Methodenartikel

Microbellen fabriceren en labelen met fluorescerende en radioactieve tracers

DOI:

10.3791/67431

⸱

24 januari 2025

 ,  ,  , 
1Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, 2Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 3Department of Medicine, University of Toronto, 4Department of Medical Biophysics, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst de fabricage van lipide microbubbels en een compatibele eenpots microbubbel radiolabelingmethode met zuiveringsvrije >95% etiketteringsefficiëntie die de fysisch-chemische eigenschappen van microbellen behoudt. Deze methode is effectief in verschillende formuleringen van lipide-microbubbels en kan worden aangepast om radioactieve en/of fluorescerende microbubbels te genereren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microbubbels zijn met lipiden omhulde, met gas gevulde deeltjes die zijn geëvolueerd van vasculaire ultrasone contrastmiddelen tot revolutionaire platforms voor kankertherapie. In combinatie met therapeutisch gefocusseerde echografie (FUS) kunnen ze veilig en lokaal fysiologische barrières overwinnen (bijv. bloed-hersenbarrière), medicijnen toedienen aan anders ontoegankelijke kankers (bijv. glioblastoom en alvleesklierkanker) en neurodegeneratieve ziekten behandelen. Het therapeutische arsenaal van microbellen-FUS gaat in nieuwe richtingen, waaronder synergetische combinatieradiotherapie, multimodale beeldvorming en alles-in-één laden en afgifte van geneesmiddelen uit microbellenschelpen.

Het labelen van microbellen met radiotracers is de sleutel tot het tot stand brengen van deze uitgebreide theranostische mogelijkheden. Bestaande strategieën voor radiolabeling van microbellen zijn echter gebaseerd op zuiveringsmethoden waarvan bekend is dat ze de fysisch-chemische eigenschappen van microbellen verstoren, kortlevende radio-isotopen gebruiken en niet altijd een stabiele chelatie opleveren. Gezamenlijk creëert dit onduidelijkheid over de nauwkeurigheid van radiobeeldvorming met microbellen en de efficiëntie van de afgifte van radio-isotopen door tumoren.

Dit protocol beschrijft een nieuwe eenpots, zuiveringsvrije microbellenlabelingsmethodologie die de fysisch-chemische eigenschappen van microbellen behoudt en tegelijkertijd een efficiëntie van >95% radio-isotoopchelatie bereikt. Het is veelzijdig en kan met succes worden toegepast in op maat gemaakte en commerciële microbellenformuleringen met verschillende acyllipideketenlengte, lading en chelaatvormer/sonde (porfyrine, DTPA, DiI) samenstelling. Het kan adaptief worden toegepast tijdens de fabricage van microbellen in de grond en op kant-en-klare formuleringen van microbellen met modulaire aanpasbaarheid van fluorescentie en multimodale fluorescentie/radioactieve eigenschappen. Dienovereenkomstig maakt deze flexibele methode de productie mogelijk van op maat gemaakte, traceerbare (radio-, fluorescentie- of radio-/fluorescerend actieve) multimodale microbubbels die nuttig zijn voor het bevorderen van mechanistische, beeldvormende en therapeutische microbubbel-FUS-toepassingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microbubbels zijn supramoleculaire theranostische middelen ter grootte van een micron met een gaskern die wordt gestabiliseerd door een eiwit, polymeer of, in de meeste gevallen, een lipidenomhulsel (Figuur 1A). Wanneer ze in de bloedbaan worden geïnjecteerd, behouden microbellen gas/vloeistof-interfaces die minutenlang vóór het oplossen van hun gaskernen door middel van echografie kunnen worden gedetecteerd 1,2. Bijgevolg was het eerste klinische gebruik van microbellen als real-time ultrasone beeldvormingscontrastmiddelen3. De uitvinding van therapeutisch gefocusseerde echografie (FUS) breidde de klinische bruikbaarheid van microbellen uit. Wanneer ze worden gestimuleerd door laagfrequente FUS, oscilleren microbellen en genereren ze gerichte, afstembare mechanische krachten, variërend van voorbijgaande vasculaire permeabilisatie tot focale weefselablatie 4,5. Als gevolg hiervan is microbubble-FUS in de afgelopen 20 jaar onderzocht voor het openen van de bloed-hersenbarrière (BBB), tumorafgifte (bijv. pancreas-, hersen- en levermetastasus), medicijn- en beeldvormingssonde, therapie met neurodegeneratieve ziekten en kankerablatie 6,7,8,9,10,11.

Het theranostische arsenaal aan microbubbels blijft zich in nieuwe en opwindende richtingen ontwikkelen. Conventionele toepassingen voor de afgifte van microbellen-FUS zijn afhankelijk van de gelijktijdige toediening van therapeutische of beeldvormende lading naast commerciële microbellen. Er is een groeiende belangstelling voor het verbeteren van de afgiftemogelijkheden van microbubbels en FUS door inzicht te krijgen in microbubbels, biologische interacties tussen microbubbels en het verkennen van op maat gemaakte niet-commerciële microbubbelformuleringen en het genereren van alles-in-één theranostische microbubbels met vracht die rechtstreeks op de microbubbelschaal wordt geladen 12,13,14. In feite maakt ongeveer 40% van de onderzoeken naar de afgifte van lipide microbubbels gebruik van dergelijke met schelpen beladen microbubbels15. Naast beeldvorming en medicijnafgifte is microbubble-FUS ook veelbelovend gebleken bij het verbeteren van kankerradiotherapie16 en het activeren van antineoplastische effecten van anders goedaardige middelen met schelpen door middel van sonodynamische therapie17,18.

Deze conventionele en uitgebreide richtingen in toepassingen van microbellenkanker kunnen strategischer worden ontwikkeld door microbellenschelpen te labelen met radioactieve tracers. Op het gebied van alles-in-één met vracht geladen microbellen, vergemakkelijkt dergelijke radiolabeling 1) een gouden standaard, kwantitatieve beoordeling van de biodistributie op en buiten het doel van deze geladen microbellenschelpen, 2) leidt farmacokinetische structuur-activiteitsrelaties af die een optimale selectie van microbellensamenstellingen informeren om de afgifte op het doel te maximaliseren, en 3) begeleidt strategische en geschikte beeldgeleide toepassings- en behandelingsplanning (bijv. soorten weefseldoelen, dosimetrie, geneesmiddelenselectie om off-target veiligheidsproblemen te verminderen, nut in vergelijking met conventionele co-behandelingsparadigma's) van alles-in-één vrachtgeladen systemen 15,19. In een preklinisch stadium kan een dergelijk begrip van het lot van microbellenschelpen ook bredere werkingsmechanismen van microbubbels en FUS verlichten. Het is bijvoorbeeld aangetoond dat lipideoverdracht van microbellenschalen naar doelcellen invloed heeft op FUS-enabled sonoporatie12,20. Het begrijpen en optimaliseren van een dergelijke overdracht kan dus preklinische en klinische microbellen-FUS-therapieën informeren waarbij sonoporatie betrokken is (in vitro transfectie, medicijnafgifte, tumorablatie, stralingssensibilisatie en sonodynamische therapie 20,21,22,23,24,25). Dubbele echografie- en radiobeeldvormingsfaciliteiten zouden ook het openen en bewaken van de behandeling van FUS-vaten mogelijk maken (bijv. BBB-openingskinetiek) vanuit een enkel middel in plaats van conventionele ontwerpen met twee middelen26. In dezelfde geest zou radiolabeling van lipide microbellen kunnen dienen als een alles-in-één alternatief voor microbubbel-FUS/radiotherapie voor microbel-FUS + radiofarmaceutische co-afgifteplatforms27.

De kwetsbaarheid van microbubbels is een onbeduidende uitdaging voor een dergelijke etikettering. Alle bestaande strategieën voor radiolabeling worden beperkt door zuiveringsmethoden waarvan bekend is dat ze de stabiliteit en grootte van microbellen verstoren, terwijl sommige ook ineffectieve en onstabiele radiolabeling bevatten 28,29,30,31,32. Zuiveringsvereisten leiden ook tot langere protocollen. In combinatie met het gebruik van kortlevende radio-isotopen (bijv. 18F t1/2 1,8 uur,28,29 99mTc t1/2 6 uur,3268Ga t1/2 1 uur31), creëert dit inefficiënties die verband houden met het verval van radio-isotopen en beperkt het de tijdschema's voor radiobeeldvorming en behandelingsplanning. Gezamenlijk riskeren deze beperkingen het verkrijgen van verkorte en niet-representatieve radiobeeldvorming, onnauwkeurige farmacokinetische gegevens en inefficiënte afgifte van tumorradio-isotopen.  

In dit rapport worden deze beperkingen overwonnen door gebruik te maken van de sterke en stabiele metaalchelatiemogelijkheden van porfyrine. Porfyrinen zijn organische, heterocyclische macromoleculen met een sterk geconjugeerde vlakke ring en een centrale coördinatieplaats die plaats biedt aan een verscheidenheid aan metalen. Dit omvat radio-isotopen met een langere levensduur, zoals koper-64 (t1/2 12,7 uur), een radiofarmaceutisch middel met positronemissietomografie (PET) en γ-tellende haalbaarheid33. Wanneer geconjugeerd aan een lipide-ruggengraat, kunnen porfyrinen gemakkelijk worden opgenomen in supramoleculaire structuren en vervolgens worden gelabeld met koper-64 met snelheid, hoge chelatie-efficiëntie en serumstabiliteit, met behoud van de eigenschappen van de niet-gelabelde moederdeeltjes33,34. Bovendien zijn porfyrinen fluorescerend actief met modulaire zelfdoving in nano- en microdeeltjes die wordt hersteld bij verstoring van deeltjes; een aanvullende uitlezing van PET en γ-telling die zowel bulk- als microscopische analyse van het lot van schelpen mogelijk maakt (Figuur 1A)15.

