Methodenartikel

Vooruitgang in door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide chimere antigeenreceptor-expressie natuurlijke killercellen

DOI:

10.3791/67438

⸱

14 februari 2025

 , 
1Department of Medicine, Division of Regenerative Medicine, University of California, San Diego, 2Sanford Stem Cell Institute, University of California, San Diego

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een methode om menselijke iPSC-afgeleide chimere antigeenreceptor (CAR)-tot expressie brengende natural killer-cellen te differentiëren en uit te breiden met verbeterde doding tegen verschillende maligniteiten. Dit protocol demonstreert de differentiatie en uitbreiding van voor natural killer (NK) geoptimaliseerde iPSC-afgeleide CAR-NK-cellen en de meting van antitumoractiviteit tegen verschillende tumorcellijnen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Natural killer (NK) cellen zijn aangeboren immuuncellen die een cruciale rol spelen in de afweer van het lichaam tegen tumoren en virale infecties. De generatie van humaan geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide chimere antigeenreceptor (CAR) die NK-cellen tot expressie brengt, is naar voren gekomen als een veelbelovende weg voor "kant-en-klare" kankerimmunotherapie. Hier gebruikten we een NK-cel-geoptimaliseerd CAR-construct dat het transmembraandomein van NKG2D, het 2B4 co-stimulerende domein en het CD3ζ-signaleringsdomein omvat, waarvan is aangetoond dat het robuuste antigeenspecifieke NK-cel-gemedieerde antitumoractiviteit stimuleert. Het gebruik van iPSC's voor het genereren van CAR NK-cellen biedt verschillende voordelen, waaronder homogene CAR-expressie, schaalbaarheid, reproduceerbaarheid en het potentieel voor klinische toepassing. Dit gedetailleerde stap-voor-stap protocol van celengineering tot differentiatie maakt het mogelijk om NK-cel-geoptimaliseerde iPSC-afgeleide NK-cellen met CAR-expressie te genereren, waardoor een gestandaardiseerde en gerichte kankerimmunotherapie wordt geboden met verbeterde antitumoractiviteit en hun potentieel als een veelbelovende behandelingsoptie voor verschillende maligniteiten wordt benadrukt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NK-cellen, een type lymfocyt binnen het aangeboren immuunsysteem, zijn cruciaal in de vroege afweer tegen tumoren en viraal geïnfecteerde cellen 1,2,3. In tegenstelling tot T-cellen hebben NK-cellen geen antigeenpresentatie nodig via major histocompatibility complex (MHC) moleculen. In plaats daarvan hebben NK-cellen een repertoire van activerende en remmende receptoren die hun activiteit reguleren3. NK-celgemedieerde cytotoxische activiteit maakt gebruik van verschillende mechanismen, waaronder de afgifte van perforine en granzymen, betrokkenheid van doodreceptoren en de productie van pro-inflammatoire cytokines zoals IFN-γ en TNF-α. Dit unieke werkingsmechanisme positioneert NK-cellen als een aantrekkelijke kandidaat voor kankerimmunotherapie, met name bij de behandeling van solide kankers waarbij immuunontwijking een belangrijke hindernis is 1,2,3,4.

Hepatocellulair carcinoom (HCC) is wereldwijd een van de meest voorkomende en dodelijke vormen van leverkanker5. Traditionele therapeutische benaderingen, waaronder chirurgie, chemotherapie en radiotherapie, bieden doorgaans een beperkt klinisch voordeel en resulteren in hoge recidiefpercentages 6,7. Recente ontwikkelingen op het gebied van immunotherapie en gerichte therapie hebben een aanzienlijke invloed gehad op de behandeling van HCC 8,9. Immuuncheckpointremmers, zoals nivolumab en pembrolizumab, hebben veelbelovende resultaten laten zien door de immuuncelrespons tegen kankercellen te versterken10,11. Deze therapieën hebben geleid tot verbeterde overlevingskansen en een betere kwaliteit van leven voor sommige patiënten. Ze kunnen echter ook immuungerelateerde bijwerkingen veroorzaken, die het gebruik ervan bij bepaalde patiënten kunnen beperken12. Gerichte therapieën, zoals sorafenib en lenvatinib, remmen specifiek routes die de groei van kankercellen en angiogenese bevorderen13. Deze behandelingen hebben een bekende werkzaamheid om de ziekteprogressie onder controle te houden en de overleving te verlengen 8,14. Desalniettemin ontwikkelt zich doorgaans resistentie tegen gerichte therapieën en komen bijwerkingen van de behandeling vaak voor15,16. Onder de veelbelovende wegen in immunotherapeutische strategieën voor kanker, heeft de komst van chimere antigeenreceptor (CAR) CAR T-cellen een revolutie teweeggebracht in de behandeling van kanker, vooral bij de behandeling van hematologische maligniteiten zoals lymfoom en multipel myeloom 17,18,19.

NK-cellen die CAR tot expressie brengen, waarbij de aangeboren cytotoxische activiteit van NK-cellen wordt gecombineerd met de precisietargeting van CAR-technologie, vertegenwoordigen een innovatieve en potentieel transformatieve benadering voor solide tumoren zoals HCC 20,21,22,23,24. CAR-gemanipuleerde cellen kunnen specifiek tumorcellen herkennen en doden die het doelantigeen tot expressie brengen, terwijl normale weefsels worden gespaard, waardoor het risico op off-target effecten die verband houden met conventionele therapieën wordt verminderd 25,26,27. CAR-NK-cellen geproduceerd uit NK-cellen geïsoleerd uit perifeer bloed of navelstrengbloed worden doorgaans geproduceerd door NK-cellen te transduceren met CAR-constructies die bestaan uit een extracellulair antigeenherkenningsdomein, een transmembraandomein en intracellulaire signaleringsdomeinen die nodig zijn voor activering en proliferatie 28,29,30.

De uitdaging om een stabiele en homogene populatie van functioneel gemanipuleerde NK-cellen voor klinische behandeling te ontwikkelen, kan worden aangepakt door gebruik te maken van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's)31,32. Engineering van menselijke iPSC's met NK-cel-geoptimaliseerde CAR's zorgt voor een verbeterd activerings- en proliferatiesignaal van NK-cellen en biedt een onuitputtelijke en homogene populatie van NK-cellen die CAR tot expressie brengen als een gestandaardiseerde, "kant-en-klare therapie"20,33. In dit protocol omvat genetische modificatie van iPSC's om iPSC-afgeleide NK-cellen te genereren die CAR tot expressie brengen, de integratie van een NK-celgeoptimaliseerd CAR-construct dat NK-cel-afgeleide transmembraan- en signaleringsdomeinen (NKG2D-2B4-CD3ζ) en een anti-glypican-3 (GPC3) scFv omvat, zoals beschreven in onze eerdere studies23. De genetisch gemanipuleerde iPSC's worden vervolgens gedifferentieerd en geëxpandeerd met behulp van een eerder ontwikkeld NK-celdifferentiatieprotocol34. Deze gemanipuleerde iPSC-afgeleide NK-cellen die CAR tot expressie brengen, hebben het vermogen om HCC en andere tumorcellen die specifieke tumor-geassocieerde antigenen tot expressie brengen, zoals Glypican 3 (GPC3), dat tot overexpressie wordt gebracht in HCC en andere maligniteiten, te herkennen en te elimineren 35,36,37,38.

