Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een niet-virale benadering om voorbijgaande chimere antigeenreceptor-T-cellen te genereren met behulp van mRNA voor immunotherapie bij kanker

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67548

⸱

21 februari 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1ProMab Biotechnologies

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol schetst een gedetailleerde procedure voor het genereren van voorbijgaande chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen met behulp van niet-integrerend mRNA voor kankerimmunotherapie en biedt betrouwbare methoden voor het evalueren van CAR-T-cellen en hun cytotoxische functie.

Samenvatting

Chimere antigeenreceptor (CAR) T-celtherapie is naar voren gekomen als een baanbrekende kankerbehandeling, met ongekend succes bij de behandeling van bepaalde hematologische maligniteiten zoals lymfomen en leukemieën. Naarmate echter meer kankerpatiënten CAR-T-celtherapieën krijgen, worden behandelingsgerelateerde secundaire primaire maligniteiten steeds vaker gemeld, deels als gevolg van onverwachte insertie van CAR-transgenen, wat ernstige veiligheidsproblemen met zich meebrengt. Om dit probleem aan te pakken, beschrijven we hier een niet-virale, niet-integrerende benadering om voorbijgaande CAR-T-cellen te genereren met behulp van mRNA. We elektropoleerden T-cellen met gemodificeerd mRNA dat codeert voor een humane epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2)-specifieke CAR en genereerden voorbijgaande HER2-gerichte CAR-T-cellen. De CAR werd 1 dag na elektroporatie efficiënt tot expressie gebracht op het oppervlak van de T-cel, nam toe op dag 2 en nam dramatisch af op dag 5. De voorbijgaande CAR-T-cellen vertoonden krachtige cytotoxiciteit tegen HER2-positieve SKOV-3 eierstokkankercellen en scheidden hoge niveaus van IFN-Υ uit. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het ontwikkelen van kleinschalige voorbijgaande CAR-T-cellen zonder permanente CAR-transgenintegratie, waarin gedetailleerde procedures worden beschreven voor de bereiding van CAR-mRNA, activering en transfectie van T-cellen, beoordeling van CAR-expressie en in-vitro-analyse van de CAR-T-celfunctie. Deze methode is geschikt voor voorbijgaande CAR-T-celgeneratie in zowel preklinische als klinische studies.

Inleiding

Kanker vormt een steeds belangrijkere bedreiging voor de menselijke gezondheid, met jaarlijks naar schatting 23,6 miljoen nieuw gediagnosticeerde gevallen en 10 miljoen sterfgevallenwereldwijd1. Chirurgische behandeling in combinatie met bestraling en chemotherapie blijft de gouden zorgstandaard voor verschillende soorten gelokaliseerde niet-invasieve en invasieve kankers 2,3,4. Hoewel de traditionele systematische behandeling enorm veel succes heeft geboekt bij de behandeling van kanker in een vroeg stadium, is het zeer giftig en heeft het een beperkt effect op uitgezaaide en hematologische kankers5. Patiënten met deze vormen van kanker ondergaan frequente behandelingen en ondergaan aanzienlijke toxiciteit in de hoop de ziekteprogressie te stabiliseren en te vertragen. Chimere antigeenreceptor (CAR) T-celtherapie is onlangs naar voren gekomen als een revolutionaire gerichte therapie die een krachtige werkzaamheid aantoont voor B-cel hematologische kankers en hoop biedt aan deze wanhopige patiënten6.

CAR-T-cellen zijn gemanipuleerde T-lymfocyten die een CAR op het celoppervlak tot expressie brengen die specifiek tumor-geassocieerde antigenen (TAA's) herkent en de cellen activeert zonder antigene presentatie van belangrijke histocompatibiliteitscomplexe eiwitten (MHC's)7. Bij activering scheiden de CAR-T-cellen een panel van cytokines en lyseertumorcellen af, onafhankelijk van MHC's, waardoor de vernietiging van tumoren wordt versterkt, zelfs wanneer MHC's worden gedownreguleerd of verloren gaan als gevolg van de immunosuppressieve tumormicro-omgeving 8,9. CAR's bestaan uit ten minste drie verschillende domeinen: een extracellulaire single-chain fragmentvariant (scFv) die de antigeen-herkennende variabele gebieden van een TAA-specifiek antilichaam bevat, een transmembraandomein dat de CAR aan het celoppervlak verankert, en een intracellulair domein dat de rekrutering van adaptereiwitten en stroomafwaartse signalering bemiddelt10. Op basis van variaties in de intracellulaire domeinen zijn de CAR-structuren tot nu toe gedurende vijf generaties geëvolueerd, waarbij de eerste generatie alleen het CD3ζ-activeringsdomein bevat en de volgende generaties een of meer extra costimulatoire domeinen bezitten van moleculen zoals 4-1BB en CD2811. Deze intracellulaire domeinen beïnvloeden de CAR-T-celsignaleringsmechanismen, proliferatie, overleving en toxiciteit, die samen de klinische antitumorwerkzaamheid bepalen. Het klinische succes van CAR-T-celtherapie is te danken aan CAR-T-cellen van de tweede generatie die zich specifiek richten op CD19, een biomarker die sterk tot expressie komt op cellen van de B-lijn, voor de behandeling van B-celleukemieën en lymfomen12,13. Tot op heden heeft de Food and Drug Administration (FDA) zes CAR-T-celtherapieën van de tweede generatie goedgekeurd die gericht zijn op CD-19 of het B-celrijpingsantigeen (BCMA) voor recidiverende of refractaire hematologische maligniteiten, waaronder grootcellig B-cellymfoom, mantelcellymfoom en multipel myeloom 6. De nieuwere generaties CAR-T-cellen ondergaan momenteel intensieve preklinische en klinische studies14,15.

