Methodenartikel

Detectie van anti-MDA5 auto-antilichamen met behulp van HeLa-cellen en immunocytochemie met lichtmicroscopie

DOI:

10.3791/67575

⸱

31 oktober 2025

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Biomedical Sciences, China Medical University, 2College of Medicine, China Medical University, 3Rheumatology and Immunology Center, China Medical University Hospital, 4Rheumatic Diseases Research Center, China Medical University Hospital, 5Drug Development Center, China Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bieden een stapsgewijze immunocytochemie (ICC) methodologie voor het detecteren van anti-MDA5. Deze benadering omvat celfixatie, permeabilisatie, incubatie van antilichamen en beeldvormingstechnieken, die de nauwkeurige detectie van anti-MDA5-auto-antilichamen mogelijk maken, wat helpt bij de diagnose van snel voortschrijdende interstitiële longziekte bij patiënten met myositis.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anti-MDA5 auto-antilichamen zijn cruciale biomarkers voor dermatomyositis (DM), amyopathische dermatomyositis (CADM) en polymyositis (PM), met name bij het identificeren van patiënten met een risico op snel progressieve interstitiële longziekte (RP-ILD). Vroege detectie van deze auto-antilichamen is essentieel om de resultaten voor de patiënt te verbeteren, aangezien een vertraagde diagnose vaak leidt tot slechte prognoses. Momenteel is radioimmunoassay de gouden standaard voor het detecteren van anti-MDA5, maar het gebruik ervan wordt beperkt door hoge kosten, langdurige procedures en de behoefte aan gespecialiseerde expertise. Bovendien vertoont de blot-test, een veelgebruikt klinisch hulpmiddel, een hoog percentage vals-positieven voor MDA5-auto-antilichamen, waardoor de diagnostische nauwkeurigheid mogelijk in gevaar komt. Om deze beperkingen aan te pakken, stellen we een niet-radioactieve, zeer gevoelige en gestandaardiseerde bevestigende testmethode voor met behulp van immunocytochemie (ICC). Dit protocol omvat de behandeling van HeLa-cellen met een MDA5-construct, het permeabiliseren van de cellen met Triton X-100 om de binding van primaire anti-MDA5-auto-antilichamen te vergemakkelijken, en het detecteren van gebonden antilichamen met behulp van enzymgeconjugeerde secundaire antilichamen (bijv. mierikswortelperoxidase) met DAB-chromogeen voor microscopische beeldvorming. ICC biedt een praktische, kosteneffectieve en zeer gevoelige benadering voor het visualiseren van anti-MDA5 auto-antilichamen in cellulaire structuren. Door ICC te integreren als een aanvullende bevestigende procedure, heeft deze studie tot doel de betrouwbaarheid van anti-MDA5-detectie te verbeteren, waardoor de diagnostische en prognostische strategieën voor RP-ILD bij DM-, CADM- en PM-patiënten worden verbeterd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Idiopathische inflammatoire myopathieën (IIM), gewoonlijk myositis genoemd, zijn een heterogene groep auto-immuunziekten die worden gekenmerkt door chronische spierontsteking, variabele klinische manifestaties en diverse therapeutische resultaten. Veel voorkomende symptomen zijn spierzwakte, verminderd uithoudingsvermogen en spierpijn1. De primaire subtypes van IIM zijn polymyositis (PM) en dermatomyositis (DM), terwijl klinisch amyopathische dermatomyositis (CADM) zich onderscheidt door karakteristieke huiduitslag die lijkt op die bij DM, maar met minimale of geen spierbetrokkenheid. Een belangrijke complicatie bij PM, DM en CADM is interstitiële longziekte (ILD), die ongeveer 40% van de patiënten treft en gepaard gaat met verhoogde mortaliteit2.