Door porfyrine-lipide als chelator te gebruiken, werden deze eigenschappen benut om een nieuwe, eenpots, zuiveringsvrije microbellenradiolabelingmethodologie te genereren (Figuur 1B,C) die de beperkingen van bestaande microbellenradiolabelingmethoden overwint. Dit protocol bereikt een >95% koper-64-chelatie-efficiëntie, vereist geen zuivering na etikettering en behoudt de fysisch-chemische eigenschappen van microbellen. Het kan gemakkelijk worden geïntegreerd in de "vermalen" fabricage van lipide microbellen voordat ze worden geactiveerd (Figuur 1B). Het is veelzijdig en kan met succes worden toegepast in op maat gemaakte en commerciële microbellenformuleringen met verschillende acyllipideketens (C16 tot C22), lading (neutraal en anionisch) en porfyrine-lipidesamenstellingen (1 mol%, 10 mol%, 30 mol%), waarbij microbellen worden gegenereerd met zowel radio- als fluorescentieactiviteit. Het aanpassingsvermogen kan ook verder reiken dan porfyrine. Het eenpotprotocol kan worden aangepast om alternatieve, in de handel verkrijgbare chelatoren (bijv. diethyleentriaminepentaacetaat (DTPA)-lipide) en fluoroforen (bijv. DiI) te gebruiken. Het kan ook worden aangepast om kant-en-klare microbubbelformuleringen te labelen door middel van een "spiking"-benadering. Dienovereenkomstig maakt deze methode de productie mogelijk van op maat gemaakte, traceerbare (radio-, fluorescerende of dubbele radio/fluorescerende actieve) microbubbels die nuttig zijn voor het bevorderen van mechanistische, beeldvormende en therapeutische microbubbel-FUS-toepassingen. Het onderstaande protocol schetst de fabricage van lipide-microbellen, de toepassing van het eenpot-radiolabelingsprotocol, de vereiste radiolabeling en fysisch-chemische karakterisering van eigenschappen, en mogelijke wijzigingen.

figure-introduction-1
Figuur 1: Protocol voor de fabricage van microbellen en radioactieve labeling. (A) Porfyrine-lipide, in de vorm van pyrofeoforbide-a-lipide, dient als een multimodale chelator binnen dit protocol. Als monomeer gechelateerd tot koper-64 (i), heeft het PET- en beeldvormingsmogelijkheden. De fluorescentie ervan wordt gedoofd in deeltjesvorm (microbellen (ii) en hun na-oplossing nanonageslacht (iii)) en niet geblust door deeltjesverstoring (iv). (B) Hydratatie-/activeringsprotocol voor lipidenfilms beschreven in dit rapport om lipidemicrobellen vanaf de grond af te genereren en (C) integratie van eenpotradiolabeling tussen vorming van lipidensuspensie en activering van microbellen. Deze figuur is aangepast met toestemming van Rajora et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparaten van reagentia

  1. Bereid ammoniumacetaatbuffer voor (0,1 M, pH 5,5)
    1. Weeg met behulp van een analytische balans 770,8 mg ammoniumacetaat af op een weegpapier. Breng de afgewogen hoeveelheid over in een schoon glazen bekerglas van 250 ml.
    2. Voeg 90 ml dubbel gedestilleerd water (ddH2O), gemeten met een pipet met schaalverdeling, toe aan de bekerglas. Voeg een roerstaaf toe en plaats het bekerglas op een magnetische roerplaat om het ammoniumacetaat op te lossen. Roer met een snelheid die een lichte draaikolk creëert, maar zonder opspattend middel.
    3. Kalibreer een pH-meter volgens de instructies van het instrument met behulp van de normen van pH 4 en 7. Eenmaal gekalibreerd, plaatst u de pH-sonde in de ammoniumacetaatbuffer.
    4. Voeg 104 μL azijnzuur toe aan de oplossing, roer om op te lossen en meet de pH.
      OPMERKING: De pH moet op dit punt dicht bij 5.5 liggen.
    5. Pas de pH van de buffer aan door 10 N natriumhydroxide (of zoutzuur als de buffer te basisch wordt) toe te voegen in stappen van 5-10 μL met behulp van een micropipet. Roer, meet de pH en herhaal indien nodig. Noteer de hoeveelheid toegevoegde base/zuur.
    6. Voeg voldoende volume ddH2O toe om in totaal 100 ml buffer te creëren.
      OPMERKING: Als bijvoorbeeld 45 μl 10 N natriumhydroxide werd gebruikt tijdens de pH-aanpassing, zou 9,851 ml ddH2O aan het bekerglas worden toegevoegd (100 ml [doelvolume] - 90 ml [stap 1.1.2] - 0,104 ml [stap 1.1.4] - 0,045 ml [stap 1.1.5] = 9,851 ml).
    7. Roer de buffer nog een laatste keer goed door voordat u deze in een opslagcontainer met deksel doet.
    8. Reinig de pH-meter volgens de instructies van het instrument.
      LET OP: Geconcentreerd waterig natriumhydroxide en zoutzuur kunnen huidreacties veroorzaken en moeten met handschoenen worden gehanteerd.
  2. Bereid hydratatiebuffer (PGG) voor
    1. Zuig fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op in een spuit en rust het uiteinde uit met een polyethersulfon-spuitfilter met een poriegrootte van 0,2 μm. Filter de PBS in een schone plastic centrifugebuis met deksel.
      OPMERKING: 0,2 μm poriënspuitfilters van alternatieve membraanmaterialen (bijvoorbeeld polyvinylideenfluoride) kunnen worden gebruikt zolang het membraan compatibel is met PBS en ammoniumacetaat.
    2. Combineer gefilterde PBS, propyleenglycol en glycerol via een micropipet in een volumetrische verhouding van 8:1:1 om de hydratatiebuffer te maken (ook wel PGG genoemd). Wanneer u propyleenglycol en glycerol toevoegt, zuigt u alle resterende druppels propyleenglycol of glycerol op en veegt u deze van het oppervlak van de pipetpunt voordat u het reagens langzaam in de PBS pipettert. Een duidelijke snaarachtige viskeuze troebelheid zal te zien zijn in de PBS.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een p1000-micropipet te gebruiken om eerst PBS aan een centrifugebuis toe te voegen, gevolgd door propyleenglycol en glycerol, aangezien de laatste twee reagentia stroperig zijn. Daarom moeten ze langzaam via de micropipet worden opgezogen totdat er geen vloeiende beweging meer in de pipetpunt wordt waargenomen en zodat er geen lucht meer wordt opgenomen wanneer de pipetpunt uit het reagens wordt verwijderd. Micropipetpunten met volumetrische markeringen moeten idealiter worden gebruikt om reagensvolumes te kiezen die overeenkomen met dergelijke markeringen (bijvoorbeeld het maken van 1 ml of 5 ml PGG, en respectievelijk het gebruik van de 0,1 ml of 0,5 ml markering op de micropipetpunt om de volledige aspiratie van propyleenglycol en glycerol te visualiseren). Veeg bij het afvegen van het oppervlak van de micropipetpunt niet af aan de tipopening, maar alleen aan de zijkanten.
    3. Pipetteer met de pipetpunt op en neer in de oplossing totdat de reagentia homogeen zijn opgelost. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de oplossing komen.
    4. Om verder te zorgen voor een volledig mengsel van de hydratatiebuffer, sluit u de centrifugebuis af en draait u langzaam op en neer. Niet draaikolken.
    5. Draai de buis 20-30 s op minder dan 1000 x g (minimumtemperatuur 4 °C, maximale RT) om niet-waarneembare luchtbellen te verwijderen.
  3. Bereid hydratatie-/radioactieve labelbuffer voor (AA-PGG)
    1. Spuitfilter 0,1 M, pH 5,5 ammoniumacetaatbuffer (vanaf stap 1.1) en PBS in afzonderlijke buisjes volgens stap 1.2.1.
    2. Combineer gefilterde ammoniumacetaatbuffer, gefilterde PBS, propyleenglycol en glycerol via een p1000-micropipet in een centrifugebuis in een 5:3:1:1 ammoniumacetaatbuffer: PBS: propyleenglycol: glycerolvolumetrische verhouding in de vermelde volgorde. Volg de instructies voor aanzuigen, mengen en centrifugeren volgens de stappen 1.2.2-1.2.5 om AA-PGG te maken.
  4. Onmiddellijke dunnelaagchromatografie (iTLC) eluent
    1. Weeg maximaal 0,1 g ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) af en breng over in een injectieflacon met dop. Los op in ddH2O zodat een 2% m/v oplossing van EDTA wordt gemaakt (voeg bijvoorbeeld voor 50 mg EDTA 2,5 ml ddH2O toe).
    2. Combineer de 2% g/v EDTA-oplossing met de ammoniumacetaatbuffer uit stap 1.1 in een verhouding van 9:1 v/v (90% EDTA-oplossing, 10% ammoniumacetaatbuffer). Sluit de resulterende iTLC-verdunning af en bewaar deze.

2. Vorming van lipidenfilms

OPMERKING: Deze procedure schetst de vorming van een lipidenfilm met samenstellingen die de commerciële microbel, Definity®, nabootsen, waarbij porfyrine-lipide het gastheerlipide vervangt en 30 mol% van het totale lipide uitmaakt. Het radioactieve labelingsprotocol kan echter worden toegepast op diverse lipideformuleringen (C16-, C18- en C22-ketenlengtes, neutrale of anionische lading, variërende porfyrine-lipidemolaire samenstellingen). Er is een aanvullende spreadsheet (aanvullend bestand 1) bijgevoegd met berekeningen, samenstellingen, massa's en voorraadvolumes voor de beschreven en andere formuleringen. Alle lipiden zijn in de handel verkrijgbaar, met uitzondering van het porfyrine-lipide, pyrofeoforbide-a-lipide (pyro-lipide), waarvan de synthese eerder in detail is beschreven35,36.

