Methodenartikel

Engineering van chimere antigeenreceptor-natuurlijke killercellen die zich richten op schimmelinfecties met behulp van het niet-virale Sleeping Beauty Transposon-systeem

DOI:

10.3791/67424

⸱

4 oktober 2024

 ,  ,  ,  , 
1Medizinische Klinik und Poliklinik II und Lehrstuhl für Zelluläre Immuntherapie, Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universitätsklinikum Würzburg, 2Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI, Außenstelle Würzburg Zelluläre Immuntherapie

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We schetsen een transfectieprotocol voor het produceren van chimere antigeenreceptor-natural killer (CAR-NK) cellen die zich richten op schimmelpathogenen met behulp van het niet-virale Doornroosje-transposonsysteem. Om de antigeenspecifieke activering te beoordelen, hebben we de gemanipuleerde cellen samen gekweekt met Aspergillus fumigatus-kiembuizen en de IFN-γ secretie gemeten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Op chimere antigeenreceptor (CAR) gebaseerde celtherapieën hebben een indrukwekkende werkzaamheid aangetoond bij de behandeling van hematologische maligniteiten. Onlangs worden deze therapieën ontwikkeld voor infectieziekten, maar studies gericht op schimmelinfecties blijven schaars. Om optimale doelen te identificeren en cellulaire producten te optimaliseren, hebben we een methode ontwikkeld om chimere antigeenreceptor-natural killer (CAR-NK)-cellen te ontwikkelen en hun reactie op stimulatie door schimmels te evalueren. Dit artikel beschrijft een eenvoudige en robuuste methode voor het genereren van CAR-NK-cellen die zijn afgestemd op schimmeldoelen met behulp van het niet-virale Doornroosje-transposonsysteem. NK-92-cellen worden getransfecteerd met de hyperactieve transposase SB100X, gevectoriseerd als minicirkel-DNA (MC) samen met een plasmide-gecodeerde CAR-transposon. De transfectieefficiency wordt 1 week later beoordeeld gebruikend stromingscytometrische analyse. Voorafgaand aan functionele tests worden de cellen die het transgen tot expressie brengen verrijkt met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering en nog 1 week gekweekt. Om de antigeenspecifieke activering te evalueren, worden de gemanipuleerde cellen gedurende ten minste 6 uur samen gekweekt met Aspergillus fumigatus-kiembuizen . Vervolgens wordt de concentratie van het uitgescheiden interferon-gamma (IFN-γ) gemeten met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenttest.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) is een alomtegenwoordige schimmel, waarbij de gemiddelde persoon dagelijks tussen de 100 en 1.000 conidia inademt1. Bij patiënten met verworven of aangeboren immunodeficiënties, zoals patiënten die chemotherapie ondergaan of die lijden aan leukemie, kan A. fumigatus leiden tot ernstige invasieve apsergillose. Elk jaar krijgen wereldwijd meer dan 200.000 mensen last van aspergillose. Ondanks het gebruik van antimycotica voor preventie en therapie met azoolderivaten, blijft het sterftecijfer tussen 30% en 95%2,3. Bovendien heeft de behandeling aanzienlijke bijwerkingen en is 7% van de A. fumigatus-culturen al azolresistent4.

Therapie met chimere antigeenreceptor (CAR)-gemanipuleerde T-cellen heeft klinisch succes aangetoond bij de behandeling van kwaadaardige ziekten en heeft veelbelovende preklinische resultaten opgeleverd bij de bestrijding van infectieziekten zoals invasieve aspergillose 5,6,7,8. Onze eerder beschreven Af-CAR-T-cellen gericht op een eiwit in de celwand van A. fumigatus hyfen hebben veelbelovende resultaten laten zien in preklinische modellen6.

