Methodenartikel

Ontwikkeling van een koolprotoplastsysteem voor het bestuderen van hypoxietolerantie in brassica

DOI:

10.3791/67444

⸱

20 september 2024

 , 
1Department of Horticulture and Landscape Architecture, National Taiwan University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een efficiënt protoplastsysteem voor koolmesophyll. Er werden verschillende zuurstofarme behandelingen getest en het systeem vertoonde een hoge activering van hypoxie-responsieve genen, waardoor studies naar de genetische en moleculaire mechanismen van overstromingstolerantie in Brassicaceae-groenten werden vergemakkelijkt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naarmate de klimaatverandering meer zware regenval met zich meebrengt, wordt kool, een belangrijke koolsoort van Brassicaceae , geconfronteerd met aanzienlijke opbrengstverliezen als gevolg van door overstromingen veroorzaakte hypoxiestress. Om mechanismen van overstromingstolerantie in kool te identificeren, is een veelzijdig platform voor genetische functionele studies nodig om de transformatie-recalcitrante aard van kool te overwinnen. In deze studie werden een koolprotoplast transiënt expressiesysteem en een bijbehorend protoplast hypoxie-inductieprotocol ontwikkeld. Dit protocol bereikte een hoge opbrengst en integriteit van protoplastisolatie uit koolbladeren, met een transfectie-efficiëntie van meer dan 40% met behulp van geoptimaliseerde enzymatische omstandigheden. Om mogelijke hypoxische invloed vóór de behandelingen te verlichten, werd de W5-oplossing gebubbeld met zuurstofgas om het gehalte aan opgeloste zuurstof te verhogen. Verschillende chemicaliën voor het aanpassen van het zuurstofgehalte en fysiologische zuurstofopruimende behandelingen werden getest, waaronder EC-Oxyrase, OxyFluor, natriumsulfiet en een zuurstofabsorberend pakket. Dual-luciferase-assays toonden aan dat promotors van anaërobe ademhalingsresponsgenen BoADH1 en BoSUS1L werden geactiveerd in koolprotoplasten na hypoxiebehandelingen, waarbij het hoogste inductieniveau werd waargenomen na behandeling met het zuurstofabsorberende pakket. Samenvattend toont het koolprotoplast transiënte expressiesysteem in combinatie met hypoxiebehandeling een efficiënt en handig platform. Dit platform kan studies vergemakkelijken van de genfunctie en moleculaire mechanismen die verband houden met hypoxiereacties in kool.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De wereldwijde klimaatverandering heeft de overstromingen verergerd, wat wereldwijd een steeds kritischer probleem is geworden. De afgelopen decennia is er een opwaartse trend geweest in de frequentie van overstromingen, wat heeft geleid tot aanzienlijke oogstverliezen 1,2. Kool (Brassica oleracea var. capitata L.), een groente van aanzienlijk mondiaal belang, is gevoelig voor de nadelige effecten van hevige regenval, waardoor de ontwikkeling van overstromingstolerante koolcultivars noodzakelijk is om een duurzame productie te garanderen in het licht van extreme weersomstandigheden. Daarom is het essentieel om de moleculaire mechanismen te begrijpen die verband houden met overstromingsstress in kool om deze uitdaging aan te gaan.

Om genregulatiemechanismen in planten onder ondergedompelde omstandigheden te begrijpen, worden transgene lijnen veel gebruikt voor genetische functionele studies. Deze aanpak wordt echter beperkt door hoge kosten, tijdrovende transformatie- en subcultuurprocessen, evenals lage transformatie-efficiëntie in veel gewassoorten, waardoor de ontwikkeling van alternatieve methodologieën noodzakelijk is. Op protoplast gebaseerde transiënte expressiesystemen zijn op grote schaal toegepast in moleculair onderzoek naar planten als een veelzijdig en efficiënt alternatief. Deze systemen vergemakkelijken onderzoek naar promotoractiviteit, signaalroutes als reactie op omgevingssignalen, eiwit-eiwit of eiwit-DNA-interacties en subcellulaire lokalisatie3. Het opzetten van protoplast transiënte expressiesystemen is niet alleen gerapporteerd in modelplanten 4,5, maar ook in economisch belangrijke gewassen zoals suikerriet6, anjer7, Phalaenopsis orchideeën8 en aubergine9. Bovendien zijn deze systemen met succes geïmplementeerd in houtige gewassen, waaronder Camellia oleifera10en Populus trichocarpa11. Protocollen voor het toepassen van protoplastsystemen om bladgroenten te bestuderen onder onderdompeling geïnduceerde hypoxiestress zijn echter beperkt. Daarom is in dit werk een geïntegreerd protocol ontwikkeld voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van hypoxiereacties in bladgroenten met behulp van een koolprotoplast transiënt expressiesysteem.

