Methodenartikel

Identificatie van functioneel relevante integratieplaatsen van lentivirussen in een cellenbibliotheek met insertionele mutagenese

DOI:

10.3791/67552

⸱

10 januari 2025

 ,  , 
1Institute of Genomics, School of Medicine, Huaqiao University, 2State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Xiamen University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insertionele mutagenese is een essentieel hulpmiddel in forward genetics voor het identificeren van functionele genomische elementen. Hier beschrijven we het op insertie gebaseerde scherm voor functionele elementen en transcripten (InSET), een methode voor het detecteren van lentivirus-integratieplaatsen binnen een op lentivirus gebaseerde insertiemutagenese-celbibliotheek.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De omvang van functionele sequenties binnen het menselijk genoom is een cruciaal maar betwist onderwerp in de biologie. Hoewel high-throughput reverse genetic screens vooruitgang hebben geboekt in het onderzoek hiernaar, beperken ze zich vaak tot bekende genomische elementen en kunnen ze niet-specifieke effecten introduceren. Dit benadrukt de dringende behoefte aan nieuwe functionele genoomtools die een dieper, onbevooroordeeld begrip van de genoomfunctionaliteit mogelijk maken. Dit protocol introduceert de Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), een methode voor het identificeren van lentivirus-integratieplaatsen binnen een lentivirus-gebaseerde insertional mutagenese celbibliotheek. InSET maakt de opname van genoom-brede lentivirale integratieplaatsen mogelijk, waarbij next-generation sequencing wordt gebruikt om flankerende sequenties te detecteren en te kwantificeren. De ontwerp van InSET maakt de analyse van variaties in de abundantie van integratieplaatsen in fenotypische screens op grote schaal mogelijk, waardoor het een robuust hulpmiddel is voor forward genetics en voor het identificeren van functionele genomische elementen. Een belangrijk voordeel van InSET is de capaciteit om eerder niet-geïdentificeerde genomische elementen te onthullen, inclusief nieuwe functionele exonen van zowel eiwitcoderende als niet-coderende RNA's, onafhankelijk van eerdere annotaties. Over het algemeen heeft InSET een aanzienlijke waarde in het bestuderen van de ingewikkelde complexiteit van het menselijk genoom en transcriptome, waarbij veel genomische elementen wachten op functionele karakterisering.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Functionele genoomkunde blijft een cruciaal en uitdagend veld, zelfs in het post-genoomtijdperk, met een aanzienlijk deel van genomische regio's dat nog steeds een functionele karakterisering mist. Een belangrijke reden voor deze uitdagingen ligt in de ingewikkelde aard van het menselijk genoom en transcriptoom, die worden gekenmerkt door alomtegenwoordige transcriptie en universele alternatieve splicing in zowel eiwitcoderende als niet-coderende regio's1,2,3,4,5. Deze complexiteit is uitgebreid benadrukt door RNA-gerichte verrijkingsstudies6,7,8,9. Het wordt steeds meer erkend dat talloze nieuwe genomische elementen ongekarteerd en functioneel niet-geannoteerd blijven10,11,12 naast de goed geannoteerde segmenten van het menselijk genoom.

In de afgelopen jaren zijn er vooruitgangen geboekt in reverse-genetica tools, zoals RNA-interferentie (RNAi) en CRISPR/Cas-systemen13,14,15,16,17,18,19,20,21. Deze methoden hebben echter opmerkelijke nadelen, waaronder niet-specifieke effecten en hoge kosten geassocieerd met het genereren van complexe bibliotheken van korte hairpin RNA's (shRNA's) of enkele gids RNA's (sgRNA's)22,23,24,25. Bovendien richten deze methoden zich voornamelijk op geannoteerde genomische elementen. In tegenstelling hiermee heeft voorwaartse genetica het voordeel dat het nieuwe, niet-geannoteerde functionele genomische elementen identificeert. Gezien de complexiteit van het menselijk genoom en transcriptoom, evenals het grote aantal nieuwe genomische elementen, is dit vermogen van voorwaartse genetica van aanzienlijk belang.