Het klinische beloop en de prognose van ILD bij IIM lopen sterk uiteen. ILD geassocieerd met DM en CADM (DM-/CADM-ILD) is doorgaans meer therapieresistent en heeft een slechtere prognose in vergelijking met PM-geassocieerde ILD. Acute of subacute interpunctie interstitiële longitis, die binnen drie maanden snel vordert3, is bijzonder ernstig, met een gerapporteerde vijfjaarsoverleving van slechts 52%, vergeleken met 87% voor chronische interstitiale interstitiale longitis Snel progressieve ILD (RP-ILD), een subtype van acute/subacute ILD, wordt gekenmerkt door een snel begin van kortademigheid en uitgebreide alveolaire schade die zichtbaar is op beeldvorming van de borstkas. RP-ILD is een levensbedreigende aandoening met een slechte prognose, wat de dringende noodzaak onderstreept van een vroege diagnose en snelle interventie om de patiëntresultaten te verbeteren 4,5,6.

Myositis-specifieke auto-antilichamen (MSA's) zijn naar voren gekomen als kritische biomarkers bij myositis-geassocieerde ILD, waarbij anti-MDA5 auto-antilichamen een bijzonder belangrijke rol spelen. Deze auto-antilichamen worden vaak gedetecteerd bij patiënten met PM-/DM-/CADM-ILD en dienen als belangrijke prognostische indicatoren voor RP-ILD 7,8,9. MDA5 (melanoomdifferentiatie-geassocieerd gen 5) is een cytosolische patroonherkenningsreceptor die wordt gecodeerd door een interferon-induceerbaar gen dat viraal en mitochondriaal dubbelstrengs RNA detecteert, waardoor interferon-gemedieerde immuunresponsen worden geïnitieerd10. Hoewel de precieze pathogene mechanismen onduidelijk blijven, wordt aangenomen dat anti-MDA5 auto-antilichamen de MDA5-functie verstoren en zo bijdragen aan de auto-immuunpathogenese.

Tijdige detectie van anti-MDA5 auto-antilichamen is essentieel voor de vroege identificatie en behandeling van RP-ILD. Traditioneel wordt radioactief gelabelde immunoprecipitatie (IP) met behulp van 35S-methionine-gelabelde K562-celextracten beschouwd als de gouden standaard voor het detecteren van anti-MDA5 auto-antilichamen11. Deze methode is echter onpraktisch voor routinematig klinisch gebruik vanwege de hoge kosten, de afhankelijkheid van gespecialiseerde apparatuur en opgeleid personeel, de strikte voorschriften voor de verwijdering van radioactief afval en de beperkte houdbaarheid van radioactief gelabelde reagentia. In de klinische praktijk worden blot-assays vaak gebruikt als alternatief; ze worden echter in verband gebracht met een hoog percentage vals-positieven voor anti-MDA5 auto-antilichamen12,13, wat aanleiding geeft tot bezorgdheid over de diagnostische nauwkeurigheid. Daarom is er dringend behoefte aan een betrouwbare, niet-radioactieve bevestigende test om positieve resultaten te valideren en het diagnostische vertrouwen te vergroten.

Om deze lacune te dichten, stellen we het gebruik van immunocytochemie (ICC) voor als aanvullende bevestigende test voor anti-MDA5 auto-antilichamen. Deze benadering omvat het transfecteren van HeLa-cellen met een MDA5-construct, het incuberen van de cellen met patiëntplasma en het detecteren van gebonden anti-MDA5-auto-antilichamen met behulp van enzymgeconjugeerde secundaire antilichamen (bijv. mierikswortelperoxidase) in combinatie met een chromogeen substraat voor visualisatie onder lichtmicroscopie. ICC biedt een niet-radioactief, zeer gevoelig en gestandaardiseerd platform voor het visualiseren van anti-MDA5 auto-antilichamen in cellulaire compartimenten. Door ICC te integreren met de blot-assay, heeft deze methode tot doel het aantal vals-positieven te verminderen, de diagnostische nauwkeurigheid te verbeteren en uiteindelijk het klinische beheer en de resultaten voor patiënten te verbeteren.