Om de door onderdompeling geïnduceerde hypoxierespons op cellulair niveau uit te voeren, zijn in eerdere studies verschillende methoden voor het opruimen van zuurstof gebruikt om hypoxische omgevingen te simuleren. Deze omvatten het gebruik van EC-Oxyrase, OxyFluor, natriumsulfiet en zuurstofverbruikende zakken. EC-Oxyrase wordt meestal gebruikt voor anaërobe behandeling in menselijke cellijnen12 en Arabidopsis protoplasten13. OxyFluor is effectief gebleken bij het verminderen van fotobleken veroorzaakt door reactieve zuurstofspecies tijdens fluorescentiebeeldvorming van levende cellen14,15. Natriumsulfiet is gebruikt bij de anaërobe behandeling van nematoden16 en, meer recentelijk, in rijstprotoplasten, in combinatie met technieken zoals chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)-tests17. Zuurstofabsorberende pakkingen, die voornamelijk worden gebruikt voor anaërobe bacteriecultuur18, hebben ook hun werkzaamheid aangetoond bij het induceren van de activering van ZmPORB1-promotors in maïsprotoplasten onder anaërobe omstandigheden19.

Het huidige werk heeft tot doel een robuuste pijplijn op te zetten voor isolatie van koolprotoplasten en transiënte expressie. Vervolgens werd de werkzaamheid van verschillende zuurstofaanpassende behandelingen geëvalueerd door de promotoractiviteit van anaërobe responsgenen te beoordelen met behulp van dual-luciferase-assays. Het protocol dat in deze studie is ontwikkeld, zal naar verwachting waardevol zijn voor toekomstig onderzoek met betrekking tot onderdompeling of hypoxiestress in Brassica-systemen .

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit onderzoek werden twee cultivars van commerciële kool (B. oleracea var. capitata) gebruikt: 'Fuyudori' en '228'. Een grafische weergave van de protocolworkflow wordt weergegeven in figuur 1. De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van koolzaailingen

  1. Zaai 'Fuyudori' en '228' koolzaden met behulp van commercieel plantsubstraat in ronde vierkante gaten (D 4,5 cm x H 4,5 cm) van 48-well plugtrays (L 49 cm x B 28 cm x H 5 cm). Veranker de zaden ongeveer 1 cm diep in het groeimedium.
  2. Kweek koolzaailingen in een kweekruimte bij 22 °C met een licht-donkercyclus van 16/8 uur. Handhaaf de lichtintensiteit van 100 μmol m-2·s-1 (witte TL-buis ) tijdens de lichtfase.
  3. Gebruik na 2-3 weken groei koolzaailingen in het 2-bladstadium voor verdere isolatie van mesofylprotoplast.
    OPMERKING: De voorgestelde grootte van koolzaailingen is een stadium van 2 bladeren, waarin het tweede echte blad volledig is uitgezet, maar het derde echte blad niet is uitgespreid en de lengte korter is dan 1 cm (Figuur 2A). Om de ontwikkelingsstadia van de koolzaailingen te synchroniseren, moeten 'Fuyudori'-zaden ongeveer 2 dagen eerder worden gezaaid dan '228'-zaden vanwege hun verschillende groeisnelheden. Deze aanpassing zorgt voor een uniforme groei en rijpheid van de koolplanten in het gewenste stadium.