Voorwaartse genetica celbibliotheken worden vaak gegenereerd door willekeurige retrovirale integratie, waardoor de efficiënte detectie van genoom-wide integratieplaatsen cruciaal is voor een voorwaartse genetica assay. Het detecteren van deze integratieplaatsen omvat doorgaans genome-walking tools26. Hoewel er significante vooruitgang is geboekt in deze tools, zijn er maar weinig geoptimaliseerd voor next-generation sequencing (NGS) toepassingen en vervolgens toegepast in insertional mutagenese studies. Insertional mutagenese in cellijnen maakt vaak gebruik van methoden zoals inverse PCR (I-PCR) of lineaire amplificatie-gemedieerde PCR (LAM-PCR) om integratieplaatsen te detecteren27,28,29. Deze methoden vereisen echter meestal restrictie-enzym digestie of ligatie stappen, wat de efficiëntie kan verminderen en vooringenomenheid in de resultaten kan introduceren.

Om de efficiënte detectie van genoom-wide integratieplaatsen in voorwaartse genetica screens te verbeteren, werd hier een methode genaamd de Insertion-based Screen voor functionele Elementen en Transcripten (InSET) methode geïntroduceerd. Door genome-walking te integreren met NGS, maakt InSET de hoog-doorvoer identificatie van lentivirus integratieplaatsen in lentivirus-gebaseerde insertional mutagenese bibliotheken mogelijk. In vergelijking met bestaande methoden27,28,29, is InSET relatief eenvoudig en rechtlijnig, elimineert de restrictie-enzym digestie of ligatie stappen, waardoor het gemakkelijker en toegankelijker wordt. Bovendien, hoewel de bestaande voorwaartse genetica screen in zoogdiercellen beperkt is tot zeer weinig haploïde of bijna-haploïde cellijnen27,28,29,30,31, is bewezen dat InSET werkt in aneuploïde cellijnen32.

Deze studie biedt een gedetailleerd, stap-voor-stap protocol voor het implementeren van de InSET methode. Bovendien, demonstreert het de toepassing van InSET in insertional mutagenese studies. InSET dient als een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van nieuwe exonen binnen genomische elementen, die zowel eiwitcoderende als niet-coderende RNA's in menselijke cellijnen omvatten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de InSET-methode. Voor optimale dekking, bereid vijf parallelle bibliotheken voor van 1 µg genomisch DNA en pool ze vervolgens voor next-generation sequencing. Deze procedure is in eerdere tests continu met succes voltooid, hoewel gebruikers op hun eigen inzicht pauzepunten kunnen invoeren. Gedetailleerde informatie over de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, is te vinden in de Tabel van Materialen.