  1. Bepaal met behulp van aanvullend bestand 1 de totale massa die nodig is voor elke lipide op basis van het aantal benodigde films.
  2. Weeg een lege injectieflacon met 0,5 dram af op een analytische balans.
    OPMERKING: Stof verstoort de succesvolle vorming van microbellen. Blaas dus perslucht in de injectieflacon om stof/deeltjes te verwijderen als deze zonder dop wordt bewaard.
  3. Weeg 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPPC) af op weegpapier.
    OPMERKING: De gewogen massa moet worden verkregen uit stap 2.1 plus nog eens 0,5-1 mg om rekening te houden met eventueel verlies tijdens de monsterbehandeling in latere stappen.
  4. Breng de DPPC over naar de gewogen glazen injectieflacon en weeg deze opnieuw om de lipidemassa in de injectieflacon te bepalen. Dit proces zorgt voor een gemakkelijkere overdracht van lipiden naar de glazen flacon, minder verlies/morsen van lipidenpoeder en een nauwkeurigere meting van de lipidemassa.
  5. Herhaal stap 2.2 tot en met 2.4 met de andere lipiden: 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[methoxy (polyethyleenglycol)-5000] (DPPE-mPEG), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfaat (DPPA) en C16 pyrolipide.
    OPMERKING: Als pyrolipide niet beschikbaar is in een weegbare poedervorm, maar eerder als een film of aliquot van onbekende hoeveelheid, kan het worden opgelost in chloroform om een voorraad te vormen waarvan de concentratie kan worden berekend door middel van UV/Vis-absorptiemetingen in methanol met behulp van de wet van Beer-Lambert zoals eerder beschreven35.
  6. Bereid de volgende organische oplosmiddelen en oplossingen in glazen reageerbuizen met behulp van micropipetten of glazen spuiten: 1) chloroform, 2) 9:1 v/v chloroform: methanol en 3) 65:35:8 chloroform: methanol: ddH2O. Piket voor de laatste de componenten en meng ze in de volgende volgorde: ddH2O, methanol en vervolgens chloroform.
    LET OP: Methanol en chloroform zijn gezondheidsrisico's, ontvlambaar en vluchtig. Draag oogbescherming, handschoenen en een laboratoriumjas en gebruik een zuurkast.
  7. Gebruik het aanvullende bestand 1 om het volume organisch oplosmiddel/oplossing te berekenen dat nodig is om lipidenvoorraden te maken en selecteer glazen spuiten met de juiste volumes.
    OPMERKING: Dit volume moet voorraadconcentraties opleveren die overeenkomen met 15-100 μL voorraad aliquo volumes per film die gemakkelijk kunnen worden gemeten met behulp van 25-100 μL glazen microliter spuiten.
  8. Spoel de glazen spuiten driemaal met chloroform. Pomp de zuiger heen en weer om de spuit te drogen.
  9. Meet en voeg het organische oplosmiddel/de oplossingen via de gereinigde glazen spuit toe aan de afzonderlijke lipideflesjes volgens de spreadsheetberekeningen in stap 2.7 om lipidenvoorraden te vormen. Los pyrolipide op in chloroform (tenzij al opgelost volgens stap 2.5 opmerking), DPPC en DPPE-mPEG in 9:1 v/v chloroform: methanol en DPPA in 65:35:8 chloroform: methanol: ddH2O. Als u voor alle toevoegingen dezelfde glazen spuit gebruikt, spoel en droog dan tussen elke lipide.
    OPMERKING: Als de gekozen formulering geen DPPA of de variant met C18-ketenlengte bevat, kunnen pyro-lipide, host-PC-lipide en PEG-lipide allemaal worden opgelost in chloroform.
  10. Sluit de flesjes en vortex af.
  11. Voeg berekende hoeveelheden voorraad lipideoplossingen toe aan een nieuwe glazen injectieflacon van 0,5 dram (filmflacon) via een glazen microliterspuit. Steek voor de eerste lipidenvoorraad de naaldpunt in het midden onderaan de injectieflacon en dompel langzaam naar beneden om te voorkomen dat de wanden van de injectieflacon opspatten. Plaats voor latere toevoegingen de naaldpunt direct boven het vloeistofniveau en raak de zijkant van de injectieflacon aan om eventuele laatste druppels te verwijderen op een manier die de naald niet blootstelt aan de vloeistof eronder.
    OPMERKING: Spoel en droog de glazen spuit tussen de lipidetoevoegingen door wanneer vervuiling optreedt. Als u meerdere films maakt, sluit dan zowel de film als de voorraadflesjes af tussen de toevoegingen om de verdamping van oplosmiddelen te minimaliseren.
  12. Draai de injectieflacon voorzichtig rechtop om de inhoud te mengen. Spetter geen oplossing tegen de wanden van de injectieflacon.
  13. Verwijder de dop (bewaar de dop) en steek een stikstofleiding in de kopruimte van de injectieflacon. Pas de stikstofstroom aan om een lichte zichtbare verstoring van het vloeistofoppervlak te veroorzaken, maar zonder trechters of spatten.
  14. Draai de injectieflacon onmiddellijk na het inbrengen van de stikstofleiding. Begin met een lage snelheid die voldoende is om een trechter te vormen met oplosmiddel die niet hoger dan 1 cm van de bodem van de injectieflacon komt. Vermijd spatten met oplosmiddelen. Terwijl het oplosmiddel verdampt, verhoogt u de vortexsnelheid langzaam en zonder pauze, waarbij u de oplosmiddelhoogte aanhoudt totdat alle vloeistof is verdampt. Het resultaat is een dunne film die over het onderste derde deel van de injectieflacon is bedekt.
  15. Plaats de injectieflacon in een vacuümuitgerust exsiccator en blijf de film 8-72 uur onder vacuüm drogen. Dek de injectieflacon (behalve de opening) of de exsiccator af met aluminiumfolie.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd na het drogen van de film, of de films kunnen worden bewaard onder argon, afgesloten met Parafilm, in een vriezer van -20 °C voor maximaal 1 maand, en langer als ze droog worden bewaard.

3. Hydratatie van de lipidenfilm

OPMERKING: Als de microbellen in vitro of in vivo worden gebruikt, gebruik dan steriele micropipetpunten, buisjes, spuiten en naalden voor de stappen 3.3 tot en met 5.4, tenzij anders aangegeven.

  1. Haal de film uit de stofzuiger of, indien in de vriezer bewaard, laat deze opwarmen tot RT.
  2. Vul een bekerglas van 250 ml met water en verwarm het water tot 70-80 °C.
  3. Verwarm een waterbadsonicator voor op 69 °C.
  4. Micropipette 1 ml AA-PGG (stap 1.3) langs de randen van de injectieflacon met lipidenfilm om het ontstaan van luchtbellen te voorkomen.
    OPMERKING: Gebruik bij het vervaardigen van ongecheleerde controle- of fluorescerende microbellen PGG (stap 1.2) in plaats van AA-PGG.
  5. Bedek de opening van de injectieflacon gedeeltelijk met een dop en laat voldoende ruimte over om een perfluorpropaan (PFP)-leiding in te brengen. Laat PFP 20 s boven de vloeistof in de hoofdruimte van de injectieflacon stromen, zodat de vloeistof zichtbaar wordt verstoord maar niet spat. Laat PFP niet rechtstreeks in de suspensie stromen. Sluit de injectieflacon af.
    OPMERKING: Als de stroom voldoende sterkte en tijd heeft, zal de injectieflacon beginnen af te koelen om aan te raken.
  6. Dompel de onderste helft van de injectieflacon 1 minuut onder in het waterbad van 70-80 °C. Soniceer vervolgens gedurende ten minste 30 s in de badsonicator van 69 °C of totdat de lipidenfilm homogeen in de AA-PGG is verspreid. Vermijd het creëren van bubbels of het voortijdig activeren van de vorming van microbellen (voortijdige activering verschijnt als melkachtige/troebele gebieden in de lipidensuspensie). Veeg het oppervlak van de injectieflacon af indien nodig om beter te kunnen zien of er nog niet-gesuspendeerde lipiden zijn achtergebleven.
    OPMERKING: Als de lipidenfilm niet binnen 1 minuut na sonicatie hydrateert, verwarm dan opnieuw in het bad van 70-80 °C en consoniceer opnieuw.
  7. Zodra de lipidenfilm homogeen is gesuspendeerd, verwarmt u nog een laatste keer gedurende 1 minuut en sonificeert u deze nog eens 30 s.
  8. Veeg de injectieflacon af en laat deze passief afkoelen tot RT (~5-10 min).
  9. Vul de kopruimte van de injectieflacon opnieuw met PFP volgens stap 3.5, dop en sluit de randen van de dop af met Parafilm.
    LET OP: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en na uiterlijk 8 uur worden hervat.

4. Radioactieve labeling

OPMERKING: Voor ongecheleerde controle of microbellen met alleen fluorescentie, ga naar protocol sectie 5.

LET OP: Voer de stappen 4.4-4.6 van dit protocol uit in een radioactief laboratorium, tenzij anders aangegeven. 64CuCl2 is een radiologisch gevaar met een risico op multisysteemtoxiciteit door blootstelling, inademing of inslikken van de huid. Hanteer het indien mogelijk indirect in een zuurkast met behulp van een tang met rubberen punt. Draag een beschermende laboratoriumjas, een persoonlijke ring- en badgedosimeter en een dubbele handschoen bij het hanteren. Zorg ervoor dat 64CuCl2 wordt behandeld over 2-inch loodafscherming. Vervoer het indien nodig in een container met loden mantel. Bescherm afvalcontainers en voer na gebruik een operationeel onderzoek uit op vervuiling.