2. Isolatie van koolprotoplasten

  1. Bereid 12,5 ml enzymoplossing (tabel 1) voor elke protoplastisolatie.
    1. Verwarm een oplossing voor met 10 mM MES (pH 5,7) en 0,6 M mannitol bij 55 °C. Blijf de oplossing gedurende 10 minuten opwarmen bij 55 °C na toevoeging van 1,5% Cellulase R10 en 0,75% Macerozym R10.
    2. Nadat de enzymoplossing is afgekoeld tot kamertemperatuur (25 °C), voeg je 10 mM CaCl2 en 0,1% runderserumalbumine (BSA) toe. Filter steriliseer de bereide enzymoplossing in een petrischaaltje van 9 cm met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm.
      OPMERKING: Voorverwarmen van de oplossing verhoogt de oplosbaarheid van enzymen en inactiveert protease. De effecten op de spijsvertering variëren afhankelijk van de verschillende soorten cellulase-enzymen. De combinatie van Cellulase R10 en Macerozyme R10 is geschikt voor de isolatie van koolprotoplast.
  2. Verzamel de tweede nieuw geëxpandeerde echte bladeren van vijf tot acht koolzaailingen en snijd ze in reepjes van 0,5-1,0 mm met behulp van een scherp scheermesje. Breng de bladstroken onmiddellijk over in de vers bereide enzymoplossing.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang om in het juiste stadium gezonde en aangewezen bladeren van kool te selecteren. De tweede, pas geëxpandeerde echte bladeren van koolzaailingen in het 2-bladstadium zorgen voor de hoogste protoplastisolatie-efficiëntie. Overrijpe planten, zaadlobben of oude bladeren worden niet aanbevolen voor isolatie van protoplasten. Vijf tot twaalf goed geëxpandeerde echte bladeren kunnen met succes koolprotoplasten opleveren in 12,5 ml enzymoplossing. Het aantal bladeren dat nodig is voor protoplastisolatie is afhankelijk van de gewenste hoeveelheid protoplasten die nodig zijn. Doorgaans zijn protoplasten verkregen van vijf tot acht bladeren voldoende voor latere experimentele procedures.
  3. Na vacuüminfiltratie in het donker gedurende 30 minuten (Figuur 2B), bewaart u de koolbladreepjes ondergedompeld in de enzymoplossing (Figuur 2C) in het donker bij kamertemperatuur nog 4-16 uur.
    OPMERKING: De verteringstijd van enzymen kan variëren tussen koolcultivars en moet worden geoptimaliseerd op basis van het specifieke genotype. Zo heeft 'Fuyudori' een langere verteringstijd nodig (16 uur) in vergelijking met '228' (4 uur) vanwege de dikkere bladeren van 'Fuyudori'.
  4. Verdun de protoplastenbevattende oplossing met een gelijk volume W5-oplossing, die bestaat uit 2 mM MES (pH 5,7), 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl en 5 mM glucose (zie tabel 1 voor de bereiding), om de enzymatische vertering te stoppen.
  5. Maak de protoplastsuspensie los door voorzichtig te draaien of met behulp van een orbitale schudder. Filtreer de celsuspensie door een celzeef van 70 μm in een conische buis van 50 ml.
    OPMERKING: De geïsoleerde protoplasten zijn in staat om door een celzeef van 70 μm te gaan, terwijl onverteerde plantenresten door de zeef worden vastgehouden en vervolgens uit de suspensie worden verwijderd. Celzeven kunnen na het wassen worden hergebruikt en in 75% ethanol worden bewaard, maar het is noodzakelijk om celzeven volledig te spoelen met W5-oplossing om resterende ethanol voor gebruik te verwijderen.
  6. Centrifugeer de protoplastenoplossing met 150 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C en verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant. Was de gepelleteerde protoplasten voorzichtig door 10 ml W5-oplossing langs de wand van de conische buis toe te voegen met een stroomsnelheid van ongeveer 1 ml/s-1. Centrifugeer de buis gedurende 2 minuten bij 150 x g bij 4 °C en herhaal deze wasprocedure opnieuw om ervoor te zorgen dat de enzymoplossing volledig is verwijderd.
  7. Resuspendeer de protoplasten in de W5-oplossing en leg ze 30 minuten op ijs. Verwijder na de ijsincubatie het bovenstaande met een pipet, 1 ml per keer, totdat al het bovenstaande is verwijderd.
  8. Resuspendeer de protoplasten in een met ijs voorgekoelde MMG-oplossing bestaande uit 4 mM MES (pH 5,7), 0,4 M mannitol en 15 mM MgCl2 (zie tabel 1 voor de bereiding).
  9. Meet de protoplastconcentratie met een hemocytometer en pas de uiteindelijke concentratie aan op 4 x 105 protoplasten·ml-1 met behulp van MMG-oplossing.