Het verminderde risico op graft-versus-host-ziekte, cytokine-afgiftesyndroom en neurotoxiciteit maakt CAR-NK-cellen tot een waardevol alternatief voor CAR-T-cellen als een "kant-en-klare" behandeling voor acute infecties9. Bovendien is aangetoond dat NK-cellen een cruciale rol spelen in de antischimmel-immuunrespons. Wanneer gestimuleerd met A. fumigatus, scheiden NK-cellen cytokines zoals IFN-ɣ en chemokinen zoals CCL-3 en CCL-4 af en geven ze cytotoxische korrels af10,11.

De NK-92-cellijn is een populaire bron van NK-cellen voor genetische manipulatie en biedt het voordeel van snelle proliferatie en expansie in relatief eenvoudige kweekomstandigheden12. Verschillende preklinische studies hebben het therapeutisch potentieel van CAR-getransduceerde NK-92-cellen aangetoond bij de behandeling van zowel hematologische als solide tumoren. Er zijn tal van klinische onderzoeken gaande om hun veiligheid, werkzaamheid en mogelijk gebruik als "kant-en-klare" cellulaire therapiete onderzoeken 13.

Het bereiken van hoge transfectie-efficiëntie en stabiele transgenexpressie in NK-cellen is een uitdaging. Hoewel virale methoden een hoge efficiëntie beloven, brengen ze het risico met zich mee van insertiemutaties met daaropvolgende oncogenese 9,14. De nieuwste generatie Doornroosje (SB) transposonvectoren biedt een veilig, krachtig en economisch levensvatbaar systeem voor stabiele genoverdracht, waarbij de beperkingen van virale en voorbijgaande niet-virale genafgiftemethoden worden overwonnen15.

Daarom schetst dit protocol een nieuwe methodologie voor het genereren van Af-CAR-NK-92-cellen, die mogelijk kunnen dienen als een "kant-en-klare" therapeutische optie voor patiënten met levensbedreigende invasieve aspergillose. De werkzaamheid van deze aanpak wordt geïllustreerd door de verhoogde productie van IFN-ɣ bij stimulatie met A. fumigatus hyfen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hier beschreven experimenten moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. In dit protocol, tonen wij twee voorwaarden: (I) Schijntransfectie zonder DNA dat als controle zal dienen en (II) CAR-transfectie gebruikend eerder beschreven Af-CAR6. Het Af-CAR-plasmide bevat een afgekapte epidermale groeifactorreceptor (EGFRt) sequentie stroomafwaarts van de CAR, die zal worden gebruikt als een transfectiemarker (aanvullende figuur S1). Voor elke aandoening zijn 4 × 106 NK-92-cellen vereist.

1. Kweken van de NK-92 cellen

  1. Bereid één of twee dagen vóór de transfectie vers celkweekmedium met de volgende samenstelling: 75% (v/v) alfa-MEM Medium (met nucleosiden) + 12,5% (v/v) door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) + 12,5% (v/v) door warmte geïnactiveerd paardenserum + 2 mM L-glutamine.
  2. Resuspendeer ten minste 107 NK-92-cellen bij een celdichtheid van 5 × 105 cellen/ml.
  3. Voeg IL-2 toe aan de celsuspensie in een concentratie van 150 UI/ml.
  4. Kweek de cellen in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C met 5% CO2 .
    OPMERKING: IL-2 kan worden gebruikt in een eindconcentratie van 5 ng/ml.