  1. Bereid een waterbad van 60 °C voor in een glazen bekerglas of een grote kristalliserende schaal met een magnetische roerstaaf. Gebruik een temperatuurgeregelde warme/roerplaat die is uitgerust met een thermische sonde die in het water wordt gestoken en is ingesteld om te roeren met een snelheid die een zwakke maar zichtbare trechter produceert.
  2. Breng een verzegelde injectieflacon met 64CuCl2 in 0,1 N HCl over naar een dosiskalibrator met een pincet met rubberen punt.
    OPMERKING: Vraag bij het bestellen van 64CuCl2 om het op te lossen in 5-20 μL 0,1 N HCl. Een lager volume is van cruciaal belang voor het behoud van de opbrengst van microbellen.
  3. Noteer de koper-64-activiteit gemeten op de dosiskalibrator en de tijd. Verwijder de injectieflacon met een tang en plaats deze in een loden container.
  4. Deel de genoteerde activiteit door het gerapporteerde volume voor de 64CuCl2 om een MBq·mL-1-waarde te verkrijgen.
  5. Verwijder de dop van de lipidensuspensie uit stap 3.9 en zet deze vast in een injectieflaconhouder.
  6. Verwijder de dop van de 64CuCl2 injectieflacon en zet deze vast met een tang.
  7. Micropipette: een volume van de 64CuCl2-oplossing dat overeenkomt met 40-250 MBq activiteit en overbrengen naar de lipidensuspensie. Zorg ervoor dat de pipetpunt in de suspensie is ondergedompeld. Dompel en pipetteer vervolgens op en neer om de 64CuCl2 volledig over te brengen.
    OPMERKING: De hoeveelheid 64CuCl2 die wordt toegevoegd, is afhankelijk van de beoogde toepassing van de radioactief gelabelde microbellen en de gevoeligheid van de dosiskalibrator. Voor longitudinale (tot 48 uur na injectie) PET en bloedafname in vivo bij muizen wordt een minimum van respectievelijk 220 MBq en 50 MBq aanbevolen.
  8. Sluit zowel de lipidensuspensie als de 64CuCl 2-injectieflacons af.
  9. Draai met behulp van een platte pincet met rubberen punt de radioactieve lipidensuspenspensie minstens 5 keer handmatig op en neer om de 64CuCl2 voorzichtig door de suspensie te mengen. Vermijd schudden of laten vallen van de injectieflacon en vermijd luchtbelvorming.
  10. Als de goede kant naar boven ligt, tikt u voorzichtig tegen de dop van de injectieflacon terwijl u de suspensie gestabiliseerd houdt. Dit zorgt ervoor dat alle vloeistof die in de dop zit, naar de bodem van de injectieflacon kan trekken. Verwijder de dop voorzichtig gedeeltelijk en plaats een PFP-lijn met een 18 G-naald. Vul de kopruimte van de injectieflacon gedurende 20 s met PFP volgens stap 3.5. Sluit de injectieflacon af en sluit af met Parafilm.
  11. Meet de activiteit van de injectieflacon op een dosiskalibrator en noteer de tijd.
    OPMERKING: Als er niet voldoende activiteit op de injectieflacon is overgebracht, herhaalt u de stappen 4.5-4.11 en voegt u een geschikt extra volume van 64CuCl2 toe.
  12. Plaats de injectieflacon in een schuimfleshouder en duw erdoorheen zodat de onderste helft van de injectieflacon wordt blootgesteld aan hitte. Plaats de houder in het roerende waterbad van 60 °C en verwarm gedurende 1 uur.
  13. Terwijl de chelatiereactie optreedt, bereidt u iTLC-platen voor. Snijd met schone handschoenen microvezelchromatografiepapier in stroken van 1 cm x 8 cm. Verwarm de reepjes in een glasdroogoven van 80 °C.
    OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd in een niet-radioactief laboratorium.
  14. Haal na 1 uur de injectieflacon in stap 4.12 van het vuur en veeg de randen af met een tissue.
  15. Draai de injectieflacon handmatig op en neer met een tang met rubberen punt om eventuele condensatie op de wanden van de injectieflacon opnieuw te condenseren in de lipidensuspensie.
  16. Met de injectieflacon rechtop, tikt u de dop terwijl u de buis stabiliseert. Verwijder de parafilm en veeg rond de dop om eventueel ingesloten badwater te verwijderen.
  17. Verwijder voorzichtig de dop van de injectieflacon en zuig 1-2 μl van de lipidensuspensie op. Zoek de suspensie op 1 cm van de onderkant in het midden van een iVRC-strip en sluit de flacon opnieuw af. Laat de plek drogen.
    OPMERKING: Idealiter zouden minimaal 2 iTLC's per reactiemengsel moeten worden gespot en voor zekerheid moeten worden ontwikkeld per radioactief gelabelde lipidensuspensie.
  18. Micropipette: 200 μL van het iTLC-eluent (bereid in stap 1.4) op de bodem van een reageerbuisje van 10 ml. Plaats de reageerbuis in een loden container. Voeg de gevlekte iTLC toe aan de buis en laat de strip zich ontwikkelen tot de eluent ongeveer 1 cm van de bovenrand van de strip is.
  19. Verwijder de ontwikkelde iVRC-strips met een tang. Houd de strip verticaal en snijd deze in drieën over γ-counter en push-cap compatibele ronde plastic buizen van 5 ml, zodat elke derde strip direct in een afzonderlijk derde deel valt. Steek de drukdoppen in de drie buizen.
  20. Meet de stripbevattende buisjes en een lege/afgedekte stuurbuis op een γ-teller voor koper-64-activiteit en noteer de bijbehorende tellingen per minuut (cpm). Trek de activiteit van de controlebuis af van de andere metingen om te corrigeren voor achtergrondactiviteit.
    OPMERKING: De gecorrigeerde metingen voor het onderste derde deel van de strip (stuk 1) zijn geassocieerd met koper-64 gechelateerd tot lipide suspensiedeeltjes. Het middelste gedeelte (stuk 2) bevat een streep vrije koper-64 en 64Cu-pyro-lipidechelaten in niet-supramoleculaire vorm. Het bovenste gedeelte (stuk 3) bevat voornamelijk vrij koper-64.
  21. Bereken de radiochemische zuiverheid via vergelijking 1.
    figure-protocol-1(vergelijking 1)
    OPMERKING: als de cpm voor stuk 1 onredelijk laag lijkt (bijvoorbeeld lager of gelijk aan stuk 2 of 3) of als de metingen boven de γ-teller niet-lineaire/verzadigingsdrempel liggen, zoek dan een lager volume of een verdund aliquoot (1-2 μL) van de radioactief gelabelde suspensie voor iTLC.
  22. Zorg ervoor dat de radiochemische zuiverheid verkregen uit beide iTLC-strips per lipidensuspensie ≥ 94% is om door te gaan. Als dit niet het geval is, ga dan door met het verwarmen van de lipidensuspensie op 60 °C en controleer de chelatie met tussenpozen van 30 minuten via iTLC.
  23. Verwijder de dop van de radioactief gelabelde injectieflacon met lipidensuspensie en micropipet 8,89 μl 1 N NaOH in de suspensie, pipetteer op en neer om de basis volledig over te brengen en de suspensie te neutraliseren. Sluit de injectieflacon af, draai deze handmatig met een tang om deze om te keren/terug te draaien en tik vervolgens voorzichtig op de dop van de injectieflacon.
  24. Vul de vrije ruimte met PFP volgens stap 4.10, sluit af en sluit af met Parafilm.

5. Activering en isolatie van microbubbels

  1. Activeer de lipidensuspensie via een mechanische injectieflaconschudder gedurende 45 s bij 4530 tpm om een melkachtige microbellensuspensie te genereren. Laat de injectieflacon ongeveer 10 minuten passief afkoelen tot RT. De resulterende melkachtige suspensie zal zich na verloop van tijd in twee lagen scheiden.
    OPMERKING: De inhoud van de injectieflacon moet er na activering melkachtig uitzien. Een duidelijkere opschorting na activering is een indicatie van een mislukte activering, waarvan de bijdragen in latere paragrafen zullen worden besproken.
  2. Eenmaal bij RT keert u de injectieflacon voorzichtig om/terug om de microbellensuspensie opnieuw te suspenderen. Plaats de injectieflacon op een vlakke ondergrond en wacht 2 minuten voordat u gaat decanteren om de gewenste microbellenpopulatie als volgt te verkrijgen:
    1. Rust een plastic spuit van 1 ml uit met een naald van 18 G en ontlucht de spuit/naald door lucht aan te zuigen en in en uit te spuiten. Na 2 minuten verwijdert u snel de dop van de injectieflacon en verbreekt u de parafilmzegel in één beweging.
    2. Trek 400-550 μl van de bodem van de injectieflacon (doelmicrobellenpopulatie), vermijd het opzuigen van de bovenste schuimlaag van grotere ongewenste microbellenpopulaties.
      OPMERKING: Kantel indien nodig de injectieflacon naar één kant om de eindvolumes in de spuit op te vangen om te voorkomen dat de schuimende/lichtere laag wordt aangezogen.
  3. Veeg de randen van de naald voorzichtig af om eventuele schuimende verontreinigingen te verwijderen en breng de geïsoleerde microbellensuspensie over in een microcentrifugebuis. Dop voorzichtig af (klik de dop niet abrupt open of dicht). Dit is de laatste werkende suspensie van radioactief gelabelde microbellen.
  4. Meet de activiteit van het uiteindelijke microbellenproduct op de dosiskalibrator en noteer de tijd. Deel deze waarde door het volume suspensie dat in stap 5.2 is gedecanteerd om een MBq·ml-1-waarde te verkrijgen om de injectievolumes te berekenen afhankelijk van de toepassing van interesse.
    OPMERKING: De radioactief gelabelde microbellen zijn nu klaar voor gebruik. Deel 6 kan tot 24 uur later worden uitgevoerd. Voor informatie over hoe deze radioactief gelabelde microbellen in vivo kunnen worden geïnjecteerd en gevolgd door middel van multimodale (echografie, PET, fluorescentie) beeldvorming, zie Rajora et al.15.