Klinische productie van CAR-T-cellen is een complex, duur en tijdrovend proces. Momenteel zijn de leukocyten die worden gebruikt voor de bereiding van CAR-T-cellen afkomstig van de patiënten zelf om allogene reacties te voorkomen, hoewel van donoren afkomstige universele (of kant-en-klare) CAR-T-cellen actief worden ontwikkeld en klinisch worden geëvalueerd16. Na isolatie van de leukocyten uit het perifere bloed van de patiënt door leukaferese, wordt een vreemd genfragment dat codeert voor de CAR in de geactiveerde T-cellen ingebracht met behulp van virale of niet-virale benaderingen 17,18,19. Retrovirussen en lentivirussen zijn de meest voorkomende virale vectoren voor de afgifte van CAR-genen, wat resulteert in willekeurige en permanente integratie van het CAR-coderende DNA in het T-celgenoom20. Niet-virale benaderingen, waaronder mRNA-lipide nanodeeltjes, transposonsystemen en CRISPR/Cas9-genoombewerking, komen minder vaak voor21. Vervolgens worden de T-cellen die CAR tot expressie brengen ex vivo op grote schaal geëxpandeerd en vervolgens verzameld en opnieuw toegediend aan de patiënten22,23. Het vervaardigen van virale vectoren die voldoen aan de strenge Good Manufacturing Practice (GMP)-normen is zeer moeilijk, complex en kostbaar en legt een aanzienlijke last op fabrikanten, regelgevende instanties en patiënten, waardoor de wijdverbreide klinische toepassing ervan wordt beperkt.

Ondanks het opwindende succes van CAR-T-therapie, is er een groeiende bezorgdheid over de veiligheid ervan. Gezien de willekeurige aard van de integratie van CAR-transgen in het T-celgenoom tijdens virale of transposontransductie, kan verstoring van tumorsuppressorgenen of activering van oncogenen optreden, wat leidt tot kwaadaardige transformatie van de T-cellen24,25. Sinds de goedkeuring door de FDA van het eerste CAR-T-celtherapieproduct in 2017, tonen vervolgonderzoeken aan dat maar liefst 15% van de patiënten die de therapie krijgen, secundaire primaire maligniteiten (SPM's) ontwikkelen, zoals T-cellymfoom (TCL), niet-kleincellige longkanker (NSCLC) en huidkanker 26,27,28,29. Opvallend is dat CAR-transgenen sterk werden gedetecteerd in sommige SPM's30,31, en sommige gevallen van TCL werden direct veroorzaakt door abnormale expansie van de CAR-T-cellen 24,32,33, wat wijst op een directe rol van de CAR-T-producten bij het induceren van sommige SPM's. Andere studies identificeerden verder CAR-transgeninserties in kritieke genen zoals TET234, JAK135 en PBX236 in de SPM-tumorcellen. In het licht van het toenemende bewijs van T-celmaligniteiten na CAR-T-celtherapie, heeft de FDA onlangs geconcludeerd dat een omkaderde waarschuwing die een ernstig risico op T-celmaligniteit benadrukt, vereist is voor alle momenteel goedgekeurde CD19-gerichte en BCMA-gerichte CAR-T-celtherapieën37. Studies met grote cohorten die de langetermijneffecten van CAR-T-behandeling volgen, rapporteren echter een incidentie van SPM's variërend van 3,8% tot 15% bij behandelde patiënten 26,27,28,38,39. De incidentie is niet significant hoger dan die waargenomen bij bloedkankerpatiënten die een traditionele systematische behandeling krijgen40,41, wat wijst op een relatief veilig profiel voor CAR-T-celtherapie. Desalniettemin is er een dringende behoefte aan de ontwikkeling van veilige en effectieve CAR-T-cellen die het risico op SPM's minimaliseren door middel van meer kosteneffectieve benaderingen.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een niet-virale, niet-integrerende benadering om CAR-T-cellen te genereren. Het doel is om een eenvoudige, stapsgewijze handleiding te bieden voor het genereren van kleinschalige, effectieve CAR-T-cellen met voorbijgaande CAR-expressie, waardoor insertiemutagenese wordt voorkomen en het risico op SPM's wordt geminimaliseerd. We tonen aan dat de elektroporatie van T-cellen met gemodificeerd mRNA dat codeert voor een CAR die specifiek is voor de TAA HER2 resulteerde in robuuste en voorbijgaande expressie van de anti-HER2 CAR op het T-celoppervlak. Tijdens het tot expressie brengen van de CAR doodden de T-cellen krachtig HER2-positieve tumorcellen en scheidden ze een hoog niveau van IFN-Υ uit. Het protocol wordt beschreven in vier afzonderlijke maar continue secties, waaronder de voorbereiding van CAR-mRNA, activering en elektroporatie van de T-cel, beoordeling van CAR-expressie en analyse van de CAR-T-celfunctie. Deze aanpak is geschikt voor het ontwikkelen en produceren van voorbijgaande CAR-T-cellen voor zowel academisch onderzoek als klinische celtherapieën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De PBMC's die hier worden gebruikt, werden eerder geïsoleerd uit volbloed van het Stanford Hospital Blood Center volgens het door de Institutional Review Board (IRB) goedgekeurde protocol (13942) met behulp van de Ficoll-Paque-dichtheidsgradiënt die eerder is beschreven42. De geïnformeerde toestemming van de deelnemers was niet van toepassing, aangezien het bloed dat we gebruikten om de PBMC's af te nemen, commercieel werd verkregen van het Stanford Hospital Blood Center.