2. Niet-virale transfectie

  1. Controleer de kwaliteit van de cellen onder de microscoop. Een suspensie van celclusters en een duidelijke achtergrond duiden op een gezonde celcultuur.
  2. Voeg in een plaat met 6 putjes voor elke toestand 2 ml celkweekmedium per putje toe. Plaats de plaat in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C met 5% CO2 .
    OPMERKING: Antibiotica kunnen de levensvatbaarheid van cellen na transfectie verminderen. Houd het medium antibioticavrij.
  3. Tel de cellen en controleer de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van (bijv. Trypan Blue-kleuring).
  4. Breng 8 × 106 NK-92-cellen over naar een conische bodembuis van 15 ml. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten met een versnelling en vertraging van 3. Gebruik dit programma voor alle volgende centrifugatiestappen.
  5. Bereid tijdens het centrifugeren twee reactiebuizen van 1,5 ml voor. Pipetteer het DNA voor Af-CAR (8 μg plasmide-DNA en 4 μg SB100X Mini Circle, tabel 1) in een van de buisjes. Houd de tweede DNA-vrij om een Mock-controle te zijn.
  6. Wanneer de centrifuge klaar is, gooit u het bovenstaande voorzichtig weg en vult u de buis met de cellen met maximaal 15 ml voorverwarmde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  7. Centrifugeren (stap 2.4).
  8. Tijdens het centrifugeren, bereid één buis van het transfectiesysteem voor elke voorwaarde voor door 3 ml elektrolytische buffer in elke buis toe te voegen. Plaats de eerste buis in het pipetstation.
  9. Wanneer de centrifuge klaar is, gooit u het bovenstaande voorzichtig weg en resuspendeert u de celpellet in 200 μL resuspensiebuffer (100 μL/4 × 106 cellen).
    OPMERKING: Vermijd het verlaten van de cellen in resuspensiebuffer langer dan 15-30 min, aangezien dit de levensvatbaarheid van de cel en de transfectieefficiency verlaagt.
  10. Voeg 100 μl van de celsuspensie toe aan elk van de twee reactiebuizen. Meng voorzichtig.
    OPMERKING: Vermijd luchtbellen tijdens het pipetteren, omdat luchtbellen vonken veroorzaken, wat leidt tot celdood.
  11. Pipetteer het DNA-celmengsel uit de eerste reactiebuis met de pipet van het transfectiesysteem en steek de pipet verticaal in de buis die in het pipetstation is geplaatst.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat de punt goed past.
  12. Stel de eerste puls in op 1.650 V en de pulstijd op 20 ms en druk op Start.
  13. Stel na voltooiing de tweede puls in op 500 V en de pulstijd op 100 ms. Druk op Start.
  14. Verwijder na voltooiing de pipet langzaam uit het pipetstation en breng de cellen onmiddellijk over in een putje van de voorbereide kweekplaat met 2 ml voorverwarmd celkweekmedium (zie stap 2.2). Verplaats de plaat voorzichtig cirkelvormig om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig verdeeld zijn.
  15. Neem voor het proefmonster 100 μl van de celsuspensie uit het DNA-vrije reactiebuisje (zie stap 2.9) en herhaal dezelfde procedure van stap 2.11 tot en met stap 2.14 met een nieuw buisje en een nieuwe pipetpunt.
  16. Incubeer de plaat in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C met 5% CO2 .
  17. Voeg na 30 minuten incubatie IL-2 toe met een eindconcentratie van 150 UI/ml.

3. Het controleren van de transfectieefficiency gebruikend stromingscytometrie

  1. Na 1 week cultiveren en splitsen van de cellen om de dag, neem je 1-5 × 105 cellen van elke aandoening in een polystyreen buis met ronde bodem.
  2. Was de cellen door 1 ml buffer toe te voegen (PBS + 0,5% (v/v) FBS + 2 mM EDTA); centrifugeer en gooi de supernatant weg.
  3. Resuspendeer de celpellet in 50 μL buffer. Voeg 1 μL 7-AAD toe om de dode cellen te detecteren.
  4. Voeg 5 μL anti-tEGFR-Alexa fluor 647-antilichaam toe om de getransfecteerde cellen te kleuren.
  5. Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C.
  6. Was de cellen (zie stap 3.2).
  7. Resuspendeer de celpellet in 200 μL buffer.
  8. Meet de monsters op een flowcytometer.
    OPMERKING: Als de transfectieefficiency niet bevredigend is, ga dan met de verrijking van transgen-tot expressie brengende cellen te werk.

4. Verrijking van cellen die transgenen tot expressie brengen door magnetische geactiveerde celsortering (MACS)

OPMERKING: Voor een optimaal resultaat start u het protocol met 8-10 × 106 cellen. Alle centrifugatiestappen worden uitgevoerd bij 4 °C.