6. Validatie van de efficiëntie van radioactieve labeling

  1. Resuspendeer de microbellensuspensie door voorzichtig pipetteren of inversie van de injectieflacon.
    OPMERKING: Draai nooit een werkend product met microbellen. Vortexing destabiliseert microbellensuspensies.
  2. Voeg 10-200 μL van de radioactief gelabelde suspensie toe aan een centrifugefiltereenheid van 0,5 ml met een molecuulgewicht van 30.000 molecuulgewicht. Als u een volume <200 μl gebruikt, voegt u ddH2O toe aan de filtereenheid om een totaal volume van 200 μl te vormen. Plaats de filtereenheid in een compatibele microcentrifugebuis en dop.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een radioactieve labelingstest uit te voeren voorafgaand aan en gescheiden van elk toegepast in vitro of in vivo gebruik van radioactief gelabelde microbellen om een succesvolle voltooiing van het protocol te garanderen. In dit geval kan in deze stap een groter volume (bijv. 200 μL) worden gebruikt. Wanneer het protocol vervolgens wordt gebruikt voor een behandelingssessie, bereid dan eerst behandelingsvolumes/injecties voor en voer vervolgens sectie 6 uit met de resterende radioactief gelabelde microbellensuspensie zo vroeg mogelijk.
  3. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 x g bij RT.
    OPMERKING: de microcentrifuge moet worden omgeven door loodafscherming.
  4. Knip de verbinding tussen de microcentrifugebuis en de dop door met een schaar.
    1. Plaats de dop in een scintillatieflacon van 20 ml met het label "caps". Breng de filtereenheid over in een nieuwe microcentrifugebuis (buis 2).
    2. Plaats de eerste microcentrifugebuis met infranatans in een scintillatieflacon van 20 ml met het label "tube 1". Voeg 200 μL ddH2O toe aan de filtereenheid in buis 2.
  5. Centrifugeer de filterunit in buis 2 bij 12.000 x g bij RT.
  6. Herhaal stap 6.4 en 6.5. Voeg de dop van tube 2 toe aan de scintillatieflacon "caps" die de dop van tube 1 herbergt. Plaats tube 2 in een nieuwe scintillatieflacon van 20 ml.
  7. Snijd de dop van de derde microcentrifugebuis af en plaats deze in de injectieflacon "doppen" volgens stap 6.4. Breng de filtereenheid over naar een nieuwe scintillatieflacon van 20 ml met het label "unit", zorg ervoor dat het infranatant in buis 3 blijft en niet wordt overgebracht naar de injectieflacon "unit". Als er druppels worden gezien aan de randen van de filtereenheid, plaatst u deze terug in buis 3, dop en draait u deze 10 s naar beneden. Plaats tube 3 in een nieuwe glazen scintillatieflacon van 20 ml.
  8. Sluit de 5 scintillatieflacons af (buis 1, buis 2, buis 3, doppen en eenheid). Bereid een lege en afgedekte scintillatieflacon van 20 ml voor als blancocontrole.
  9. Meet de zes scintillatieflesjes op een γ-teller voor koper-64-activiteit. Trek de activiteit van de lege injectieflacon af van die van andere injectieflacons. Bereken de efficiëntie van radioactieve labeling/chelatie met behulp van vergelijking 2.
    figure-protocol-2(Vergelijking 2)
    OPMERKING: Als de cpm van de eenheid onredelijk laag is (bijv. lager of gelijkwaardig aan de buizen) of als de metingen boven de γ-counter niet-lineaire/verzadigingsdrempel liggen, bewaar de scintillatieflacons dan maximaal 4 dagen in loden containers om de activiteit te laten afnemen totdat de waarden onder de drempel liggen en meet opnieuw.

7. Fysisch-chemische karakterisering van microbellen

OPMERKING: Tenzij een laboratorium beschikt over aangewezen apparatuur voor de verwerking van radioactieve monsters, moet de fysisch-chemische karakterisering van microbellen worden uitgevoerd met behulp van niet-radioactieve, "koude" koperchelaatmonsters. Deze "koude" etikettering vergemakkelijkt de beoordeling van de opbrengst van microbellen, wat van vitaal belang is voor het beoordelen van de dosis microbellen die worden gebruikt voor de beoogde toepassing. Bovendien maakt het een vergelijking mogelijk met niet-gecheleerde microbellen om ervoor te zorgen dat het radioactieve labelingproces de eigenschappen van microbellen niet verstoort. Deze "koude" labeling en bijbehorende fysisch-chemische karakterisering moeten plaatsvinden voorafgaand aan het aanbrengen van radioactief gelabelde microbellen en kunnen worden gebruikt als feedback als wijzigingen in de radioactieve labeling nodig zijn (zie Discussie).

  1. "Koude" koperen microbubbel etikettering
    1. Bereken aan de hand van het volume van 64CuCl2-oplossing dat in stap 4.7 aan de lipidensuspensie is toegevoegd, de samenstelling van de porfyrine-molar in de lipidefilms en de specifieke activiteit die wordt aangetroffen op het productblad 64CuCl2 bij benadering de metaal:porfyrine-molaire verhouding die tijdens radioactieve labeling is bereikt. Voorbeeldberekeningen zijn te vinden in Aanvullend Dossier 1.
    2. Volg de secties 1-3 van het huidige protocol.
    3. Bereid een 0,1 mg·ml-1 CuCl2-oplossing in 0,1 N HCl.
    4. Micropipetteer het juiste volume van deze CuCl2-oplossing in de lipidensuspensie berekend vanaf stap 7.1.1 en sluit de injectieflacon af.
    5. Draai de injectieflacon om de CuCl2 in de lipidensuspensie te mengen, vul de kopruimte met PFP, sluit af en verwarm volgens de stappen 4.9, 4.10 en 4.12. Een rubberen pincet is niet nodig voor het hanteren van injectieflacons.
    6. Haal de injectieflacon na 1 uur van het vuur en veeg de buitenkant droog af. Laat de injectieflacon afkoelen tot RT.
    7. Neutraliseer de lipidensuspensie, meng, vul de kopruimte met PFP en sluit af volgens de stappen 4.23 en 4.24.
    8. Activeer de microbellensuspensie en decanteer om een werkend product te verkrijgen volgens de stappen 5.1-5.3.
  2. Grootte van microbubbels
    OPMERKING: Het dimensioneren van microbellen moet onmiddellijk na activering worden uitgevoerd. Als u de stabiliteit van de werksuspensie beoordeelt, herhaalt u de monstervoorbereiding en -metingen met tussenpozen van 30 minuten. Doorgaans is een venster van 1-2 uur representatief voor het tijdsbestek waarin de werkende suspensie van de microbel zou worden gebruikt/toegediend na activering. Het doel van stabiliteitsmetingen is ervoor te zorgen dat de grootte en opbrengst van microbellen gedurende dit tijdsbestek behouden blijven, zodat alle behandelingen die met de werkoplossing worden toegediend, vergelijkbare microbellenpopulaties bevatten.
    1. Schakel de Coulter Counter (CC) in en stel de volgende parameters in met behulp van de Edit SOP-tool : 30 μm diafragma, 0.6-18 μm groottebereik, diafragmastroom 400-600 μA, voorversterkerversterking 4-8, 400 bins, spoelen voor en na elke run, volumetrische analyse, 5 μL monstervolume.
    2. Filter CC-elektrolyt door een vacuümfiltereenheid van 0,2 μm. Vul de elektrolytcontainer en een aparte container voor de monstervoorbereiding.
    3. Achtergrondmeting: Vul een wegwerpcuvet van 10 ml met 10 ml gefilterde elektrolyt en voer een nulmeting uit. Zorg ervoor dat het aantal onder de 400 ligt. Als dit niet het geval is, spoelt u het instrument door.
    4. Meting van de steekproef
      1. Voeg 10 ml gefilterde elektrolyt toe aan een nieuwe cuvet. Resuspendeer de microbellensuspensie door handmatig om te keren/terug te draaien. Micropipet 5 μL vanaf de onderkant in het midden van de injectieflacon. Veeg de randen van de pipetpunt af (behalve de opening) en dompel het monster rechtstreeks in de voorbereide elektrolyt.
      2. Pipetteer op en neer om de suspensie volledig over te brengen. Gebruik de pipetpunt om de elektrolyt voorzichtig rond te draaien totdat de "slierten" van de microbellensuspensie zijn verspreid.
    5. Meet het monster op de CC (twee runs per analyt).
      OPMERKING: Een monstervolume van 5 μL microbellen is doorgaans geschikt voor monsters die 1-5 x 109 microbubbel-ml-1-concentraties bevatten. Dit monstervolume moet mogelijk worden aangepast, afhankelijk van de specifieke opstelling van het CC-instrument en of de opbrengst van de microbellen van het monster buiten het bovenstaande bereik valt.
  3. Confocale beeldvorming
    NOTITIE: Voer confocale beeldvorming uit onmiddellijk na het verkleinen van de microbellen en binnen het tijdsbestek van behouden stabiliteit van de microbubbels volgens de opmerking in stap 7.2.
    1. Resuspendeer de microbellensuspensie en breng 1-5 μL over naar het midden van een glazen microscoopglaasje. Plaats voorzichtig een dekglaasje over de druppel van de microbellensuspensie en voorkom dat er luchtbellen bekneld raken. De suspensie verspreidt zich onder het dekglaasje.
    2. Beeld de microbellen af met een vergroting van 60x met een olie-onderdompelingsobjectief. Verkrijg beelden in helderveld en onder 633 nm excitatie/640-765 nm emissie. Over elkaar heen leggen van de helderveld- en fluorescentiebeelden.
      OPMERKING: Het fluorescentiesignaal moet overlappen over de schaal van alle zichtbare deeltjes wanneer de sonde homogeen is opgenomen in de microbellenschaal.
  4. Spectrofluorometrie
    OPMERKING: Spectrofluorometriemetingen kunnen binnen 24 uur na activering van de microbel worden uitgevoerd.
    1. Bereid 1% Triton X-100 zoals eerder beschreven35.
    2. Zet de spectrofluorometer 15-30 minuten voor de eerste meting aan.
    3. Meet de fluorescentiespectra van 1% Triton X-100 met behulp van een excitatie van 410 nm en een emissiebereik van 600-800 nm in een kwartscuvet. Selecteer de optie om het signaal te normaliseren met het referentiedetectorsignaal (vaak aangeduid als S1/R1).
      OPMERKING: Triton X-100 borrelt gemakkelijk wanneer het wordt gepipetteerd. Dompel daarom bij het overbrengen naar een cuvet alleen naar de eerste micropipetstop.
    4. Spoel de cuvet af met methanol en droog af met perslucht tussen de monsters.
    5. Breng 6 ml 1% Triton X-100 over in een centrifugebuis van 15 ml. Resuspendeer de microbellensuspensie en zuig 1 μL aan via een micropipet. Veeg de randen van de pipetpunt af, behalve de opening, en breng het monster over op de voorbereide 1% Triton X-100, pipetteer op en neer om de overdracht te voltooien. Draai de oplossing en breng deze over naar een kwartscuvet.
      OPMERKING: Pas de verhouding van het monster aan: 1% Triton X-100 volgens de gevoeligheid van het instrument en de niet-lineaire verzadigingsdrempel.
    6. Meet dit monster met behulp van de parameters in stap 7.4.3. Deze meting komt overeen met "verstoorde" deeltjes.
    7. Herhaal stap 7.4.3-7.4.6 met behulp van PBS. Deze meting komt overeen met "intacte" deeltjes.
    8. Corrigeer de verstoorde en intacte monsterspectra in de basislijn met behulp van respectievelijk 1% Triton X-100- en PBS-metingen.
    9. Bereken de afschrikefficiëntie (QE) via vergelijking 3 met behulp van een geïntegreerd basisgecorrigeerd fluorescentiesignaal van het intacte monster in PBS (FPBS) en in 1% Triton X-100 (FTx):
      figure-protocol-3(vergelijking 3)
  5. UV/VIS spectroscopie
    OPMERKING: Spectroscopiemetingen kunnen tot 72 uur na activering van de microbel worden uitgevoerd.
    1. Sonificeer een aliquoot van de microbellensuspensie in een microcentrifugebuis met behulp van een badsonicator bij RT totdat de suspensie transparant is. Dit vermindert verstrooiingseffecten tijdens spectroscopie.
    2. Zet de spectrofotometer 10 minuten voor de eerste meting aan. Selecteer een scaninterval van 0,25 nm en een acquisitiebereik van 200-800 nm. Schakel basislijn aftrekken in.
    3. Gebruik een kwartscuvet met een weglengte van 1 cm voor metingen. Spoel de cuvet tussen de metingen door af met methanol en droog af met perslucht.
    4. Verkrijg een nulmeting van methanol.
    5. Draai de gesonificeerde, transparante microbellensuspensie en breng 10-50 μL over in een microcentrifugebuis met 200-1000 μL methanol. Zorg ervoor dat het methanolvolume wordt gemeten en aan de buis wordt toegevoegd via een schone glazen microliterspuit. Vortex de oplossing om een "verstoord" monster te verkrijgen.
      OPMERKING: De verdunning van het monster is afhankelijk van de efficiëntie van de porfyrinebelasting en de samenstelling van het molaire percentage. Een verdunning van 20x is geschikt voor een samenstelling van 30 mol% pyro-lipide microbellen.
    6. Verzamel UV-VIS-spectrum.
    7. Herhaal de stappen 7.5.4 tot en met 7.5.6 met PBS in plaats van methanol.
      OPMERKING: Een micropipet kan worden gebruikt om PBS-volumes te meten in plaats van een glazen microliterspuit.

