Methodenartikel

Gepaarde Cisterna Magna-nano-injectie en laserspikkelcontrastbeeldvormingstest om cerebrale bloedstroomregulatie in vivo te bestuderen

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67544

⸱

8 juli 2025

 , 
1Department of Neuroscience, Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Om de cerebrale bloedstroomregulatie in vivo te bestuderen, zijn traditionele farmacologische methoden invasief en beschadigen ze vaak de schedel, dura en leptomeninges. In dit werk hebben we een minimaal invasieve techniek ontwikkeld die nano-injectorgeleide intracisternale magna (ICM) injectie combineert met beeldvorming met laserspikkelcontrast, waardoor de integriteit van de schedel en leptomeninges behouden blijft.

Samenvatting

De regulatie van de cerebrale bloedstroom (CBF) is cruciaal voor het behoud van cognitieve functies, maar de onderliggende mechanismen worden nog steeds slecht begrepen. Het onderzoeken van de cellulaire en moleculaire processen die betrokken zijn bij deze regulatie vereist een farmacologische benadering die nauwkeurige toediening van geneesmiddelen in cerebrale spinale vloeistof (CSF) mogelijk maakt, terwijl real-time monitoring van de dynamiek van de cerebrale bloedstroom mogelijk is. In dit artikel presenteren we een methode voor het bestuderen van cerebrale bloedstroomregulatie in vivo door op nano-injector gebaseerde intracisternale magna (ICM) injectie te combineren met laserspikkelcontrastbeeldvorming.

De op nanoliter injector gebaseerde ICM-injectietechniek maakt nauwkeurige medicijnafgifte mogelijk met een dynamisch bereik van nL/min tot μL/min. In onze experimenten verminderde deze aanpak het injectievolume aanzienlijk van de traditionele 5-10 μl tot slechts 1,5 μl, waardoor de normale intracraniale druk behouden bleef. In combinatie met beeldvorming met laserspikkelcontrast waren we in staat om de dynamiek van de cerebrale bloedstroom (CBF) in realtime te volgen voor, tijdens en na ICM-injecties.

Met behulp van deze methode evalueerden we CBF-veranderingen als reactie op ICM-injectie van drie verschillende vaatverwijders: (S)-3,5-dihydroxyfenylglycine (DHPG), acetylcholine en adenosine. Hoewel alle drie de vaatverwijders de basale CBF verhoogden, hadden ze duidelijke effecten op de CBF-dynamiek. De impact van adenosine was bijvoorbeeld van voorbijgaande aard, terwijl DHPG en acetylcholine langdurige effecten hadden. Met zijn unieke voordelen vormt deze methode een waardevolle aanvulling op de gereedschapskist van het bestuderen van CBF-regulatie bij knaagdieren in vivo.

Inleiding

Cerebrale bloedstroom (CBF) zorgt voor een continue toevoer van zuurstof en voedingsstoffen naar de hersenen en verwijdert metabolisch afval, wat essentieel is voor het behoud van normale cognitieve functies 1,2. Onder homeostatische omstandigheden blijft CBF relatief stabiel ondanks fluctuaties in de perfusiedruk, een proces dat bekend staat als autoregulatie 3,4,5. Naast autoregulatie kan lokale CBF dynamisch worden aangepast als reactie op nabijgelegen neuronale activiteit, een fenomeen dat neurovasculaire koppeling wordt genoemd 6,7. Zowel autoregulatie als neurovasculaire koppeling worden gereguleerd door een groep cellen - endotheelcellen, murale cellen, astrocyten, fibroblasten en neuronen - gezamenlijk bekend als neurovasculaire eenheidscellen 4,7. De cellulaire en moleculaire mechanismen waarmee deze verschillende celtypen coördineren om CBF te moduleren, zijn echter nog grotendeels onbekend.

Methoden voor het onderzoeken van CBF-regulatie zijn over het algemeen onderverdeeld in in vitro en in vivo modellen. In vitro studies, vaak met behulp van acute hersenplakjes, worden meestal gecombineerd met elektrofysiologische of farmacologische technieken om te onderzoeken hoe neuronen en gliacellen de verwijding of vernauwing van individuele bloedvaten reguleren 8,9,10. De belangrijkste beperking van in vitro-modellen is dat ze geen in vivo-omstandigheden repliceren, met name de afwezigheid van fysiologische bloeddruk. In vivo modellen voor het bestuderen van CBF-regulatie variëren van macroschaal tot microschaalbenaderingen. Technieken op macroschaal, zoals positronemissietomografie (PET) en functionele magnetische resonantiebeeldvorming (fMRI), zijn niet-invasief, maar hebben een lage ruimtelijke en temporele resolutie 11,12,13,14.