  1. Bereid de buffer voor zoals beschreven in stap 3.2. Verdun de cellen in een concentratie van 1-2 × 106/100 μL met de buffer in een conische bodembuis van 15 ml.
  2. Voeg 1 μL anti-EGFRt-biotine toe per 1-2 × 106 cellen en draai de tube voorzichtig rond om een gelijkmatig verdeelde oplossing te garanderen.
  3. Incubeer gedurende 25 minuten bij 4 °C en vul de buis vervolgens met maximaal 10 ml buffer.
  4. Centrifuge. Gooi het bovenstaande weg.
  5. Voeg 8 μL/1 × 106 cellen koude buffer toe.
  6. Voeg 2 μL anti-biotine magnetische kralen toe per 1 × 106 cellen.
  7. Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C.
  8. Wassen door tot 10 ml met buffer te vullen.
  9. Centrifuge. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen opnieuw in 500 μl buffer.
  10. Plaats een LS-kolom in de MACS-magneet en was met 3 ml buffer.
  11. Zodra de buffer volledig door de kolom is gemigreerd, voeg je de celsuspensie toe.
  12. Was de zuil 3x, elk met 3 ml buffer.
  13. Verwijder de kolom van de magneet en plaats deze in een schone conische bodembuis van 15 ml.
  14. Voeg 5 ml buffer toe aan de kolom. Spoel met behulp van de zuiger de EGFR-positieve cellen zo snel mogelijk weg.
  15. Kweek de cellen een paar dagen; Controleer vervolgens de efficiëntie door middel van flowcytometrie.

5. Functioneel testen

OPMERKING: Bereid voor het komende experiment het volgende medium voor en gebruik het: RPMI + 20% FBS.

  1. Dag 1 - Zaaien van Aspergillus fumigatus conidia
    1. Bereid een A. fumigatus conidia suspensie met een concentratie van 2,5 ×10,5 conidium/ml in het medium.
    2. Piket in een kweekplaat met 96 putjes 100 μL van de conidia suspensie per putje en incubeer bij 25 °C gedurende 16 uur.
      OPMERKING: Na de incubatietijd zullen de conidia ontkiemen (Figuur 1).
  2. Dag 2 - Co-cultuur met CAR NK-92 cellen
    1. Was de Mock en Af-CAR NK-92 cellen 2x met het medium.
    2. Co-cultuur met de schimmel in een effector-to-target verhouding van 2:1 door 5 × 104 cellen toe te voegen in 100 μL medium per putje (Figuur 2).
    3. Voeg voor positieve controle 1 ng PMA en 100 ng ionomycine per putje toe in 100 μL medium. Gebruik cellen in medium alleen als negatieve controle.
    4. Incubeer de plaat bij 37 °C in een bevochtigde CO2 -incubator gedurende ten minste 6 uur.
    5. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten op 300 × g .
    6. Oogst 100 μL van elke put; Vermijd het aanraken van de bodem. Breng de supernatanten over in reactiebuisjes.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat alleen het bovenstaande middel wordt gepipetteerd en niet de gegroeide schimmel. Voeg bij twijfel nog een centrifugatiestap toe.
    7. Voer IFN-ɣ ELISA uit volgens de instructies van de fabrikant of bewaar de monsters tot gebruik bij -80 °C.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gehele proces van het produceren van Af-CAR NK-92-cellen, inclusief transfectie, herstel, verrijking en uitbreiding, duurt ongeveer 14 dagen. Na transfectie worden de cellen gekweekt en om de twee dagen gesplitst. De levensvatbaarheid van de cellen kan afnemen tijdens de eerste splitsing twee dagen na transfectie. Typisch, herstellen de cellen 4 dagen na transfectie en beginnen te prolifereren, met een verdubbelingstijd van 48 h.

Na terugwinning worden de transfectie-efficiënties gemeten en zullen naar verwachting 10-20% bereiken (representatieve resultaten die in Figuur 3 worden getoond). Verrijking van EGFR-positieve cellen via MACS verhoogt het percentage Af-CAR NK-92-cellen tot meer dan 95% (representatieve resultaten weergegeven in figuur 4).

