogeniteit en dynamiek van het glycoproteoom in complexe TME's, en genereert robuuste biochemische gegevens die nodig zijn om de glycobiologie van kankers beter te begrijpen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwitglycosylering is een veel voorkomende en complexe vorm van co- en posttranslationele modificatie van eiwitten die door soorten in de fylogenetische levensboom worden geproduceerd 1,2,3. Van de eiwitgekoppelde glycanen is bekend dat ze een impact hebben op een breed scala aan biologische processen die belangrijk zijn voor de menselijke gezondheid, waaronder bemiddeling en regulatie van cellulaire interacties en communicatiegebeurtenissen 4,5. Afwijkende eiwitglycosylering wordt verondersteld een oorzaak te zijn van kwaadaardige transformatie, tumorprogressie en verspreiding 6,7,8. Dit impliceert glycanen in belangrijke tumorigene processen in de tumormicro-omgeving (TME) en biedt een aanzienlijk en grotendeels onbenut potentieel voor de ontdekking van op glycaan gebaseerde biomarkers en therapeutische toepassingen. Glycobiologie krijgt daarom steeds meer aandacht in kankeronderzoek en in de biowetenschappen9.

Aangedreven door belangrijke ontwikkelingen in glycoanalyse en informatica in het afgelopen decennium 10,11,12,13,14,15,16,17, zijn vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS)-gedreven glycomics en glycoproteomics gevestigd als krachtige hulpmiddelen voor de systeembrede profilering van vrijgekomen glycanen en intacte glycopeptiden uit complexe mengsels van glycoproteïnen die rechtstreeks uit hun biologische monsteroorsprong worden geëxtraheerd, zoals verschillende soorten monsters van kankerpatiënten (bijv. tumorweefsels, celpopulaties, lichaamsvloeistoffen)3,13,18,19,20.

Glycomics geeft informatie over de structuur en hoeveelheid van het glycaanrepertoire (het glycoom), dat dynamisch wordt geproduceerd door cellen, weefsels en zelfs hele organismen. Aan de andere kant biedt glycoproteomics kwantitatieve informatie over de eiwitdragers en hun plaats(en) van glycosylering, de bezettingsgraad van de plaats (macro-heterogeniteit), de plaatsspecifieke glycaansamenstellingen en hun verspreidingspatroon op de plaats (microheterogeniteit) met beperkte informatie over de glycaanstructuur (vaak beperkt tot de glycaansamenstelling)15,16,21. Daarom zijn glycomics en glycoproteomics complementaire benaderingen om de biochemische details van het glycoproteoom22 te onderzoeken.

Er is een groot aantal methodologische ontwerpen en analytische strategieën voor glycomics en glycoproteomics ontwikkeld en toegepast in laboratoria, afhankelijk van de glycoanalyt die van belang is (bijv. N-/O-/C-gekoppeld, glycaan/glycopeptide/glycoproteïne, geëtiketteerd/niet-geëtiketteerd), de aard van het monster (bijv. cellen, weefsels, lichaamsvloeistoffen), hoeveelheid (nanogram/microgram/milligram eiwitniveaus) en het beschikbare analytische instrument23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32. Ondanks de erkende voordelen van hun parallelle gebruik, worden glycomics en glycoproteomics niet vaak samen toegepast, maar eerder als op zichzelf staande benaderingen in glycobiologische en kankeronderzoeken vanwege hun grote vraag naar analytische expertise en gespecialiseerde instrumentatie.

Toen we deze technologische kloof erkennen, introduceerden we meer dan tien jaar geleden de glycomics-geassisteerde glycoproteomics-methode, die in staat is om glycomics en glycoproteomics-gegevens verkregen uit complexe biologische monsterste integreren 33. Kortom, de glycomics-geassisteerde (of glycomics-geleide zoals in dit protocol) glycoproteomics-technologie profileert de N- en/of O-glycanen via een gevestigde poreuze grafitized carbon (PGC) LC-MS/MS-methode34,35, die vervolgens worden gebruikt voor de analyse van intacte N- en/of O-glycopeptidegegevens die zijn verkregen uit dezelfde steekproef (monsters) door de grenzen van de glycaanzoekruimtete definiëren 36. PGC-LC-MS/MS is een bijzonder krachtige glycomics-methode omdat het kwantitatief inzicht biedt in de glycome met een hoge gevoeligheid en structurele resolutie, wat informatie oplevert over de topologie (monosacharidesequentie en vertakkingspatroon) en glycosidische bindingen van glycanen, zelfs binnen complexe mengsels 35,37,38. De glycoproteomics-workflow omvat peptidegeneratie, optionele peptidelabeling, multiplexing en prefractionering, evenals verrijking vóór omgekeerde fase LC-MS/MS-analyse die idealiter gebruik maakt van verschillende fragmentatiemethoden, waaronder getrapte botsingsenergie/botsingsdissociatie met hogere energie (sceHCD, voor N-glycopeptiden) en elektronenoverdracht/botsingsdissociatie met hogere energie (EThcD, voor O-glycopeptiden) voor analytidentificatie. Voor N-glycoproteoomanalyse kan parallelle de-N-glycoproteomics de intacte N-glycopeptide-gegevensanalyse begeleiden door de eiwit/peptide-zoekruimte te definiëren en door meer details te verstrekken over de bezette N-glycosyleringsplaatsen en hun snelheid van sitebezetting, terwijl de parallelle analyse van niet-gemodificeerde peptiden eventuele veranderingen in het eiwitniveau tussen de bestudeerde omstandigheden aan het licht brengt.

Dit artikel biedt een gedetailleerd en gemakkelijk te volgen stap-voor-stap protocol voor de glycomics-geleide glycoproteomics-methode (zie Figuur 1 voor een overzicht van de workflow). Het protocol biedt experimentele details van de stappen voor de monstervoorbereiding en de LC-MS/MS-gebaseerde glycomics- en glycoproteomics-experimenten en presenteert representatieve resultaten die de toepassing van de methode op in formaline gefixeerde paraffine ingebedde (FFPE) weefselsecties van tumoren die zijn weggesneden van patiënten met colorectale kanker (CRC), waardoor inzicht wordt verkregen in de glycobiologie van de TME in een waardevol monstertype dat wordt gearchiveerd in kankerbiobanken over de hele wereld. De analyse en integratie van glycomics en glycoproteomics data worden ook kort besproken.

figure-introduction-1
Figuur 1: Overzicht van de glycomics-geleide glycoproteomics methode. Het overzicht toont gedetailleerde experimentele stappen in glycomics (links) en glycoproteomics (rechts) workflows, met een overzicht van de verkregen informatie (vetgedrukt) en hoe de twee benaderingen zijn geïntegreerd door verbeterde gegevensanalyse en interpretatie. Insert: Zelfgemaakte SPE-microkolommen die worden gebruikt voor de (i) glycomics en (ii-iii) glycoproteomics workflows. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie werd goedgekeurd door de Human Research Ethics Committee (Medical Sciences) aan de Macquarie University, Sydney, Australië (Protocol 5201800073).