1. Bereiding van CAR-mRNA

  1. Sjabloon voorbereiding
    OPMERKING: Een gelineariseerd plasmide of een PCR-fragment kan dienen als sjabloon om CAR-mRNA in vitro te synthetiseren, op voorwaarde dat ze een geschikte 5' SP6- of T7-promotor, een 5' onvertaalde regio (UTR), een CAR-transgen en een 3'UTR met een geschikte poly(A) staart bevatten. In deze studie gebruikten we een CAR-plasmide DNA-construct met een SP6-promotor, een korte menselijke bèta-globine 5'UTR, een CAR-transgen en een 3'UTR bestaande uit twee tandem bèta-globine 3'UTR's gevolgd door een 112-bp poly(A) staart43. De UTR's, de coderende sequentie en de poly(A)-staart hebben allemaal invloed op de RNA-stabiliteit en translationele efficiëntie 43,44,45. Het is aangetoond dat een poly(A)-staart van 120 bp de eiwitopbrengst in celcultuur verhoogt in vergelijking met kortere poly(A)-staarten43.
    1. Bereid CAR voor om plasmide-DNA te construeren met behulp van een plasmidevoorbereidingskit volgens de instructies van de fabrikant. Hoogwaardig plasmide-DNA is essentieel voor het genereren van een hoge opbrengst aan CAR-mRNA.
    2. Lineariseer het CAR-plasmide-DNA met het restrictie-enzym BglII. Kies een restrictie-enzym dat na de poly(A)-staart snijdt, bij voorkeur dicht bij het einde van de poly(A)-staart. Verteer 10 μg (of 10.000 ng) van het plasmide, gekwantificeerd door een spectrofotometer, in een reactiemengsel van 100 μl dat 10 E van het enzym, 10 μl digestiebuffer en nucleasevrij water bevat, 's nachts bij 37 °C.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het restrictie-enzym niet snijdt in het CAR-transgen en zijn flankerende promotor-, UTR- en poly(A)-staartsequenties. Volledige linearisatie van het CAR-plasmide is noodzakelijk voor efficiënte CAR-mRNA-transcriptie.
    3. Voeg 200 μg/ml protease K en 0,5% g/v SDS toe aan het digestiemengsel en incubeer gedurende 1 uur bij 50 °C.
    4. Zuiver het gelineariseerde CAR-plasmide-DNA. Voeg een gelijk volume fenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1, v/v) toe aan de verteringsreactie. Draai krachtig gedurende ongeveer 15 s. Draai het monster in een tafelcentrifuge gedurende 5 minuten op maximale snelheid bij kamertemperatuur (RT).
    5. Breng de bovenste waterige laag, die het DNA bevat, over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Vermijd overdracht van een van de middelste en onderste lagen, die eiwit- en fenolonzuiverheden bevatten. Voer een tweede extractieronde uit met chloroform om onzuiverheden te verminderen.
    6. Voeg 1/10e volume 7,5 M ammoniumacetaat of 3 M natriumacetaat toe en meng voorzichtig. Voeg 2,5 hoeveelheden ethanol toe om het DNA neer te slaan. Bewaar het monster minimaal 30 minuten bij -20 °C.
    7. Draai het monster gedurende 15 minuten bij 4 °C op maximale snelheid om het DNA te pelleteren. Verwijder het bovenstaande voorzichtig. Voeg 500 μL 70% ethanol toe om de DNA-pellet te wassen.
    8. Draai het monster opnieuw 2 minuten bij 4 °C. Verwijder voorzichtig het supernatant. Laat een kleine hoeveelheid oplossing in de tube zitten.
    9. Herhaal de centrifuge gedurende 2 minuten bij 4°C. Verwijder voorzichtig het resterende bovenbeen. Laat de DNA-pellet bij RT ongeveer 10 minuten aan de lucht drogen in een steriel kapje totdat er geen ethanoloplossing meer zichtbaar is op de bodem van de buis.
      OPMERKING: Vermijd overdroging van de DNA-pellet, omdat deze moeilijk op te lossen kan zijn.
    10. Voeg 20 μL nucleasevrij water toe en piponeer voorzichtig op en neer om het DNA op te lossen. Centrifugeer het monster kort op maximale snelheid. Meet de DNA-concentratie met een spectrofotometer.
    11. Bewaar het monster op ijs voor onmiddellijk gebruik of bij -20 °C voor toekomstig gebruik. Laad 100 ng van het gezuiverde DNA op een agarosegel en controleer de grootte en integriteit. Het DNA moet eruitzien als een enkele, afzonderlijke band van de verwachte grootte. Er mogen geen extra of besmeurde banden worden waargenomen.
      OPMERKING: De kwaliteit van het sjabloon-DNA is van cruciaal belang voor efficiënte mRNA-transcriptie. Vermijd het gebruik van onzuiver, gefragmenteerd en gedegradeerd DNA als sjabloon voor mRNA-transcriptie.
  2. In vitro transcriptie (IVT)
    1. Synthese van het CAR-mRNA in vitro. Zorg ervoor dat u tijdens de procedures nucleasevrije reagentia, buisjes en pipetpunten gebruikt.
    2. Ontdooi de reagentia vermeld in tabel 1 tot RT, met uitzondering van het SP6 RNA-polymerasemengsel, dat tot gebruik bij -20 °C moet worden bewaard. Bereid de transcriptiereactie voor in de volgorde die is aangegeven in tabel 1 bij RT. Meng voorzichtig en incubeer gedurende ten minste 2 uur bij 37 °C.
      OPMERKING: De reactie kan worden opgeschaald of verkleind op basis van de benodigde hoeveelheid mRNA. De hierboven getoonde reactie levert doorgaans ten minste 100 μg (of 100.000 ng) afgetopt mRNA op bij gebruik van hoogwaardig sjabloon-DNA. Langere incubatie, d.w.z. 's nachts, kan de mRNA-opbrengst verhogen.
    3. Voeg 2 μL RNase-vrij DNase I toe aan de reactie, meng voorzichtig en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C om het sjabloon-DNA af te breken.
    4. Zuiver het getranscribeerde CAR-mRNA met behulp van een RNA-opruimkit (zie materiaaltabel). Volg de instructies van de fabrikant van de kit voor de zuivering. Elueer het mRNA in nucleasevrij water.
      OPMERKING: Het mRNA kan ook worden gezuiverd met behulp van de hierboven getoonde fenol-chloroform-extractiemethode (stap 1.1.4).
    5. Meet de mRNA-concentratie met een spectrofotometer. Laad ten minste 200 ng van het mRNA op een agarosegel en controleer de grootte en integriteit ervan. Het mRNA moet verschijnen als een dominante band van de verwachte grootte, zonder extra of uitgesmeerde banden. Bewaar het mRNA bij -80 °C tot gebruik.