Culturen met meer dan 95% Af-CAR-cellen werden gebruikt voor functionele testen. Hier hebben we de cellen gedurende 6 uur gekweekt met A. fumigatus-kiembuizen en de IFN-ɣ-secretie gemeten als activeringsmarker. Zoals te zien is in figuur 5, vertoonden de Af-CAR-cellen een significante cytokinesecretie (gemiddelde = 340,6 ± 86,5 pg/ml) in vergelijking met Mock NK-92-cellen (gemiddelde = 75,6 ± 19,5 pg/ml), wat wijst op een aanzienlijk hogere activering van de Af-CAR-cellen (p-waarde = 0,03).

figure-results-1
Figuur 1: Kiembuizen van Aspergillus fumigatus. Microscopiebeeld van A. fumigatus na 16 uur incubatie. Kiembuisjes/kleine schimmeldraden worden geobserveerd en homogeen over de put verdeeld. Schaalbalk = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Co-cultuur van Aspergillus fumigatus kiembuizen met NK-92 cellen. Microscopiebeeld van co-cultuur. De NK-92-cellen vormen clusters en staan in contact met de A. fumigatus-kiembuizen . Schaalbalk = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: De efficiency van de transfectie die door kleuring voor de transfectieteller EGFR wordt geëvalueerd . Op dag 5, na elektroporatie, werden NK-92-cellen gekleurd met 7-AAD en anti-EGFR. De resultaten worden getoond voor één representatief experiment voor (A) Mock en (B) Af-CAR NK-92 cellen. De linkerkolom toont puntdiagrammen van celgrootte versus celgranulariteit; het hek is geplaatst op de NK-92 cellen. De dode cellen worden geëxgateerd met behulp van 7-AAD-labeling (tweede kolom). Het percentage levende EGFR+ -cellen wordt weergegeven in de derde kolom. Afkortingen: EGFR = epidermale groeifactorreceptor; 7-AAD = 7-aminoactinomycine D; CAR = chimere antigeenreceptor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Kleuring van het celoppervlak na verrijking van NK-92-cellen die het transgen tot expressie brengen. Aan de linkerkant worden de Mock-cellen weergegeven. Aan de rechterkant zijn de Af-CAR-NK-cellen weergegeven. De rode histogrammen geven de ongekleurde cellen weer. De blauwe histogrammen geven de corresponderende gekleurde cellen weer. De poort wordt ingesteld op de EGFR+ cellen; De cijfers geven het percentage positieve cellen aan. Afkortingen: EGFR = epidermale groeifactorreceptor; CAR = chimere antigeenreceptor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Cytokinesecretie van NK-cellen geactiveerd door Aspergillus fumigatus kiembuizen. De diagrammen geven de resultaten weer van de IFN-ɣ-secretie van Af-CAR- en Mock-cellen in co-cultuur met schimmel gemeten door ELISA na 6 uur co-cultuur. De getoonde gegevens zijn het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijk uitgevoerde experimenten (n = 3). P-waarde berekend door Welch's t-test met behulp van GraphPad Prism 10, * p < 0,05. Afkortingen: NK = natural killer; IFN-ɣ = interferon gamma; CAR = chimere antigeenreceptor; ELISA = enzymgekoppelde immunosorbenttest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

NaamBedrijfVoorraad concentratieReferentie
TransposaseSB100X Mini CirkelPlasmidefabriek1 μg/μL19
TransposonAf-CAR plasmideIn eigen huis geproduceerd1 μg/μL6

Tabel 1: DNA gebruikt in dit protocol.

Aanvullende figuur S1: Plasmidekaart van de Af-CAR-transposon: Schema van plasmidevector en ontwerp van CAR-transposon. Afkortingen: EF1 = elongatiefactor-1 alfa-promotor; ORI = bacteriële oorsprong van replicatie; LIR = linkse omgekeerde herhaling; RIR: rechts omgekeerde herhaling; Cyto = cytoplasmatisch; Tm = Transmembraan. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het meegeleverde protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare methode voor het maken van CAR-NK-cellen die zich richten op schimmelpathogenen met behulp van het niet-virale Sleeping Beauty transposon-systeem. Deze methode maakt de stabiele en permanente insertie van grote transgenen mogelijk, waardoor de expansie van cellen mogelijk is om de nodige hoeveelheden te verkrijgen voor verdere analyse14,16.