De primaire microschaalmethode voor het bestuderen van CBF in vivo is beeldvorming met twee fotonen, die een hoge ruimtelijk-temporele resolutievan 9,15,16,17,18 biedt. Deze techniek vereist echter de verwijdering van de schedel en dura mater, en in combinatie met farmacologische manipulatie wordt het nog invasiever, wat mogelijk bloedingen kan veroorzaken, hersenweefsel kan beschadigen en de intracraniale druk kan veranderen19. Daarom is het van cruciaal belang om een methode te hebben voor het manipuleren en monitoren van CBF in vivo die aan specifieke criteria voldoet: het moet niet-invasief zijn (met behoud van de integriteit van de schedel, leptomeninges en bloedvaten), een hoge ruimtelijk-temporele resolutie bieden en nauwkeurige farmacologische manipulatie van CBF mogelijk maken. In dit artikel introduceren we een nieuwe methode die op nanoliter injector gebaseerde intracisternale magna (ICM) injectie combineert met laserspikkelcontrastbeeldvorming, en voldoet aan al deze vereisten.

Traditionele farmacologische benaderingen voor het bestuderen van CBF-regulatie omvatten vaak het verwijderen van de schedel en hersenvliezen om het hersenweefsel bloot te leggen voor lokale medicijnafgifte. ICM-injectie daarentegen vermijdt deze schade door medicijnen rechtstreeks in de cerebrale spinale vloeistof (CSF) toe te dienen, waardoor ze de natuurlijke stroom van CSF kunnen volgen en daardoor fysiologische omstandigheden beter kunnen nabootsen. Een uitdaging bij ICM-injectie is dat er meestal grote hoeveelheden vloeistof nodig zijn - vaak 5 μL of meer bij muizen20. Aangezien het totale CSF-volume bij volwassen muizen ongeveer 36 μL is, kan het injecteren van 5 μL de intracraniale druk verhogen en de CBF-dynamiek veranderen. Ons nano-injectorsysteem, dat gebruikmaakt van glazen pipetten, levert vloeistof met nauwkeurige controle over volume en snelheid zonder CSF-lekkage op de injectieplaats te veroorzaken.

Urethaan en alfa-chloralose worden in onze studie gebruikt omdat ze een stabielere fysiologische basislijn van de cerebrale bloedstroom bieden en de neurovasculaire koppeling (NVC) beter behouden dan veelgebruikte alternatieven zoals isofluraan of ketamine/xylazine (KX). Met behulp van dit systeem hebben we drie verschillende vaatverwijders getest: (S)-3,5-dihydroxyfenylglycine (DHPG), acetylcholine en adenosine, en hebben bevestigd dat het nauwkeurige manipulatie en monitoring van CBF-dynamiek in vivo mogelijk maakt.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Virginia. Alle experimenten voldeden aan de National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Zes mannelijke C57BL/6-muizen in de leeftijd van 10-14 weken werden gebruikt voor de experimenten. De chirurgische ingrepen worden beschreven in figuur 1A.