De toepassing van iPSC-afgeleide CAR-NK-cellen voor de behandeling van diverse vormen van kanker is veelbelovend 30,39,40; veel van deze iPSC-afgeleide CAR-NK-cellen bevinden zich momenteel in klinische proeven 41,42,43. Om vooruitgang op dit gebied te vergemakkelijken, maakt dit protocol een efficiënte productie mogelijk van gemanipuleerde iPSC-afgeleide CAR-NK-cellen, van celengineering tot differentiatie tot volwassen NK-cellen en in vitro expansie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Feeder-vrije kweekmethode van menselijke iPSC's

OPMERKING: Ontdooi de ingevroren ongedifferentieerde menselijke iPSC's en kweek ze met behulp van mTeSR 1-plus op Matrigel (hierna aangeduid als basaalmembraanmatrix [BMM]) voorgecoate platen, zoals eerder beschreven23,34. Het is erg belangrijk om ervoor te zorgen dat de iPSC's niet voor en na engineering worden gedifferentieerd. Vers ontdooide iPSC's moeten gedurende ongeveer 2-3 passages worden gekweekt om pluripotentiemorfologie te vertonen die consistent is met de menselijke pluripotente stamcellen. De volgende instructies worden gebruikt voor het passeren van cellen uit één putje van een plaat met 6 putjes.

  1. Voordat u iPSC's passeert, smeer u de nieuwe plaat met 6 putjes in met 1x BMM (1 ml/putje) en incubeert u deze 2-4 uur voor gebruik in een incubator van 37 °C.
  2. Bereiding van 1x opgeloste BMM.
    1. Ontdooi een voorraadflesje BMM van 5 ml een nacht bij 4 °C.
    2. Snel aliquot BMM met behulp van voorgekoelde tips in voorgekoelde microcentrifugebuisjes.
    3. Bewaren bij -80 °C tot 6 maanden.
    4. Om 1x BMM-werkoplossing te bereiden, resuspendeert u een BMM-aliquot in een verhouding van 1:100 in een koud DMEM/F12-medium. De 1x BMM werkoplossing kan 2 weken bewaard worden bij -4 °C.
    5. Smeer de plaat in met voldoende volume om het oppervlak te bedekken (gebruik bijvoorbeeld 1 ml per putje van een plaat met 6 putjes).
    6. Incubeer in een broedmachine van 37 °C gedurende 2-4 uur voor gebruik.
  3. Ontdooi een injectieflacon met bevroren iPSC's (meestal 1 × 106 cellen/injectieflacon) in een waterbad bij 37 °C.
  4. Voeg de ontdooide iPSC's geleidelijk toe aan een conische buis van 15 ml met 5 ml voorverwarmd mTeSR Plus-medium, zodat de cellen kunnen acclimatiseren door ze druppel voor druppel toe te voegen om cellulaire shock te minimaliseren.
  5. Centrifugeer de cellen bij 300 × g gedurende 5 min.
  6. Zuig het bovenstaande op en was de cellen eenmaal met 5 ml PBS.
  7. Resuspendeer de cellen in mTeSR Plus-medium en plateer ze met een dichtheid van ongeveer 200.000 cellen/3 ml/putje in de BMM voorgecoate plaat met 6 putjes.
  8. Passage iPSC's.
    1. Zodra de iPSC's 70-80% samenvloeiing bereiken, zuigt u de media op en voert u een eencellige passage uit met TrypLE gedurende 5 minuten bij 37 °C (1 ml/putje in een plaat met 6 putjes).
    2. Voeg na 5 minuten 3 ml 1x PBS toe om de dissociatiereactie te stoppen en was de cellen eenmaal met 3 ml PBS.
    3. Centrifugeer de cellen bij 300 × g gedurende 5 minuten. Resuspendeer na het wassen de eencellige iPSC's in mTeSR Plus-medium en plaats ze vervolgens op de BMM voorgecoate plaat met 6 putjes.
      OPMERKING: Het totale benodigde mediavolume is 3 ml/putje in een plaat met 6 putjes. De media moeten elke 2-3 dagen worden vervangen en stap 1.8 moet worden herhaald wanneer de cellen 70-80% confluent worden gedurende ten minste 1-2 passages voordat de iPSC's worden gemanipuleerd.
  9. Controleer regelmatig de pluripotentie van de iPSC's. Kleur de iPSC's gedurende 30 minuten op ijs met allofycocyanine (APC) geconjugeerd TRA-1-81 en PE-Cy7 geconjugeerd stadiumspecifiek embryonaal antigeen-4 (SSEA-4) antilichaam en analyseer ze vervolgens met behulp van flowcytometrie zoals eerder beschreven23,41.
    OPMERKING: De iPSC's die in dit experiment worden gebruikt, zijn aangepast aan TrypLE. iPSC's die nog niet eerder met TrypLE zijn gepasseerd, hebben doorgaans 8-10 passages nodig om volledig aangepast te zijn aan TrypLE, wat zorgt voor de productie van hoogwaardige spin-embryoïde lichamen (EB's).