Verscheidene zeer belangrijke factoren kunnen het succes van de transfectie beïnvloeden, met inbegrip van celaantal en levensvatbaarheid, impulssterkte en duur, evenals DNA-kwaliteit en kwantiteit17. Het is van cruciaal belang om de gezondheid van de cellen te beoordelen voordat u begint, waarbij een levensvatbaarheid van ten minste 90% wordt gegarandeerd. Het is aangetoond dat een verhoogde pulssterkte de transfectie-efficiëntie van een celpopulatie kan verbeteren. Deze aanpak kan echter ook resulteren in een aanzienlijke vermindering van de levensvatbaarheid van cellen. In gevallen met overtollige cellen en een beperkte hoeveelheid of kwaliteit DNA, kan het aantal cellen dat het plasmide met succes opneemt onvoldoende zijn17. Desalniettemin is aangetoond dat hoge concentraties DNA giftig zijn en de levensvatbaarheid van cellen verminderen18.

De vroegere studies hebben hogere transfectieefficiency bereikt, maar richtten zich uitsluitend op voorbijgaande eiwitexpressie17. Ons protocol daarentegen zorgt voor een stabiele insertie van transgenen. Om de lage transfectie-efficiëntie aan te pakken, hebben we de verrijking van positief getransfecteerde cellen geïmplementeerd en ongeveer 95% cellen met CAR-expressie bereikt. Dit verlengde de productietijd echter tot ~1 week. Als kortere productietijden gewenst zijn, kan het transposon-DNA als een minicirkel worden geleverd, wat de transfectie-efficiëntie kan verbeteren en de noodzaak voor de verrijkingsstap19 kan elimineren. Desalniettemin kan de productietijd niet worden teruggebracht tot <1 week om celherstel en proliferatie mogelijk te maken.

Gezien de acute aard van invasieve aspergillose, zouden "kant-en-klare" cellulaire therapieën gunstig zijn. De uitdagingen en kosten die gepaard gaan met het isoleren van cellen van patiënten en het uitbreiden van primaire cellen hebben de populariteit van NK-92 als een handige cellijn voor de productie van CAR-NK-cellen vergroot20. NK-92-cellen zijn over het algemeen robuust en vermenigvuldigen zich snel in aanwezigheid van IL-2, wat het bereiken van grote celhoeveelheden in een relatief korte periode vergemakkelijkt. In het licht van deze voordelen hebben we een protocol ontwikkeld om NK-92-cellen te gen-engineeren, wat aantoont dat het mogelijk is om CAR-NK cellulaire producten met een hoge zuiverheid veilig te transferleren en te bereiden. Hoewel dit protocol kan worden aangepast om primaire CAR-NK-cellen te bereiden, moeten verschillende wijzigingen worden overwogen. Deze omvatten het optimaliseren van het aantal en de intensiteit van pulsen, de hoeveelheid DNA die wordt gebruikt en het opstellen van een geschikt uitbreidingsprotocol. Eventuele wijzigingen in het protocol vereisen een grondig onderzoek om de werkzaamheid te garanderen. Desalniettemin biedt ons protocol een fundamenteel sjabloon dat in toekomstige experimenten kan worden aangepast voor primaire NK-cellen.