1. Voorbereiding van de operatie

  1. Plaats een verwarmingskussen op het stereotactische frame en verwarm het voor op 37 °C ~20 minuten voor de operatie. Bereid vers urethaan (750 mg/kg) en chloralose (50 mg/kg) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor anesthesie.
    OPMERKING: Voor de bereiding van de alfa-chloralose-oplossing in PBS hebben we de oplossing verwarmd in een waterbad van 40 °C en elke 10-15 minuten gevortexeerd totdat deze volledig was opgelost. Zowel de urethaan- als de alfa-chloralose-oplossing werden voor gebruik gefilterd met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm.
  2. Verzamel vóór de operatie alle benodigde chirurgische instrumenten, waaronder scharen, tangen, micronaaldhouders, hemostaten, wattenstaafjes, poetsdoeken en hechtingen. Steriliseer de instrumenten door middel van autoclaveren (121 °C bij 15 psi gedurende 60 min).
  3. Bereid glazen capillaire buizen voor (buitendiameter 1,14 mm, binnendiameter 0,53 mm, 88,9 mm lang). Gebruik een glastrekker om glazen pipetten te maken voor injectie21. De geprefereerde pipetweerstand is ongeveer 80 - 100 MΩ. Steriliseer en bewaar de glazen pipetten in een schone container.
  4. Bereid een nanoinjector voor met het juiste injectievolume (25 nL - 4,5 μL) en snelheid (6 nL/s - 644 nL/s).
  5. Bereid de volgende vaatverwijdende oplossingen in kunstmatig hersenvocht (aCSF): (S)-3,5-dihydroxyfenylglycine (DHPG) bij 5 mM, acetylcholine bij 0,5 mM en adenosine bij 10 mM.
  6. Bereid meloxicam (4,0 mg/kg) voor pijnverlichting tijdens de operatie. Dien meloxicam ongeveer 30 minuten voor de operatie subcutaan toe aan de muizen om voldoende analgesie te garanderen.

2. Chirurgische ingreep

  1. Weeg zes mannelijke muizen C57BL/6 (10-14 weken oud) en verdoof ze via intraperitoneale injectie van urethaan (750 mg/kg) en chlooralose (50 mg/kg). Plaats de muizen in een anesthesiekamer met 1% isofluraan om de verdoving te behouden. Dit proces duurt ongeveer 40 minuten tot 1 uur.
    OPMERKING: Isofluraan kan de inductie van de verdoving versnellen.
  2. Haal de muizen voorzichtig uit de anesthesiekamer en beoordeel de diepte van de anesthesie door de afwezigheid van de teenknijpreflex te bevestigen. Breng met een wattenstaafje ontharingscrème aan op de bovenkant van de schedel en de achterkant van de nek om de vacht te verwijderen.
  3. Breng oogzalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen en breng indien nodig opnieuw aan tijdens de procedure. Controleer regelmatig tijdens het experiment en dien indien nodig extra zalf toe.
  4. Plaats de muis in buikligging binnen het stereotactische frame en zorg voor voldoende ventilatie met medische lucht met een debiet van 1 tot 2 l/min. Zet de muis vast met oorstangen voor een goede fixatie en kantel de kop vervolgens voorzichtig naar beneden om een hoek van 120° met het lichaam te vormen, waardoor de cisterna magna zichtbaar wordt.
    OPMERKING: Isofluraan wordt uitsluitend gebruikt voor anesthesie-inductie en niet tijdens de onderhoudsfase.
  5. Desinfecteer het operatiegebied met ten minste drie afwisselende toepassingen van 70% alcohol en een chirurgische scrub (bijv. chloorhexidine of povidon-jodium) om een adequate sterilisatie van de huid te garanderen.
  6. Zoek de occipitale kam onder een chirurgische microscoop. Til de bovenliggende huid op met een pincet en maak een incisie in de middellijn van 1 cm. Beperk eventuele bloedingen met wattenstaafjes.
  7. Leg de nekspieren bloot en snijd ze voorzichtig in en scheid ze langs de middellijn met behulp van een tang. Gebruik twee gebogen tangen, één in elke hand, om de spieren voorzichtig terug te trekken en de dura mater, die de buitengrens van de cisterna magna vormt, bloot te leggen.
  8. Pas de positie van het hoofd aan door het naar beneden te kantelen om een hoek van 150° met het lichaam te vormen voor een optimale belichting van de cisterna magna.
  9. Maak een incisie van 5 mm langs de sagittale hechting, die zowel de lambda- als de bregmapunten bedekt. Gebruik twee gebogen tangen om de huid voorzichtig opzij te trekken en reinig het oppervlak van de schedel met zoutoplossing. Zorg ervoor dat er geen haar op de blootgestelde schedel achterblijft.
  10. Breng na het reinigen een laag ultrasone gel ~1 mm dik aan op de blootgestelde schedel met behulp van wattenstaafjes om vocht in het gebied vast te houden. Aangezien ultrasone gel luchtbellen kan bevatten, moet u ervoor zorgen dat alle luchtbellen worden verwijderd voordat u de beeldvorming uitvoert.
  11. Plaats de muis onder de lens van het laserspikkelcontrastbeeldvormingssysteem. Schakel het systeem en de bijbehorende software in. Zorg ervoor dat het muizenbrein gecentreerd is in het beeldveld en gebruik vervolgens de autofocusfunctie om de juiste focus voor beeldvorming te bereiken. Verwijder indien nodig voorzichtig eventuele achtergebleven haren of luchtbellen uit het beeldvormingsveld met een pincet.