2. Engineering van menselijke iPSC's om anti-GPC3 CAR tot expressie te brengen met behulp van piggyBac-vector

  1. Smeer een nieuwe 6-puts plaat in met BMM en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur (het kan langer duren zolang de vloeistof niet opdroogt).
  2. Verwarm mTeSR Plus voor met 10 μM Rho-geassocieerde, opgerolde spoel bevattende proteïnekinase (ROCK)-remmer (Y-27632) (van 1 mM voorraad bereid in steriel gedestilleerd water) bij 37 °C.
  3. Schakel het Nucleofection-systeem in. Selecteer de X-eenheid en selecteer vervolgens de locaties van de putten die moeten worden getransfecteerd. Kies de P3-oplossing en voer handmatig de code in (CA-137).
  4. Oogst iPSC's bij 70-80% samenvloeiing met 1 ml TrypLE en incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Kijk onder de microscoop om de dissociatie te bevestigen.
  5. Pipetteer 4-6 keer om een eencellige suspensie te verkrijgen, neutraliseer vervolgens met 5 ml PBS en pellet bij 300 × g gedurende 5 minuten.
  6. Was de cellen nog een keer voorzichtig om alle sporen van TrypLE te verwijderen.
  7. Resuspendeer in 1 ml mTeSR Plus met Rock-Inhibitor en tel de cellen.
  8. Om anti-GPC3 CAR iPSC's te maken, gebruikt u 1 × 106 cellen per transfectie in een microcentrifugebuis en spint u gedurende 5 minuten bij 300 × g naar beneden.
  9. Combineer tijdens het centrifugeren het transposon-DNA dat de CAR tot expressie brengt met de super PiggyBac-transposase-expressievector in een microcentrifugebuis van 1,5 ml in een verhouding van 3:1 (bijv. 3 μg plasmide dat de transposon bevat tot 1 μg transposaseplasmide).
  10. Voeg een positieve controle van groen fluorescerend eiwit (GFP) toe (tabel met materialen) met 0,5 μl 1 mg/ml oplossing en een niet-getransfecteerde negatieve controle om de GFP-expressie te bevestigen.
  11. Resuspendeer de celpellet voorzichtig in 20 μL kamertemperatuur (RT) P3 Nucleofector-oplossing met het supplement dat in de nucleofectiekit zit. Voeg dit mengsel vervolgens toe aan een microcentrifugebuisje van 1,5 ml met plasmide-DNA, wat resulteert in een eindvolume van ongeveer 22-25 μl.
    OPMERKING: Resuspendeer alle iPSC's die moeten worden getransfecteerd in P3 Nucleofectoroplossing voordat u GPC3 CAR-plasmiden of GFP-controleplasmide aan de cellen toevoegt.
  12. Breng de cel/DNA-suspensie over naar een strip van 20 μl met 16 putjes. Zorg ervoor dat het monster de bodem van de cuvet bedekt zonder luchtbellen.
  13. Tik voorzichtig met 16 putjes op het werkblad om eventuele luchtbellen te verwijderen en cellen in de bodem te laten bezinken.
  14. Plaats de strips met 16 putjes met iPSC's en CAR DNA-mix in het nucleofectiesysteem, selecteer programma CA-137, P3-oplossing en start vervolgens het programma. Dit programma eindigt in 1 s en toont een groen vinkje.
  15. Voeg 80 μL voorverwarmd mTeSR Plus met ROCK-Inhibitor medium toe aan het putje en breng de cellen voorzichtig over naar de met BMM beklede 6-putjesplaat (eindvolume 1 ml per putje).
  16. Controleer kort de cellen onder de fluorescentiemicroscoop na 4 h op om het even welke GFP-uitdrukking om het succespercentage van transfectie te bevestigen.
  17. Screen iPSC's op GFP-expressie om de transfectie-efficiëntie 24 uur na transfectie te beoordelen met behulp van flowcytometrie23,41 om de GFP-expressie te bevestigen.
  18. Incubeer gedurende 4 dagen bij 37 °C en verander de media indien nodig voordat u overgaat tot de selectie van het geneesmiddel.
    OPMERKING: Elke nucleofectie vereist 0,2-2 x 106 iPSC's per reactie. Afhankelijk van het aantal reacties kunnen 24-puts platen of 6-putjes platen worden gebruikt.

3. Klonale selectie en pluripotentiebevestiging van GPC3-CAR iPSC's

  1. Voer een reeks zeocinselecties (1:10.000) uit op de getransfecteerde iPSC's om GPC3-CAR die iPSC's tot expressie brengt klonaal te selecteren.
  2. Om de transfectie-efficiëntie te bevestigen, meet u de GFP-expressie met behulp van een fluorescerende microscoop en flowcytometrie23,41.
    OPMERKING: Het CAR-construct is opgenomen met een FLAG-tag44,45 met het oog op het evalueren van CAR-expressie, zowel tijdens de iPSC-fase als na NK-celdifferentiatie.
  3. Houd de getransfecteerde CAR iPSC's onder geneesmiddelselectie totdat ze een optimale CAR-gen- en GFP-expressie bereiken.
  4. Om een homogene GFP- en CAR-expressie te garanderen, moet de duur van de geneesmiddelenselectie met 2-3 weken worden verlengd.
  5. Voer celsortering uit op basis van GFP- of CAR-expressie met behulp van flowcytometrie om een homogene populatie van klonaal geselecteerde iPSC's23 te verkrijgen.
  6. Het CAR-construct dat hier wordt gebruikt, bevat een zeocine-medicijnselectiemarker. Selecteer de GPC3 CAR-gengetransfecteerde cellen door zeocine (50 μg/ml zeocine) aan het kweekmedium toe te voegen.
  7. Verdun na de selectie van zeocine de GPC3 CAR-gen getransfecteerde iPSC's en plaats ze in een plaat met 96 putjes om ongeveer één cel per putje te verkrijgen. Dit kan worden gedaan door middel van seriële verdunning of met behulp van een celsorteerder.
    OPMERKING: Gebruik fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om afzonderlijke getransfecteerde cellen te isoleren op basis van de expressie van een fluorescerende marker die is gekoppeld aan het CAR-construct.
  8. Laat de afzonderlijke cellen uitdijen tot kolonies in de plaat met 96 putjes.
  9. Voed de cellen elke 3-4 dagen één keer met vers kweekmedium en controleer de putten op koloniegroei.
  10. Screen de kolonies voor CAR-expressie. Dit kan worden gedaan door polymerasekettingreactie (PCR), kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) of westerse blotting om de aanwezigheid van het CAR-constructte verifiëren 23,47.
  11. U kunt ook flowcytometrie23,41 gebruiken om de oppervlakte-expressie van het CAR-eiwit te detecteren.
    OPMERKING: In deze studie werd de CAR-expressie gekwantificeerd door FLAG-tag-expressie met behulp van flowcytometrie.
  12. Voer bovendien karyotypering uit om eventuele chromosomale afwijkingen te identificeren.
    OPMERKING: Dit kan worden gedaan door externe organisaties zoals Wicell (wicell.org) of Thermo Fisher Scientific (thermofisher.com).
  13. Zodra de CAR-positieve klonen zonder afwijkingen zijn geïdentificeerd, breidt u deze klonen uit in grotere kweekvaten zoals een plaat met 6 putjes en een T75-kolf.
  14. Cryopreservatie van de klonaal geëxpandeerde CAR iPSC's met behulp van een cryopreservatiemedium in meerdere injectieflacons voor toekomstig gebruik.
    OPMERKING: De volgende punten worden in deze stap aanbevolen: (i) Zorg voor optimale kweekomstandigheden voor iPSC's om differentiatie te voorkomen. (ii) Wacht 1-4 weken om een homogene populatie van CAR- en GFP-expressie in iPSC's te bereiken na medicijnselectie. (iii) Doorgaan met het monitoren van de cellen op stabiliteit van CAR-expressie en pluripotentiemarkers. (iv) Gebruik passende controles tijdens de screening- en verificatiestappen. (v) Controleer na klonale selectie en expansie de pluripotentie door de expressie van TRA-1-81 en SSEA-4 te beoordelen op de iPSC's die CAR tot expressie brengen.

4. Generatie van hematopoëtische voorlopercellen uit gemanipuleerde CAR iPSC's door vorming van spinembryoïde lichaam (EB)

OPMERKING: Een spin EB of hematopoëtisch organoïde protocol wordt gebruikt om hematopoëtische voorlopercellen te produceren23,34. De cellen in de EB's differentiëren tot stromale cellen om de ontwikkeling van lymfocyten te ondersteunen38, waardoor er geen behoefte meer is aan xeno-afgeleide stromale cellen zoals OP9 23,34,48. Hieronder vindt u de instructies voor het verzamelen van cellen uit een enkel putje van een plaat met 6 putjes voor EB-vorming.