3. Transfectie van protoplasten

  1. Meng een totale hoeveelheid van 10 μl plasmide (5-10 μg) (aanvullend bestand 1) met 100 μl protoplasten (4 x 104 protoplasten) en plaats gedurende 10 minuten op ijs.
    OPMERKING: Voor de zuivering van plasmide van transfectierang, wordt een in de handel verkrijgbare plasmideuitrusting gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. Ongeveer 4 x 104 protoplasten worden doorgaans gebruikt in een dual-luciferase reporter-test. Voor experimenten op grotere schaal is een grotere hoeveelheid protoplasten beschikbaar voor transfectie. Concreet vertonen ongeveer 2 x 105 protoplasten getransfecteerd met 10 μg plasmide een bewezen transfectie-efficiëntie variërend van 30% tot 40%.
  2. Voeg een gelijk volume (110 μl) vers bereide PEG-oplossing (zie tabel 1 voor de bereiding) met 40% polyethyleenglycol 4000 (PEG4000), 0,1 M CaCl2 en 0,2 M mannitol toe aan de protoplastoplossing en meng voorzichtig.
  3. Incubeer het protoplastmengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker en voeg vervolgens 440 μl W5-oplossing toe om de reactie te beëindigen.
  4. Centrifugeer de getransfecteerde protoplasten bij 150 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C en suspendeer de pellet in 750 μl met zuurstof verrijkte W5-oplossing. Breng de geresuspendeerde protoplasten over naar een weefselkweekplaat met 6 putjes die is voorgecoat met 1% BSA.
    OPMERKING: W5-oplossing die wordt gebruikt voor celincubatie moet gedurende 5 minuten met zuurstof worden gebubbeld met behulp van een zuurstofconcentrator (~90% zuurstof) die is aangesloten op een luchtsteen (Figuur 2D). Na dit oxygenatieproces steeg de uiteindelijke concentratie van opgeloste zuurstof in de W5-oplossing van 7,84 mg· L-1 ± 0,05 mg· L-1 tot 29,18 mg· L-1 ± 0,43 mg· L-1, zoals gemeten met een meter voor opgeloste zuurstof. Het volume van W5-oplossing voor resuspensie van getransfecteerde protoplast is afhankelijk van het type weefselcelkweekplaat dat wordt gebruikt. Voor celkweekplaten met 12 putjes of 24 putjes is het raadzaam om het volume van de W5-oplossing te verminderen om hypoxiestress tijdens incubatie te verminderen vanwege de diepere diepte in de putjes. Voor BSA-coating kreeg elk putje van de kweekplaat 1 ml 1% BSA-oplossing, die de putjes 10 s mocht coaten. De BSA-oplossing werd vervolgens uit elke put weggegooid en de putjes werden vervolgens opnieuw gevuld met W5-oplossing. Deze procedure was gericht op het creëren van een tijdelijk niet-hechtend oppervlak met behulp van BSA, waardoor effectief werd voorkomen dat protoplasten aan het plastic oppervlak van de kweekplaat bleven plakken tijdens volgende experimentele stappen.

4. Hypoxiebehandeling op koolprotoplasten

  1. Voer chemische of fysisch geïnduceerde hypoxiebehandelingen uit onmiddellijk na protoplasttransfectie.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat hypoxiebehandeling onmiddellijk na protoplasttransfectie wordt toegepast. Langdurige incubatie van protoplasten kan de daaropvolgende hypoxierespons verminderen.
    1. Voor chemisch geïnduceerde hypoxie op koolprotoplasten voegt u OxyFluor, EC-Oxyrase en natriumsulfiet toe aan de W5-protoplastoplossing.
      OPMERKING: Het gebruik van 0,6 eenheden/mL-1 EC-oxyrase, 0,6 eenheden/mL-1 OxyFluor en 1 g·ml-1 natriumsulfiet in W5 waren de geteste omstandigheden die BoADH1 en BoSUS1L-promotor konden induceren (Figuur 3A) met lage schade aan de protoplastintegriteit in de twee onderzochte koolrassen.
    2. Voor zuurstofverbruikende zak-geïnduceerde hypoxie plaatst u twee zuurstofabsorberende verpakkingen in een anaërobe pot van 3,5 l om een hypoxische omgeving te creëren.
  2. Oogst met hypoxie behandelde protoplasten door te centrifugeren bij 150 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Vries de verzamelde protoplasten in met vloeibare stikstof en bewaar ze in een vriezer van -80 °C voor latere analyses.

