LED-gebaseerde in-vitroscreening voor het beoordelen van fotoactiveerbare moleculen bij bacteriële fotodynamische inactivatie

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en economische methode voor het evalueren van de effectiviteit van potentiële fotosensibilisatoren bij antibacteriële fotodynamische inactivatie (aPDI), met behulp van een plaatformaat met 96 putjes in combinatie met een lichtbron van een LED-paneel. Deze benadering maakt het mogelijk om meerdere experimentele omstandigheden gelijktijdig te testen, waaronder verschillende concentraties, verbindingen en bacteriestammen.

Samenvatting

De opkomst van multiresistente infecties en het ontbreken van nieuwe antibioticaklassen hebben de belangstelling voor alternatieve therapieën zoals fotodynamische inactivatie van bacteriën (aPDI) hernieuwd. Dit proces omvat de toediening van een fotosensibilisator (PS) die wordt geactiveerd door een geschikte zichtbare lichtbron, waardoor verergerde niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) worden geproduceerd die cruciale cellulaire biomoleculen beschadigen en uiteindelijk bacteriële celdood veroorzaken. Het is van cruciaal belang om gestandaardiseerde, gebruiksvriendelijke en reproduceerbare eerste tests te creëren om de effectiviteit van door licht geïnduceerde fototoxiciteit van potentiële fotosensibilisatoren te beoordelen en te vergelijken. Deze studie introduceert een eenvoudige en efficiënte in vitro techniek voor het beoordelen van fotodynamische activiteit tegen planktonische bacteriële cellen. Door gebruik te maken van een microplaatformaat met 96 putjes in combinatie met een groot LED-paneel, vergemakkelijkt het systeem de systematische evaluatie van verschillende verbindingen. Een dergelijke configuratie maakt high-throughput screening van potentiële fotosensibilisatoren mogelijk in een gecontroleerde en consistente omgeving, waardoor het proces van het identificeren van veelbelovende kandidaten voor verdere ontwikkeling wordt vereenvoudigd. Dit flexibele platform dient als een belangrijke stap in de ontwikkeling van innovatieve fotodynamische therapieën voor de behandeling van antibioticaresistente infecties.

Inleiding

Fotodynamische therapie (PDT) is een minimaal invasieve therapeutische benadering die de afgelopen jaren veelbelovende resultaten heeft laten zien, met name bij dermatologische klinische behandeling¹. Een bijzonder interessant toepassingsgebied van deze therapeutische modaliteit is de behandeling van microbiële infecties, een proces dat bekend staat als antimicrobiële fotodynamische inactivatie (aPDI)². Hoewel aanvankelijk over het hoofd gezien, vooral vanwege de opmerkelijke efficiëntie van antibiotica, kreeg de door licht veroorzaakte uitroeiing van bacteriegroei de afgelopen jaren een hernieuwde belangstelling, gedreven door de opkomst van antimicrobiële multidrugresistentie (AMR) en de noodzaak om alternatieve en efficiënte strategieën te vinden om dit probleem voor de volksgezondheid aan te pakken ^3,4. Significante resultaten kunnen binnen enkele seconden of minuten worden bereikt, waarbij ruimtelijke en temporele precisie worden geboden door respectievelijk het interessegebied en de aan/uit-functie van de procedure specifiek te bestralen.

Het mechanisme achter het fotodynamische principe is gebaseerd op de combinatie van lichtgevoelige moleculen (fotosensibilisator), moleculaire zuurstof en een externe lichtbron. Hoewel deze drie componenten onschadelijk zijn, kunnen ze, wanneer ze worden gecombineerd, dodelijk worden voor de doelcellen als gevolg van de fotoactivering van de fotosensibilisator. Door licht getriggerde reacties resulteren in een massale generatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), die uiteindelijk ernstige en onomkeerbare schade veroorzaken in cruciale cellulaire componenten, wat leidt tot celdood ^5,6. Ook heeft de combinatie van aPDI met andere conventionele antimicrobiële behandelingen veelbelovende therapeutische resultaten opgeleverd, waaronder een hogere werkzaamheid van de behandeling, een kortere behandelingstijd en lagere medicijndoseringen⁷.