  1. Passage ~200.000 cellen/putje van 6-well BMM-voorgecoate plaat 2 dagen voor spin EB-vorming. Zorg ervoor dat het 70-80% samenvloeiing bereikt op de dag van de opstelling van de spin-EB's. Over het algemeen is 1 putje van een plaat met 6 putjes voldoende voor twee platen spin EB.
  2. Verwijder het kweekmedium en maak de cellen los door 5 minuten te incuberen met 1 ml voorverwarmde TrypLE Select bij 37 °C.
  3. Scheid de celaggregaten voorzichtig tot een enkele celsuspensie met behulp van een micropipet van 1 ml en breng de cellen over in een conische buis van 15 ml. Voeg 3 ml 1x PBS toe om de dissociatiereactie te stoppen en was de cellen eenmaal met 3 ml PBS.
  4. Resuspendeer de cellen in mTesR Plus-medium en filtreer door een celzeef van 70 μM om aggregaten te verwijderen.
  5. Draai de cellen naar beneden om supernatant te verwijderen en was de cellen opnieuw met 5 ml PBS. Resuspendeer de cellen vervolgens in 1 ml STEMdiff APEL-medium (EB-vormingsmedium).
  6. Tel en verdun de cellen tot de juiste dichtheid met behulp van het EB-vormingsmedium dat de volgende cytokines bevat (SCF: 40 ng/ml, BMP4: 20 ng/ml, VEGF: 20 ng/ml) plus 10 μM ROCK-remmer.
  7. Zaai 3000-10000 cellen/putje in 100 μL media (100.000 cellen/ml) in de platen met 96 putjes.
    OPMERKING: Het aantal cellen dat wordt gebruikt bij EB-vorming kan variëren, afhankelijk van de iPSC-lijn. Het wordt aanbevolen om tussen de 3.000 en 10.000 cellen per put te testen in platen met 96 putjes.
  8. Laad met behulp van een meerkanaalspipet de celsuspensie in platen met 96 putjes bij 100 μl/putje.
    OPMERKING: Voor een betere vorming van embryoïde lichamen (EB's) wordt aanbevolen om ultralage bevestiging met ronde bodem 96-well platen te gebruiken.
  9. Centrifugeer de plaat met 96 putjes gedurende 5 minuten bij 300 × g en incubeer de platen vervolgens gedurende 6 dagen bij 37 °C met 5% CO2 .
    OPMERKING: Voorlopige studies hebben aangetoond dat 6 dagen voldoende zijn om aanleiding te geven tot >30% CD34+ -cellen voor de CAR iPSC-lijnen in deze studie.
  10. Controleer de EB-kwaliteit door middel van flowcytometrie23,41.
    1. Bereid 4 ml voorverwarmde 0,25% trypsine met 0,4% kippenserum (16 μl voor 4 ml trypsine) voor het dissociëren van EB's.
    2. Breng 10-30 EB's over in een conische buis van 15 ml.
    3. Voeg de trypsine/kippenserumoplossing toe aan de EB's en incubeer gedurende 10 minuten in een waterbad, waarbij u elke 30 s vortex om volledige dissociatie van EB's garandeert.
    4. Pipetteer de getrypsiniseerde EB's. Meng meerdere keren op en neer om de EBS grondig te dissociëren.
    5. Voeg 5 ml 1x PBS toe om het trypsinisatieproces te stoppen.
    6. Filtreer de celoplossing door een celzeef van 70 μm in een nieuwe conische buis.
    7. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 min.
    8. Zuig het bovenstaande op en resusinfecteer in 3-5 ml verse media.
    9. Tel de cellen, kleurt met typische EB-markers zoals CD34, CD31, CD43 en CD45 en analyseert met behulp van flowcytometrie23,41 (Figuur 3).
    10. Voeg het aanbevolen volume antilichamen volgens de instructies van de fabrikant toe aan elke buis met gedissocieerde afzonderlijke cellen van EB in 100 μl stroombuffer en incubeer op ijs gedurende30 minuten 39,41.
    11. Was de cellen na incubatie twee keer met flowbuffer, voeg SYTOX blauwe levende/dode vlek toe en analyseer met behulp van flowcytometrie.
      OPMERKING: Doorgaans worden op dag 30 >6% CD64+ -cellen verkregen uit de totale populatie van gedissocieerde Spin-embryoïde lichamen met behulp van de iPSC's die in dit onderzoek zijn gebruikt, hoewel dit percentage kan variëren afhankelijk van de iPSC-bron en kweekomstandigheden.

5. Differentiatie van GPC3 CAR iPSC afgeleide NK cellen uit Spin EBs

OPMERKING: De GPC3 CAR-expressie Spin EB's kunnen worden overgebracht in platen met 24 putjes of platen met 6 putjes bedekt met 2% gelatine of zonder coating. Voor mediumveranderingen zijn platen met 6 putjes meer geschikt, terwijl 2% gelatinecoating de hechting van EB verbetert.

  1. Bereid met gelatine bedekte borden met 6 putjes voor door de onderstaande stappen te volgen.
    1. Bereid een 2% (w/v) gelatineoplossing door gelatine op te lossen in water van weefselkweekkwaliteit.
    2. Steriliseer de oplossing door te autoclaveren bij 121 °C, 15 psi gedurende 30 min.
    3. Smeer het oppervlak van elk putje in met 5-10 μL gelatineoplossing per cm2 (~1 ml per putje van een plaat met 6 putjes).
    4. Incubeer de platen 2-4 uur bij 37 °C voor gebruik. Zuig na de incubatie de resterende gelatineoplossing op voordat u overgaat tot de overdracht van EB's.
  2. Bereid NK-celdifferentiatiemedium voor: Voeg 56,6% DMEM+ GlutaMAX-I, 28,3% F12+ GlutaMAX-I, 15% door warmte geïnactiveerd humaan AB-serum, 1% P/S, 2 mM L-glutamine, 1 μM β-mercaptoethanol, 5 ng/ml natriumseleniet, 50 μM ethanolamine en 20 mg/l ascorbinezuur toe. Bewaren bij 4 °C in het donker.
  3. Voeg 3 ml NK-differentiatiemedium met de volgende cytokines toe aan elk putje van de met gelatine beklede 6-putjes platen (IL-3: 5 ng/ml, SCF: 20 ng/ml, IL-7: 20 ng/ml en IL-15: 10 ng/ml).
  4. Breng op dag 6 de Spin EB's rechtstreeks over in de voorbereide, met gelatine beklede 6-putjes platen met NK-differentiatiemedium door de onderstaande stappen te volgen.
    1. Breng de EB's voorzichtig over van platen met 96 putjes naar een schaal van 10 cm en gebruik een serologische pipet van 10 ml om het grootste deel van het medium te verwijderen.
    2. Voeg 3 ml NK-differentiatiemedium met de bovengenoemde cytokines toe aan elk putje van de met gelatine omhulde plaat met 6 putjes.
    3. Verdeel 16-20 EB's in elk putje van de plaat met 6 putjes met behulp van een micropipet van 1 ml.
      OPMERKING: Gemiddeld kunnen de EB's van een enkele plaat met 96 putjes worden gebruikt om één plaat met 6 putjes voor de NK-differentiatieplaat te zaaien.
  5. Voer elke 5-7 dagen mediumveranderingen uit. Sluit na de eerste week van NK-celdifferentiatie IL-3 uit van de media.
    OPMERKING: Na 14 dagen moet het medium elke 3-4 dagen worden vervangen.
  6. Ga door met gemiddelde veranderingen gedurende 3-4 weken. Evalueer de expressie van NK-celmarkers (CD45+CD56+) door middel van flowcytometrie24,42 op suspensiecellen.
  7. Wanneer >80% van de suspensiecellen CD45+CD56+ tot expressie brengt, oogst je de cellen door ze door een filter van 70 μm te leiden om eventuele klonten te verwijderen.
  8. Co-cultuur geoogste NK-cellen met 100 grijs bestraalde aAPC's34,48 en cultuur in NK-expansiemedium dat IL-2 (100 ng/ml) en IL-15 (10 ng/ml) bevat.