2. Activering en elektroporatie van T-cel

  1. suspendeer 1 x 106 gecryopreserveerde menselijke perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) in 1 ml CAR-T-medium (AIM-V-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), penicilline/streptomycine en 10 ng/ml humaan recombinant IL-2). Activeer de T-cellen met een gelijk aantal voorgewassen Human T-Activator CD3/CD28-kralen (zie materiaaltabel). Kweek en laat de cellen gedurende enkele dagen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 groeien.
    OPMERKING: Het aantal PBMC's kan worden opgeschaald of verlaagd op basis van de hoeveelheid T-cellen die nodig zijn voor volgende experimenten.
  2. Dooi bereidde CAR-mRNA op ijs. Voeg 1 ml CAR-T-medium per putje toe aan twee putjes van een plaat met 12 putjes en breng het medium in evenwicht door de plaat bij 37 °C in de incubator te plaatsen.
  3. Breng 5 x 106 T-cellen over in een steriele buis en verwijder de parels door de buis op een magnetische standaard te plaatsen en de celsuspensie voorzichtig in een nieuwe buis te pipetteren.
  4. Centrifugeer de buis bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de celpellet opnieuw in 1 ml steriel PBS.
  5. Centrifugeer de buis opnieuw. Gooi het bovenstaande weg en resustribueer de cellen in 200 μl neonbuffer T (zie materiaaltabel).
  6. Pipetter 100 μL cellen in een nieuw buisje en voeg 5 μg (of 5.000 ng) CAR-mRNA toe aan de cellen46. Vul Neonbuffer T aan tot een totaal van 125 μL en meng door op en neer te pipetteren.
    OPMERKING: De hoeveelheid CAR-mRNA die door elektroporatie moet worden getransfecteerd, kan worden verhoogd tot 8 μg (of 8.000 ng) per 1 x 106 T-cellen zonder de levensvatbaarheid van de cellen negatief te beïnvloeden, en een grotere hoeveelheid mRNA kan leiden tot verhoogde CAR-expressie46.
  7. Voeg 25 μL Neonbuffer T toe aan de resterende 100 μL cellen. Dit dient als de negatieve controle.
  8. Elektroporeren van de T-cellen. Gebruik de Neon-pipet om het T-cellen/CAR-mRNA-mengsel of de negatieve controle-T-cellen op te zuigen tot een Neon-tip van 100 μL en elektropoleer de cellen met een puls van 10 ms van 1800 V.
  9. Breng de cellen na de elektroporatie onmiddellijk over naar het geëquilibreerde kweekmedium in de plaat met 12 putjes (bereid in stap 2.2).
  10. Plaats de plaat terug in de broedmachine en breid de cellen uit tot ze klaar zijn voor gebruik. Om een gezonde en snelle groei van de CAR T-cellen te garanderen, moet u de celdichtheid tussen 1-3 x 106 cellen/ml met vers medium handhaven totdat het nodig is.

3. Beoordeling van de expressie van de Centraal-Afrikaanse Republiek

  1. Meng de CAR T-cellen door meerdere keren voorzichtig op en neer te pipetteren in elk putje en breng ten minste 1 x 105 cellen over in een FACS-buis van 5 ml.
  2. Voeg 3 ml koudewasbuffer (PBS met 2 mM EDTA en 0,5% w/v BSA) toe aan de tube. Centrifugeer de buis op 500 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder het bovenstaande voorzichtig.
  3. Resuspendeer de celpellet in 100 μL wasbuffer. Voeg 2 μl van het CAR-detectiereagens allophycocyanine (APC)-geconjugeerd geitenanti-humaan IgG F(ab')2-antilichaam (zie materiaaltabel) en 2 μl van een levensvatbaarheidskleurstof 7-AAD toe aan de gesuspendeerde cellen.
    OPMERKING: De CAR kan ook worden gedetecteerd met behulp van een op de juiste manier gelabeld doelantigeen of een anti-tag-antilichaam als de CAR een tag (d.w.z. FLAG) bevat. Als een niet-gelabeld antilichaam wordt gebruikt voor CAR-detectie, is incubatie met een geschikt fluorescentie-gelabeld secundair antilichaam vereist na stap 3.4.
  4. Meng het monster door de buis voorzichtig te schudden en broed gedurende 30 minuten op ijs. Vermijd licht tijdens de incubatie. Was de cellen met 3 ml koude wasbuffer en centrifugeer de buis op 500 x g gedurende 5 minuten op RT.
  5. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen opnieuw in 100 μl wasbuffer. Analyseer de cellen onmiddellijk met behulp van een flowcytometer. Zorg ervoor dat het fluorescerende etiket van het detectiereagens en de kleurstof voor de levensvatbaarheid naar behoren worden gecompenseerd met behulp van de juiste positieve en negatieve controles.
  6. Evalueer de CAR-expressie met behulp van de volgende poortstrategie: Gate op de cellen met behulp van de FSC-A versus SSC-A-plot; Poort op de afzonderlijke cellen met behulp van de FSC-A versus FSC-H-plot; Poort op de levende cellen met behulp van de 7-AAD-kleuring.
  7. Bereken het percentage levende T-cellen dat is gekleurd door het anti-menselijke IgG F(ab')2-antilichaam. Vergelijk de CAR-T-cellen met de negatieve controle-T-cellen, die minimale kleuring moeten hebben.