3. Opstelling van nano-injectie

  1. Bevestig de pomp aan de stereotactische manipulatorarm en sluit de kabel aan op de controller. Zet de controller aan en selecteer de doelpomp. Stel in het bedieningspaneel DIRECTION in op INFUSE. Stel de snelheid in op 2 μl per minuut en het volume op 4.5 μl.
    OPMERKING: Het nano-injectiesysteem bestaat uit twee hoofdcomponenten: de injectiepomp en de controller. Elke controller kan twee pompen tegelijk bedienen. Voor ICM-injectie gebruiken we slechts één pomp.
  2. Nadat de INFUSE is voltooid, haalt u een glazen pipet uit de container en vult u deze met kleurloze, geurloze minerale olie met behulp van een 34 G MicroFil flexibele naald of een soortgelijk type naald. Zorg ervoor dat de hele glazen pipet gevuld is met olie.
  3. Schroef de spantang van de pomp los, plaats de glazen pipet en draai vervolgens de spantang vast. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de glazen pipet aanwezig zijn.
  4. Verander de RICHTING in het configuratiescherm voor TERUGTREKKEN. Stel de snelheid in op 2 μ l/min en het volume op 4,5 μ l.
  5. Beweeg de stereotactische arm om de pipet voorzichtig in de bereide oplossing te brengen en trek het gewenste volume op.

4. Injectie van vaatverwijders in de cisterna magna en monitoring CBF

  1. Zorg ervoor dat de pomp stevig is bevestigd aan de stereotactische manipulatorarm. Stel de hoek van de stereotactische manipulatorarm in op 45° in het voor-achterste vlak.
  2. Gebruik een gebogen pincet onder de dissectiemicroscoop om de cisterna magna voorzichtig bloot te leggen. Reinig het gebied met zoutoplossing om eventueel bloed te verwijderen. Gebruik de stereotactische micromanipulator om de glazen pipet in de buurt van de dura mater van de cisterna magna te plaatsen.
  3. Zodra de glazen pipet de dura raakt, manoeuvreert u deze voorzichtig om naar het midden van de cisterna magna te gaan, waarbij u elke penetratie in het cerebellum of medulla vermijdt. Zorg ervoor dat de punt van de glazen pipet tot een diepte van 1-2 mm is ingebracht voordat u het pincet loslaat.
    OPMERKING: Een digitaal stereotactisch frame is essentieel voor het bewaken van de diepte van de penetratie van glazen pipetten in cisterna magna.
  4. Verander de RICHTING in het bedieningspaneel in INFUSE. Stel de injectiesnelheid in op 300 nL/min en het volume op 1,5 μL.
  5. Start de software voor laserspikkelcontrastbeeldvorming (LSCI) en pas de focus aan om het duidelijkste beeld van de bloedvaten te krijgen. Zorg ervoor dat er geen haar of luchtbellen in het gezichtsveld zijn.
  6. Stel het beeldvormingsinterval in op 5 s in het LSCI-configuratiescherm. Registreer de basislijn CBF gedurende ongeveer 10 minuten en zorg ervoor dat de basislijn stabiel blijft. Als er fluctuaties zijn in de basislijn, ga dan langer door met registreren totdat de stabiliteit is bereikt.
  7. Start na 10 minuten stabiele basislijnregistratie met de nano-injectie en noteer de starttijd van de injectie in het LSCI-opnamesysteem. Zodra de injectie is voltooid, markeert u de eindtijd en gaat u nog 20 minuten of langer door met opnemen. Na voltooiing van het experiment, transcardiale perfusie van de muizen met PBS en hersenweefsel verzamelen voor histologische analyse.