6. Uitbreiding van anti-GPC3 CAR iPSC afgeleide NK-cellen

OPMERKING: Doorgaans kan een opbrengst van 2-20 × 106 NK-cellen worden verkregen uit een enkele plaat met 6 putjes, zelfs vóór de expansie. Om de verdere uitbreiding van NK-cellen voor downstream-toepassingen te vergemakkelijken, worden kunstmatige antigeenpresenterende cellen (aAPC's) gebruikt om >1 × 109 NK-cellen te genereren.

  1. Gebruik gemanipuleerde K562-cellen die 41BBL tot expressie brengen en membraangebonden IL-21 (41BBL-mbIL-21)48 als aAPC's om NK-celexpansie te induceren.
  2. Alvorens aAPC's samen met NK-cellen te kweken, bestraalt u aAPC's met 100 gray en bewaart u ze als bevroren voorraden.
  3. Oogst de suspensiecellen uit de plaat met 6 putjes en kweek de NK-cellen in een NK-expansiemedium aangevuld met 50 E/ml IL-2 en IL-15 (10 ng/ml; vers toe te voegen) met een dichtheid van 5 × 105 cellen/ml.
  4. Voeg ontdooide bestraalde aAPC's toe aan NK-cellen in een verhouding van 1:1.
  5. Vul het kweekmedium elke 3-4 dagen aan en voeg verse IL-2 en IL-15 toe in een concentratie van respectievelijk 50 E/ml en 10 ng/ml.
  6. Zorg ervoor dat CAR iPSC-afgeleide NK-cellen het vermogen tot expansie behouden over een periode van >3 maanden, waarbij zowel de levensvatbaarheid van de cellen als de cytolytische activiteit behouden blijven.

7. Fenotypische en functionele karakterisering van GPC3 CAR iPSC-afgeleide NK-cellen

OPMERKING: De karakterisering van GPC3 CAR iPSC-afgeleide NK-cellen omvat een uitgebreide beoordeling van hun fenotypische profiel en functionele activiteit.

  1. Evalueer de NK-activeringsreceptoren, waaronder CD45, CD56, CD94, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, DNAM, TRAIL en FasL, expressie op de anti-GPC3 CAR iPSC-afgeleide NK-cellen door middel van flowcytometrie24,42 om de CAR NK-celactiviteit en rijpingsstatus te bepalen (Figuur 4).
  2. Beoordeel de in vitro functionele activiteit van GPC3 CAR iPSC-afgeleide NK-cellen met behulp van op flowcytometrie gebaseerde Caspase-3/7-assays, CD107a-granule-afgiftetests, IFN-γ- en TNF-α-cytokineafgiftetests tegen verschillende tumordoelen.
  3. Volg de onderstaande stappen voor de Caspase3/7-test.
    1. Tel de doelcellen en kleur ze voor met celtracering fluorescerende kleurstof in een eindconcentratie van 5 μM in PBS gedurende 15 minuten bij 37 °C.
    2. Was de gekleurde doelwitcellen in een volledig kweekmedium vóór co-cultuur met CAR iPSC-afgeleide NK-cellen in verschillende effector-to-target (E:T)-verhoudingen bij 37 °C.
    3. Voeg na 3 uur en 30 minuten co-cultuur Caspase-3/7 groen detectiereagens toe voor nog eens 30 minuten incubatie, wat resulteert in een totale incubatietijd van 4 uur.
    4. Voeg 1 μL dode celkleuringsoplossing toe tijdens de laatste 5 minuten van de kleuring en meng voorzichtig.
    5. Analyseer de gekleurde cellen met behulp van flowcytometrie23,41 (Figuur 5).
  4. Implementeer dit protocol om een uitgebreid begrip te garanderen van de fenotypische kenmerken en functionele activiteit van GPC3 CAR iPSC-afgeleide NK-cellen, waardoor een robuuste beoordeling van hun therapeutisch potentieel mogelijk wordt.
    OPMERKING: Het duurt doorgaans 4-5 weken om >90% CD45+CD56+ -cellen te verkrijgen uit op spin EB gebaseerde GPC3 CAR iPSC-afgeleide NK-celdifferentiatie en NK-expansiecondities met behulp van GPC3 CAR iPSC-lijnen. Sommige iPSC-cellijnen hebben mogelijk slechts 3 weken nodig en sommige lijnen kunnen langer duren (ongeveer 4-5 weken).

8. Problemen met items en oplossingen oplossen

OPMERKING: Het oplossen van problemen met de differentiatie, expansie en functioneel testen van iPSC-afgeleide GPC3 CAR NK-cellen met behulp van de spin embryoid body (EB)-methode kan verschillende stappen omvatten. Hieronder staan enkele veelvoorkomende problemen die u kunt tegenkomen, samen met voorgestelde oplossingen:

  1. Symptomen van inconsistente EB-vorming
    1. Controleer of de EB's te klein of te groot zijn, met onregelmatige vormen.
  2. Oplossing voor inconsistente EB-vorming
    1. Pas de centrifugesnelheid en -duur aan die worden gebruikt om EB's te vormen. Een snelheid van ongeveer 200-300 × g gedurende 5-10 minuten is typisch.
    2. Zorg ervoor dat de juiste U-bodemplaten of kweekschalen met ultralage hechting worden gebruikt om de vorming van EB te vergemakkelijken.
    3. Bevestig dat de iPSC's homogeen zijn en vrij van gedifferentieerde cellen die de vorming van EB kunnen beïnvloeden.
  3. Symptomen van slechte differentiatie van iPSC's naar NK-cellen
    1. Controleer op lage expressie van NK-celmarkers (bijv. CD56, NKp46).
    2. Controleer op het niet vormen van EB's of slecht gevormde EB's.
  4. Oplossing voor slechte differentiatie van iPSC's naar NK-cellen
    1. Zorg ervoor dat de concentraties van essentiële groeifactoren (bijv. VEGF, BMP4, Y-27632, FLT3, IL-15, IL-7, SCF en IL-3) optimaal zijn voor EB-vorming en NK-celdifferentiatie. Pas de concentraties aan op basis van eerdere studies 23,34,41.
    2. Zorg ervoor dat de initiële zaaidichtheid van iPSC's geschikt is. Doorgaans wordt een dichtheid van 8000-10.000 cellen/100 μL aanbevolen voor de vorming van spin-EB.
    3. Controleer of het differentiatiemedium correct is geformuleerd, inclusief de noodzakelijke supplementen (bijv. serum of serumvrije alternatieven, andere cytokines).
    4. Geef voldoende tijd voor EB-vorming, minimaal 6 dagen tot maximaal 12 dagen voordat u overschakelt op NK-celdifferentiatiemedium.
  5. Symptomen van slechte expansie van NK-cellen
    1. Controleer op beperkte celopbrengst tijdens de expansie.
    2. Controleer op verminderde levensvatbaarheid van geëxpandeerde NK-cellen.
  6. Oplossingen voor slechte expansie van NK-cellen
    1. Verhoog de concentratie van IL-15 en IL-2 tijdens de expansiefase. Dit kan de proliferatie van NK-cellen aanzienlijk verbeteren.
    2. Overweeg het gebruik van feedercellen zoals bestraalde aAPC's om de overleving en expansie van NK-cellen te verbeteren.
    3. Controleer de celdichtheid regelmatig en passeer cellen voordat ze overvol raken om optimale groeiomstandigheden te behouden.
  7. Symptomen van suboptimale functionele testresultaten
    1. Controleer op verminderde cytotoxiciteit tegen doelcellen.
    2. Controleer op lage cytokinesecretieniveaus (bijv. IFN-γ, TNF-α).
  8. Oplossingen voor suboptimale functionele testresultaten
    1. Optimaliseer de target-to-effector ratio in cytotoxiciteitstesten. Begin met een verhouding van 10:1 en pas aan op basis van de resultaten.
    2. Zorg ervoor dat NK-cellen voldoende worden geactiveerd vóór functionele tests. Dit kan prestimulatie met cytokines of co-culturatie met bestraalde aAPC's omvatten.
    3. Controleer de gevoeligheid van de doelcellijn voor NK-celgemedieerde lysis. Gebruik bekende gevoelige doelen als besturingselementen.
    4. Verleng de duur van de functionele testen om voldoende tijd te geven om NK-celactiviteit te manifesteren.
  9. Symptomen van variabele CAR-expressieniveaus
    1. Controleer op inconsistente CAR-expressie tussen NK-cellen.
  10. Oplossingen voor variabele CAR-expressieniveaus
    1. Controleer de doeltreffendheid van de CAR-transfectiemethode (bijv. virale transductie, elektroporatie). Pas indien nodig het MOI (multipliciteit van infectie) of elektroporatie aan.
    2. Implementeer geschikte selectiemarkers om CAR+ NK-cellen te verrijken. Gebruik indien nodig antibioticaselectie of sortering van fluorescerende markers.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematisch diagram van differentiatie en expansie van anti-GPC3-CAR iPSC-afgeleide NK-cellen
Het schematische diagram illustreert de in vitro differentiatie van anti-GPC3-CAR gemanipuleerde NK-cellen afgeleid van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en een schematische weergave van de piggyBac-vector die het GPC3 CAR-construct draagt. Aanvankelijk worden niet-gemodificeerde iPSC's getransfecteerd met een piggyBac-vector die codeert voor ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst een gestandaardiseerde en reproduceerbare benadering voor het genereren van iPSC-afgeleide NK-cellen die CAR tot expressie brengen uit een consistente celbron, gericht op het mogelijk maken van gerichte "kant-en-klare" kankerimmunotherapie. Meerdere preklinische en klinische studies hebben de werkzaamheid aangetoond van adoptieve NK-celgebaseerde immunotherapie bij de behandeling van kankers, terwijl toxiciteiten, zoals graft-versus-host-ziekten (GvHD) of cytokine-re...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DSK is medeoprichter en adviseur van Shoreline Biosciences en heeft een aandelenbelang in het bedrijf. DSK adviseert ook voor Therabest en RedC Bio waarvoor hij inkomsten en/of eigen vermogen ontvangt. De voorwaarden van deze regelingen zijn beoordeeld en goedgekeurd door de University of California, San Diego in overeenstemming met haar beleid inzake belangenconflicten. De overige auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken alle leden van het Kaufman-lab voor hun steun, wetenschappelijke inzichten en discussies. Deze studies werden ondersteund door de NIH/NCI-beurzen U01CA217885, P30CA023100 (administratief supplement) en het Sanford Stem Cell Institute van UCSD. JT: schrijven en revisie van manuscript. DSK: het manuscript beoordeeld en geredigeerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
aAPC Dean A. Lee lab N/A
a-MEM culture medium Fisher Scientific Cat#12634
APC anti-DYKDDDDK (FLAG Tag)BD Biosciences Cat#637308
APC-anti-human TRA-1-81 ThermoFisher17-8883-42 
APC-CD16BD Biosciences Cat#302015
APC-CD43 BD BiosciencesCat# 560198 
APC-CD45 BD BiosciencesCat# 555485 
APC-GPC3BD Biosciences Cat#DB100B
APC-NKG2D BD Biosciences Cat# 558071 
CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent Thermo fisher Cat#C10423
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Thermo fisher Cat#C34571Cell tracing fluorescent dye 
CryoStor solution Stem Cell Technologieshttps://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.htmlCryopreservation medium
CTS NK XpanderGibcoA5019001
CTS NK-Xpander MediumLife TechnologiesCat#A5019001
DMEMGibco11965084
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvateGibco10569010
EasySep Human NK Cell Enrichment Kit StemCell Technologies, Inc. Cat#19055
EthanolamineSigma AldrichE9508
Fetal bovine serum Fisher Scientific Cat# 10437010
FITC-CD94 BD Biosciences Cat#555888
GlutaMAX SupplementGibco35050061
GolgiPlug BD Biosciences Cat#555029
GolgiStop BD Biosciences Cat#554724
Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX SupplementGibco31765035
Horse serum Fisher Scientific Cat#16050130
Human Serum AB Sigma-AldrichCat#BP2525100
Human Stem Cell NucleofectorTM Kit Lonza Cat# VPH-5012
Human: HePG2 cells ATCC Cat#HB-8065
Human: HePG2-td-tomato-luc cells Dan S. Kaufman labN/A
Human: iPS cells Dan S. Kaufman lab N/A
Human: SNU-449 cells ATCCCat#CRL-2234
Human: SNU-449-td-tomato-luc cells Dan S. Kaufman labN/A
IncuCyte Caspase-3/7 Green Apoptosis Assay Essenbioscience Cat#4440
L-Ascorbic acidSigma AldrichA5960
MP Biomedicals Human Serum, Type ABMP BiomedicalsICN2938249
mTeSR plusStemCell Technologies, Inc. 100-0276
NovoExpress software ACEA Biosciences https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805
PE/Cy7 anti-human SSEA-4 Antibody Biolegend330420
PE-CD16 BD Biosciences Cat#560995 
PE-CD226BD Biosciences Cat#559789
PE-CD34 BD BiosciencesCat# 555822 
PE-CD45 BD Biosciences Cat# 555483 
PE-CD94 BD Biosciences Cat#555888 
PE-cy7-CD56 BioLegendCat# 318318 
PE-FAS Ligand BD Biosciences Cat#564261 
PE-NKp30BD BiosciencesCat# 558407
PE-NKp44 BD Biosciences Cat#558563 
PE-NKp46BD Biosciences Cat#331908
PE-NKp46 BD Biosciences Cat#557991 
Peripheral blood buffy coat San Diego Blood Bank (https://www. sandiegobloodbank.org/) N/A
PE-TRAIL BD Biosciences Cat#565499 
pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO Branden Moriarity lab N/A
pMAX-GFP plasmidLonzaN/AGFP positive control 
Prism 9Graphpad Version 9
pSpCas9 GenScriptPX165
RBC Lysis Buffer (10x)BiolegendCat#420301
Recombinant human bFGF basic R&D Systems Cat#4114-TC
Recombinant human BMP-4 PeproTechCat#120-05
Recombinant human FLT-3 Ligand PeproTechCat# 300-19
Recombinant human IL-15 PeproTechCat# 200-15
Recombinant human IL-2 PeproTechCat#