OPMERKING: De glycomics-geleide glycoproteomics-methode kan worden toegepast op een gevarieerde reeks biologische monsters, variërend van lage tot extreme glycoproteïne-complexiteit. Voor labelvrije glycoproteomics-benaderingen (waarbij geen pooling van monsters wordt uitgevoerd), is ongeveer 100-200 μg totaal eiwit uit complexe mengsels vereist als uitgangsmateriaal om een hoge glycoproteoomdekking na verrijking te garanderen voor glycopeptiden die slechts 1%-10% van de peptidepopulatie mogen uitmaken. Vanwege ruimtegebrek wordt de initiële eiwitextractie uit cellen of weefsels weggelaten en worden lezers doorverwezen naar andere bronnen15. Glycomics consumeert conservatief ~10-20 μg eiwit per analyse voor diepe glycome-profilering, waardoor het grootste deel van het eiwitextract overblijft voor glycoproteomics. Tenzij anders vermeld, zijn de uiteindelijke concentraties vermeld en moeten chemicaliën worden opgelost in ultrahoogwaardig water om waterige oplossingen te maken in het onderstaande protocol.

1. Eiwit preparaat

  1. Bepaal de eiwitconcentratie van extracten met behulp van een gevestigde methode (bijv. bicinchoninezuur of Bradford-eiwittesten). Stel de eiwitconcentratie in op 10 μg/μL in 50 mM TEAB (pH 8,5).
  2. Verminder de disulfidebindingen door monsters gedurende 45 minuten bij 56 °C te incuberen met 10 mM DTT. Alkylaatvrije thiolgroepen door vervolgens monsters met 40 mM IAZ in het donker gedurende 30 minuten bij 20-25 °C te incuberen. Blus de alkyleringsreactie met een teveel aan DTT (~40 mM).
  3. Splits elk eiwitmonster. Sta ongeveer 10-20 μg totaal eiwit toe voor glycomics en 100-200 μg totaal eiwit voor de glycoproteomics-workflow.
    OPMERKING: Neem naast de betreffende eiwitmonster(s) een bekend modelglycoproteïne (bijv. runderfetuin) of eiwitmengsel (bijv. cellijnlysaat, plasma) op om de efficiëntie en reproduceerbaarheid van de procedures te beoordelen en om de LC-MS/MS-prestaties te controleren.