Resultaten

Na voltooiing van de operatie hebben we de muis vastgezet in een stereotactisch frame met een digitale uitlezing (Figuur 1A,B). Voor het meten van de cerebrale bloedstroom (CBF) hebben we de huid over de schedel na de incisie voorzichtig uit elkaar getrokken en een transparante ultrasone gel aangebracht om vocht op het schedeloppervlak te houden (Figuur 1C). Om intracisternale magna (ICM) injectie mogelijk te maken, hebben we de nekspieren rond de occipitale kam ontleed om de cisterna magna bloot te leggen. Daarna trekken we de doeloplossing op met een glazen pipet en gebruikten we de micromanipulator om de glazen pipet te geleiden om de membranen van cisterna magna binnen te dringen tot een diepte van 1-2 mm (Figuur 1D,E). De stereotactische arm werd in een hoek van 45graden gekanteld om te helpen bij het inbrengen.

Vervolgens onderzochten we CBF-dynamische veranderingen als reactie op drie verschillende vaatverwijders: (S)-3,5-dihydroxyfenylglycine (DHPG), acetylcholine en adenosine 22,23,24,25. We registreerden aanvankelijk een basislijn van 10 minuten voordat we 1,5 μl van elke vaatverwijder injecteerden met een snelheid van 300 nL/min gedurende 5 minuten. Na de injectie registreerden we nog eens 20 minuten aan gegevens. Onze resultaten toonden aan dat alle drie de vaatverwijders de CBF verhoogden, zij het met een duidelijke dynamiek. DHPG veroorzaakte een sterke toename van CBF, gevolgd door een geleidelijke afname na injectie (Figuur 2A,B). Acetylcholine daarentegen veroorzaakte een geleidelijke toename van CBF gedurende de registratieperiode (Figuur 2C,D). Adenosine veroorzaakte ook een voorbijgaande toename van CBF, die ongeveer 15-20 minuten na injectie terugkeerde naar het basisniveau (Figuur 2E,F).

figure-results-1
Figuur 1: Samenvatting van chirurgische ingrepen. (A) Stapsgewijze belangrijkste chirurgische ingrepen voor nano-injectie + LSCI-model. (B) Schema's van het gecombineerde nano-injectie + LSCI-systeem. De nano-injector is stabiel bevestigd op de stereotactische arm en de arm is 45o gekanteld om de penetratie van het atlanto-occipitale membraan in de cisterna magna te vergemakkelijken. (C) Bovenaanzicht van de muizenschedel onder het LSCI-systeem. De schedel is bedekt met ultrasone gel. (D) Achteraanzicht van de glazen pipet die de cisternale magna binnendringt. De glazen pipet was gevuld met Evans-blauw om visualisatie te vergemakkelijken. Gebruik voor dit experiment het digitale stereotactische frame, zodat de penetratieafstand nauwkeurig kan worden gekwantificeerd. (E) Schema's die de locatie van de glazen pipetpunt in cisternale magna weergeven. Het hoofd van de muis werd 30o gekanteld om de cisternale magna-injectie te vergemakkelijken. Afkorting: LCSI = laser speckle contrast imaging. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Verhoogde cerebrale bloedstroom na nano-injectie van vaatverwijders. (A) Representatieve beelden van veranderingen in de cerebrale bloedstroom voor en na DHPG-injectie. De bloedsnelheid is kleurgecodeerd. Blauw staat voor lage snelheid en rood staat voor hoge snelheid. (B) Real-time bloedstroom in het gebied gemarkeerd met een rode lijn, die het tijdvenster voor de DHPG-injectie aangeeft. (C) Representatieve beelden van veranderingen in de cerebrale bloedstroom voor en na ACh-injectie. De bloedsnelheid is kleurgecodeerd. Blauw en rood geven respectievelijk lage en hoge snelheden aan. (D) Real-time bloedstroom in het gebied gemarkeerd door de rode lijn, die het tijdvenster voor ACh-injectie aangeeft. (E) Representatieve beelden van veranderingen in de cerebrale bloedstroom voor en na injectie met adenosine. De bloedsnelheid is kleurgecodeerd. Blauw en rood geven respectievelijk lage en hoge snelheden aan. (F) Real-time bloedstroom in het gebied gemarkeerd door de rode lijn, die het tijdvenster voor adenosine-injectie aangeeft. Afkortingen: DHPG = (S)-3,5-Dihydroxyfenylglycine; ACh = acetylcholine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

We presenteren een nieuwe methode voor het onderzoeken van de regulatie van de cerebrale bloedstroom (CBF) in vivo door nauwkeurige cisternale magna-nano-injectie te combineren met laserspikkelcontrastbeeldvorming (LSCI). Deze aanpak maakt een nauwkeurige toediening van geneesmiddelen in de cerebrale spinale vloeistof (CSF) mogelijk, terwijl real-time monitoring van CBF mogelijk is, waardoor de evaluatie van cerebrale vasculaire reactiviteit wordt vergemakkelijkt.