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. J Clin Invest. 132 (6), e143762(2022).
  2. Yu, Y. The function of NK cells in tumor metastasis and NK cell-based immunotherapy. Cancers (Basel). 15 (8), 2323(2023).
  3. Paul, S., Lal, G. The molecular mechanism of natural killer cells function and its importance in cancer immunotherapy. Front Immunol. 8, 1124(2017).
  4. Myers, J. A., Miller, J. S. Exploring the NK cell platform for cancer immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (2), 85-100 (2021).
  5. Llovet, J. M., et al. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primers. 7, 6(2021).
  6. Yang, Y., Xiong, L., Li, M., Jiang, P., Wang, J., Li, C. Advances in radiotherapy and immunity in hepatocellular carcinoma. J Transl Med. 21 (1), 526(2023).
  7. Rich, N. E., Yopp, A. C., Singal, A. G. Medical management of hepatocellular carcinoma. J Oncol Pract. 13 (6), 356-364 (2017).
  8. Niu, M., Yi, M., Li, N., Wu, K., Wu, K. Advances of Targeted Therapy for Hepatocellular Carcinoma. Front Oncol. 11, 719896(2021).
  9. Yu, S. J. Immunotherapy for hepatocellular carcinoma: Recent advances and future targets. Pharmacol Ther. 244, 108387(2023).
  10. Ntellas, P., Chau, I. Updates on systemic therapy for hepatocellular carcinoma. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 44, e430028. 44, e430028(2024).
  11. Liu, T. -H., Shen, Y. -C., Cheng, A. -L. Immune checkpoint inhibitors for hepatocellular carcinoma - A game changer in treatment landscape. J Formos Med Assoc. 121 (8), 1371-1383 (2022).
  12. Sun, Q., Hong, Z., Zhang, C., Wang, L., Han, Z., Ma, D. Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 320(2023).
  13. Huang, A., Yang, X. -R., Chung, W. -Y., Dennison, A. R., Zhou, J. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 146(2020).
  14. Girardi, D. M., Pacífico, J. P. M., Guedes de Amorim, F. P. L., Dos Santos Fernandes, G., Teixeira, M. C., Pereira, A. A. L. Immunotherapy and targeted therapy for hepatocellular carcinoma: A literature review and treatment perspectives. Pharmaceuticals (Basel). 14 (1), 28(2020).
  15. Laface, C., et al. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma: Old and new opportunities. Cancers (Basel). 14 (16), 4028(2022).
  16. Shyam Sunder, S., Sharma, U. C., Pokharel, S. Adverse effects of tyrosine kinase inhibitors in cancer therapy: pathophysiology, mechanisms and clinical management. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 262(2023).
  17. Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell therapy: what we know so far. Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).
  18. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  19. Schuster Stephen, J., et al. Chimeric antigen receptor T cells in refractory B-cell lymphomas. N Engl J Med. 377 (26), 2545-2554 (2017).
  20. Schmidt, D., et al. Engineering CAR-NK cells: how to tune innate killer cells for cancer immunotherapy. Immunother Adv. 2 (1), Itac003(2022).
  21. Zhang, B., et al. Chimeric antigen receptor-based natural killer cell immunotherapy in cancer: from bench to bedside. Cell Death Dis. 15 (1), 50(2024).
  22. Wang, K., et al. Reprogramming natural killer cells for cancer therapy. Mol Ther. 32 (9), 2835-2855 (2024).
  23. Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance antitumor activity. Cell Stem Cell. 23 (2), 181-192.e5 (2018).
  24. Liu, E., Marin, D., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. N Engl J Med. 382 (6), 545-553 (2020).
  25. Chen, L., Xie, T., Wei, B., Di, D. L. Current progress in CAR-T cell therapy for tumor treatment. Oncol Lett. 24 (4), 358(2022).
  26. Rafiq, S., Hackett, C. S., Brentjens, R. J. Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 17 (3), 147-167 (2020).
  27. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  28. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Ther. 28 (9), 513-527 (2021).
  29. Dagher, O. K., Posey, A. D. Forks in the road for CAR T and CAR NK cell cancer therapies. Nat Immunol. 24 (12), 1994-2007 (2023).
  30. Xie, G., Dong, H., Liang, Y., Ham, J. D., Rizwan, R., Chen, J. CAR-NK cells: A promising cellular immunotherapy for cancer. EBioMedicine. 59, 102975(2020).
  31. Cichocki, F., van der Stegen, S. J. C., Miller, J. S. Engineered and banked iPSCs for advanced NK- and T-cell immunotherapies. Blood. 141 (8), 846-855 (2023).
  32. Goldenson, B. H., Hor, P., Kaufman, D. S. iPSC-derived natural killer cell therapies - Expansion and targeting. Front Immunol. 13, 841107(2022).
  33. Zhu, H., Kaufman, D. S. Engineered human pluripotent stem cell-derived natural killer cells: the next frontier for cancer immunotherapy. Blood Sci. 1 (1), 4-11 (2019).
  34. Knorr, D. A., et al. Clinical-scale derivation of natural killer cells from human pluripotent stem cells for cancer therapy. Stem Cells Transl Med. 2 (4), 274-283 (2013).
  35. Shimizu, Y., Suzuki, T., Yoshikawa, T., Endo, I., Nakatsura, T. Next-generation cancer immunotherapy targeting Glypican-3. Front Oncol. 9, 248(2019).
  36. Schepers, E. J., Glaser, K., Zwolshen, H. M., Hartman, S. J., Bondoc, A. J. Structural and functional impact of posttranslational modification of Glypican-3 on liver carcinogenesis. Cancer Res. 83 (12), 1933-1940 (2023).
  37. Batra, S. A., et al. Glypican-3-specific CAR T cells coexpressing IL15 and IL21 have superior expansion and antitumor activity against hepatocellular carcinoma. Cancer Immunol Res. 8 (3), 309-320 (2020).
  38. Gao, W., et al. Immunotoxin targeting glypican-3 regresses liver cancer via dual inhibition of Wnt signalling and protein synthesis. Nat Commun. 6, 6536(2015).