1. Vastleggen van lentivirus-integratieplaatsen in het genoom

  1. Gebruik het genomische DNA geïsoleerd uit een lentivis-gebaseerde insertionele mutagenese celbibliotheek (1 µg), zoals beschreven in een eerdere studie32, als sjabloon voor een lineaire PCR in een 50 µL reactie bevattende 1x Taq Buffer, 2,5 U Taq DNA Polymerase, 4 µL van dNTP Mixture (2,5 mM elk), en 0,3 µM van biotinyleren primer 3-LTR_prime (Tabel 1) in een PCR tube.
    OPMERKING: De 3-LTR_prime primer bindt aan de LTR-regio van de lentivis-sequentie. Als deze bindt aan de 5' LTR, bevat het versterkte fragment de flankerende genomische sequentie. Als het bindt aan de 3' LTR, bevat het versterkte fragment een interne lentivis-sequentie, die niet kan worden uitgelijnd met het gastheergenoom en dus zal worden gefilterd tijdens downstream sequencing data-analyse. Deze primer kan ook worden aangepast om te passen bij andere soorten vectoren die worden gebruikt om een insertionele mutagenese celbibliotheek te genereren.
  2. Voer 50 cycli van lineaire PCR uit in een standaard PCR-thermocycler, waarbij 2,5 U van Taq DNA Polymerase wordt toegevoegd aan het begin en opnieuw onmiddellijk na 25 cycli. PCR-condities zijn als volgt: 94 °C gedurende 5 min; 50 cycli van 94 °C gedurende 30 s, 55 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s; 72 °C gedurende 5 min.
    OPMERKING: Om de activiteit van de Taq DNA Polymerase tijdens langdurige reacties te behouden, wordt het aanbevolen om het enzym zowel aan het begin als in het midden van de reactie toe te voegen.
  3. Breng de PCR-producten over naar een nieuwe, schone 1,5 mL centrifugeerbuis.
  4. Meng de PCR-producten grondig met 10 µL van biotin-streptavidine magnetische kralen.
  5. Incubeer het mengsel gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, schudden bij 400 rpm in een metalen bad.
    OPMERKING: Neem de buis eruit om elke 15 minuten goed te mengen met de pipette.
  6. Gebruik een magnetische standaard om de kralen te verzamelen en verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant.
  7. Was de kralen met 300 µL Binding/Wash Buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween-20) 6 keer en gooi het supernatant weg.
  8. Was met 300 µL (65 °C) DNase/RNase-vrij gedestileerd water twee keer en gooi het supernatant weg.
  9. Voor de tweede strengsynthese, resuspendeer de kralen in een 24 µL reactievolume bevattende 1x Klenow Fragment Buffer, 2 µL van dNTP Mixture (2,5 mM elk), en 6,25 µM van P5_N6 primer (Tabel 1) in een PCR tube.
    OPMERKING: Bereid een 100 µM stockoplossing van P5_N6 primer. De P5_N6 primer bestaat uit een vaste P5-adaptersequentie aan het 5'-uiteinde en een willekeurige hexameersequentie aan het 3'-uiteinde. Het willekeurige hexameer kan binden aan een diverse reeks doelsequenties, waardoor het geschikt is voor het amplificeren van verschillende DNA-fragmenten gegenereerd door lineaire PCR.
  10. Pre-incubeer het mengsel gedurende 20 min bij 15 °C in een PCR-thermocycler.
  11. Voeg 2 U van Klenow Fragment (Large Fragment E.coli DNA Polymerase) toe.
  12. Incubeer de mengsels in een PCR-thermocycler onder de volgende omstandigheden: geleidelijk verhogen met 0,5 °C/min van 15 °C naar 25 °C gevolgd door 30 min incubatie; vervolgens geleidelijk verhogen met 0,5 °C/min naar 37 °C gevolgd door 1 uur incubatie.
  13. Breng de PCR-producten over naar een nieuwe, schone 1,5 mL centrifugeerbuis.
  14. Gebruik een magnetische standaard om de kralen te verzamelen en verwijder vervolgens het supernatant.
  15. Was de kralen voorzichtig met 300 µL van 4 °C DNase/RNase-vrij gedestileerd water. Verzamel de kralen en gooi het supernatant weg.

2. Constructie van NGS-bibliotheek met geneste PCR

  1. Resuspendeer de kralen uit stap 1.15 in een 25 µL PCR-reactievolume bevattende 1x Taq Buffer, 1,25 U Taq DNA Polymerase, 0,5 µM van primer P5 (Tabel 1), 2 µL van dNTP Mixture (2,5 mM elk), en 0,5 µM van primer 3-LTR_Nest (Tabel 1) in een PCR tube.
  2. Voer PCR-reacties uit in een PCR-thermocycler onder de volgende omstandigheden: 94 °C gedurende 3 min; 20 cycli van 94 °C gedurende 30 s, 55 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s; 72 °C gedurende 7 min.
  3. Gebruik 5 µL van de PCR-producten uit stap 2.2 als sjabloon voor de volgende ronde van PCR in 50 µL volume bevattende 1x Taq Buffer, 2,5 U Taq DNA Polymerase, 4 µL van dNTP Mixture (2,5 mM elk), 0,4 µM van primer Illumina_P5 (Tabel 1) en 0,4 µM van primer Illumina_P7-3LTR (Tabel 1).
  4. Voer PCR-reacties uit in een PCR-thermocycler onder de volgende omstandigheden: 94 °C