Farmacologische manipulatie en technieken voor medicijnafgifte zijn van cruciaal belang voor het bestuderen van CBF en cerebrale vasculaire reactiviteit in vivo. Traditionele methoden voor het aanbrengen van medicijnen, zoals het gebruik van vaatverwijders of constrictoren, vereisen vaak het verwijderen van de schedel, die de leptomeninges en zelfs het hersenparenchym kan beschadigen 9,10,18. Deze invasieve technieken kunnen de micro-omgeving van de hersenen verstoren, met name door vasculaire schade en bloedingen te veroorzaken, waardoor de echte fysiologische omstandigheden niet kunnen worden nagebootst. Onze methode biedt daarentegen vier belangrijke voordelen.

Ten eerste is onze benadering voor medicijntoepassing niet-invasief en behoudt het fysiologische omstandigheden. Ten tweede zijn klassieke ICM-injectiemethoden meestal gebaseerd op spuiten of canules, wat kan leiden tot lekkage van medicijnen of sporen en CSF vanwege de grote omvang van de uiteinden. Deze traditionele methoden vereisen vaak grote hoeveelheden medicijn of sporen - meestal 5 μL of meer, wat de intracraniële druk kan veranderen. Daarentegen vereist onze nano-injectorgeleide ICM-injectie slechts een klein volume van slechts 1,5 μL of minder. Bovendien kan de injectiesnelheid nauwkeurig worden geregeld over een breed bereik, van 1 nL/s tot 100 nL/s. We gebruiken doorgaans een snelheid van 5 nL/s (300 nL/min), omdat deze snelheid geen invloed heeft op de intracraniale druk. Ten derde, in tegenstelling tot pipetgeleide medicijninjecties in hersenparenchym of medicijnperfusie op het corticale oppervlak, volgt onze op cisternale magna-injectie gebaseerde medicijnafgifte de natuurlijke stroom van CSF, waarbij fysiologische omstandigheden nauwkeurig worden nagebootst. Ten slotte, aangezien onze methode de integriteit van de schedel en hersenvliezen behoudt, kunnen we metingen uitvoeren op dezelfde groep muizen op verschillende tijdstippen, waardoor longitudinale vergelijkingen mogelijk zijn - iets dat niet haalbaar is met andere methoden voor het toedienen van geneesmiddelen. Voor overlevingsstudies en longitudinale vergelijkingen moeten strikte aseptische technieken worden gevolgd, waaronder een goede voorbereiding van de huid, het gebruik van steriele instrumenten en materialen en naleving van de institutionele richtlijnen voor dierenverzorging. Voor wondgenezing moet rekening worden gehouden met een herstelperiode van twee weken.

De methode van anesthesie kan een aanzienlijke invloed hebben op de CBF. Ketamine-xylazine-anesthesie kan CBF bijvoorbeeld met meer dan 50% boven de basiswaarden verhogen, terwijl isofluraan het basale CBF-niveau kan verdubbelen. In onze experimenten hebben we gekozen voor urethaan en chloralose vanwege hun minimale effecten op het cardiovasculaire systeem, dat helpt bij het handhaven van fysiologische niveaus van CBF, zoals vaak gebruikt in het veld26,27. Bovendien hebben we intra-arteriële canulatie overgeslagen omdat herhaalde bloedgasmeting niet-invasief is, hoewel dergelijke procedures kunnen worden gecombineerd met onze methode26.

Onze aanpak integreert twee systemen: het op nano-injectie gebaseerde ICM-injectiesysteem28 en het laserspikkelcontrastbeeldvormingssysteem (LSCI)29. Onderzoekers moeten in beide systemen worden getraind om de procedure met succes uit te voeren. Aangezien het LSCI-systeem alle ruimte boven het hoofd van de muis in beslag neemt, vergemakkelijkt het kantelen van de arm met 45o niet alleen de ICM-injectie, maar zorgt het ook voor compatibiliteit tussen de twee systemen. Deze opzet is cruciaal voor het succes van het experiment.