Samenvattend is dit innovatieve transfectieprotocol voor het produceren van stabiele Af-CAR-NK-cellen een efficiënte en reproduceerbare methode die kan worden gebruikt om andere ziekten aan te pakken. Bovendien kan het worden gebruikt als een kosteneffectieve methode om te screenen op nieuwe CAR's die gericht zijn op een verscheidenheid aan antigenen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.H.: Uitvinder van octrooiaanvragen en verleende octrooien met betrekking tot CAR-technologie, gedeeltelijk in licentie gegeven aan de industrie. Medeoprichter en aandeelhouder T-CURX GmbH, Würzburg. Spreker honoraria: BMS, Janssen, Kite/Gilead, Novartis. Onderzoeksondersteuning: BMS. M. B. meldt reisondersteuning van farmaceutisch bedrijf "Eli Lilly and company", wat geen verband houdt met deze studie. De andere auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiering en ondersteuning voor het project werden verstrekt door Wilhelm Sander Stiftung, project 2020.017.1 aan M.H., en J.L.; Deutsche Forschungsgemeinschaft (Collaborative Research Center/Transregio 124 Pathogene schimmels en hun menselijke gastheer: Networks of interaction-FungiNet; project A8 aan M.H. en H.E.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 ML conical bottom tubesGreiner Bio-One188271PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STERIELE
50 ML conical bottom tubesGreiner Bio-One227270PP, 30/115 MM, CELLSTAR, STERIELE
6- and 96-Well- Cell culture plateCorning Inc. LifeSciences83-3736/ 83-3474TC-treated Multiple Well Plates, Flat bottoms, Treated for optimal cell attachment, Sterilized by gamma irradiation, Nonpyrogenic
7-AAD (7-Aminoactinomycin D)BD Biosciences559925Ready-to-use nucleic acid dye for the exclusion of nonviable cells in flow cytometric assays
Alexa Fluor 647 anti-human EGFR AntibodyBiolegend352918Clone AY13
Anti-Biotin MicroBeads UltraPureMiltenyi Biotec130-105-637UltraPure MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies
Aspergillus fumigatusATCC46645
Biosphere Filter Tips (20 and 100 μL) Sarstedt70.3030.365 / 70.3030.275
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537 Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture, endotoxin, tested
ELISA MAX Deluxe Set Human IFN-γBiolegend430104
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA)Sigma-AldrichE7889for molecular biology, 0.5 M in H2O, DNase, RNase, NICKase and protease, none detected, 0.2 μm filtered.
FACS cleanBD Biosciences340345
FACS Flow Sheath FluidBD Biosciences342003
FACS Rinse SolutionBD Bioscience340346
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF7524sterile-filtered, suitable for cell culture, heat inactivated before use
Gibco, MEM α, nucleosidesThermofisher Scientific22571020Phenol Red, Ribonucleosides, Deoxyribonucleosides, Sodium Bicarbonate
Horse serumThermo Fisher Scientific16050122Sterile-filtered, heat inactivated before use
Human IL-2 IS, research gradeMiltenyi Biotec130-097-742Research grade. The ED50 is ≤0.3 ng/mL, corresponding to an activity of ≥3 × 106 IU/mg.
IonomycinSigma-AldrichI0634-1MGfrom Streptomyces conglobatus, used as positive control for cytokine secretion 
L-GlutamineSigma-AldrichW368401For cell culture
MACS LS ColumnMiltenyi Biotec130-042-401 Columns and plungers, sterile packed
NK-92DSMZACC 488
Neon Transfection System 100 μL-KitThermo Fisher ScientificMPK10096Resuspension Buffer R, Electrolytic Buffer E2, 100 μL Neon Tips, Neon Electroporation Tubes
Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)Sigma-AldrichP1585-1MGused as positive control for cytokine secretion 
Polystyrene round-bottom tube, 5 mLBD BioscienceS-452400used for flow cytometry
Reaction tube, 1.5 MLGreiner Bio-One7,26,90,001PP, transparent, cap attached, with injected graduation. Sterilized before use. 
RPMI 1640 Medium, GlutaMAXThermo Fisher Scientific72400021GlutaMax I,  Phenol Red, HEPES, Sterile-filtered
TipOne 1000 μL XL Graduated Filter TipStarLabS1122-1730
Equipment
BD FACSCaliburBD Bioscience
CO2 Incubator C60 Labotect
Heraeus Multifuge 3SRThermo Scientific
HydroFLEX microplate washer Tecan
NanoQuant Infinite M200 ProTecan
Neon Transfection SystemInvitrogen
Pipettes Eppendorf
Quadro MACS Separator Miltenyi Biotec