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De beoordeling van de kwaliteitscontrole van een NGS-bibliotheek, die meestal door de sequencing-aanbieder wordt uitgevoerd, dient als standaard kwaliteitscontrole voorafgaand aan sequencing. Om de impact van de kwaliteit van de bibliotheek te demonstreren, werden twee monsters vergeleken. De bibliotheek van hoge kwaliteit, gelabeld s2-20-15, werd bereid volgens het standaard nested PCR-protocol, bestaande uit twee opeenvolgende versterkingsstappen: de eerste met 20 cycli, gevolgd door de tweede met 15 cycli. In tegenste...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In forward genetics-analysen is genome-walking essentieel voor het profileren van integratieplaatsen in cellenbibliotheken voor insertionele mutagenese. Klassieke genome-walking-methoden zoals I-PCR en LAM-PCR vereisen vaak restrictie-enzymdigestie en ligatie, wat de complexiteit van de bibliotheek kan verminderen en vooringenomenheid kan introduceren vanwege afhankelijkheid van enzymlocaties27,28,29. De InSET-methode overwint d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen onthullingen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.X. wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32000441), de Natural Science Foundation van de provincie Fujian, China (2023J01130), de Fundamental Research Funds voor de Central Universities van Huaqiao University (ZQN-924) en de Scientific Research Funds van Huaqiao University (18BS205). P.K. wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32170619), het Research Fund voor Internationale Senior Wetenschappers van de National Natural Science Foundation of China (32150710525) en de Natural Science Foundation van de provincie Fujian, China (2020J02006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTAInvitrogenAM9260GOm Binding/Wash Buffer te maken
1 M Tris-HCl (Ph 8.0)Invitrogen15568025Om Binding/Wash Buffer te maken
10× Klenow Fragment Buffer Takara2140A
10× Taq BufferTiangenET101-01-01
5 M NaClInvitrogenAM9659Om Binding/Wash Buffer te maken
BeaverBeads StreptavidinBeaver22307-11 µm
BEDToolsSoftware, v2https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/
BWA-MEMSoftware, v0.7.12
dNTP MixtureTakara40302,5 mM elk
Equalbit dsDNA HS Assay KitVazymeEQ111-02
fastpSoftware
HiSeq X TenIlluminaSY-412-1001Illumina platform, uitbesteed aan Novogene Corporation (Beijing)
Klenow FragmentTakara2140A
NovaSeq 6000Illumina20012850Illumina platform, uitbesteed aan Novogene Corporation (Beijing)
Qubit 3.0 FluorometerThermoFisher ScientificQ33216
SICERSoftware, v1.1
Taq DNA PolymeraseTiangenET101-01-01
Tween-20HuShi30189328Om Binding/Wash Buffer te maken
UltraPure Gedistilleerd WaterInvitrogen10977015
VAHTS DNA Clean BeadsVazymeN411-01