Voor beginners die de nano-injector-geleide ICM-injectie gebruiken, is uitgebreide oefening vereist om de coördinatie van het scheiden van de spieren met een pincet in de ene hand onder de knie te krijgen tijdens het manoeuvreren van de micromanipulator om de glazen pipet met de andere te geleiden. Een goed laserlicht en een stereomicroscoop met scharnierende arm zijn essentieel voor een optimale visualisatie tijdens de procedure.

Met behulp van deze methode hebben we beoordeeld hoe klassieke vaatverwijders zoals DHPG, acetylcholine en adenosine CBF beïnvloeden. Zoals verwacht verhoogden alle drie de vaatverwijders de CBF; Ze veroorzaakten echter verschillende dynamieken. DHPG veroorzaakte een sterke toename van CBF, gevolgd door een langzaam verval, terwijl acetylcholine een geleidelijke toename opriep. Daarentegen veroorzaakte adenosine slechts een voorbijgaande stijging van CBF.

Deze methode zou ook van toepassing moeten zijn op rattenmodellen. Aangezien de dikte van de rattenschedel echter ongeveer 0,5-1 mm is, moet deze worden verdund voor beeldvorming met laserspikkelcontrast. Bovendien, hoewel de huidige methode kan worden aangepast voor wakkere muizen die met het hoofd zijn gefixeerd, vereist het uitgebreide training om de beweging van de dieren tijdens experimenten te minimaliseren. We hebben een beperkt aantal muizen gebruikt om onze methode te demonstreren; Daarom is onze studie statistisch beperkt en moet voorzichtigheid worden betracht bij het trekken van brede conclusies uit onze bevindingen.

Voor consistente en betrouwbare CBF-metingen is het belangrijk dat onderzoekers erkennen dat andere fysiologische parameters, zoals lichaamstemperatuur, bloeddruk en CO2 -niveaus, een cruciale rol spelen bij uitgebreide fysiologische beoordeling en zorgvuldig moeten worden overwogen in toekomstige studies. Samenvattend presenteren we een nieuwe in vivo methode voor het bestuderen van CBF-regulatie bij muizen. Deze benadering is nauwkeurig en minimaal invasief, waardoor het zeer geschikt is voor het onderzoeken van door geneesmiddelen geïnduceerde CBF-dynamiek.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de NIH-subsidies (NS108763, NS127392, NS125788, NS125677).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(RS)-3,5-DihydroxyphenylglycineTocrisCat. No. 0342
Acetylcholine chlorideSigmaA6625-25G
AdenosineSigmaA9251-25G
Alcohol Swab 70% Isopropyl AlcoholVitrex Medical A/S520213
AmScope SM-8T Series Articulating Arm Zoom Stereo MicroscopeAmScopeSM-8TZ-144S-10M
Aquasonic Clear Ultrasound Transmission GelAquasonicGelPLI 03-50
Digital Mouse Stereotaxic InstrumentsStoelting51730D
Ethyl alcoholSigma459836-2L
Fiber-Lite DC950 IlluminatorDolan-Jenner industriesDC950H
Glass replacement 1.14 MMWorld Precision Instruments504949
Kimtech Science Precision Wipes Tissue WipersKimberly Clark Professional5511
Laser Speckle Contrast Imagermoor instrumentsMOORFLPI-2
Lasik Eye Spear (100 Per Case) hospeqBV40815
MICROFIL FLEXIBLE NEEDLEWorld Precision InstrumentsMF34G-5
Mineral oilSigmaM5904
Mouse heating padFisher scientific50-195-4000
Nair Cocoa Butter Hair Remover LotionAmazonASIN ‏ : ‎ B000GCW5CS
NANOLITER 2020 INJECTORWorld Precision InstrumentsNANOLITER2020
P-2000 micropipette pullerSutter InstrumentP-2000
Puritan® Swabs, Cotton Head, Wood Shaft,Puritan Medical806-WC
Sterile Ocular LubricantMedi-Vet11897
UrethaneSigmaU2500
Vetbond tissue glueWorld Precision InstrumentsVETBOND
α-ChloraloseSigma23120