5. Dubbele luciferase-test

  1. Voer de dual-luciferase reporter-test uit volgens de instructies van de fabrikant met kleine aanpassingen.
    1. Resuspendeer koolprotoplasten in 50 μL 1x passieve lysisbuffer en vortex gedurende 10 s.
    2. Incubeer verstoorde protoplasten gedurende 10 minuten op ijs en vang het bovenstaande op na centrifugatie bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    3. Voeg 20 μL cellysaat toe aan elk putje van de microtiter. Doseer 100 μL Luciferase assay reagens II in de putjes en meet de luciferase-activiteit van vuurvliegjes met behulp van een microplaatlezer.
    4. Voeg 100 μl van het in de handel verkrijgbare analysereagens toe aan elk putje en meet de luciferase-activiteit van Renilla met behulp van een microplaatlezer.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk ontwikkelde met succes een voorbijgaand expressiesysteem met behulp van koolprotoplasten (zie figuur 1 voor de workflow). Protoplasten werden geïsoleerd uit 2 tot 3 weken oude koolbladeren van de juiste grootte (Figuur 2A) van commerciële koolcultivars 'Fuyudori' en '228' met behulp van cellulase/macerozym-digestie en infiltratie van donker vacuüm (Figuur 2B,C). Om de hypoxische omstandigheden te verminderen die ondergedompelde protoplasten tijdens de incubatie ervaren, werd de W5-oplossing van zuurstof voorzien met behulp van een luchtsteenbubbler die was aangesloten op een zuurstofmachine (Figuur 2D). Dit proces verhoogde de concentratie opgeloste zuurstof in de W5-oplossing aanzienlijk van 7,84 mg· L-1 ± 0,05 mg· L-1 tot 29,18 mg· L-1 ± 0,43 mg· L-1 na 5 minuten zuurstofborrel. Na het isolatieproces was de opbrengst van protoplasten 1,04 x 107 voor 'Fuyudori' en 4,00 x 106 protoplasten/g-1 vers gewicht voor '228' na een nachtelijke verteringsperiode (Figuur 2E). Vervolgens werd GFP gebruikt als een reportergen om de transformatie-efficiëntie van de PEG-gemedieerde transfectiemethode te evalueren, wat aantoont dat de protoplast-transfectie-efficiëntie in kool in beide cultivars meer dan 40% bedroeg (Figuur 2F), waardoor de levensvatbaarheid van dit systeem wordt bevestigd.

Bovendien werden promotorconstructen van anaërobe ademhalingsresponsgenen voor kool, BoADH1p::Luc en BoSUS1Lp::Luc-vectoren (Figuur 3A), geïntroduceerd in koolprotoplasten als reporters om de hypoxische inductie-effecten van verschillende behandelingen te evalueren. Er werden ook verschillende zuurstofaanpassende behandelingen toegepast op dit transiënte expressiemodelsysteem. De resultaten toonden aan dat alle zuurstofvangende behandelingen, met uitzondering van natriumsulfiet, met succes een hypoxierespons induceerden in koolprotoplasten (Figuur 3B). In het bijzonder nam de promotoractiviteit van BoADH1 ongeveer 2,6 keer en 3,2 keer toe in vergelijking met de controlegroep na behandeling met respectievelijk EC-Oxyrase en OxyFluor, en met name met meer dan 7,0 keer met behandeling met zuurstofabsorberpakketten (Figuur 3B). Evenzo steeg de BoSUS1L-promotoractiviteit ongeveer 1,7 keer en 1,8 keer met respectievelijk EC-Oxyrase en OxyFluor, terwijl behandeling met zuurstofabsorberpakketten een substantiële toename van meer dan 5,6 keer veroorzaakte (Figuur 3B). Deze resultaten suggereren dat het zuurstofabsorberpakket een superieure werkzaamheid vertoont bij het creëren van een hypoxische omgeving in dit experimentele systeem voor koolprotoplast.