2. N-glycomics werkstroom

  1. Immobilisatie van eiwitten op een PVDF-membraan
    1. Gebruik een perforator met één gat om de PVDF-membraanfitting te snijden met het aantal eiwitmonsters dat moet worden gespot.
    2. Maak de uitgesneden membranen nat met ethanol of methanol en breng de membranen vervolgens over naar een plaat met 96 putjes met platte bodem.
    3. Zodra de membranen bijna droog zijn, deponeert u de eiwitmonsters in een maximaal volume van 2.5 μL per plek om het oppervlak van het afgezette eiwitmonster te minimaliseren. Spot monsters indien nodig opnieuw, zodat de totale hoeveelheid geïmmobiliseerd eiwit ter plaatse ~10-20 μg is. Om dit te doen, laat u de spot aan de lucht drogen voordat u de spotting-procedure herhaalt.
      OPMERKING: Tijdens het spotten kan het nodig zijn om het membraan opnieuw nat te maken met ethanol of methanol om te voorkomen dat de membranen volledig opdrogen.
    4. Laat de membranen minstens 3 uur aan de lucht drogen bij 20-25 °C, bij voorkeur een nacht. Vermijd elke vervuiling van de membranen tijdens het drogen.
      OPMERKING: Als optionele kwaliteitscontrolestap kunnen de eiwitten die op de membranen worden gevlekt, worden gevisualiseerd door kleuring met Direct Blue 71-oplossing zoals eerder beschreven34.
  2. Afgifte van eiwitgebonden N-glycanen
    1. Voeg 100 μL 1% (m/v) PVP40 in methanol toe aan elk putje met de gevlekte membranen. Zorg ervoor dat de kant van het membraan waarop het eiwitmonster is gespot, tijdens de monstervoorbereiding naar boven wijst.
    2. Schud de plaat 5 minuten in de PVP40-oplossing bij 20-25 °C en gooi de PVP40-oplossing vervolgens weg.
      OPMERKING: De PVP40-oplossing blokkeert de PVDF-membranen en de putjes om niet-specifieke binding van PNGase F (en eventuele exoglycosidasen die kunnen worden toegepast om koppelingsspecifieke informatie te verkrijgen in parallelle experimenten; zie discussie hieronder) in de volgende stappen te voorkomen.
    3. Was elk putje met de geblokkeerde eiwitvlekken met 100 μL ultrapuur water en schud de plaat gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap 3x. Zorg ervoor dat het water na elke wasbeurt volledig wordt weggegooid.
    4. Voeg 15 μL PNGase F-oplossing (0,5 E/μL, verdund in ultrapuur water uit de 10 E/μL stockoplossing) toe aan elk putje, ervan uitgaande dat er 15 μg eiwit per monster is afgezet.
    5. Voeg water toe aan de omringende lege putjes om uitdroging van het monster tijdens de volgende incubatiestappen te voorkomen en gebruik transparante folie om de plaat zorgvuldig af te dichten. Incubeer de plaat gedurende ten minste 8 uur bij 37 °C.
    6. Sonificeer de plaat gedurende 5 minuten om eventuele verdampte druppels aan de zijkant van de putjes op de bodem van de plaat te verzamelen.
    7. Breng de vrijgekomen N-glycaanmonsters voorzichtig over in individuele microcentrifugebuisjes (1,5 ml). Was de monsterputjes 2x met 20 μL ultrapuur water, doseer en aspireer meerdere keren. Meng het resterende monster van elk putje in de microcentrifugebuisjes met de N-glycaanmonsters.
      OPMERKING: Vermijd het gebruik van buisjes met een lage binding voor de voorbereiding van het N-glycomics-monster, aangezien de hydrofiele glycanen onomkeerbaar aan de gecoate buisjes kunnen binden.
    8. Voeg 10 μL 100 mM ammoniumacetaat pH 5,0 toe en incubeer de monsters gedurende 1 uur bij 20-25 °C.
      OPMERKING: Deze stap hydroxyleert de geamineerde N-acetylglucosamineresiduen aan het reducerende uiteinde van de vrijgekomen N-glycanen, waardoor een uitputtende reductie in de volgende stap mogelijk is. Pas 100 mM ammoniumacetaat aan op pH 5,0, aangezien hoge conversiesnelheden van glycosylamine naar hydroxyl in het reducerende uiteinde van de losgeraakte N-glycanen afhangen van de zwakke zuurgraad van de oplossing.
    9. Droog de N-glycaanmonsters in een vacuümconcentratorsysteem.
  3. Vermindering van vrijgekomen N-glycanen
    1. Voeg 20 μL vers bereide 1 M NaBH4 in 50 mM KOH toe aan de gedroogde N-glycaanmonsters en meng grondig.
      OPMERKING: NaBH4 moet vers worden bereid in KOH op de dag dat het wordt gebruikt.
    2. Sluit de deksels van elk buisje goed en incubeer de monsters gedurende 3 uur bij 50 °C.
      OPMERKING: N-glycanen ondergaan een reductie, waardoor de α- en β-anomeren van het reducerende uiteinde worden omgezet in een enkele alditolvorm, wat leidt tot een enkele chromatografische piek in de PGC-LC-MS/MS-analyse.
    3. Draai na de incubatie de monsterbuisjes in een microcentrifuge om de vloeistof naar de bodem van de buisjes te brengen.
    4. Voeg 100 μL ultrapuur water toe aan elk monster. Voeg 2 μL ijsazijn toe om de alkalische N-glycaanmonsters te neutraliseren. Draai de monsterbuisjes in een microcentrifuge om de monsters naar de bodem van de buisjes te brengen.
      OPMERKING: IJsazijn neutraliseert de alkalische monsters, wat leidt tot de vorming van waterstofgas (H2) en het daaropvolgende bruisen tijdens de reactie.
  4. Ontzouten van N-glycanen met behulp van PGC-C18-SPE
    1. Bereid zelfgemaakte PGC-C18-SPE microkolommen voor zoals hieronder beschreven.
      1. Gebruik een geschikte spuit om de C18-schijven aan te sluiten en over te brengen naar geschikte pipetpunten (10 μL).
        OPMERKING: Hier kunnen ook commerciële C18-SPE-microkolommen worden gebruikt.
      2. Pipetteer 10 μL slurry PGC-hars gesuspendeerd in 50% (v/v) methanol in de C18-SPE-microkolommen. Plaats de microkolommen in buisjes van 2 ml die zijn voorzien van microcentrifugeadapters. Draai de buizen om PGC-C18-SPE-microkolommen te maken met een kolomhoogte van ~0,5 cm (zie figuur 1i). Bereid voor elk monster een PGC-C18-SPE-microkolom voor.
        OPMERKING: Het gebruik van adapters zorgt ervoor dat de microkolommen in het midden van de buis hangen.
      3. Stel voor de volgende stappen voor het wassen en laden van monsters een tafelcentrifuge in op 6.000 tpm (~2.000 x g) en centrifugeer gedurende 60 s om de mobiele fasen door de PGC-C18-SPE-microkolommen te laten gaan. Was en conditioneer elke PGC-C18-SPE-microkolom achtereenvolgens met 50 μL 0,1% (v/v) TFA in ACN driemaal, gevolgd door 50 μL 0,1% (v/v) TFA driemaal.