Bovendien maakt de lokale toediening van fotosensibilisatoren (PS) bij PDT een gerichte behandeling mogelijk met minimale schade aan de omliggende weefsels en lage systemische effecten, waardoor het een zeer gewaardeerde optie is voor de behandeling van oppervlakkige huidinfecties⁸. Het gemak van lokale behandeling en de oppervlakkige aard van veel huidinfecties en laesies maken het een aantrekkelijk doelwit voor PDT. Studies hebben de effectiviteit van aPDI ondersteund bij de behandeling van brandwondinfecties, chirurgische wondinfecties, zwerende laesies en andere oppervlakkige aandoeningen zoals acne en impetigo ^9,10,11.

Talrijke moleculen, zowel natuurlijke als synthetische, zijn getest en voorgesteld voor aPDI. Het gebruik van variërende en vaak niet-gespecificeerde parameters in experimentele protocollen maakt het echter een uitdaging om resultaten te vergelijken, wat de duidelijkheid van wetenschappelijke bevindingen aantast. Het ontwikkelen van eenvoudige en reproduceerbare tests kan de snelle screening van talrijke verbindingen vergemakkelijken, waardoor de identificatie van veelbelovende kandidaten wordt versneld. Eenvoudige, reproduceerbare en kosteneffectieve protocollen zijn vooral waardevol bij tests in een vroeg stadium, omdat ze het mogelijk maken om de resultaten van verschillende onderzoeksfaciliteiten te vergelijken. Efficiënte screeningprocessen maken het ook gemakkelijker om een breder scala aan moleculen te verkennen, wat mogelijk kan leiden tot de ontdekking en selectie van nieuwe fotosensibilisatoren voor verdere tests in meer geavanceerde, complexe en kostbare methodologieën.

Dit protocol schetst een eenvoudige methode voor het evalueren van de fototoxiciteit van potentiële fotosensibilisatoren op bacteriën met behulp van een LED-paneel met een lichtintensiteit van 25 mW/^cm2. Een representatieve bacteriestam, S. aureus, werd gebruikt en het witte lichtkanaal werd geselecteerd, dat volledige dekking van het zichtbare spectrum biedt. De procedure omvatte een pre-incubatieperiode van 30 minuten, gevolgd door een blootstelling van 15 minuten aan licht (22,5 J/^cm2). Hoewel de resultaten gebaseerd zijn op deze specifieke experimentele omstandigheden, kunnen ze worden aangepast volgens individuele protocollen. Het is essentieel om deze instellingen duidelijk te definiëren en op te nemen in de procedurele beschrijving.

Protocol

Een algemene beschrijving van het protocol wordt geïllustreerd in figuur 1. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Preparaat van de bacteriecultuur

1. Kweek S. aureus (ATCC 29213) bacteriën op Mueller-Hinton agar (MH) uit stamculturen. Incubeer de MH-platen gedurende 24 uur vóór de bepaling bij 37 °C om verse culturen te verkrijgen.
2. Inoculeer bacteriën: Verzamel 2-3 verse kolonies van de agarplaat en verdun in 6 ml voorverwarmde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4, steriel gefilterd.
3. Vortex (1200 tpm) het inoculum 3-4 keer om een goede homogenisatie van het monster te garanderen. Trek 3 ml op in een wegwerpcuvet.
4. Meet OD₆₀₀ en stel deze in op 0.1 (ongeveer 1 x 10⁸ CFU/ml) met behulp van PBS.
   OPMERKING: De exacte conversie van OD naar CFU kan variëren op basis van de stam van S. aureus. Men kan een standaard groeicurve vaststellen voor de specifieke stam en laboratoriumexperimentele omstandigheden waarmee wordt gewerkt.