4. Analyse van de CAR-T-celfunctie

  1. Cytotoxiciteit analyse
    1. Zorg ervoor dat de doeltumorcellen het antigeen tot expressie brengen in een conformatie die door de CAR kan worden herkend. Om de antigeenexpressie te bevestigen, analyseert u de tumorcellen door middel van flowcytometrie met behulp van het ouderantilichaam waarvan de CAR is afgeleid. Als de CAR de tumorcellen niet kan herkennen, zullen de CAR-T-cellen er niet in slagen de tumorcellen te doden.
    2. Bereid doeltumorcellen voor die het antigeen van de CAR tot expressie brengen op het celoppervlak. Trypsiniseer de aanhangende tumorcellen met 0,05% trypsine-EDTA-oplossing gedurende 1 minuut bij 37 °C en bereid eencellige suspensie met geschikt kweekmedium bij 1-4 x 105 cellen/ml.
      OPMERKING: De tumorcellen moeten goed hechten om een nauwkeurige analyse in de volgende stappen te garanderen. Als de tumorcellen slecht hechten, gemakkelijk loskomen of in suspensie groeien, bedek dan de putjes van de plaat die in de volgende stap wordt gebruikt met een geschikt antilichaam, polykationisch polymeer of biologisch materiaal zoals fibronectine of collageen om de celhechting te vergemakkelijken.
    3. Bereid een E-plaat voor (zie materiaaltabel). Ontwerp de experimentele opstelling. Voeg 50 μL voorverwarmd tumorcelkweekmedium toe aan elk putje en plaats de E-plaat in het Real-Time Cell Analysis (RTCA)-instrument om de achtergrondimpedantie te meten. Meet de impedantie bij 1 min per meting (of sweep) gedurende 3 sweeps.
      OPMERKING: De achtergrondimpedantie wordt gebruikt om de celindex op nul in te stellen. Zonder achtergrondimpedantiemeting kunnen de putten niet met elkaar worden vergeleken, waardoor de resultaten niet interpreteerbaar zijn.
    4. Verwijder de E-plaat van het RTCA-instrument en voeg 100 μL van de tumorcelsuspensie toe aan elk putje. Daarom bevat elk putje 1-4 x 104 cellen in een totaal volume van 150 μL.
      OPMERKING: Het aantal tumorcellen dat in elk putje moet worden gezaaid, moet voorafgaand aan het experiment worden bepaald. Bedek de E-plaat met een reeks celnummers en controleer vervolgens de celindexen gedurende de volgende 24-48 uur. Het gewenste aantal cellen zorgt voor een gestage toename van de celindex gedurende ten minste 24 uur zonder plateau. Overmatige celuitzaaiing kan de uitputting van voedingsstoffen en de gemiddelde verzuring versnellen, wat resulteert in een vroege afvlakking van de celindex. Bovendien moeten voor elke groep replicate-putten worden opgenomen om mogelijke uitbijtermetingen te identificeren.
    5. Breng de E-plaat gedurende 30 minuten in evenwicht op RT. Door deze stap kunnen de tumorcellen zich nestelen en zich hechten aan de bodem van de putjes.
      OPMERKING: Deze stap is nodig voor een nauwkeurige meting van de celindex. Het overslaan van deze stap veroorzaakt meestal well-to-well variabiliteit in celindexmetingen en ongelijke hechting van tumorcellen in de putjes, wat resulteert in verhoogde ruis in de test.
    6. Plaats de E-plaat terug op het RTCA-instrument en controleer de celindexen gedurende ongeveer 24 uur, waarbij elke 5-15 minuten wordt geveegd.
    7. Bereid de volgende dag de CAR-T-celsuspensie voor. Suspendeer de CAR-T-cellen (de effectorcellen) vanaf stap 2.10 in RPMI 1640-medium plus 10% FBS tot een concentratie die wordt bepaald door de tumorcel (de doelcel) en de gewenste effector:target (E:T) celverhouding. Als de tumorcelsuspensie bijvoorbeeld een dichtheid had van 2 x 105 cellen/ml en een E:T-verhouding van 10:1 gewenst is, dan moeten de CAR-T-cellen worden gesuspendeerd tot 2 x 106 cellen/ml. Neem de juiste controles op, zoals alleen tumorcellen (geen effectorcellen) en controle-T-cellen (T-cellen geëlektropoleerd zonder mRNA of met controle-mRNA).
      OPMERKING: Gebruik voor optimale resultaten de CAR-T-cellen 1-2 dagen na elektroporatie wanneer de CAR-expressie aan het oppervlak hoog is. Om de optimale E:T-verhouding te onderzoeken, kan een reeks E:T-verhoudingen (bijvoorbeeld 3:1 tot 20:1) worden getest. Tenzij de CAR-T-frequentie erg laag is, d.w.z. minder dan 10%, is een E:T-verhouding van 10:1 of 20:1 meestal voldoende om een bijna volledige doding van de tumorcellen te bereiken.
    8. Pauzeer de registratie van de celindex en verwijder de E-plaat van het RTCA-instrument.
    9. Kantel de plaat iets, verwijder 50 μL kweekmedium uit elk putje voorzichtig zonder de tumorcellen aan te raken, en voeg 100 μL van de CAR-T-cellen of controle-T-cellen toe aan elk putje.
    10. Plaats de E-plaat terug in het RTCA-instrument en hervat de celindexbewaking gedurende ten minste 24 uur, waarbij elke 5-15 minuten wordt geveegd.
      OPMERKING: De duur van de monitoring van de celindex hangt af van hoe snel de CAR-T-cellen zich op de tumorcellen richten. Een incubatietijd van 24 uur is meestal voldoende voor de CAR-T-cellen om een maximaal cytotoxisch effect uit te oefenen.