        OPMERKING: De PGC-SPE-microkolommen kunnen uren van tevoren worden bereid, maar moeten vóór gebruik gehydrateerd bij kamertemperatuur worden bewaard.
    2. Breng de N-glycaanmonsters aan op de PGC-C18-SPE-microkolommen in een laadvolume van maximaal 40 μL en draai met 6.000 tpm (~2.000 x g) gedurende 60 s na elke toevoeging. Herhaal de laadstap totdat het volledige N-glycaanmonster op de microkolom is aangebracht.
      OPMERKING: Hoewel de doorstroomfracties geen glycanen mogen bevatten, raden we aan deze fracties te bewaren totdat de glycomics-gegevens met succes zijn verkregen in het geval van onvolledige retentie op de PGC-C18-SPE-microkolommen.
    3. Was de PGC-C18-SPE microkolommen met 20 μL ultrapuur water. Breng de PGC-C18-SPE-microkolommen over naar nieuwe microcentrifugebuisjes van 1,5 ml ter voorbereiding op de elutie van N-glycaan.
    4. Elueer de N-glycanen door 40 μL 0,1% TFA in 50% (beide v/v) ACN toe te voegen aan elke PGC-C18-SPE-microkolom en draai vervolgens. Herhaal deze procedure en combineer het eluaat.
      OPMERKING: Het is belangrijk om de microkolommen na elke centrifuge te controleren om er zeker van te zijn dat de oplossing volledig is doorgesponnen, omdat dit een efficiënte elutie bevordert.
    5. Droog de ontzoute N-glycanen in een vacuümconcentratorsysteem.
  5. Overname PGC-LC-MS/MS
    1. Bereid LC-oplosmiddelen voor zoals hieronder beschreven.
      1. Oplosmiddel A: Bereid 100 ml 100 ml ammoniumbicarbonaat (NH4HCO3) stockoplossing in ultrapuur water. Filtreer de voorraadoplossing door een nylon filterschijf van 0,2 μm met behulp van een vacuümfiltratie-eenheid om deeltjes te verwijderen. Bereid vervolgens 1 l 10 ml NH4HCO3-oplossing (oplosmiddel A) door 100 ml 100 ml NH4HCO3-stockoplossing te verdunnen in 900 ml ultrapuur water. Sonicaat oplosmiddel A gedurende 15 minuten om de oplossing te ontgassen. Oplosmiddel A kan 1 week worden bewaard bij 20-25 °C, terwijl de 100 mM NH4HCO3 stockoplossing 1 maand kan worden bewaard bij 4 °C.
      2. Oplosmiddel B: Bereid 1 l 10 ml NH4HCO3 in 70% (v/v) ACN in ultrapuur water (oplosmiddel B) door 100 ml 100 ml NH4HCO3 stockoplossing (zie vorige stap 2.5.1.2) toe te voegen aan 700 ml ACN en verdun tot een totaal volume van 1 l met ultrapuur water. Sonicaat oplosmiddel B gedurende 15 minuten om te ontgassen. Oplosmiddel B is 2 weken houdbaar bij 20-25 °C.
    2. Resuspendeer de ontzoute N-glycanen in 10 μL ultrapuur water en meng grondig. Draai de monsters gedurende 5 minuten op 14.000 x g en breng het bovenstaande vervolgens voorzichtig over naar MS-monsterflesjes, waarbij u ongeveer 0,5 μl achterlaat om te voorkomen dat er zichtbare of onzichtbare deeltjes en vuil worden overgedragen die het LC-MS/MS-systeem zouden kunnen beschadigen.
    3. Injecteer en scheid de N-glycanen op een PGC-LC capillaire kolom die is verwarmd tot 50 °C met behulp van een lineaire (of anderszins geschikte) gradiënt van 60 minuten van 0%-70% (v/v) oplosmiddel B in oplosmiddel A op een HPLC-systeem. Zorg ervoor dat het HPLC-systeem is aangesloten op de massaspectrometer en werkt met een constant debiet van 20 μL/min (pas het debiet aan de geometrie van de PGC-LC-kolom aan).
    4. Detecteer de gescheiden N-glycanen met behulp van een lineaire ionenval quadrupoolmassaspectrometer (of een ander geschikt MS-systeem met lage of hoge resolutie) dat is geïnstalleerd met een elektrospray-ionenbron en werkt in de negatieve ionenpolariteitsmodus.
    5. Stel het MS1-acquisitiescanbereik in op m/z 150-2.000 met een zoomscanpiekbreedte van m/z 0,25 full-width half maximum (FWHM) bij m/z 200. Stel de bronspanning in op 3,2 kV. Stel voor MS1-scans de automatische versterkingsregeling (AGC) in op 5 x 104 ionen met een maximale accumulatietijd van 50 ms (of anderszins toepasselijke instellingen).
      OPMERKING: De lage startdatum m/z is bedoeld om de detectie van mono- en disacchariden te omvatten die vaak bijdragen aan het N- en O-glycoom.
    6. Stel voor MS/MS de resolutie in op m/z 0.25 FWHM bij m/z 200, de AGC op 2 x 104 ionen en de maximale accumulatietijd op 300 ms. Schakel data-afhankelijke acquisitie (DDA) in en selecteer de vijf meest voorkomende voorlopers in elke MS1 volledige scan voor fragmentatie met behulp van resonantieactivering (ionenval), botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) bij een genormaliseerde botsingsenergie (NCE) van 33%. Deselecteer dynamische uitsluiting om te voorkomen dat nauw afluerende isobare N-glycaanisomeren ontbreken.
  6. Gegevensanalyse van LC-MS/MS-glycomics-gegevens
    1. Blader door de gegenereerde LC-MS/MS-onbewerkte gegevens met behulp van de juiste software om een hoge gegevenskwaliteit te garanderen na bevestiging van een smalle LC-piekbreedte, effectieve N-glycaanisomeerscheiding, hoge MS-nauwkeurigheid, resolutie en signaal-ruis, en hoge CID-MS/MS-fragmentatie-efficiëntie.
    2. Identificeer handmatig de N-glycanen in het monster op basis van hun mono-isotopische precursormassa, CID-MS/MS-fragmentatiepatroon en relatieve en absolute PGC-LC-retentietijd.
      OPMERKING: RawMeat v2.1, GlycoMod en GlycoWorkBench v2.1 kunnen helpen bij het identificatieproces zoals beschreven26. Bekende biosynthetische beperkingen en structurele verwantschap tussen de waargenomen analyten kunnen ook meer vertrouwen geven in de geïdentificeerde N-glycanen26. Als alternatief kan semi-automatische glycaanidentificatie en spectrale annotatie worden gedaan met behulp van commerciële software.
    3. Genereer voor de kwantificering van relatieve N-glycaan een overgangslijst met de mono-isotopische precursor m/z van alle geïdentificeerde N-glycaanisomeren en gebruik commerciële software om de area-under-the-curve (AUC)-waarden te bepalen op basis van geëxtraheerde ionchromatogrammen (EIC's) van alle N-glycaanprecursorionen zoals beschreven26.