8. Wijzigingen in het protocol

  1. Alternatieve chelator
    1. Bereid lipidefilms voor volgens sectie 2 en vervang het pyrolipide door een alternatieve lipide-geconjugeerde koperchelator (bijvoorbeeld 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-diethyleentriaminepenta-azijnzuur (ammoniumzout), hierna DTPA-lipide genoemd). Gebruik het aanvullende bestand 1 om de benodigde massa en voorraadvolumes te berekenen.
      OPMERKING: Het testen van verschillende molaire samenstellingen van een alternatieve chelator is waarschijnlijk nodig om de bovengrens te bepalen waarboven stabiele microbellen met hoge opbrengsten niet kunnen worden gegenereerd.
    2. Volg de secties 3 tot en met 6 om radioactief gelabelde microbellen te genereren en te karakteriseren.
    3. Volg de stappen 7.1 tot en met 7.3 om "koude" microbellen met koperchelaatjes te karakteriseren. Alleen helderveldconfocale microscopiebeeldacquisitie is vereist om de deeltjesmorfologie te beoordelen. Als de alternatieve chelator fluorescerend is, voer dan confocale microscopie uit met bijbehorende excitatie- en emissiegolflengten naast de stappen 7.4 en 7.5.
  2. Alternatieve fluorofoor
    1. Bereid lipidefilms voor volgens sectie 2 en vervang het pyrolipide door een alternatieve lipidegeconjugeerde of intercalerende fluorofoor (bijv. DiI). Gebruik aanvullend bestand 1 om de benodigde massa en voorraadvolumes te berekenen.
      OPMERKING: Het testen van verschillende molaire samenstellingen van een alternatieve fluorofoor is waarschijnlijk nodig om de bovengrens te bepalen waarboven geen stabiele microbellen met hoge opbrengsten kunnen worden gegenereerd.
    2. Volg sectie 3 met PGG in plaats van AA-PGG.
    3. Voltooi stap 5.1 t/m 5.3 en stap 7.2 t/m 7.5.
  3. "Spiking"-benadering: etikettering van voorgevormde microbellenlipidensuspensies
    1. Genereer een porfyrine-lipidefilm volgens sectie 2, waarbij alleen pyro-lipide wordt gebruikt zonder andere lipidebestanddelen. Raadpleeg het aanvullende bestand 1 voor de hoeveelheden pyro-lipiden.
    2. Hydrateer de pyro-lipidenfilm volgens sectie 3 met 100-200 μL AA-PGG (of PGG als radioactieve labeling niet nodig is) in plaats van 1 ml hydratatiebuffer.
    3. Breng de volledige pyro-lipidensuspensie over naar een vooraf gemaakte lipide microbellensuspensie.
    4. Vul de hoofdruimte met PFP, verwarm en sonificeer de suspensie en dicht af onder PFP volgens de stappen 3.4 tot en met 3.9. Controleer op dispersie van de pyro-lipidensuspensie in de vooraf gemaakte lipide microbellensuspensie en voer warmte-/sonicatiecycli uit totdat deze volledig is verspreid.
      OPMERKING: Als u een septum-verzegelde commerciële injectieflacon met microbellen gebruikt, kan de pyro-lipidensuspensie via een spuit/naald in de injectieflacon worden ingebracht zonder de kopruimte van de injectieflacon opnieuw te vullen met PFP.
    5. Voer radioactieve labeling uit (zie stap 8.3.5.1 hieronder), activering, isolatie (zie OPMERKING hieronder) en bijbehorende karakterisering volgens secties 4 tot en met 7.
      1. Een alternatieve benadering is om eerst de gehydrateerde pyro-lipidensuspensie radioactief te labelen, te controleren op >94% radiochemische zuiverheid, te neutraliseren met 1 N NaOH (het volume aan te passen aan het AA-PGG-volume dat wordt gebruikt om de pyro-lipidenfilm te hydrateren), en vervolgens de radioactief gelabelde pyro-lipidensuspensie in de vooraf gemaakte microbellenlipidensuspensie te introduceren volgens stap 8.3.3.
        OPMERKING: Deze aangepaste benadering mag alleen worden gebruikt om fluorescerende of multimodale radioactief gelabelde microbellen te genereren, indien gevolgd door een isolatieproces waarbij submicron multilamellaire blaasjes worden verwijderd die zijn ontstaan tijdens lipidenhydratatie maar niet in microbubbels zijn opgenomen. Zie Discussie voor meer informatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De belangrijkste kwantificeerbare resultaten bij het vervaardigen van radioactief gelabelde microbellen zijn radiochemische zuiverheid en radioactieve labelingefficiëntie. Dit protocol maakt respectievelijk gebruik van iTLC en een gevalideerde centrifugale procedure om elk te karakteriseren. Figuur 2A laat zien dat een gemiddelde radiochemische zuiverheid en efficiëntie van ≥95% werd bereikt in commerciële formuleringen die microbellen nabootsen waarin het g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol voor radiolabeling van lipide microbellen bereikt >95% radiochemische zuiverheid, >95% chelatie-efficiëntie en behoud van fysisch-chemische eigenschappen van microbellen zonder dat enige zuivering na het labelen nodig is. Deze prestaties vertegenwoordigen vooruitgang die voorheen niet werd bereikt voor bestaande labelprotocollen. Gebrek aan zuiveringsstappen maakt een sneller gebruik van radio-isotopen (in dit geval koper-64) mogelijk, en dus vermindering van ineffic...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs melden geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Deborah Scollard en Teesha Komal (University Health Network Spatio-Temporal Targeting and Amplification of Radiation Response (STTARR) programma, Toronto, Ontario) voor hun technische diensten en begeleiding. We danken ook Mark Zheng en Dr. Alex Dhaliwal voor hun technische assistentie tijdens confocale microscopie en de Advanced Optical Microscopy Facility (Toronto, Ontario) voor het leveren van bijbehorende apparatuur. We erkennen onze financieringsbronnen: de Canadian Institutes of Health Research, het Terry Fox Research Institute, de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, de Canada Foundation for Innovation, de Princess Margaret Cancer Foundation, Canada Research Chairs Program, het McLaughlin Centre, het Vanier Scholarship Program, het Ontario Graduate Student Scholarship Program, Prostate Cancer Canada en de Peterborough KM Hunter Charitable Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
64CuCl2Washington University School of Medicine, Mallinckrodt Institute of RadiologyN/ABestel in klein volume (<10 µL) opgelost in 0.1 N HCl
Azijnzuur Elk bedrijf> 95% zuiverheid
AluminiumfolieElk bedrijf
AmmoniumacetaatElk bedrijfZuiverheid: ≥ 98%
Analytische weegschaalElk bedrijfIn staat om te meten tot 0,1 mg
BadsonicatorElk bedrijfKan worden verwarmd tot 69 oC
CC-opening - 30 micronBeckman CoulterA36391Deeltjesdiameterbereik: 0,6-18 um
CC-elektrolytBeckman Coulter8546719Isoton II-diluent
CC SoftwareBeckman CoulterMultisizer 4e
Centrifugeerfiltereenheden (0,5 mL 30.000 MWCO) met compatibele microcentrifugebuizenMilliporeSigmaUFC503096Amicon Ultra - 0,5 mL
Centrifugebuizen - 15 mL met doppenElk bedrijf
ChloorformElk bedrijfZuiverheid: ≥ 99,8% 
CoultertellerBeckman CoulterB43905Multisizer 4e Coulterteller
DekglasjesVWR48393081VWR microdekglas
CuCl2Elk bedrijfZorg ervoor dat het niet geoxideerd is
CuCl2
Cuvet - kwarts, 1 cm padlengteElk bedrijf
Cuvettes - 10 mL plastic voor CC-metingenBeckman CoulterA35471Coulterteller Accuvette ST
ddH2OElk bedrijfKan worden verkregen via een ultrapuur waterzuiveringssysteem
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)Elk bedrijfPoedervorm
DosiskalibratorElk bedrijfIn staat om koper-64 te lezen
DPPA (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfaat (natriumzout))Avanti Polar Lipids830855PPoedervorm
DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine)Avanti Polar Lipids850355PPoedervorm
DPPE-MPEG (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleenglycol)-5000] (ammoniumzout))Avanti Polar Lipids880200PPoedervorm
DTPA-lipide (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-diethyleentreaminepentaazijnzuur (ammoniumzout))Avanti Polar Lipids790106PPoedervorm
EDTA (ethyleendiaminetetraazijnzuur)Elk bedrijf
GammatellerElk bedrijfIn staat om koper-64 te lezen
Kappen voor gammatellingsbuizenGlobe Scientific22-171-665Flenskappetjes voor buizen van 12 mm
GammatellingsbuizenSarstedt55.15795 mL, 75 x 12 mm, PS
Glasbeker - 250 mLElk bedrijfIn staat om temperaturen tot 100 oC te weerstaan
GlasdroogovenElk bedrijfKan worden verwarmd tot 80 oC
Glazen microliterspuiten - 25, 50, 100, 1000 µLElk bedrijfCompatibel met organische oplosmiddelen
Glazen scintillatieflacons - 20 mLVWR66022-081VWR® Scintillatieflacons, borosilicaatglas, met schroefdop, Met pulpfolievoering
Glazen flacons - 0,5 dramVWR66011-020VWR flacon 1/2 dram, met zwarte fenolische schroefdop en polyvinyl-gecoate pulpvoering
GlycerolSigma AldrichG7757-1LZuiverheid:  ≥ 99,0% 
Gegradueerde pijp/pistoolElk bedrijf
Hot/roerplaatUitgerust met temperatuurprob voor automatische temperatuurregeling
Zoutzuur - 0,1 NElk bedrijf
iTLC-platenAgilentA120B12 iTLC-SA-chromatografiepapier
LaboratoriumweefselElk bedrijf
Mediavacuümfiltratie-eenheidElk bedrijf0,22 micron poriegrootte, PES-membraan, 500 mL trechtercapaciteit
MethanolElk bedrijfZuiverheid:  ≥ 99,8%, HPLC-kwaliteit, voldoet aan ACS-specificaties
Microcentrifugebuizen niet-steriel - 1,5 mLElk bedrijf
Microcentrifugebuizen steriel - 1,5 mLElk bedrijf
Micropipetten - p1000, p200, p20, p10Elk bedrijfZorg ervoor dat ze gekalibreerd zijn
MicroscoopglaasjesFisher Scientific12-550-15Superfrost Plus Microscoopglaasjes, voorgereinigd
Naalden - 18 GSteriel
ParafilmElk bedrijf
PBSSigma AldrichD8537-500MLDPBS, gemodificeerd, zonder calciumchloride en magnesiumchloride, vloeibaar, sterieel gefilterd, geschikt voor celcultuur
PFPFluoroMedAPF-N40HPZuiverheid:  ≥ 99,8%
PFP-lijnElk bedrijf