    11. Stop de monitoring van de celindex, verwijder de E-plaat van het RTCA-instrument en analyseer het cytotoxiciteitsresultaat. Bereken cytotoxiciteit als het percentage tumorcellen dat is gedood door de CAR-T-cellen. Bereken de gemiddelde cytotoxiciteit van de CAR-T-cellen en controleer T-cellen met behulp van de RTCA-software. Gebruik de formule om de cytotoxiciteit handmatig te berekenen
      cytotoxiciteit = ((celindex van tumorcellen) − (celindex van tumorcellen plus effectorcellen)) / (celindex van tumorcellen) × 100%.
  2. Analyse van cytokinesecretie
    1. Om de cytokinen zoals IFN-Υ te analyseren die door de CAR-T-cellen worden uitgescheiden tijdens de cytotoxiciteitsanalyse, brengt u het bovenstaande over van de E-plaat naar een ronde bodem of V-vormige plaat met 96 putjes.
      OPMERKING: Als een tijdsverloopanalyse van de cytokinesecretie gewenst is, pauzeert u de celindexbewaking bij stap 4.1.10, verzamelt u een klein deel van het bovenstaande uit elk putje, plaatst u de E-plaat terug in het RTCA-instrument en hervat u de bewaking.
    2. Centrifugeer de plaat met 96 putjes bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT. Breng de bovenstaande middelen voorzichtig over op een nieuwe plaat met 96 putjes zonder de celpellets te verstoren.
    3. Meet de cytokineniveaus in de supernatanten met behulp van commerciële enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA)-kits volgens de instructies van de fabrikant. De supernatanten moeten meestal worden verdund voordat ze worden gemeten, soms meer dan 100 keer, afhankelijk van de cytokines die worden geanalyseerd.
    4. Analyseer de gegevens door de extinctiewaarden van het monster te interpoleren tegen een standaardcurve die is gegenereerd op basis van serieel verdunde standaarden. Bereid grafieken voor met foutbalken die het gemiddelde ± de standaarddeviatie (SD) weergeven met behulp van de juiste software. Om het verschil tussen behandelingen te vergelijken, kan een Student's t-test worden uitgevoerd. Een p-waarde van minder dan 0,05 wordt meestal als statistisch significant beschouwd.
      OPMERKING: Gegevenspunten die duidelijke uitschieters zijn, waarschijnlijk als gevolg van experimentele fouten, moeten worden uitgesloten van de analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We hebben een HER2-gerichte CAR van de tweede generatie geconstrueerd met een scFv afgeleid van het gehumaniseerde anti-HER2 monoklonale antilichaam (mAb) van de muis 4D547, een transmembraangebied en een intracellulair 4-1BB costimulatoir domein gevolgd door het CD3ζ-activeringsdomein (Figuur 1A). De DNA-sequentie die codeert voor de CAR bevatte een 5' SP6-promotor om de transcriptie van het CAR-mRNA in vitro aan te sturen (...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie beschrijven we een gedetailleerde niet-virale, niet-integrerende benadering voor het genereren van voorbijgaande CAR-T-cellen en bieden we technische procedures voor het beoordelen van de CAR-T-celfunctie. Deze benadering vermijdt het gebruik van conventionele retrovirale en lentivirale vectoren voor permanente en willekeurige afgifte van CAR-transgenen, maar maakt gebruik van elektroporatie om efficiënt in vitro gemodificeerd CAR-mRNA in T-cellen te introduceren....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs Liang Hu, Robert Berahovich, Yanwei Huang, Shiming Zhang, Jinying Sun, Xianghong Liu, Hua Zhou, Shirley, Xu, Haoqi Li en Vita Golubovskaya zijn medewerkers van ProMab Biotechnologies. Lijun Wu is werknemer en aandeelhouder van ProMab Biotechnologies.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door ProMab Biotechnologies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
7-AAD viability dye Biolegend420404
ACEA Novocyte flow cytometerAgilentNovoCyte 3000
AIM-V mediumGibco12055083
APC goat anti-human IgG F(ab')2 antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories109-136-097
BglII Restriction EnzymeNew England BioLabs (NEB)R0144L
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNEBS1411S
DMEM, high glucoseGibco11965092
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 beadsGibco11131D
E-Plate 96Agilent5232376001
EthanolSigma459844-4L
FBSLonza.com14-503F
HiScribe SP6 RNA Synthesis KitNew England BioLabs (NEB)E2070S
Human IL-2 Recombinant ProteinGibco15140122
Millennium RNA MarkersInvitrogenAM7150
Monarch RNA Cleanup Kit (500 μg)NEBT2050L
N1-Methylpseudo-UTPTrilinkN-1081-10
Neon Transfection InstrumentInvitrogenMPK5000
Neon Transfection System 100-μL KitInvitrogenMPK10096
Penicillin-Streptomycin (10000 U/mL)Gibco14-503F
RPMI 1640 MediumGibco11875135
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300120
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)Invitrogen15593049
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) instrumentAgilentRTCA MP
ZymoPURE II Plasmid Midiprep KitZymo ResearchD4201