2. Voorbereiding van de fotosensibilisator

1. Voorraadoplossing: Bereid een voorraadoplossing van de fotosensibilisator van belang (zie de sectie Resultaten voor details) in een geschikt oplosmiddel (bijv. DMSO of PBS; Figuur 2).
2. Werkende oplossing: Verdun de voorraadoplossing in PBS. Het gebruik van PBS in plaats van bacteriële kweekmedia zorgt ervoor dat de componenten van de media de lichtabsorptie tijdens aPDI-experimenten niet verstoren.
3. Vortex het monster om volledige homogenisatie te garanderen. Gebruik indien nodig een ultrasoonbad om volledige oplosbaarheid te garanderen en een heldere oplossing te verkrijgen (in dat geval zorgvuldig controleren. Voor hydrofobe verbindingen kan aanpassing van het oplosmiddelsysteem nodig zijn (bijv. het toevoegen van een % DMSO of ethanol). Zorg ervoor dat het effect van het oplosmiddel op de levensvatbaarheid van de cellen altijd wordt gecontroleerd.
   OPMERKING: De voorwaarden voor sonicatie zijn afhankelijk van het type verbinding, de concentratie en het oplosmiddel van het systeem; Kortere tijden (bijv. 5 min) kunnen voldoende zijn voor gemakkelijk oplosbare verbindingen, terwijl langere tijden (20-30 min) nodig kunnen zijn voor sterk hydrofobe verbindingen.

3. Plaat instellen

1. Bereid twee afzonderlijke platen met 96 putjes voor: een om licht te ondergaan en een andere om in het donker te houden (donkercontrole).
2. Meng in elk van de platen 100 μl van de fotosensibiliserende oplossing met 100 μl van de bacteriële suspensie. Pipette 5-10 keer op en neer.
3. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende een vooraf bepaald interval (in deze studie werd een periode van 30 minuten gebruikt) om de fotosensibilisator in staat te stellen te interageren met de bacteriële cellen.

4. Bestraling

1. Verwijder de platen uit de couveuse en stel een ervan bloot aan het licht dat door het LED-paneel wordt uitgestraald (het apparaat dat in dit experiment werd gebruikt, bestond uit een rechthoekige LED-projector met een vermogen van 50 W; IP65; ingangsspanning: AC 85-265 V), waarbij de andere wordt beschermd tegen blootstelling aan licht.
2. Plaats een van de platen boven het LED paneel. Om een nauwkeurige afstelling van de plaat te garanderen door middel van verschillende protocolherhalingen, markeert u de randen van de 96-wells plaat direct op het LED-oppervlak.
3. Stel de plaat bloot gedurende een geschikte bestralingstijd (in dit onderzoek werd een periode van 15 minuten gebruikt).
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de lichtdosis voldoende is om de fotosensibilisator te activeren zonder de cellulaire levensvatbaarheid in gevaar te brengen. Om die reden moet lichtregeling worden opgenomen (bacteriën die worden blootgesteld aan licht bij afwezigheid van fotosensibilisator).