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Itani, M., Mattrey, R. F. The effect of inhaled gases on ultrasound contrast agent longevity in vivo. Mol Imaging Biol. 14 (1), 40-46 (2012).
  2. Kong, W. T., Wang, W. P., Huang, B. J., Ding, H., Mao, F. Value of wash-in and wash-out time in the diagnosis between hepatocellular carcinoma and other hepatic nodules with similar vascular pattern on contrast-enhanced ultrasound. J Gastroenterol Hepatol. 29 (3), 576-580 (2014).
  3. Wilson, S. R., Burns, P. N. Microbubble-enhanced us in body imaging: What role. Radiology. 257 (1), 24-39 (2010).
  4. Hynynen, K., Mcdannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. Noninvasive mr imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier bbb in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  5. He, W., et al. Enhanced ablation of high intensity focused ultrasound with microbubbles: An experimental study on rabbit hepatic vx2 tumors. Cardiovasc Intervent Radiol. 34 (5), 1050-1057 (2011).
  6. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in alzheimer's disease using mr-guided focused ultrasound. Nat Commun. 9 (1), 2336(2018).
  7. Burke, C. W., Klibanov, A. L., Sheehan, J. P., Price, R. J. Inhibition of glioma growth by microbubble activation in a subcutaneous model using low duty cycle ultrasound without significant heating. J Neurosurg. 114 (6), 1654-1661 (2011).
  8. Dimcevski, G., et al. A human clinical trial using ultrasound and microbubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreatic cancer. J Control Release. 243, 172-181 (2016).
  9. Haram, M., Hansen, R., Bouget, D., Myhre, O. F., Davies, C. L., Hofsli, E. Treatment of liver metastases with focused ultrasound and microbubbles in patients with colorectal cancer receiving chemotherapy. Ultrasound Med Biol. 49 (9), 2081-2088 (2023).
  10. Mainprize, T., et al. Blood-brain barrier opening in primary brain tumors with non-invasive MR-guided focused ultrasound: A clinical safety and feasibility study. Sci Rep. 9 (1), 321(2019).
  11. Karakatsani, M. E., et al. Focused ultrasound mitigates pathology and improves spatial memory in alzheimer's mice and patients. Theranostics. 13 (12), 4102-4120 (2023).
  12. Aron, M., Vince, O., Gray, M., Mannaris, C., Stride, E. Investigating the role of lipid transfer in microbubble-mediated drug delivery. Langmuir. 35 (40), 13205-13215 (2019).
  13. Wang, S., Samiotaki, G., Olumolade, O., Feshitan, J. A., Konofagou, E. E. Microbubble type and distribution dependence of focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Ultrasound Med Biol. 40 (1), 130-137 (2014).
  14. Huynh, E., Rajora, M. A., Zheng, G. Multimodal micro, nano, and size conversion ultrasound agents for imaging and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8 (6), 796-813 (2016).
  15. Rajora, M. A., et al. Quantitative pharmacokinetics reveal impact of lipid composition on microbubble and nanoprogeny shell fate. Adv Sci. 11 (4), 2304453(2024).
  16. Leong, K. X., Sharma, D., Czarnota, G. J. Focused ultrasound and ultrasound stimulated microbubbles in radiotherapy enhancement for cancer treatment. Technol Cancer Res Treat. 22, 1-9 (2023).
  17. Li, Y., et al. Ultrasound-triggered release of sinoporphyrin sodium from liposome-microbubble complexes and its enhanced sonodynamic toxicity in breast cancer. Nano Research. 11, 1038-1056 (2017).
  18. Nomikou, N., Fowley, C., Byrne, N. M., Mccaughan, B., Mchale, A. P., Callan, J. F. Microbubble-sonosensitiser conjugates as therapeutics in sonodynamic therapy. Chem Commun. 48 (67), 8332-8334 (2012).
  19. Chakravarty, R., Hong, H., Cai, W. Positron emission tomography image-guided drug delivery: Current status and future perspectives. Mol Pharm. 11 (11), 3777-3797 (2014).
  20. Delalande, A., Leduc, C., Midoux, P., Postema, M., Pichon, C. Efficient gene delivery by sonoporation is associated with microbubble entry into cells and the clathrin-dependent endocytosis pathway. Ultrasound Med Biol. 41 (7), 1913-1926 (2015).
  21. Sheikov, N., Mcdannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound Med Biol. 30 (7), 979-989 (2004).
  22. Conway, G. E., Paranjape, A. N., Chen, X., Villanueva, F. S. Development of an in vitro model to study mechanisms of ultrasound-targeted microbubble cavitation-mediated blood-brain barrier opening. Ultrasound Med Biol. 50 (3), 425-433 (2024).
  23. Hu, S., Zhang, X., Unger, M., Patties, I., Melzer, A., Landgraf, L. Focused ultrasound-induced cavitation sensitizes cancer cells to radiation therapy and hyperthermia. Cells. 9 (12), 2595(2020).
  24. Zhao, C., et al. Synergistically augmenting cancer immunotherapy by physical manipulation of pyroptosis induction. Phenomics. , (2024).
  25. Tachibana, K., Uchida, T., Ogawa, K., Yamashita, N., Tamura, K. Induction of cell-membrane porosity by ultrasound. Lancet. 353 (9162), 1409(1999).
  26. Arif, W. M., et al. Focused ultrasound for opening blood-brain barrier and drug delivery monitored with positron emission tomography. J Control Release. 324, 303-316 (2020).
  27. Da Ros, V., et al. PVA-microbubbles as a radioembolization platform: Formulation and the in vitro proof of concept. Pharmaceutics. 15 (1), 217(2023).
  28. Tartis, M. S., et al. Dynamic micropet imaging of ultrasound contrast agents and lipid delivery. J Control Release. 131 (3), 160-166 (2008).
  29. Willmann, J. K., et al. Targeted microbubbles for imaging tumor angiogenesis: Assessment of whole-body biodistribution with dynamic micro-pet in mice. Radiology. 249 (1), 212-219 (2008).
  30. Ingram, N., et al. Ultrasound-triggered therapeutic microbubbles enhance the efficacy of cytotoxic drugs by increasing circulation and tumor drug accumulation and limiting bioavailability and toxicity in normal tissues. Theranostics. 10 (24), 10973-10992 (2020).
  31. Hernández-Gil, J., et al. Development of 68ga-labelled ultrasound microbubbles for whole-body pet imaging. Chem Sci. 10 (215), 5603-5615 (2019).
  32. Warram, J. M., et al. Biodistribution of p-selectin targeted microbubbles. J Drug Target. 22 (5), 387-394 (2014).
  33. Liu, T. W., Macdonald, T. D., Shi, J., Wilson, B. C., Zheng, G. Intrinsically copper-64-labeled organic nanoparticles as radiotracers. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (52), 13128-13131 (2012).
  34. Rajora, M. A., et al. Tailored theranostic apolipoprotein e3 porphyrin-lipid nanoparticles target glioblastoma. Chem Sci. 8 (8), 5371-5384 (2017).