Referenties

  1. Ataeinia, B., et al. National and subnational incidence, mortality, and years of life lost due to breast cancer in iran: Trends and age-period-cohort analysis since 1990. Front Oncol. 11, 561376(2021).
  2. Jordan, R. M., Oxenberg, J. Breast cancer conservation therapy. , Statpearls. (2024).
  3. Tannock, I. F. Combined modality treatment with radiotherapy and chemotherapy. Radiother Oncol. 16 (2), 83-101 (1989).
  4. Mcree, A. J., Cowherd, S., Wang, A. Z., Goldberg, R. M. Chemoradiation therapy in the management of gastrointestinal malignancies. Future Oncol. 7 (3), 409-426 (2011).
  5. Palumbo, M. O., et al. Systemic cancer therapy: Achievements and challenges that lie ahead. Front Pharmacol. 4, 57(2013).
  6. Mitra, A., et al. From bench to bedside: The history and progress of car t cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
  7. Lim, W. A., June, C. H. The principles of engineering immune cells to treat cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
  8. Silveira, C. R. F., et al. Cytokines as an important player in the context of car-t cell therapy for cancer: Their role in tumor immunomodulation, manufacture, and clinical implications. Front Immunol. 13, 947648(2022).
  9. Labanieh, L., Majzner, R. G., Mackall, C. L. Programming car-t cells to kill cancer. Nat Biomed Eng. 2 (6), 377-391 (2018).
  10. Sadelain, M., Brentjens, R., Riviere, I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).
  11. Tokarew, N., Ogonek, J., Endres, S., Von Bergwelt-Baildon, M., Kobold, S. Teaching an old dog new tricks: Next-generation car t cells. Br J Cancer. 120 (1), 26-37 (2019).
  12. Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of b-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous t cells genetically engineered to recognize cd19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
  13. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous cd19-targeted t cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory b-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
  14. Tomasik, J., Jasinski, M., Basak, G. W. Next generations of car-t cells - new therapeutic opportunities in hematology. Front Immunol. 13, 1034707(2022).
  15. Asmamaw Dejenie, T., et al. Current updates on generations, approvals, and clinical trials of car t-cell therapy. Hum Vaccin Immunother. 18 (6), 2114254(2022).
  16. Sun, W., Jiang, Z., Jiang, W., Yang, R. Universal chimeric antigen receptor t cell therapy - the future of cell therapy: A review providing clinical evidence. Cancer Treat Res Commun. 33, 100638(2022).
  17. Wang, X., Riviere, I. Clinical manufacturing of car t cells: Foundation of a promising therapy. Mol Ther Oncolytics. 3, 16015(2016).
  18. Pinto, I. S., Cordeiro, R. A., Faneca, H. Polymer- and lipid-based gene delivery technology for car t cell therapy. J Control Release. 353, 196-215 (2023).
  19. Magnani, C. F., et al. Sleeping beauty-engineered car t cells achieve antileukemic activity without severe toxicities. J Clin Invest. 130 (11), 6021-6033 (2020).
  20. Irving, M., Lanitis, E., Migliorini, D., Ivics, Z., Guedan, S. Choosing the right tool for genetic engineering: Clinical lessons from chimeric antigen receptor-t cells. Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1044-1058 (2021).
  21. Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral car t cells. Front Immunol. 13, 867013(2022).
  22. Song, H. W., et al. Car-t cell expansion platforms yield distinct t cell differentiation states. Cytotherapy. 26 (7), 757-768 (2024).
  23. Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Res. 7, F1000 Faculty Rev-517 (2018).
  24. Micklethwaite, K. P., et al. Investigation of product-derived lymphoma following infusion of piggybac-modified cd19 chimeric antigen receptor t cells. Blood. 138 (16), 1391-1405 (2021).
  25. Ghilardi, G., et al. T cell lymphoma and secondary primary malignancy risk after commercial car t cell therapy. Nat Med. 30 (4), 984-989 (2024).
  26. Steffin, D. H. M., et al. Long-term follow-up for the development of subsequent malignancies in patients treated with genetically modified iecs. Blood. 140 (1), 16-24 (2022).
  27. Cappell, K. M., et al. Long-term follow-up of anti-cd19 chimeric antigen receptor t-cell therapy. J Clin Oncol. 38 (32), 3805-3815 (2020).
  28. Cordeiro, A., et al. Late events after treatment with cd19-targeted chimeric antigen receptor modified t cells. Biol Blood Marrow Transplant. 26 (1), 26-33 (2020).
  29. Zhao, A., et al. Secondary myeloid neoplasms after cd19 car t therapy in patients with refractory/relapsed b-cell lymphoma: Case series and review of literature. Front Immunol. 13, 1063986(2022).
  30. Verdun, N., Marks, P. Secondary cancers after chimeric antigen receptor t-cell therapy. N Engl J Med. 390 (7), 584-586 (2024).
  31. Ruella, M., et al. Induction of resistance to chimeric antigen receptor t cell therapy by transduction of a single leukemic b cell. Nat Med. 24 (10), 1499-1503 (2018).
  32. Bishop, D. C., et al. Development of car t-cell lymphoma in 2 of 10 patients effectively treated with piggybac-modified cd19 car t cells. Blood. 138 (16), 1504-1509 (2021).
  33. Shah, N. N., et al. Clonal expansion of car t cells harboring lentivector integration in the cbl gene following anti-cd22 car t-cell therapy. Blood Adv. 3 (15), 2317-2322 (2019).