figure-results-1
Figuur 1: Grafische weergave van de protoplast-isolatieworkflow. Deze figuur illustreert het stapsgewijze proces dat betrokken is bij het isoleren van protoplasten uit koolbladweefsel. De workflow wordt visueel weergegeven om een duidelijk begrip van de procedure te geven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Protoplastisolatie uit bladweefsel van kool. (A) Het verschijnen van de in de handel verkrijgbare koolrassen "Fuyudori" en "228" in het aanbevolen groeistadium wordt getoond. De tweede pas volledig uitgevouwen echte bladeren (aangegeven door de pijlpunt) van kool in het 2-bladstadium worden geselecteerd voor protoplastisolatie. Schaalbalk: 2 cm. (B) Een vacuümpomp en exsiccator worden gebruikt voor het vacuüminfiltratieproces van koolbladrepen, waarbij een infiltratie van 30 minuten wordt uitgevoerd vóór enzymatische vergisting. (C) De toestand van koolbladreepjes tijdens enzymatische vertering wordt afgebeeld. De volledige vertering van het bladweefsel duurt in totaal 4-16 uur. Schaalbalk: 3 cm. (D) Foto's tonen het gebruik van een zuurstofconcentrator aangesloten op een luchtsteen om de concentratie opgeloste zuurstof in de W5-oplossing te verhogen. Schaalbalk: 5 cm. (E) Meer dan 4,00 x 106 mesofylprotoplasten per gram vers gewicht (FW) werden verkregen van zowel 'Fuyudori' als '228' koolrassen en werden onder een microscoop geobserveerd. Schaal balk: 200 μm. (F) De transfectie-efficiëntie van protoplasten van beide koolgenotypen, met behulp van een constitutief tot expressie gebrachte GFP-reporter, blijkt meer dan 40% te zijn. Schaalbalk: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Hypoxierespons van koolprotoplasten onder zuurstofarme omstandigheden. (A) Hypoxieresponsgenconstructen, BoADH1- en BoSUS1L-promotors , worden gebruikt als reporters om de hypoxierespons in 'Fuyudori'-koolprotoplasten te evalueren. (B) In totaal wordt 5 μg reporterplasmiden getransfecteerd in "Fuyudori"-koolprotoplasten, die worden geïncubeerd in een W5-oplossing met zuurstofbubbels voordat ze gedurende 4 uur worden blootgesteld aan hypoxiebehandelingen. Het zuurstofgehalte wordt tijdens de incubatie verlaagd door EC-oxyrase (0,6 eenheden/ml-1), OxyFluor (0,6 eenheden/ml-1) en natriumsulfiet (1 g/ml-1) aan de W5-oplossing toe te voegen. De behandeling van het zuurstofabsorberende pakket wordt uitgevoerd door twee zuurstofabsorberende zakken in een anaërobe pot van 3,5 L te plaatsen. De "CK"-groep vertegenwoordigt de controlegroep zonder enige hypoxiebehandeling. Na de behandeling worden protoplasten geoogst voor een dubbele luciferase-assay. Elke waarde vertegenwoordigt het gemiddelde ± SD, waarbij n = 4. Verschillende letters geven significante verschillen aan (P < 0,05) op basis van een eenrichtings-ANOVA met LSD post-hoc test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Bereiding van enzymoplossing, W5-oplossing en MMG-oplossing. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Plasmidedetails voor protoplasttransfectie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol presenteert een gestroomlijnde methode voor protoplastisolatie uit twee commerciële koolcultivars. De werkzaamheid van deze methode wordt voornamelijk beoordeeld aan de hand van twee kritische kwaliteitscontroleparameters: de opbrengst van levensvatbare protoplasten en de efficiëntie van protoplasttransfectie. De implementatie van dit protocol resulteerde in een opbrengst van meer dan 4,00 x 106 protoplasten·g−1· FW van mesofylweefsel van beide koolcultivars (Figuur 2E,F). Deze opbrengst is vergelijkbaar met die gerapporteerd bij andere soorten, waaronder aubergine, anjer, suikerriet en Camellia oleifera, waar de opbrengst van protoplasten varieerde van 2,5 x 106 tot 1,4 x 107 protoplasten·g-1· FW 6,7,9,17. Deze resultaten suggereren de mogelijke toepasbaarheid van het protocol op verschillende genetische achtergronden met B. oleracea.

Het succes van het protocol hangt af van verschillende kritische factoren. Het belangrijkste is het gebruik van gespecificeerde bladeren van gezonde koolzaailingen in een geschikt groeistadium (Figuur 2A). Het gebruik van oudere of ongezonde planten kan resulteren in protoplasten van slechte kwaliteit. Het is ook van cruciaal belang om het bladweefsel voorzichtig in reepjes van 0,5-1,0 mm te snijden en te voorkomen dat u het met een bot mes plet. Het enzymverteringsproces, dat 4-16 uur duurt, is een andere cruciale stap. Spijsverteringsperioden van minder dan 4 uur kunnen leiden tot een onvolledige spijsvertering, terwijl spijsverteringsperioden van meer dan 16 uur van de spijsvertering het risico op cellulaire stress veroorzaken. Met name genotypen met dikkere bladeren, zoals 'Fuyudori', kunnen baat hebben bij langere spijsverteringstijden om de opbrengst van protoplasten te maximaliseren. Daarentegen had '228' slechts 4 uur nodig voor een volledige spijsvertering. Bovendien kan een breed scala aan verteringstijden zorgen voor meer flexibiliteit bij het plannen van experimenten. Een digestie van 4 uur maakt het bijvoorbeeld mogelijk om protoplastisolatie en daaropvolgende transiënte testen binnen één dag te voltooien. Omgekeerd maakt een 16-uurs spijsvertering het mogelijk om 's avonds de enzymvertering op gang te brengen en de volgende stappen de volgende dag te voltooien, wat het gemak bij het toepassen van dit protocol kan vergroten. Bovendien is het van cruciaal belang om de protoplasten voorzichtig te behandelen tijdens het hele protoplastisolatieproces vanwege hun kwetsbaarheid en gevoeligheid voor mechanische belasting.