3. N-glycoproteomics-werkstroom

  1. Vertering van eiwitmengsel
    1. Onteer 100-200 μg van het gereduceerde en gealkyleerde eiwitextract (uit deel 1) door trypsine (1:50 enzym:eiwitverhouding, w/w) en/of andere proteasen naar keuze aan elk monster toe te voegen.
      OPMERKING: In tegenstelling tot de voorbereiding van het glycomics-monster, moet u, indien mogelijk, microcentrifugebuisjes met een lage binding gebruiken voor de stappen voor de voorbereiding van het glycoproteomics-monster voor maximaal peptideherstel.
    2. Incubeer de monsters gedurende 8-12 uur bij 37 °C. Zorg ervoor dat de pH ~8,5 is, aangezien een licht alkalische oplossing de efficiëntie van de trypsinevertering verbetert.
      OPMERKING: Specifieke proteasen die voorspelbare splitsingspatronen produceren en de meeste N-glycopeptiden met een enkele sequon (glycosyleringsplaats) achterlaten, zoals trypsine en Lys-C, hebben de voorkeur. Vermijd overincubatie van de monsters om niet-specifieke splitsingen van eiwitten door trypsine of andere proteasen te verminderen.
    3. Stop de spijsvertering door verzuring (om niet-specifieke splitsingen veroorzaakt door langdurige spijsvertering te voorkomen) door toevoeging van 1% (v/v) TFA.
  2. Peptide ontzouten met behulp van Oligo R3-C18-SPE
    1. Bereid zelfgemaakte Oligo R3-C18-SPE microkolommen voor zoals hieronder beschreven.
      1. Gebruik een geschikte spuit om C18-schijven aan te sluiten en over te brengen naar pipetpunten van 10 μl.
        OPMERKING: Hier kunnen ook commerciële C18-SPE-microkolommen worden gebruikt.
      2. Breng een brij van Oligo R3-hars gesuspendeerd in zuiver ACN aan in de C18-SPE-microkolommen. Plaats de microkolommen in buizen van 2 ml die zijn uitgerust met microcentrifugeadapters om ervoor te zorgen dat de microkolommen in het midden van de buis hangen en draai om Oligo R3-C18-SPE-microkolommen te creëren met een kolomhoogte van ~1 cm (zie figuur 1ii). Bereid voor elk monster een Oligo R3-C18-SPE-microkolom voor.
    2. Voor de volgende was- en monsterlaadstappen stelt u een tafelcentrifuge in op 6.000 tpm (~2.000 x g) en centrifugeert u gedurende 60 s om de mobiele fasen door de Oligo R3-C18-SPE-microkolommen te laten gaan. Was en conditioneer elke Oligo R3-C18-SPE microkolom achtereenvolgens met 50 μL zuivere ACN, 3x, en vervolgens 50 μL 0,1% (v/v) TFA, 3x.
      OPMERKING: De Oligo R3-C18-SPE microkolommen kunnen van tevoren worden bereid en urenlang gehydrateerd bij kamertemperatuur worden bewaard voor gebruik.
    3. Plaats de geconditioneerde Oligo R3-C18-SPE microkolommen in nieuwe buisjes van 1,5 ml, samen met microcentrifugeadapters. Breng de tryptisch verteerde peptidemengsels aan op de Oligo R3-C18-SPE microkolommen en draai op 2.000 x g gedurende 60 s. Er kunnen meerdere laadrondes nodig zijn voor monstervolumes groter dan 50 μl.
    4. Was de Oligo R3-C18-SPE microkolommen 3x met 50 μL 0,1% (v/v) TFA. Breng de Oligo R3-C18-SPE microkolommen over in nieuwe buisjes van 1,5 ml ter voorbereiding op de elutie van de ontzoute peptiden.
    5. Elueer de ontzoute peptiden door 50 μL 0,1% TFA aan te brengen in 50% (beide v/v) ACN, gevolgd door 50 μL 0,1% TFA in 70% (beide v/v) ACN op elke Oligo R3-C18-SPE microkolom. Draai na elke stap.
      OPMERKING: Het is belangrijk om de microkolommen na elke centrifuge te controleren om er zeker van te zijn dat de oplossing volledig is doorgesponnen, omdat dit een efficiënte elutie bevordert.
    6. Verzamel, combineer en droog de ontzoute peptiden in een vacuümconcentratorsysteem.
      OPMERKING: Als u parallelle proteomics en de-N-glycoproteomics uitvoert (zie Discussie), splits dan de ontzoute peptidemonsters en zet afzonderlijke fracties opzij voordat u ze droogt.
  3. Verrijking van N-glycopeptide met behulp van ZIC-HILIC-C8-SPE
    1. Bereid zelfgemaakte ZIC-HILIC-C8-SPE-microkolommen voor zoals hieronder beschreven.
      1. Gebruik een geschikte spuit om C8-schijven aan te sluiten en over te brengen naar pipetpunten van 10 μl.
      2. Deponeer een slurry van ZIC-HILIC-hars gesuspendeerd in methanol in de C8-SPE-microkolommen. Plaats de microkolommen in buizen van 2 ml die zijn uitgerust met microcentrifugeadapters om ervoor te zorgen dat de microkolommen in het midden van de buis hangen en draai om ZIC-HILIC-C8-SPE-microkolommen te creëren met een kolomhoogte van ~1 cm (zie figuur 1iii). Bereid voor elk monster een ZIC-HILIC-C8-SPE-microkolom voor.
    2. Stel voor de volgende was- en laadstappen een tafelcentrifuge in op 6.000 tpm (~2.000 x g) en centrifugeer gedurende 60 s om de mobiele fasen door de ZIC-HILIC-C8-SPE-microkolommen te laten gaan. Was en conditioneer elke ZIC-HILIC-C8-SPE microkolom achtereenvolgens met 50 μL methanol, 3x, en vervolgens 50 μL ultrapuur water, 3x, en tenslotte 50 μL 1% TFA in 80% (beide v/v) ACN, 3x.
      OPMERKING: De ZIC-HILIC-C8-SPE microkolommen kunnen uren van tevoren worden bereid, maar moeten voor gebruik gehydrateerd bij kamertemperatuur worden bewaard.
    3. Resuspendeer de gedroogde peptidemengsels die bestemd zijn voor verrijking met N-glycopeptiden in 50 μl 1% TFA in 80% (beide v/v) ACN en meng grondig.
      OPMERKING: Als peptiden moeilijk opnieuw op te lossen zijn in het HILIC-laadoplosmiddel, kunnen de peptiden eerst opnieuw worden opgelost in 10% (v/v) TFA en vervolgens snel worden verdund in ACN om de concentraties van het HILIC-laadoplosmiddel te bereiken. Vermijd het verhitten van het monster in een hoge TFA-concentratie om hydrolyse te voorkomen.
    4. Plaats de geconditioneerde ZIC-HILIC-C8-SPE-microkolommen in nieuwe buisjes van 1.5 ml, samen met microcentrifugeadapters. Breng de geresuspendeerde peptidemengsels aan op de ZIC-HILIC-C8-SPE-microkolommen en draai gedurende 60 s op 2.000 x g . Er kunnen meerdere laadrondes nodig zijn voor monstervolumes groter dan 50 μl.
    5. Verzamel de doorstroomfractie(s) en breng de fractie(s) opnieuw aan op dezelfde ZIC-HILIC-C8-SPE-microkolom. Herhaal het opnieuw aanbrengen 2x en behoud de doorstroombuisjes.
    6. Was de ZIC-HILIC-C8-SPE microkolommen 2x met 50 μL 1% TFA in 80% (beide v/v) ACN, centrifugeer en combineer deze doorspoeling met de doorspoeling uit stap 3.3.4.
      OPMERKING: De gecombineerde doorstroomfractie bevat doorgaans ~90% van het totale peptidemateriaal, waardoor in feite de niet-gemodificeerde peptidefractie wordt gevormd die daarom kan worden gebruikt voor afzonderlijke stroomafwaartse analyse (in plaats van een afzonderlijk experiment van het proteomics-type uit te voeren).
    7. Breng de ZIC-HILIC-C8-SPE-microkolommen over naar nieuwe microcentrifugebuisjes van 1,5 ml met een lage binding. Elueer de achtergebleven N-glycopeptiden achtereenvolgens met 50 μl 0,1% (v/v) TFA, gevolgd door 50 μl 25 mM ammoniumbicarbonaat en vervolgens 50 μl 50% (v/v) ACN. Draai na elke stap 60 s op 2.000 x g .