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fang, W., Latgé, J. -P. Microbe profile: Aspergillus fumigatus: A saprotrophic and opportunistic fungal pathogen. Microbiology (Reading). 164 (8), 1009-1011 (2018).
  2. Brown, G. D., et al. Hidden killers: Human fungal infections. Sci Transl Med. 4 (165), 165rv113(2012).
  3. Sun, K. S., Tsai, C. F., Chen, S. C., Huang, W. C. Clinical outcome and prognostic factors associated with invasive pulmonary aspergillosis: An 11-year follow-up report from Taiwan. PLoS One. 12 (10), e0186422(2017).
  4. Meis, J. F., Chowdhary, A., Rhodes, J. L., Fisher, M. C., Verweij, P. E. Clinical implications of globally emerging azole resistance in Aspergillus fumigatus. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1709), 20150460(2016).
  5. Seif, M., Einsele, H., Löffler, J. CAR T cells beyond cancer: Hope for immunomodulatory therapy of infectious diseases. Front Immunol. 10, 2711(2019).
  6. Seif, M., et al. CAR T cells targeting Aspergillus fumigatus are effective at treating invasive pulmonary aspergillosis in preclinical models. Sci Transl Med. 14 (664), eabh1209(2022).
  7. Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
  8. Kumaresan, P. R., et al. A novel lentiviral vector-based approach to generate chimeric antigen receptor T cells targeting Aspergillus fumigatus. mBio. 15 (4), e0341323(2024).
  9. Lu, H., Zhao, X., Li, Z., Hu, Y., Wang, H. From CAR-T cells to CAR-NK cells: A developing immunotherapy method for hematological malignancies. Front Oncol. 11, 720501(2021).
  10. Robertson, M. J., Ritz, J. Biology and clinical relevance of human natural killer cells. Blood. 76 (12), 2421-2438 (1990).
  11. Ziegler, S., et al. CD56 is a pathogen recognition receptor on human natural killer cells. Sci Rep. 7 (1), 6138(2017).
  12. Esmaeilzadeh, A., Hadiloo, K., Jabbari, M., Elahi, R. Current progress of chimeric antigen receptor (car) t versus car nk cell for immunotherapy of solid tumors. Life Sci. 337, 122381(2024).
  13. Zhang, J., Zheng, H., Diao, Y. Natural killer cells and current applications of chimeric antigen receptor-modified NK-92 cells in tumor immunotherapy. Int J Mol Sci. 20 (2), 317(2019).
  14. Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy. Acta Pharmacol Sin. 39 (2), 167-176 (2018).
  15. Hudecek, M., et al. Going non-viral: The Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side. Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).
  16. Amberger, M., Ivics, Z. Latest advances for the Sleeping Beauty transposon system: 23 years of insomnia but prettier than ever. BioEssays. 42 (11), 2000136(2020).
  17. Ingegnere, T., et al. Human car nk cells: A new non-viral method allowing high efficient transfection and strong tumor cell killing. Front Immunol. 10, 957(2019).
  18. Stacey, K. J., Ross, I. L., Hume, D. A. Electroporation and DNA-dependent cell death in murine macrophages. Immunol Cell Biol. 71 (Pt 2), 75-85 (1993).
  19. Monjezi, R., et al. Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors. Leukemia. 31 (1), 186-194 (2017).
  20. Moscarelli, J., Zahavi, D., Maynard, R., Weiner, L. M. The next generation of cellular immunotherapy: Chimeric antigen receptor-natural killer cells. Transplant Cell Ther. 28 (10), 650-656 (2022).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CAR NK cellenNK 92 cellenmagnetisch geactiveerde cel sorteringAspergillus fumigatusniet virale genoverdrachtinterferon gamma secretieflowcytometrische analyseenzyme linked immunosorbent assay

Gerelateerde artikelen