Om anaërobe omstandigheden te simuleren die representatief zijn voor overstromingsstress, maakte dit protocol gebruik van gewone zuurstofvangers en zuurstofverbruikende zakken om hypoxische omgevingen te creëren. Om de effectiviteit van het systeem te verbeteren, wordt een zuurstofmachine gebruikt om de W5-oplossing van zuurstof te voorzien (Figuur 2D), met als doel de hypoxische responssignalen op de achtergrond in koolprotoplasten tijdens hun incubatietijd vóór de behandeling te verminderen. Een oxygenatieproces van 5 minuten verhoogt het gehalte aan opgeloste zuurstof aanzienlijk van 7,84 mg· L-1 ± 0,05 mg· L-1 tot 29,18 mg· L-1 ± 0,43 mg· L-1, wat wijst op een uitgesproken effect bij het verlichten van hypoxische aandoeningen. Van de zuurstofopruimingsmethoden die in deze studie werden gebruikt, vertoonden de zuurstofabsorberende pakketten superieure prestaties, waarbij ze de hoogste promotoractiviteit induceerden in twee anaërobe responskerngenen (Figuur 3). Bovendien biedt deze methode het extra voordeel van schaalbaarheid, waardoor gelijktijdige behandeling van meerdere monsters mogelijk is door het gebruik van zuurstofverbruikende zakken in een enkele anaërobe pot, in tegenstelling tot de individuele toepassing van zuurstofopruimers op elke celkweekplaat. Samenvattend bieden de zuurstofabsorberende pakketten een handig en effectief platform dat geschikt is voor het evalueren van de respons van koolprotoplasten onder hypoxische omstandigheden.

Hoewel dit protocol verschillende voordelen aantoont, is het belangrijk om de beperkingen ervan te erkennen, met name de relatief bescheiden transfectie-efficiëntie van koolprotoplasten. Hoewel deze efficiëntie niet de 90% bereikt die voor Arabidopsis5 wordt gerapporteerd, blijkt het toch voldoende voor succesvolle latere studies naar de promotoractiviteit (Figuur 3), wat wijst op een aanzienlijk potentieel voor functionele analyse in dit systeem.

Gezien het wereldwijde belang van kool als belangrijk groentegewas, is de integratie van dit protocol met hypoxiebehandelingen en genetische analysetechnieken veelbelovend om meer inzicht te krijgen in regulerende mechanismen in kool onder overstromingsomstandigheden. Dergelijke inzichten kunnen mogelijk de ontwikkeling van overstromingstolerante koolrassen versnellen, waarmee wordt ingespeeld op een kritieke behoefte in het licht van extreem weer en toenemende overstromingen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Science and Technology Council (MOST 111-2313-B-002-029- en NSTC 112-2313-B-002-050-MY3). Voor Figuur 1 zijn de experimentele iconen afkomstig uit BioRender.com.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-(N-morpholino) ethanesulfonic Acid (MES)PhytoTech LabsM825Voor bereiding van enzymoplossing
228 koolzadenTakii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)
50 mL Conische buisSPL Life Sciences50050Voor bereiding van enzymoplossing
6-wells weefselkweekplaatAlpha Plus16106Voor protoplast incubatie
70 μm celstrainerSorfa SCS701Voor protoplast filtratie
9-cm Petri-schaalAlpha Plus16001Voor enzymatische vertering
Anaërobe potHIMEDIAAnaërobe Pot 3,5 LVoor hypoxie behandeling 
Rundserum albumineSigma-AldrichA7906Voor bereiding van W5 oplossing en coating van kweekplaat
CalciumchlorideJ.T.Baker131301Voor bereiding van W5 oplossing en PEG oplossing
Cellulase R10YakultVoor bereiding van enzymoplossing
DesiccatorTarsons 402030Voor vacuüm infiltratie
D-GlucoseBioshopGLU501Voor bereiding van W5 oplossing
Opgeloste zuurstofmeterThermo ScientificOrion Star A223Voor zuurstofmeting
D-MannitolSigma-AldrichM1902Voor bereiding van enzymoplossing, PEG oplossing en MMG oplossing
Dual-Luciferase Reporter Assay SysteemPromegaE1960Voor Dual-luciferase reporter assay
EC-OxyraseOxyrase Inc.EC-0005Voor hypoxie behandeling
Fuyudori koolzadenKobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)
Hoge snelheid gekoelde centrifugeHitachiCR21GIIIVoor protoplast oogst
Macerozyme R10 YakultVoor bereiding van enzymoplossing
MagnesiumchlorideAlfa Aesar12315Voor bereiding van MMG oplossing
MicrocentrifugeHitachiCT15REVoor protoplast oogst
MicroplaatGreiner655075Voor Dual-luciferase reporter assay
Microplaat ReaderMolecular DevicesSpectraMax MiniVoor Dual-luciferase reporter assay
Millex 0,22 μm spuitfilterMerckSLGP033RSVoor bereiding van enzymoplossing
Olievrije vacuümpompRocker Rocker 300Voor vacuüm infiltratie
OxyFluorOxyrase Inc.OF-0005Voor hypoxie behandeling
Zuurstofabsorptie pakketMitsubishi Gas Chemical CompanyAnaeroPack, MGCC1Voor hypoxie behandeling
ZuurstofconcentratorUTMOST PERFECTAII-XVoor zuurstof-bubbelen in W5 oplossing
PlantensubstraatKlasmann-DeilmannPotgrond H substraatVoor bereiding van koolzaailingen
Plasmid Midi KitQIAGEN12145Voor zuivering van transfectie-kwaliteit plasmide DNA 
Polyethyleen Glycol 4000Fluka81240Voor protoplast transfectie
KaliumchlorideJ.T.Baker304001Voor bereiding van W5 oplossing
SchermesjeGilletteVoor bereiding van koolbladen strips
NatriumchlorideBioshopSOD002Voor bereiding van W5 oplossing
NatriumsulfietSigma-AldrichS0505Voor hypoxie behandeling
WaterbadYihderBU-240DVoor bereiding van enzymoplossing