  34. Fraietta, J. A., et al. Disruption of tet2 promotes the therapeutic efficacy of cd19-targeted t cells. Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).
  35. Heinrich, T., et al. Mature t-cell lymphomagenesis induced by retroviral insertional activation of janus kinase 1. Mol Ther. 21 (6), 1160-1168 (2013).
  36. Harrison, S. J., et al. Car+ t-cell lymphoma post ciltacabtagene autoleucel therapy for relapsed refractory multiple myeloma. Blood. 142 (Supplement 1), 6939-6939 (2023).
  37. FDA Administration. Fda requires boxed warning for t cell malignancies following treatment with bcma-directed or cd19-directed autologous chimeric antigen receptor (car) t cell immunotherapies. , (2024).
  38. Elsallab, M., et al. Second primary malignancies after commercial car t-cell therapy: Analysis of the fda adverse events reporting system. Blood. 143 (20), 2099-2105 (2024).
  39. Levine, B. L., et al. Unanswered questions following reports of secondary malignancies after car-t cell therapy. Nat Med. 30 (2), 338-341 (2024).
  40. Tward, J. D., Wendland, M. M., Shrieve, D. C., Szabo, A., Gaffney, D. K. The risk of secondary malignancies over 30 years after the treatment of non-hodgkin lymphoma. Cancer. 107 (1), 108-115 (2006).
  41. Kumar, V., et al. Trends in the risk of second primary malignancies among survivors of chronic lymphocytic leukemia. Blood Cancer J. 9 (10), 75(2019).
  42. Holtkamp, S., et al. Modification of antigen-encoding rna increases stability, translational efficacy, and t-cell stimulatory capacity of dendritic cells. Blood. 108 (13), 4009-4017 (2006).
  43. Dvir, S., et al. Deciphering the rules by which 5'-utr sequences affect protein expression in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (30), E2792-E2801 (2013).
  44. Van Der Velden, A. W., Voorma, H. O., Thomas, A. A. Vector design for optimal protein expression. Biotechniques. 31 (3), passim 572-580 (2001).
  45. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by ficoll-paque density gradient. Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2A), 1(2007).
  46. Zhao, Y., et al. High-efficiency transfection of primary human and mouse t lymphocytes using rna electroporation. Mol Ther. 13 (1), 151-159 (2006).
  47. Carter, P., et al. Humanization of an anti-p185her2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (10), 4285-4289 (1992).
  48. Hu, L., et al. Her2-cd3-fc bispecific antibody-encoding mrna delivered by lipid nanoparticles suppresses her2-positive tumor growth. Vaccines. 12 (7), 808(2024).
  49. Perales-Puchalt, A., et al. DNA-encoded bispecific t cell engagers and antibodies present long-term antitumor activity. JCI Insight. 4 (8), e126086(2019).
  50. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  51. Kozak, M. Features in the 5' non-coding sequences of rabbit alpha and beta-globin mrnas that affect translational efficiency. J Mol Biol. 235 (1), 95-110 (1994).
  52. Wu, Q., et al. Translation affects mrna stability in a codon-dependent manner in human cells. Elife. 8, e45396(2019).
  53. Henderson, J. M., et al. Cap 1 messenger rna synthesis with co-transcriptional cleancap((r)) analog by in vitro transcription. Curr Protoc. 1 (2), e39(2021).
  54. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mrna yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  55. Gehl, J. Electroporation: Theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177 (4), 437-447 (2003).
  56. Stacey, M., Fox, P., Buescher, S., Kolb, J. Nanosecond pulsed electric field induced cytoskeleton, nuclear membrane and telomere damage adversely impact cell survival. Bioelectrochemistry. 82 (2), 131-134 (2011).
  57. Meaking, W. S., Edgerton, J., Wharton, C. W., Meldrum, R. A. Electroporation-induced damage in mammalian cell DNA. Biochim Biophys Acta. 1264 (3), 357-362 (1995).
  58. Zhang, J., et al. Non-viral, specifically targeted car-t cells achieve high safety and efficacy in b-nhl. Nature. 609 (7926), 369-374 (2022).
  59. Von Auw, N., et al. Comparison of two lab-scale protocols for enhanced mrna-based car-t cell generation and functionality. Sci Rep. 13 (1), 18160(2023).
  60. Gauthier, J., Turtle, C. J. Insights into cytokine release syndrome and neurotoxicity after cd19-specific car-t cell therapy. Curr Res Transl Med. 66 (2), 50-52 (2018).
  61. Beatty, G. L., et al. Activity of mesothelin-specific chimeric antigen receptor t cells against pancreatic carcinoma metastases in a phase 1 trial. Gastroenterology. 155 (1), 29-32 (2018).
  62. Beatty, G. L., et al. Mesothelin-specific chimeric antigen receptor mrna-engineered t cells induce anti-tumor activity in solid malignancies. Cancer Immunol Res. 2 (2), 112-120 (2014).
  63. Tchou, J., et al. Safety and efficacy of intratumoral injections of chimeric antigen receptor (car) t cells in metastatic breast cancer. Cancer Immunol Res. 5 (12), 1152-1161 (2017).
  64. Wu, J., Wu, W., Zhou, B., Li, B. Chimeric antigen receptor therapy meets mrna technology. Trends Biotechnol. 42 (2), 228-240 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

CAR T-cellenniet-virale CAR-generatiemRNA-elektroporatietransiënte CAR-expressieHER2-gerichte therapieflowcytometriecytokinesecretietumorcytotoxiciteitin vitro transcriptiereal-time celanalyse
Een niet-virale benadering om voorbijgaande chimere antigeenreceptor-T-cellen te genereren met behulp van mRNA voor immunotherapie bij kanker
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.