Het doel van deze studie is het opstellen van een robuust, niet-radioactief protocol voor de detectie van anti-MDA5 auto-antilichamen, dat de beperkingen van de huidige detectiemethoden aanpakt en clinici een praktisch en betrouwbaar hulpmiddel biedt voor de vroege diagnose van RP-ILD bij patiënten met PM, DM en CADM. In de begeleidende videovertelling wordt deze levensgevaarlijke koers in de volksmond omschreven als 'snelle dood'; wetenschappelijk komt het overeen met snel progressieve ILD (RP-ILD). Dit werk bouwt voort op bestaand bewijs en heeft het potentieel om de prognostische beoordeling en therapeutische besluitvorming in de klinische praktijk aanzienlijk te verbeteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celcultuur en transfectie

  1. Onderhoud de HeLa-cellen met Dulbecco's Modified Eagle Medium, dat 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibioticum-antimycoticum bevat bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 .
  2. Passeer de cellen elke 2-3 dagen of wanneer de cellen 90%-100% samenvloeiing bereiken.
  3. Zaad 7 × 104 HeLa-cellen in elk putje van een plaat met 24 putjes (1,9 cm2/putje) 24 uur vóór transfectie om de cellen ongeveer 90% samenvloeiing te laten bereiken.
  4. Verdun 500 ng plasmide (pENTER-MDA5) en 1,5 μL transfectiereagens elk in 25 μL gereduceerd serummedium.
  5. Voeg verdund DNA toe aan verdund transfectiereagens (verhouding 1:1). Meng goed en incubeer gedurende 5 minuten.
  6. Voeg het mengsel toe aan de cellen die een dag ervoor zijn gezaaid en schud om het DNA-lipidencomplex onmiddellijk te mengen. Bevestig dat de cellen voor 80%-90% samenvloeien.
  7. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en ga verder met het uitvoeren van ICC.
    OPMERKING: We hebben een in de handel verkrijgbare vector gebruikt (pEnter-MDA5); meer informatie is te vinden in de Materiaaltabel. De transfectiedoeltreffendheid is ~50%.
    Het succes van transfectie en expressie van het doeleiwit kan worden bepaald door de cellen te transfecteren met een fluorescerend eiwit-tot expressie brengend plasmide en het uitvoeren van een westerse vlek om de uitdrukking van het doeleiwit te visualiseren.

2. Cel fixatie

  1. Was de cellen na incubatie 2x met PBS om eventuele achtergebleven media te verwijderen.
    OPMERKING: Wassen kan worden uitgevoerd door de plaat op een orbitale schudder te schudden.
  2. Fixeer de cellen in 4% paraformaldehyde in PBS. Laat de cellen 15 minuten op kamertemperatuur staan.
    LET OP: Paraformaldehyde is giftig. Gebruik de juiste richtlijnen voor het hanteren.
  3. Zuig het fixatief reagens op en gebruik PBS om de cellen 2x te wassen.

3. Permeabilisatie van cellen

  1. Voeg Triton X-100 reagens toe (0,3% in PBS) en laat de cellen 10 minuten bij kamertemperatuur staan.
  2. Gooi na 10 minuten het wasmiddel weg.
  3. Voeg PBS toe om de cellen één keer te wassen.

4. Cel blokkeren

  1. Voer een blokkering uit met 10% foetaal runderserum in PBS (1x) en incubeer de cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  2. Verwijder het blokkerende reagens en voeg vervolgens PBS toe om de cellen één keer te wassen.

5. Hybridisatie van het antilichaam van de patiënt

  1. Voeg het verdunde patiëntplasma toe aan de cellen. Zorg ervoor dat u het patiëntenmonster (1:5.000 verdunning in PBS) voor gebruik verdunt in PBS.
    OPMERKING: Pas de verdunning aan om het signaal te versterken of de achtergrond te verminderen indien nodig. Om onbevooroordeelde resultaten te garanderen, wist het personeel dat de tests uitvoerde niet welke monsters van de patiënten waren en welke van gezonde personen.
  2. Incubeer het monster gedurende 12-16 uur (nacht) bij 4 °C.
  3. Verwijder na de incubatietijd het patiëntmonster en spoel de cellen 3x met PBS.

6. Hybridisatie van secundair antilichaam

  1. Behandel de cellen met verdunde mierikswortelperoxidase-geconjugeerde Geit Anti-Human IgG (1:250 verdunning in PBS) en laat de cellen 1 uur bij kamertemperatuur staan.
  2. Gooi een uur later de secundaire antilichamen weg.
  3. 3x afspoelen met PBS.