  39. Thangaraj, J. L., Coffey, M., Lopez, E., Kaufman, D. S. Disruption of TGF-β signaling pathway is required to mediate effective killing of hepatocellular carcinoma by human iPSC-derived NK cells. Cell Stem Cell. 31 (9), 1327-1343.e5 (2024).
  40. Maddineni, S., Silberstein, J. L., Sunwoo, J. B. Emerging NK cell therapies for cancer and the promise of next generation engineering of iPSC-derived NK cells. J Immunother Cancer. 10 (5), e004693(2022).
  41. Zhu, H., et al. Metabolic reprograming via deletion of CISH in human iPSC-derived NK cells promotes in vivo persistence and enhances antitumor activity. Cell Stem Cell. 27 (2), 224-237.e6 (2020).
  42. Strati, P., et al. Preliminary results of a phase I trial of FT516, an off-the-shelf natural killer (NK) cell therapy derived from a clonal master induced pluripotent stem cell (iPSC) line expressing high-affinity, non-cleavable CD16 (hnCD16), in patients (pts) with relapsed/refractory (R/R) B-cell lymphoma (BCL). J Clin Oncol. 39, 7541-7541 (2021).
  43. Hong, D., et al. Preliminary results of an ongoing phase I trial of FT500, a first-in-class, off-the-shelf, induced pluripotent stem cell (iPSC) derived natural killer (NK) cell therapy in advanced solid tumors. J Immunother Cancer. 8 (3), A231-A232 (2020).
  44. Zah, E., et al. Systematically optimized BCMA/CS1 bispecific CAR-T cells robustly control heterogeneous multiple myeloma. Nat Commun. 11 (1), 2283(2020).
  45. Ahn, S., et al. Cancer immunotherapy with T cells carrying bispecific receptors that mimic antibodies. Cancer Immunol Res. 7 (5), 773-783 (2019).
  46. Ludwik, K. A., Telugu, N., Schommer, S., Stachelscheid, H., Diecke, S. ASSURED-optimized CRISPR protocol for knockout/SNP knockin in hiPSCs. STAR Protoc. 4 (3), 102406(2023).
  47. Zhu, H., Kaufman, D. S. An improved method to produce clinical scale natural killer cells from human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 2048, 107-119 (2019).
  48. Denman, C. J., et al. Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS One. 7 (1), e30264(2012).
  49. Leivas, A., et al. NKG2D-CAR-transduced natural killer cells efficiently target multiple myeloma. Blood Cancer J. 11 (8), 146(2021).
  50. Ramdial, J. L., et al. A phase II clinical trial of "Off-the-Shelf" NK cells with allogeneic stem cell transplantation to decrease disease relapse in patients with high-risk myeloid malignancies. Blood. 140 (Supplement 1), 7484-7485 (2022).
  51. Bachanova, V., et al. Initial clinical activity of FT596, a first-in-class, multi-antigen targeted, off-the-shelf, iPSC-derived CD19 CAR NK cell therapy in relapsed/refractory B-cell lymphoma. Blood. 136, 8(2020).
  52. Bae, W. K., et al. A phase I study of locoregional high-dose autologous natural killer cell therapy with hepatic arterial infusion chemotherapy in patients with locally advanced hepatocellular carcinoma. Front Immunol. 13, 879452(2022).
  53. Marin, D., et al. Safety, efficacy and determinants of response of allogeneic CD19-specific CAR-NK cells in CD19+ B cell tumors: a phase 1/2 trial. Nat Med. 30 (3), 772-784 (2024).
  54. Fehniger, T. A., et al. A phase 1 trial of CNDO-109-activated natural killer cells in patients with high-risk acute myeloid leukemia. Biol Blood Marrow Transplant. 24 (8), 1581-1589 (2018).
  55. Nguyen, R., et al. A phase II clinical trial of adoptive transfer of haploidentical natural killer cells for consolidation therapy of pediatric acute myeloid leukemia. J Immunother Cancer. 7 (1), 81(2019).
  56. Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
  57. Liu, E., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. N Engl J Med. 382 (6), 545-553 (2020).
  58. Daher, M., Melo Garcia, L., Li, Y., Rezvani, K. CAR-NK cells: the next wave of cellular therapy for cancer. Clin Transl Immunology. 10 (4), e1274(2021).
  59. Lin, X., Sun, Y., Dong, X., Liu, Z., Sugimura, R., Xie, G. IPSC-derived CAR-NK cells for cancer immunotherapy. Biomed Pharmacother. 165, 115123(2023).
  60. Bachanova, V., et al. Safety and efficacy of FT596, a first-in-class, multi-antigen targeted, off-the-shelf, iPSC-derived CD19 CAR NK cell therapy in relapsed/refractory B-cell lymphoma. Blood. 138, 823(2021).
  61. Saetersmoen, M. L., Hammer, Q., Valamehr, B., Kaufman, D. S., Malmberg, K. J. Off-the-shelf cell therapy with induced pluripotent stem cell-derived natural killer cells. Semin Immunopathol. 41 (1), 59-68 (2019).
  62. Gerew, A., et al. Deletion of CISH and TGFβR2 in iPSC-derived NK cells promotes high cytotoxicity and enhances in vivo tumor killing. Blood. 138, 2780(2021).
  63. Goldenson, B. H., Hor, P., Kaufman, D. S. iPSC-derived natural killer cell therapies - Expansion and targeting. Front Immunol. 13, 841107(2022).
  64. Karvouni, M., Vidal-Manrique, M., Lundqvist, A., Alici, E. Engineered NK cells against cancer and their potential applications beyond. Front Immunol. 13, 825979(2022).
  65. Ayuso, J. M., et al. Microphysiological model reveals the promise of memory-like natural killer cell immunotherapy for HIV± cancer. Nat Commun. 14 (1), 6681(2023).
  66. Miller, J. S., et al. Safety and virologic impact of haploidentical NK cells plus interleukin 2 or N-803 in HIV infection. J Infect Dis. 229 (5), 1256-1265 (2024).
  67. Gutiérrez-Hoya, A., Soto-Cruz, I. NK cell regulation in cervical cancer and strategies for immunotherapy. Cells. 10 (11), 3104(2021).
  68. Lisco, A., et al. Treatment of relapsing HPV diseases by restored function of natural killer cells. N Engl J Med. 385 (10), 921-929 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CAR NK cellenge nduceerde pluripotente stamcellenNK celdifferentiatiekankerimmunotherapieflowcytometriegenbewerkingniet virale genintegratietumormicro omgevingdeletie van immuuncheckpointsvorming van embryo de lichaampjes

Gerelateerde artikelen