  35. Yoo, K., Dhaliwal, A., Chen, J., Sheeran, P. S., Zheng, G. Synthesis and characterization of multi-modal phase-change porphyrin droplets. J Vis Exp. 176, e62665(2021).
  36. Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat Mater. 10 (4), 324-332 (2011).
  37. Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjug Chem. 25 (4), 796-801 (2014).
  38. Mcmahon, D., Hynynen, K. Acute inflammatory response following increased blood-brain barrier permeability induced by focused ultrasound is dependent on microbubble dose. Theranostics. 7 (16), 3989-4000 (2017).
  39. Bismuth, M., Katz, S., Rosenblatt, H., Twito, M., Aronovich, R., Ilovitsh, T. Acoustically detonated microbubbles coupled with low frequency insonation: Multiparameter evaluation of low energy mechanical ablation. Bioconjug Chem. 33 (6), 1069-1079 (2022).
  40. Kutscher, H. L., et al. Threshold size for optimal passive pulmonary targeting and retention of rigid microparticles in rats. J Control Release. 143 (1), 31-37 (2010).
  41. You, Y., et al. Porphyrin-grafted lipid microbubbles for the enhanced efficacy of photodynamic therapy in prostate cancer through ultrasound-controlled in situ accumulation. Theranostics. 8 (6), 1665-1677 (2018).
  42. Chen, X., Qin, B., Whitehurst, D., Helfield, B., Lavery, L., Villanueva, F. S. Sonodynamic therapy using protoporphyrin ix encapsulated microbubbles inhibits tumor growth. 2017 IEEE International Ultrasonics Symposium. , Washington, DC. 1-4 (2017).
  43. Cheng, M. H. Y., et al. Targeted theranostic 111in/lu-nanotexaphyrin for spect imaging and photodynamic therapy. Mol Pharm. 19 (6), 1803-1813 (2022).
  44. Cheng, M. H. Y., Cevallos, A., Rajora, M. A., Zheng, G. Fast, facile, base-free microwave-assisted metallation of bacteriochlorophylls and corresponding high yield synthesis of tookad. J Porphyrins Phthalocyanines. 25 (07n08), 703-713 (2021).
  45. Macdonald, T. D., Liu, T. W., Zheng, G. An MRI-sensitive, non-photobleachable porphysome photothermal agent. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (27), 6956-6959 (2014).
  46. Shao, S., et al. Functionalization of cobalt porphyrin-phospholipid bilayers with his-tagged ligands and antigens. Nat Chem. 7 (5), 438-446 (2015).
  47. Teh, J. H., et al. A kit-based aluminium-[(18)f]fluoride approach to radiolabelled microbubbles. Chem Commun (Camb). 57 (88), 11677-11680 (2021).
  48. Rajora, M. A. Supramolecular Structure-Enabled Delivery of Porphyrin to Glioblastomas Beyond the Blood-Brain Barrier [Doctor of Philosophy thesis]. , University of Toronto. (2024).
  49. Carugo, D., et al. Modulation of the molecular arrangement in artificial and biological membranes by phospholipid-shelled microbubbles. Biomaterials. 113, 105-117 (2017).
  50. Dhaliwal, A. Utilizing Porphyrin to Improve Ultrasound-Activated Supramolecular Agent Design for Solid Tumor Delivery [Doctor of Philosophy thesis]. , University of Toronto. (2023).
  51. Kilroy, J. P., Klibanov, A. L., Wamhoff, B. R., Bowles, D. K., Hossack, J. A. Localized in vivo model drug delivery with intravascular ultrasound and microbubbles. Ultrasound Med Biol. 40 (10), 2458-2467 (2014).
  52. Dhaliwal, A., et al. Deep learning for automatic organ and tumor segmentation in nanomedicine pharmacokinetics. Theranostics. 14 (3), 973-987 (2024).
  53. Shakya, G., Cattaneo, M., Guerriero, G., Prasanna, A., Fiorini, S., Supponen, O. Ultrasound-responsive microbubbles and nanodroplets: A pathway to targeted drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 206, 115178(2024).
  54. Honari, A., Merillat, D. A., Bellary, A., Ghaderi, M., Sirsi, S. R. Improving release of liposome-encapsulated drugs with focused ultrasound and vaporizable droplet-liposome nanoclusters. Pharmaceutics. 13 (5), 609(2021).
  55. Barmin, R. A., et al. Polymeric materials for ultrasound imaging and therapy. Chem Sci. 14 (43), 11941-11954 (2023).
  56. Chen, Y., Liang, Y., Jiang, P., Li, F., Yu, B., Yan, F. Lipid/PLGA hybrid microbubbles as a versatile platform for noninvasive image-guided targeted drug delivery. ACS Appl Mater Interfaces. 11 (45), 41842-41852 (2019).
  57. Barmin, R. A., et al. Engineering the acoustic response and drug loading capacity of pbca-based polymeric microbubbles with surfactants. Mol Pharm. 19 (9), 3256-3266 (2022).
  58. Barrefelt, A. A., et al. Multimodality imaging using SPECT/CT and MRI and ligand functionalized 99mTc-labeled magnetic microbubbles. EJNMMI Res. 3 (1), 12(2013).
  59. Song, R., Hu, D., Chung, H. Y., Sheng, Z., Yao, S. Lipid-polymer bilaminar oxygen nanobubbles for enhanced photodynamic therapy of cancer. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (43), 36805-36813 (2018).
  60. Böhmer, M. R., Chlon, C. H. T., Raju, B. I., Chin, C. T., Shevchenko, T., Klibanov, A. L. Focused ultrasound and microbubbles for enhanced extravasation. J Control Release. 148 (1), 18-24 (2010).
  61. Zhang, S., et al. Compare ultrasound-mediated heating and cavitation between flowing polymer- and lipid-shelled microbubbles during focused ultrasound exposures. J Acoust Soc Am. 131 (6), 4845-4855 (2012).
  62. Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
  63. Krasnovskaya, O. O., et al. Recent advances in (64)cu/(67)cu-based radiopharmaceuticals. Int J Mol Sci. 24 (11), 9154(2023).
  64. Navarro-Becerra, J. A., Borden, M. A. Targeted microbubbles for drug, gene, and cell delivery in therapy and immunotherapy. Pharmaceutics. 15 (6), 1625(2023).
  65. Fan, C. -H., et al. Antiangiogenic-targeting drug-loaded microbubbles combined with focused ultrasound for glioma treatment. Biomaterials. 34 (8), 2142-2155 (2013).
  66. Luo, T., et al. Ultrasound-mediated destruction of oxygen and paclitaxel loaded dual-targeting microbubbles for intraperitoneal treatment of ovarian cancer xenografts. Cancer Lett. 391, 1-11 (2017).
  67. Fix, S. M., et al. Oxygen microbubbles improve radiotherapy tumor control in a rat fibrosarcoma model - a preliminary study. PLoS One. 13 (4), e0195667(2018).
  68. Eisenbrey, J. R., et al. Sensitization of hypoxic tumors to radiation therapy using ultrasound-sensitive oxygen microbubbles. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 101 (1), 88-96 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fabricage van microbellenlabelen van microbellenfluorescerende microbellenradioactieve microbellengefocust ultrageluidradio isotoopchelatiemultimodale beeldvorminglipide microbellengammacountercentrifugatiefiltratie

Gerelateerde artikelen