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tanoue, M., Hirabayashi, Y., Ikeuchi, H. Global-scale river flood in the last 50 years. Sci Rep. 6 (1), 36021(2016).
  2. Voesenek, L. aC. J., Bailey-Serres, J. Flood adaptive traits and processes: An overview. New Phytol. 206 (1), 57-73 (2015).
  3. Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127 (4), 1466-1475 (2001).
  4. Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defense gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
  5. Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  6. Wang, Q., et al. Optimization of protoplast isolation, transformation, and its application in sugarcane (Saccharum spontaneum L). Crop J. 9 (1), 133-142 (2021).
  7. Adedeji, O. S., et al. Optimization of protocol for efficient protoplast isolation and transient gene expression in carnation. Sci Hortic. 299, 111057(2022).
  8. Lin, H. -Y., Chen, J. -C., Fang, S. -C. A protoplast transient expression system to enable molecular, cellular, and functional studies in Phalaenopsis orchids. Front Plant Sci. 9, (2018).
  9. Wang, Y., et al. A highly efficient mesophyll protoplast isolation and PEG-mediated transient expression system in eggplant. Sci Hortic. 304, 111303(2022).
  10. Lin, Z., et al. Development of a protoplast isolation system for functional gene expression and characterization using petals of Camellia oleifera. Plant Physiol Biochem. 201, 107885(2023).
  11. Guo, J., et al. Highly efficient isolation of Populus mesophyll protoplasts and its application in transient expression assays. PLOS One. 7 (9), e44908(2012).
  12. Gottschald, O. R., et al. TIAR and TIA-1 mRNA-binding proteins co-aggregate under conditions of rapid oxygen decline and extreme hypoxia and suppress the HIF-1α pathway. J Mol Cell Biol. 2 (6), 345-356 (2010).
  13. Cho, H. -Y., Chou, M. -Y., Ho, H. -Y., Chen, W. -C., Shih, M. -C. Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2. Sci Adv. 8 (22), eadm7863(2022).
  14. Boudreau, C., et al. Excitation light dose engineering to reduce photo-bleaching and photo-toxicity. Sci Rep. 6 (1), 30892(2016).
  15. Shcherbakova, D. M., Cox Cammer, N., Huisman, T. M., Verkhusha, V. V., Hodgson, L. Direct multiplex imaging and optogenetics of Rho GTPases enabled by near-infrared FRET. Nat Chem Biol. 14 (6), 591-600 (2018).
  16. Jiang, B., et al. Sodium sulfite is a potential hypoxia inducer that mimics hypoxic stress in Caenorhabditis elegans. J Biol Inorg Chem. 16 (2), 267-274 (2011).
  17. Lin, C. -C., et al. SUB1A-1 anchors a regulatory cascade for epigenetic and transcriptional controls of submergence tolerance in rice. PNAS Nexus. 2 (7), pgad229(2023).
  18. Zhang, X., et al. Bis-molybdopterin guanine dinucleotide modulates hemolysin expression under anaerobiosis and contributes to fitness in vivo in uropathogenic Escherichia coli. Mol Microbiol. 116 (4), 1216-1231 (2021).
  19. Liu, N., et al. The light and hypoxia-induced gene zmPORB1 determines tocopherol content in the maize kernel. Sci China Life Sci. 67 (3), 435-448 (2024).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Protoplast IsolationTransient ExpressionHypoxia InductionOxygen Absorber PackDual Luciferase AssayAnaerobic JarFlooding StressBrassica Hypoxia

Gerelateerde artikelen