      OPMERKING: Het eluaat bevat doorgaans ~ 10% van het totale peptidemateriaal, waarvan de meeste N-glycopeptiden moeten zijn als een hoge verrijkingsefficiëntie wordt bereikt. Het is belangrijk om de microkolommen na elke centrifuge te controleren om er zeker van te zijn dat de oplossing volledig is doorgesponnen, omdat dit een efficiënte elutie zal vergemakkelijken.
    8. Verzamel, combineer en droog de verrijkte N-glycopeptiden en (indien nodig) de niet-gemodificeerde peptiden stromen door fracties in een vacuümconcentratorsysteem.
  4. Omgekeerd gefaseerde LC-MS/MS van intacte N-glycopeptiden
    1. Bereid LC-oplosmiddelen voor zoals hieronder beschreven.
      1. Oplosmiddel A: Bereid 1 L 0,1% (v/v) mierenzuur in ultrapuur water. Sonificeer gedurende 15 minuten om het oplosmiddel te ontgassen. Oplosmiddel A is een maand houdbaar bij 20-25 °C.
      2. Oplosmiddel B: Bereid 1 L 0,1% mierenzuur in 99,9% (beide v/v) ACN. Sonificeer gedurende 15 minuten om te ontgassen. Oplosmiddel B kan een maand worden bewaard bij 20-25 °C.
    2. Resuspendeer de gedroogde peptidefracties in 0,1% (v/v) mierenzuur tot een concentratie van ongeveer 0,2-0,5 μg peptide/μL en meng grondig. Draai de monsters gedurende 5 minuten op 14.000 x g en breng het bovenstaande vervolgens voorzichtig over naar MS-monsterflesjes, waarbij u ongeveer 0,5 μl achterlaat om te voorkomen dat ongewenste deeltjes en vuil worden overgebracht.
    3. Injecteer voor elk monster ~0,5-1 μg totaal peptide op een C18-LC-vangkolom en scheid de peptiden op een C18-LC analytische kolom met een constant debiet van 250 nL/min met behulp van een UPHLC-systeem dat is aangesloten op de massaspectrometer met een gradiënt van 2%-30% oplosmiddel B over 100 min, 30%-50% B over 18 min, 50%-95% B gedurende 1 minuut en 9 minuten bij 95% (alle v/v) B in oplosmiddel A (of een anderszins geschikte opstelling).
    4. Detecteer de peptiden met een massaspectrometer met hoge resolutie, gekoppeld aan het nanoLC-systeem dat is uitgerust met een nano-elektrospray-ionenbron en werkt in de positieve ionenpolariteitsmodus.
    5. Gebruik voor MS1 een acquisitiescanbereik van m/z 350-1.800, hoge resolutie bij 60.000-120.000 FWHM bij m/z 200 en een bronspanning van ~2,5 kV. Stel de AGC in op 3 x 106 ionen met een maximale accumulatietijd van 50 ms (of anderszins toepasselijke instellingen).
    6. Selecteer voor MS/MS de 20 meest voorkomende voorloperionen uit elke MS1 volledige scan voor fragmentatie met behulp van DDA-modus met behulp van HCD-MS/MS met een vaste NCE van 35% of sceHCD met NCE van 25%, 35% en 45%. Belangrijk is dat u de onderste m/z-waarde instelt op 110 (bijv. scanbereik m/z 110 - 1.800) om alle oxoniumionen met een lage massa in elk fragmentspectrum te observeren.
    7. Selecteer precursoren die meer dan 2 ladingen dragen (Z ≥ 2) voor fragmentatie. Verkrijg (sce) HCD-MS/MS-spectra met een resolutie van 30.000-45.000 FWHM bij m/z 200 met een AGC van 1 x 105 ionen en een accumulatietijd van 90 ms met behulp van een precursorisolatievenster van ± 1,0 Th. Schakel dynamische uitsluiting van 30 s in na de enkele isolatie en fragmentatie van een bepaald voorloperion.
      OPMERKING: Als ETD beschikbaar is, overweeg dan om ook EThcD-MS/MS van intacte N-glycopeptidemonsters te verkrijgen met behulp van productafhankelijke ionentriggering. Voer deze stap uit wanneer diagnostische glycaanoxoniumionen (bijv. m/z 138.0545, 204.0867 en 366.1396) tot de top 20 fragmentionen behoren binnen elk HCD-MS/MS-spectrum39. Detecteer de EThcD-MS/MS-fragmenten met een resolutie van 30.000-45.000 FWHM bij m/z 200 met een AGC van 4 x 105 ionen, injectietijd van 250 ms, HCD NCE van 15% en een precursorisolatiebreedte van 1,6 Th.
  5. Gegevensanalyse van LC-MS/MS-glycoproteomics-gegevens
    1. Bevestig de verrijking van LC-MS/MS ruwe gegevens met N-glycopeptiden door te controleren of de meeste HCD-MS/MS-spectra glycaanoxoniumionen bevatten (bijv. m/z 138.0545, 204.0867 en 366.1396) en (voor labelstrategieën) een basislijnscheiding hebben van de TMT-reporterionen met lage massa, een hoge fragmentatie-efficiëntie in de MS/MS-spectra en een smalle LC-piekbreedte, en een hoge MS-nauwkeurigheid, resolutie en signaal-ruis.
    2. Zoek met behulp van een zoekmachine (er zijn er meerdere beschikbaar; zie hieronder) in de MS/MS-gegevens naar intacte N-glycopeptiden tegen een geschikte eiwit/peptide-database gericht op het monster dat wordt onderzocht (bijv. verkregen uit een de-N-glycoproteomics-experiment) of tegen alle beoordeelde UniProtKB menselijke eiwitten. Stem de zoektocht af op peptide N-glycosylering door te zoeken naar peptiden met sequon-gelokaliseerde Asn. Belangrijk is dat u een glycomics-geïnformeerde N-glycaandatabase selecteert, d.w.z. glycanen geïdentificeerd op basis van glycomics-gegevens in stap 2, om de zoekruimte te beperken tot glycanen waarvan bekend is dat ze in het monster (de monsters) voorkomen.
      OPMERKING: Parallelle zoekopdrachten met behulp van een brede, vooraf gedefinieerde N-glycaandatabase kunnen worden overwogen om het bestaan van aanvullende N-glycaansamenstellingen in de gegevens uit te sluiten.
    3. Pas de resterende zoekvariabelen aan op basis van de steekproef die wordt bestudeerd, de specifieke steekproefverwerkingsprocedures die zijn uitgevoerd en de gebruikte MS-instellingen en gebruikte instrumentatie. Veelgebruikte zoekinstellingen voor het zoeken naar N-glycoproteomics-gegevens zijn onder meer:
      Tolerantie voor precursoren en productmassa: 10 ppm en 20 ppm
      Proteasespecificiteit: Volledig specifiek en/of semi-specifiek (N-razig)
      Toegestane gemiste decolletés: 2
      Vaste wijzigingen: Cys carbamidomethylering (+57.021 Da)
      Variabele modificaties: Met oxidatie (+15.994 Da) (vaak 1)
      Toegestane variabele modificaties per peptide: 1 of 2
      Glycaanmodificaties: Glycomics-geïnformeerde glycaandatabase (zeldzaam 1)
      Database met eiwitlokvogels en contaminanten: ingeschakeld
    4. Filter alle zoekopdrachten op <1% false discovery rate (FDR) op eiwitniveau en peptideniveau. Beschouw alleen N-glycopeptiden die met hoge betrouwbaarheid zijn geïdentificeerd (bijv. PEP 2D-scores < 0,001) en voer handmatige annotatie/curatie van de gefilterde output uit om de snelheid van onjuiste N-glycopeptide-identificatie verder te verminderen, zoals besproken 36,40,41.
      OPMERKING: Glycopeptiden met gesialyleerde en meervoudig gefucosyleerde N-glycanen en glycopeptiden die naast glycanen ook andere variabele modificaties dragen (d.w.z. Met-oxidatie en Asn/Gln-deamidatie) zijn bijzonder vatbaar voor verkeerde interpretatie door de zoekmachines41. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan het valideren van dergelijke kandidaten voordat ze zich melden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Representatieve resultaten van de glycomics-geleide glycoproteomics-methode toegepast op een FFPE-weefselglaasje van een patiënt die lijdt aan CRC in stadium II worden in deze sectie gegeven.