Referenties

  1. Lassen, N. A., Ingvar, D. H., Skinhøj, E. Brain function and blood flow. Sci Am. 239 (4), 62-71 (1978).
  2. Leenders, K., et al. Cerebral blood flow, blood volume and oxygen utilization: normal values and effect of age. Brain. 113 (Pt 1), 27-47 (1990).
  3. Armstead, W. M. Cerebral blood flow autoregulation and dysautoregulation. Anesthesiolo Clin. 34 (3), 465-477 (2016).
  4. Claassen, J. A., Thijssen, D. H., Panerai, R. B., Faraci, F. M. Regulation of cerebral blood flow in humans: physiology and clinical implications of autoregulation. Physiol Rev. 101 (4), 1487-1559 (2021).
  5. Strandgaard, S., Paulson, O. Cerebral autoregulation. Stroke. 15 (3), 413-416 (1984).
  6. Iadecola, C. The neurovascular unit coming of age: a journey through neurovascular coupling in health and disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  7. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100 (1), 328-335 (2006).
  8. Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
  9. Zonta, M., et al. Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation. Nat Neurosci. 6 (1), 43-50 (2003).
  10. Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3811-3816 (2010).
  11. Grafton, S. T., et al. Functional anatomy of human procedural learning determined with regional cerebral blood flow and PET. J Neurosci. 12 (7), 2542-2548 (1992).
  12. Tillfors, M., et al. Cerebral blood flow in subjects with social phobia during stressful speaking tasks: a PET study. Am J Psychiatry. 158 (8), 1220-1226 (2001).
  13. Goense, J., Merkle, H., Logothetis, N. K. High-resolution fMRI reveals laminar differences in neurovascular coupling between positive and negative BOLD responses. Neuron. 76 (3), 629-639 (2012).
  14. Wang, J., et al. Perfusion functional MRI reveals cerebral blood flow pattern under psychological stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (49), 17804-17809 (2005).
  15. Takano, T., et al. Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow. Nat Neurosci. 9 (2), 260-267 (2006).
  16. Holstein-Rønsbo, S., et al. Glymphatic influx and clearance are accelerated by neurovascular coupling. Nat Neurosci. 26 (6), 1042-1053 (2023).
  17. Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
  18. Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
  19. Cai, C., et al. Stimulation-induced increases in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (25), E5796-E5804 (2018).
  20. Xavier, A. L., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. (135), e57378(2018).
  21. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e939(2008).
  22. Liu, X., et al. Epoxyeicosatrienoic acid-dependent cerebral vasodilation evoked by metabotropic glutamate receptor activation in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (2), H373-H381 (2011).
  23. Yamada, M., et al. Cholinergic dilation of cerebral blood vessels is abolished in M5 muscarinic acetylcholine receptor knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 14096-14101 (2001).
  24. O'Regan, M. Adenosine and the regulation of cerebral blood flow. Neurol Res. 27 (2), 175-181 (2005).
  25. Morii, S., Ngai, A., Ko, K. R., Winn, H. R. Role of adenosine in regulation of cerebral blood flow: effects of theophylline during normoxia and hypoxia. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H165-H175 (1987).
  26. Park, L., et al. Aβ-induced vascular oxidative stress and attenuation of functional hyperemia in mouse somatosensory cortex. J Cereb Blood Flow Metab. 24 (3), 334-342 (2004).
  27. Park, L., et al. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species mediate the cerebrovascular dysfunction induced by the amyloid β peptide. J. Neurosci. 25 (7), 1769-1777 (2005).
  28. Herz, J., et al. GABAergic neuronal IL-4R mediates T cell effect on memory. Neuron. 109 (22), 3609-3618.e9 (2021).
  29. Sun, Y. -Y., et al. Prophylactic edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Injectie in de cisterna magnalaser speckle-imagingneurovasculaire koppelingmicrogliële regulatieinjectie van vaatverwijdersin vivo assaystereotactische chirurgiebeeldvorming van het knagerbreinintracisternale injectie
Gepaarde Cisterna Magna-nano-injectie en laserspikkelcontrastbeeldvormingstest om cerebrale bloedstroomregulatie in vivo te bestuderen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.