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapranov, P., et al. Large-scale transcriptional activity in chromosomes 21 and 22. Science. 296 (5569), 916-919 (2002).
  2. Bertone, P., et al. Global identification of human transcribed sequences with genome tiling arrays. Science. 306 (5705), 2242-2246 (2004).
  3. Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
  4. Kapranov, P., et al. The majority of total nuclear-encoded non-ribosomal RNA in a human cell is 'dark matter' un-annotated RNA. BMC Biol. 8, 149(2010).
  5. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  6. Kapranov, P., et al. Examples of the complex architecture of the human transcriptome revealed by race and high-density tiling arrays. Genome Res. 15 (7), 987-997 (2005).
  7. Denoeud, F., et al. Prominent use of distal 5' transcription start sites and discovery of a large number of additional exons in encode regions. Genome Res. 17 (6), 746-759 (2007).
  8. Mercer, T. R., et al. Targeted RNA sequencing reveals the deep complexity of the human transcriptome. Nat Biotechnol. 30 (1), 99-104 (2011).
  9. Deveson, I. W., et al. Universal alternative splicing of non-coding exons. Cell Syst. 6 (2), 245-255.e5 (2018).
  10. Xu, D., Tang, L., Kapranov, P. Complexities of mammalian transcriptome revealed by targeted RNA enrichment techniques. Trends Genet. 39 (4), 320-333 (2023).
  11. Amaral, P., et al. The status of the human gene catalogue. Nature. 622 (7981), 41-47 (2023).
  12. Mattick, J. S., et al. Long non-coding RNAs: Definitions, functions, challenges and recommendations. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (6), 430-447 (2023).
  13. Bassik, M. C., et al. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
  14. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  15. Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nat Biotechnol. 34 (12), 1279-1286 (2016).
  16. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long non-coding RNA loci in human cells. Science. 355, 6320(2017).
  17. Bester, A. C., et al. An integrated genome-wide CRISPRa approach to functionalize lncRNAs in drug resistance. Cell. 173 (3), 649-664.e20 (2018).
  18. Liu, Y., et al. Genome-wide screening for functional long non-coding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites. Nat Biotechnol. 36, 1203-1210 (2018).
  19. Xu, D., et al. A CRISPR/Cas13-based approach demonstrates biological relevance of vlinc class of long non-coding RNAs in anticancer drug response. Sci Rep. 10 (1), 1794(2020).
  20. Noguchi, Y., Matsui, R., Suh, J., Dou, Y., Suzuki, J. Genome-wide screening approaches for biochemical reactions independent of cell growth. Annu Rev Genomics Hum Genet. 25 (1), 51-76 (2024).
  21. Recinos, Y., et al. CRISPR-dCas13d-based deep screening of proximal and distal splicing-regulatory elements. Nat Commun. 15 (1), 3839(2024).
  22. Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
  23. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 4 (11), e264(2015).
  24. Stojic, L., et al. Specificity of RNAi, LNA and CRISPRi as loss-of-function methods in transcriptional analysis. Nucleic Acids Res. 46 (12), 5950-5966 (2018).
  25. Gao, F., Cai, Y., Kapranov, P., Xu, D. Reverse-genetics studies of lncRNAs-what we have learnt and paths forward. Genome Biol. 21 (1), 93(2020).
  26. Leoni, C., Volpicella, M., De Leo, F., Gallerani, R., Ceci, L. R. Genome walking in eukaryotes. FEBS J. 278 (21), 3953-3977 (2011).
  27. Carette, J. E., et al. Haploid genetic screens in human cells identify host factors used by pathogens. Science. 326 (5957), 1231-1235 (2009).
  28. Carette, J. E., et al. Global gene disruption in human cells to assign genes to phenotypes by deep sequencing. Nat Biotechnol. 29 (6), 542-546 (2011).
  29. Burckstummer, T., et al. A reversible gene trap collection empowers haploid genetics in human cells. Nat Methods. 10 (10), 965-971 (2013).
  30. Carette, J. E., et al. Ebola virus entry requires the cholesterol transporter niemann-pick c1. Nature. 477 (7364), 340-343 (2011).
  31. Cao, J. Y., et al. A genome-wide haploid genetic screen identifies regulators of glutathione abundance and ferroptosis sensitivity. Cell Rep. 26 (6), 1544-1556.e8 (2019).
  32. Xu, D., et al. Evidence for widespread existence of functional novel and non-canonical human transcripts. BMC Biol. 21 (1), 271(2023).
  33. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. Fastp: An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).
  34. Li, H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with bwa-mem. arXiv preprint arXiv:1303.3997. , (2013).
  35. Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification chip-seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
  36. Quinlan, A. R., Hall, I. M. Bedtools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  37. Pule, M. A., et al. Flanking-sequence exponential anchored-polymerase chain reaction amplification: A sensitive and highly specific method for detecting retroviral integrant-host-junction sequences. Cytotherapy. 10 (5), 526-539 (2008).
  38. Demeulemeester, J., De Rijck, J., Gijsbers, R., Debyser, Z. Retroviral integration: Site matters: Mechanisms and consequences of retroviral integration site selection. Bioessays. 37 (11), 1202-1214 (2015).
  39. Kvaratskhelia, M., Sharma, A., Larue, R. C., Serrao, E., Engelman, A. Molecular mechanisms of retroviral integration site selection. Nucleic Acids Res. 42 (16), 10209-10225 (2014).
  40. Ambrosi, A., et al. Estimated comparative integration hotspots identify different behaviors of retroviral gene transfer vectors. PLoS Comput Biol. 7 (12), e1002292(2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Functional GenomicsForward Genetic ScreenGenome Wide ScreeningNext Generation SequencingFunctional Genomic ElementsPCR AmplificationMagnetic Bead PurificationHuman Genome Analysis

Gerelateerde artikelen