Om voldoende eiwituitgangsmateriaal voor het protocol te verkrijgen, werden eiwitextracten van twee objectglaasjes (z-stapels) gecombineerd uit hetzelfde FFPE-weefselblok volgens een gepubliceerd protocol en werd een TMT-labelingbenadering toegepast om de gevoeligheid van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritieke stappen in het protocol
In dit protocoldocument hebben we stap voor stap de glycomics-geleide glycoproteomics-methode geschetst, die een uitgebreid beeld geeft van de heterogeniteit en dynamiek van het glycoproteoom in het complexe TME.

Een cruciale stap in het protocol is om te zorgen voor volledige proteolyse zonder het eiwitmengsel te oververteren. Niet-specifieke splitsingen van eiwitten vergroten inherent de zoekruimte voor pe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

THC wordt ondersteund door een International Research Training Program Scholarship die wordt gefinancierd door de Australische overheid. NB wordt ondersteund door International Macquarie University Research Excellence Scholarships, gefinancierd door Macquarie University. AC wordt ondersteund door een beurs voor het Research Training Program die wordt gefinancierd door de Australische overheid. RK werd ondersteund door het Cancer Institute of New South Wales (ECF181259). MTA is de ontvanger van een Australian Research Council Future Fellowship (FT210100455).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chemicals
Ammonium acetate Sigma AldrichA1542Alternatieven beschikbaar
Ammonium bicarbonate, zuiverheid ≥99,0%Sigma AldrichA6141Alternatieven beschikbaar
Watervrij acetonitrile (ACN), LC-MS kwaliteitSigma Aldrich34851Alternatieven beschikbaar
Bovine fetuïneSigma AldrichF3004Alternatieven beschikbaar
Dithiothreitol (DTT)Sigma AldrichD0632Alternatieven beschikbaar
EthanolSigma AldrichE7023Alternatieven beschikbaar
Formic acid, LC-MS kwaliteitSigma Aldrich00940Alternatieven beschikbaar
Glacial azijnzuurSigma AldrichA6283Alternatieven beschikbaar
Iodoacetamide (IAA)Sigma AldrichI1149Alternatieven beschikbaar
MethanolSigma AldrichM1775Alternatieven beschikbaar
Peptide-N-glycosidase F (PNGase F)PromegaV4831Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μL) recombinant uitgedrukt in Escherichia coli 
Polyvinylpyrrolidon 40 (PVP)Sigma AldrichPVP40Alternatieven beschikbaar
Kaliumhydroxide (KOH)Sigma Aldrich484016Alternatieven beschikbaar
Sequencing-grade varkenstrypsine PromegaV5113Alternatieven beschikbaar
Natriumborohydride (NaBH4)Sigma Aldrich213462Alternatieven beschikbaar
Triethylammoniumbicarbonaat (TEAB), LC-MS kwaliteitSigma AldrichT7408Alternatieven beschikbaar
Trifluorazijnzuur (TFA), LC-MS kwaliteitSigma AldrichT6508Alternatieven beschikbaar
Tools/Materialen
C18 schijvenEmpore66883-U
C8 schijvenEmpore66882-U
Vlakbodem polypropyleen 96-well plate Corning3364
Immobilon-PSQ polyvinylideen difluoride (PVDF) membraanMilliporeIPVH20200Poriegrootte: 0,45 μm 
MicrocentrifugeEppendorf5452000069Alternatieven beschikbaar
Microcentrifuge adapters The Nest Group, Inc., MASS18VMiniSpin Column Collar, komt met Microspin Columns
Oligo R3 harsThermo1133903Deelgrootte 30 μm
ParafilmParafilm MPM996
Protein LoBind buizen 1,5 mLEppendorf0030108450
Protein LoBind buizen 2,0 mLEppendorf0030108442
Safe-lock buizen 1,5 mLEppendorf0030120086
Safe-lock buizen 2,0 mLEppendorf0030120094
ShakerEppendorf5382000066Alternatieven beschikbaar
Punsmachine met enkele openingSwingline74005
SpeedVac concentratorMartin ChristRVC 2-25 CDplusAlternatieven beschikbaar
Supelclean ENVI-Carb SPE harsSupelco57088Deelgrootte 120-400 mesh. Hars kan handmatig uit cartridges worden geëxtraheerd en kan langdurig worden bewaard in 50% (v/v) methanol in MilliQ water
Spuit 5 mLSigma AldrichZ116866Alternatieven beschikbaar
Temperatuurgestuurde incubatorThermolineE7.30Alternatieven beschikbaar
UltrasoonbadUnisonicsFXPAlternatieven beschikbaar
ZIC-HILIC harsMerck150455Deelgrootte/poriegrootte, 5 μm/200 Å. Hars kan handmatig uit LC-kolom worden geëxtraheerd en kan langdurig worden bewaard in 50% (v/v) methanol in MilliQ water
ZipTip C18 solid-phase extractie (SPE) micro-kolommen MilliporeZTC18S096Alternatief, zelfgemaakte C18-SPE micro-kolommen kunnen commercieel product vervangen
LC-MS/MS Analyse
1260 Infinity Capillary HPLC systeem AgilentAlternatieven beschikbaar
Analytische LC-kolom voorgevuld met ReproSil-Pur C18 AQ harsDr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Duitslandr13.aq.s2570Deelgrootte/poriegrootte: 3 μm/120 Å, lengte/binnendiameter: 25 cm/75 μm. Commerciële C18 nano-LC-kolommen ook beschikbaar/ 
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC Systeem ThermoAlternatieven beschikbaar
HyperCarb KAPPA PGC capillaire LC-kolom ThermoDiscontinuedDeelgrootte/poriegrootte, 3 μm/250 Å; kolomlengte, 30 mm; binnendiameter, 0,180 mm. Grotere geometrieën van de HyperCarb PGC-LC-kolommen, die vergelijkbare kwaliteitsgegevens produceren, zijn commercieel verkrijgbaar (bijv. Thermo #35003-031030). SupelTMCarb LC-kolom van Merck met een deelgrootte/poriegrootte, 2,7 μm/200 en met verschillende kolomlengten en interne diameter zijn ook beschikbaar (bijv. Merck #59994-U). 
LCMS-kwaliteit acetonitrileLiChrosolv100029Alternatieven beschikbaar
Linear trap quadrupole (LTQ) Velos Pro ion trap massaspectrometer (glycomics) Thermo

