Identificatie van functioneel relevante integratieplaatsen van lentivirussen in een cellenbibliotheek met insertionele mutagenese

Samenvatting

Insertionele mutagenese is een essentieel hulpmiddel in forward genetics voor het identificeren van functionele genomische elementen. Hier beschrijven we het op insertie gebaseerde scherm voor functionele elementen en transcripten (InSET), een methode voor het detecteren van lentivirus-integratieplaatsen binnen een op lentivirus gebaseerde insertiemutagenese-celbibliotheek.

Samenvatting

De omvang van functionele sequenties binnen het menselijk genoom is een cruciaal maar betwist onderwerp in de biologie. Hoewel high-throughput reverse genetic screens vooruitgang hebben geboekt in het onderzoek hiernaar, beperken ze zich vaak tot bekende genomische elementen en kunnen ze niet-specifieke effecten introduceren. Dit benadrukt de dringende behoefte aan nieuwe functionele genoomtools die een dieper, onbevooroordeeld begrip van de genoomfunctionaliteit mogelijk maken. Dit protocol introduceert de Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), een methode voor het identificeren van lentivirus-integratieplaatsen binnen een lentivirus-gebaseerde insertional mutagenese celbibliotheek. InSET maakt de opname van genoom-brede lentivirale integratieplaatsen mogelijk, waarbij next-generation sequencing wordt gebruikt om flankerende sequenties te detecteren en te kwantificeren. De ontwerp van InSET maakt de analyse van variaties in de abundantie van integratieplaatsen in fenotypische screens op grote schaal mogelijk, waardoor het een robuust hulpmiddel is voor forward genetics en voor het identificeren van functionele genomische elementen. Een belangrijk voordeel van InSET is de capaciteit om eerder niet-geïdentificeerde genomische elementen te onthullen, inclusief nieuwe functionele exonen van zowel eiwitcoderende als niet-coderende RNA's, onafhankelijk van eerdere annotaties. Over het algemeen heeft InSET een aanzienlijke waarde in het bestuderen van de ingewikkelde complexiteit van het menselijk genoom en transcriptome, waarbij veel genomische elementen wachten op functionele karakterisering.

Inleiding

Functionele genoomkunde blijft een cruciaal en uitdagend veld, zelfs in het post-genoomtijdperk, met een aanzienlijk deel van genomische regio's dat nog steeds een functionele karakterisering mist. Een belangrijke reden voor deze uitdagingen ligt in de ingewikkelde aard van het menselijk genoom en transcriptoom, die worden gekenmerkt door alomtegenwoordige transcriptie en universele alternatieve splicing in zowel eiwitcoderende als niet-coderende regio's^1,2,3,4,5. Deze complexiteit is uitgebreid benadrukt d....

Protocol

Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de InSET-methode. Voor optimale dekking, bereid vijf parallelle bibliotheken voor van 1 µg genomisch DNA en pool ze vervolgens voor next-generation sequencing. Deze procedure is in eerdere tests continu met succes voltooid, hoewel gebruikers op hun eigen inzicht pauzepunten kunnen invoeren. Gedetailleerde informatie over de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, is te vinden in de Tabel van Materialen.

1. Vastleggen van lentivirus-integratieplaatsen in het genoom

1. Gebruik het genomische DNA geïsoleerd ....

Resultaten

De kwaliteitscontrolebeoordeling van een NGS-library, die gewoonlijk door de sequencingprovider wordt uitgevoerd, dient als de standaard kwaliteitscontrole vóór de sequencing. Om de impact van de library-kwaliteit aan te tonen, werden twee monsters vergeleken. De library van hoge kwaliteit, aangeduid als s2-20-15, werd bereid volgens het standaard nested PCR-protocol, bestaande uit twee opeenvolgende amplificatiestappen: de eerste met 20 cycli, gevolgd door de tweede met 15 cycli. Daarentegen werd de library van lage kwa.......

Discussie

In forward genetics-analysen is genome-walking essentieel voor het profileren van integratieplaatsen in cellenbibliotheken voor insertionele mutagenese. Klassieke genome-walking-methoden zoals I-PCR en LAM-PCR vereisen vaak restrictie-enzymdigestie en ligatie, wat de complexiteit van de bibliotheek kan verminderen en vooringenomenheid kan introduceren vanwege afhankelijkheid van enzymlocaties^27,28,29. De InSET-methode overwint d.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.5 M EDTA	Invitrogen	AM9260G	Om Binding/Wash Buffer te maken
1 M Tris-HCl (Ph 8.0)	Invitrogen	15568025	Om Binding/Wash Buffer te maken
10× Klenow Fragment Buffer	Takara	2140A
10× Taq Buffer	Tiangen	ET101-01-01
5 M NaCl	Invitrogen	AM9659	Om Binding/Wash Buffer te maken
BeaverBeads Streptavidin	Beaver	22307-1	1 µm
BEDTools		Software, v2	https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/
BWA-MEM			Software, v0.7.12
dNTP Mixture	Takara	4030	2,5 mM elk
Equalbit dsDNA HS Assay Kit	Vazyme	EQ111-02
fastp			Software
HiSeq X Ten	Illumina	SY-412-1001	Illumina platform, uitbesteed aan Novogene Corporation (Beijing)
Klenow Fragment	Takara	2140A
NovaSeq 6000	Illumina	20012850	Illumina platform, uitbesteed aan Novogene Corporation (Beijing)
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216
SICER			Software, v1.1
Taq DNA Polymerase	Tiangen	ET101-01-01
Tween-20	HuShi	30189328	Om Binding/Wash Buffer te maken
UltraPure Gedistilleerd Water	Invitrogen	10977015
VAHTS DNA Clean Beads	Vazyme	N411-01