5. Bemonstering na bestraling en agarplaat

1. Gebruik een andere plaat met 96 putjes om de seriële verdunningen van de monsters te bereiden (controleputjes, niet-bestraalde en bestraalde putjes).
2. Voeg 180 μL PBS/putje toe, afhankelijk van het aantal monsters. Om de lay-out goed te definiëren, moet u er rekening mee houden dat een rij van 6 putjes nodig is voor de seriële verdunning van één monster (10-voudige verdunning, van ^10-1 tot ^10-6).
3. 20 μl uit elke put (van de bestraalde en niet-bestraalde plaat met 96 putjes) tot de eerste kolom van de plaat die eerder met PBS is gevuld.
4. Voer met de meerkanaals micropipet een eenvoudige seriële verdunning uit van putje 1 tot 6 (^10-1 tot ^10-6). OPMERKING: Homogenisatie van het monster is op dit punt van cruciaal belang om een uniform en consistent mengsel te garanderen. Piketeer bij elke verdunningsstap 5-10 keer op en neer.
5. Verdeel de agarplaat in zes gelijke delen, waarbij elk deel overeenkomt met een van de verdunningen (zie figuur 3).
6. 10 μl uit elk putje op het overeenkomstige gedeelte op het oppervlak van de agarplaat (voeg voor elk monster ten minste 3 replicaten toe). Plaats aliquots niet te dicht bij elkaar. Transporteer de agarplaten voorzichtig naar de broedmachine en wacht 18-20 uur.
   OPMERKING: Houd er rekening mee dat de morfologie van CFU's aanzienlijk varieert, afhankelijk van de bacteriesoort. Terwijl S. aureus-kolonies bijvoorbeeld relatief gemakkelijk te tellen zijn, heeft P. aeruginosa de neiging om meer kolonies van het diffuse type te vormen. Het aantal replicaten kan hiermee worden aangepast.

6. Bepaling van de cellulaire levensvatbaarheid (telling van kolonievormende eenheden)

1. Verwijder de agarplaten uit de broedmachine en selecteer de gebieden die geschikt zijn voor het tellen van cellen.
   OPMERKING: Vermijd het tellen binnen secties met overvloedige, overlappende en niet-goed gedefinieerde kolonies.
2. Tel binnen elke sectie het aantal kolonievormende eenheden (CFU's) en bepaal het gemiddelde van de 3 replicaten
3. Converteer het aantal getelde CFU naar CFU/ml, vermenigvuldig de gemiddelde telling met de verdunningsfactor en splits met het volume cultuur in ml.

7. Gegevensanalyse

1. Converteer de gegevens van CFU/ml naar de logaritmische schaal en geef de cellulaire levensvatbaarheid weer in log₁₀|KVE/ml| als functie van de geteste concentratie.

Resultaten

Op aminozuren gebaseerde flavyliumverbindingen (Figuur 2): 7-diethylamino-4′-dimethylaminoflavylium (7NEt₂4′NMe₂), 7-diethylamino-2-(dimethylaminostyryl)-1-benzopyrylium (7NEt₂st4′NMe₂), 7-diethylamino-4′-aminoflavylium (7NEt₂4′NH₂) en 7-diethylamino-4′-hydroxyflavylium (7NEt₂4′OH), waarvan de lichtgevoelige aard eerder werd besproken^12,13

Discussie

Hoewel dit protocol dient als een testplatform in de eerste fase, is het belangrijk om zinvollere testomstandigheden voor de behandeling van microbiële infecties in een meer gevorderde studiefase in overweging te nemen. Bij het beoordelen van de effectiviteit van aPDI moeten experimenten worden uitgevoerd met biofilm-type bacteriële organisaties in plaats van planktonische bacteriën. In veel klinische gevallen zijn micro-organismen betrokken die in deze meer resistente conformatie zijn g...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent	G6860A
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable cuvettes PMMA	BRAND GMBH + CO KG	759030
Eppendorfs (500 mL)	Fisher Scientific	15625367
Falcon tubes (15 mL)	Corning	430791
Falcon tubes (50 mL)	Corning	430291
LED panel IP65 50W
Micropippete (100 uL)	Transferpette S	705874
Micropippete (1000 uL)	Transferpette S	705880
Mueller Hinton agar	Oxoid	CM0405
Multichannel pippete 12-channel	Transferpette S
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Scientific	260844
Phospate Buffered Saline tablets pH 7.4	Panreac Applichem	A9177
Serological Pipets (10 mL)	Thermo Scientific	170356N
Serological Pipets (5 mL)	Thermo Scientific	170366N
Tissue Culture Dish	TPP Techno Plastic Products AG	93150