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor. NY. 265-278 (2022).
  2. Tjondro, H. C., Loke, I., Chatterjee, S., Thaysen-Andersen, M. Human protein paucimannosylation: Cues from the eukaryotic kingdoms. Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (6), 2068-2100 (2019).
  3. West, C. M., Malzl, D., Hykollari, A., Wilson, I. B. H. Glycomics, glycoproteomics, and glycogenomics: An inter-taxa evolutionary perspective. Mol Cell Proteomics. 20, 100024(2021).
  4. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2016).
  5. Reily, C., Stewart, T. J., Renfrow, M. B., Novak, J. Glycosylation in health and disease. Nat Rev Nephrol. 15 (6), 346-366 (2019).
  6. Leite-Gomes, E., et al. Bringing to light the risk of colorectal cancer in inflammatory bowel disease: Mucosal glycosylation as a key player. Inflamm Bowel Dis. 28 (6), 947-962 (2022).
  7. He, K., et al. Decoding the glycoproteome: A new frontier for biomarker discovery in cancer. J Hematol Oncol. 17 (1), 12(2024).
  8. Mereiter, S., Balmana, M., Campos, D., Gomes, J., Reis, C. A. Glycosylation in the era of cancer-targeted therapy: Where are we heading. Cancer Cell. 36 (1), 6-16 (2019).
  9. Seeberger, P. H., et al. What comes next in glycobiology. Cell. 187 (11), 2628-2632 (2024).
  10. Abrahams, J. L., et al. Recent advances in glycoinformatic platforms for glycomics and glycoproteomics. Curr Opin Struct Biol. 62, 56-69 (2020).
  11. Thaysen-Andersen, M., Packer, N. H., Schulz, B. L. Maturing glycoproteomics technologies provide unique structural insights into the N-glycoproteome and its regulation in health and disease. Mol Cell Prot. 15 (6), 1773-1790 (2016).
  12. Gaunitz, S., Nagy, G., Pohl, N. L., Novotny, M. V. Recent advances in the analysis of complex glycoproteins. Anal Chem. 89 (1), 389-413 (2017).
  13. Chernykh, A., Kawahara, R., Thaysen-Andersen, M. Towards structure-focused glycoproteomics. Biochem Soc Trans. 49 (1), 161-186 (2021).
  14. Hu, H., Khatri, K., Zaia, J. Algorithms and design strategies towards automated glycoproteomics analysis. Mass Spectrom Rev. 36 (4), 475-498 (2017).
  15. Bagdonaite, I., et al. Glycoproteomics. Nat Rev Meth Primers. 2 (1), 48(2022).
  16. Peng, W., et al. MS-based glycomics and glycoproteomics methods enabling isomeric characterization. Mass Spectrom Rev. 42 (2), 577-616 (2023).
  17. Aoki-Kinoshita, K. F., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. 705-718 (2022).
  18. Thomas, D. R., Scott, N. E. Glycoproteomics: Growing up fast. Curr Opin Struct Biol. 68, 18-25 (2021).
  19. Thaysen-Andersen, M., Kolarich, D., Packer, N. H. Glycomics & glycoproteomics: From analytics to function. Mol Omics. 17 (1), 8-10 (2021).
  20. Trbojevic-Akmacic, I., et al. High-throughput glycomic methods. Chem Rev. 122 (20), 15865-15913 (2022).
  21. Oliveira, T., Thaysen-Andersen, M., Packer, N. H., Kolarich, D. The hitchhiker's guide to glycoproteomics. Biochem Soc Trans. 49 (4), 1643-1662 (2021).
  22. Rudd, P. M., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor. NY. 689-704 (2022).
  23. Madunić, K., et al. Colorectal cancer cell lines show striking diversity of their O-glycome reflecting the cellular differentiation phenotype. Cell Mol Life Sci. 78 (1), 337-350 (2021).
  24. Parker, R., et al. Mapping the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-derived peptidome presented by HLA class II on dendritic cells. Cell Rep. 35 (8), 109179(2021).
  25. Zhao, P., et al. Virus-receptor interactions of glycosylated SARS-CoV-2 spike and human ACE2 receptor. Cell Host Microbe. 28 (4), 586-601.e6 (2020).
  26. Chatterjee, S., et al. Serum N-glycomics stratifies bacteremic patients infected with different pathogens. J Clin Med. 10 (3), 516(2021).
  27. Osimanjiang, W., et al. Analysis of N- and O-linked glycosylation: Differential glycosylation after rat spinal cord injury. J Neurotrauma. 37 (18), 1954-1962 (2020).
  28. Chatterjee, S., et al. Trends in oligomannosylation and α1,2-mannosidase expression in human cancers. Oncotarget. 12 (21), 2188-2205 (2021).
  29. Chang, D., Klein, J. A., Nalehua, M. R., Hackett, W. E., Zaia, J. Data-independent acquisition mass spectrometry for site-specific glycoproteomics characterization of SARS-CoV-2 spike protein. Anal Bioanal Chem. 413 (29), 7305-7318 (2021).
  30. Pan, J., et al. Glycoproteomics-based signatures for tumor subtyping and clinical outcome prediction of high-grade serous ovarian cancer. Nat Commun. 11 (1), 6139(2020).
  31. Venkatakrishnan, V., et al. Glycan analysis of human neutrophil granules implicates a maturation-dependent glycosylation machinery. J Biol Chem. 295 (36), 12648-12660 (2020).
  32. Sethi, M. K., et al. In-depth matrisome and glycoproteomic analysis of human brain glioblastoma versus control tissue. Mol Cell Proteom. 21 (4), 100216(2022).
  33. Parker, B. L., et al. Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity. J Proteome Res. 12 (12), 5791-5800 (2013).
  34. Jensen, P. H., Karlsson, N. G., Kolarich, D., Packer, N. H. Structural analysis of N- and O-glycans released from glycoproteins. Nat Protoc. 7 (7), 1299-1310 (2012).
  35. Hinneburg, H., et al. Post-column make-up flow (pcmf) enhances the performance of capillary-flow PGC-LC-MS/MS-based glycomics. Anal Chem. 91 (7), 4559-4567 (2019).
  36. Chau, T. H., et al. Glycomics-assisted glycoproteomics enables deep and unbiased N-glycoproteome profiling of complex biological specimens. Meth Mol Biol. 2628, 235-263 (2023).
  37. Madunic, K., Wagt, S., Zhang, T., Wuhrer, M., Lageveen-Kammeijer, G. S. M. Dopant-enriched nitrogen gas for enhanced electrospray ionization of released glycans in negative ion mode. Anal Chem. 93 (18), 6919-6923 (2021).
  38. Zhang, T., Wang, W., Wuhrer, M., De Haan, N. Comprehensive O-glycan analysis by porous graphitized carbon nanoliquid chromatography-mass spectrometry. Anal Chem. 96 (22), 8942-8948 (2024).
  39. Wu, S. W., Pu, T. H., Viner, R., Khoo, K. H. Novel LC-MS2 product dependent parallel data acquisition function and data analysis workflow for sequencing and identification of intact glycopeptides. Anal Chem. 86 (2), 5478-5486 (2014).
  40. Kawahara, R., et al. The complexity and dynamics of the tissue glycoproteome associated with prostate cancer progression. Mol Cell Proteom. 20, 100026(2021).
  41. Chau, T. H., Chernykh, A., Kawahara, R., Thaysen-Andersen, M. Critical considerations in N-glycoproteomics. Curr Opin Chem Biol. 73, 102272(2023).
  42. Carnielli, C. M., et al. Comprehensive glycoprofiling of oral tumors associates N-glycosylation with lymph node metastasis and patient survival. Mol Cell Proteom. 22 (7), 100586(2023).
  43. Sethi, M. K., et al. In-depth N-glycome profiling of paired colorectal cancer and non-tumorigenic tissues reveals cancer-, stage- and EGFR-specific protein N-glycosylation. Glycobiology. 25 (10), 1064-1078 (2015).
  44. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  45. Ostasiewicz, P., Zielinska, D. F., Mann, M., Wiśniewski, J. R. Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry. J Proteome Res. 9 (7), 3688-3700 (2010).
  46. Tian, Y., Gurley, K., Meany, D. L., Kemp, C. J., Zhang, H. N-linked glycoproteomic analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. J Proteome Res. 8 (4), 1657-1662 (2009).
  47. Cozzolino, F., et al. New label-free methods for protein relative quantification applied to the investigation of an animal model of huntington disease. PLoS One. 15 (9), e0238037(2020).
  48. Sethi, M. K., et al. Quantitative proteomic analysis of paired colorectal cancer and non-tumorigenic tissues reveals signature proteins and perturbed pathways involved in CRC progression and metastasis. J Proteomics. 126, 54-67 (2015).
  49. Rosati, D., et al. Differential gene expression analysis pipelines and bioinformatic tools for the identification of specific biomarkers: A review. Comput Struct Biotechnol J. 23, 1154-1168 (2024).
  50. Niu, B., et al. Nonspecific cleavages arising from reconstitution of trypsin under mildly acidic conditions. PLoS One. 15 (7), e0236740(2020).
  51. Delafield, D. G., Li, L. Recent advances in analytical approaches for glycan and glycopeptide quantitation. Mol Cell Proteom. 20, 100054(2021).
  52. Viner, R. I., Snovida, S., Bodnar, E., Perreault, H., Saba, J. A novel workflow for glycopeptide analysis using cellulose-based separation cartridges, TMT-labeling and LTQ Orbitrap ETD. J Biomol Tech. 21 (3 Suppl), S25(2010).
  53. Kawahara, R., et al. Community evaluation of glycoproteomics informatics solutions reveals high-performance search strategies for serum glycopeptide analysis. Nat Meth. 18 (11), 1304-1316 (2021).
  54. Polasky, D. A., Nesvizhskii, A. I. Recent advances in computational algorithms and software for large-scale glycoproteomics. Curr Opin Chem Biol. 72, 102238(2023).
  55. Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nat Meth. 17 (11), 1125-1132 (2020).
  56. Goodson, H., et al. Α-mannosylated HLA-II glycopeptide antigens dominate the immunopeptidome of immortalised cells and tumour tissues. Glycobiology. 34 (11), cwae057(2024).
  57. Shajahan, A., Heiss, C., Ishihara, M., Azadi, P. Glycomic and glycoproteomic analysis of glycoproteins-a tutorial. Anal Bioanal Chem. 409 (19), 4483-4505 (2017).
  58. Rosenbalm, K. E., Tiemeyer, M., Wells, L., Aoki, K., Zhao, P. Glycomics-informed glycoproteomic analysis of site-specific glycosylation for SARS-CoV-2 spike protein. STAR Prot. 1 (3), 100214-100214 (2020).
  59. Zhao, P., et al. Virus-receptor interactions of glycosylated SARS-CoV-2 spike and human ACE2 receptor. Cell Host Microbe. 28 (4), 586-601.e6 (2020).
  60. Chandler, K. B., et al. Multi-isotype glycoproteomic characterization of serum antibody heavy chains reveals isotype- and subclass-specific N-glycosylation profiles. Mol Cell Proteomics. 18 (4), 686-703 (2019).
  61. Haab, B. B., Klamer, Z. Advances in tools to determine the glycan-binding specificities of lectins and antibodies. Mol Cell Proteom. 19 (2), 224-232 (2020).
  62. Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. The use of lectin microarray for assessing glycosylation of therapeutic proteins. MAbs. 8 (3), 524-535 (2016).
  63. Goumenou, A., Delaunay, N., Pichon, V. Recent advances in lectin-based affinity sorbents for protein glycosylation studies. Front Mol Biosci. 8, 746822(2021).
  64. Parker, B. L., et al. Terminal galactosylation and sialylation switching on membrane glycoproteins upon TNF-alpha-induced insulin resistance in adipocytes. Mol Cell Proteomics. 15 (1), 141-153 (2016).
  65. Blazev, R., et al. Integrated glycoproteomics identifies a role of N-glycosylation and galectin-1 on myogenesis and muscle development. Mol Cell Proteomics. 20, 100030(2021).
  66. Thaysen-Andersen, M., et al. Human neutrophils secrete bioactive paucimannosidic proteins from azurophilic granules into pathogen-infected sputum. J Biol Chem. 290 (14), 8789-8802 (2015).
  67. Loke, I., Ostergaard, O., Heegaard, N. H. H., Packer, N. H., Thaysen-Andersen, M. Paucimannose-rich N-glycosylation of spatiotemporally regulated human neutrophil elastase modulates its immune functions. Mol Cell Proteom. 16 (8), 1507-1527 (2017).
  68. Loke, I., Packer, N. H., Thaysen-Andersen, M. Complementary LC-MS/MS-based N-glycan, N-glycopeptide, and intact N-glycoprotein profiling reveals unconventional ASN71-glycosylation of human neutrophil cathepsin g. Biomolecules. 5 (3), 1832-1854 (2015).
  69. Tjondro, H. C., et al. Hyper-truncated Asn355- and Asn391-glycans modulate the activity of neutrophil granule myeloperoxidase. J Biol Chem. 296, 100144(2021).
  70. Kawahara, R., et al. Glycoproteome remodeling and organelle-specific N-glycosylation accompany neutrophil granulopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (36), e2303867120(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tumormicro omgevingmassaspectrometrieglycaanstructurenN glycoproteoomprofileringporeus gegrafiteerd koolstofLC MS MSglycopeptide verrijkingplaatspecifieke glycosyleringcolorectaal kankerweefsel

Gerelateerde artikelen