7. Celkleuring

  1. Kleur de cellen na het wassen van de cellen met 300 μL DAB-werkoplossing/putje.
    OPMERKING: Deze oplossing is bereid door DAB-chromogenenconcentraat en DAB-verdunningsmiddel te mengen volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Nadat u de cellen 5 minuten hebt gekleurd, verwijdert u de kleurstof, spoelt u deze af met gedeïoniseerd gedestilleerd water en schudt u gedurende 5 minuten.

8. Tegenkleuring van cellen

  1. Tegenkleur de celkern met verdund hematoxyline.
    OPMERKING: We gebruiken Hematoxylin Gill II in een 10-voudige verdunning en wachten 5 minuten op het kleuringsproces.
  2. Gooi na 5 minuten de hematoxyline weg en was vervolgens 2 x 5 minuten met gedeïoniseerd gedestilleerd water.

9. Observatie

  1. Bekijk de kleuringsresultaten met een optische microscoop.
    OPMERKING: Een echt positief resultaat vertoont sterke bruine kleuring in HeLa-cellen die MDA5 tot expressie brengen; dit bevestigt de anti-MDA5 auto-antilichamen in het monster van de patiënt. Een negatief resultaat toont HeLa-cellen zonder bruine kleuring, wat wijst op geen anti-MDA5 auto-antilichamen. Een vals-positief resultaat toont uitgebreide bruine kleuring in alle cellen, ongeacht de MDA5-expressie. Deze niet-specifieke kleuring, die wordt gezien bij andere auto-immuunziekten, moet worden onderscheiden van een echte positieve om een verkeerde diagnose te voorkomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het personeel dat de tests uitvoerde, was blind voor de identiteit van de monsters, inclusief de specifieke patiënten van wie ze waren verkregen, om mogelijke vooringenomenheid in het evaluatieproces te minimaliseren. Hoewel de gezonde controlemonsters niet werden geblindeerd, produceerden ze consequent duidelijke en ondubbelzinnige resultaten.

Figuur 1A toont de su...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onze ICC-gebaseerde techniek voor het identificeren van anti-MDA5 auto-antilichamen biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van traditionele methoden zoals line blot-analyse en radioimmunoassay. Eerder rapporteerden Nombel et al. gevoeligheids- en specificiteitswaarden van respectievelijk 96% en 100% door indirecte immunofluorescentie (IIF) op MDA5-getransfecteerde cellen te vergelijken met ELISA in een cohort van 23 anti-MDA5-positieve dermatomyositispatiënten en 22 anti-MDA5-negatiev...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen te verklaren.

Delen van dit manuscript zijn gegenereerd met behulp van OpenAI's GPT-4. De auteurs hebben de inhoud beoordeeld en bewerkt om nauwkeurigheid en originaliteit te garanderen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Taiwanese National Science and Technology Council die werden toegekend aan Jye-Lin Hsu (NSTC 114-2320-B-039-038 en NSTC 113-2320-B-039-032). Deze studie werd ook gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de China Medical University en het ziekenhuis die werden toegekend aan Jye-Lin Hsu (CMU113-MF-89 en C1110812016-12).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24-well plates (1.9 cm²/well)Corning354541
Antibiotic-antimycoticGibco15240062
beakersPYREX1000-600
Conical tubes (15 mL)Corning430052
Conical tubes (50 mL)Corning430290
Deionized distilled waterOns gedeïoniseerd gedistilleerd water wordt in eigen beheer geproduceerd met behulp van een Milli-Q-systeem (kolom 1: Quantum TEX, SN: F4EB53476; kolom 2: Prepak, SN: F1CB11442)
Fetal Bovine Serum CharacterizedCytivaSH30396.03
graduated cylinders (50 mL)VITLAB64804
Hematoxylin Gill IILeica3801522
Hyclone Dulbecco’s Modified Eagle Medium with high glucoseCytivaSH30243.02
Lipofectamin 2000 transfection reagentInvitrogen11668019Transfectiereagens
MDA-5 (D74E4) Rabbit mAbCell Signaling Technology5321
Microcentrifuge tubes (1.5 mL Eppendorf tubes)AXYGEN142503
Opti-MEM I reduced serum mediumGibco31985070
Orbital shaker (optioneel)FIRSTEKS300R
ParaformaldehydeSigma-Aldrich4% in 1x PBS
PBSPRO TECHME222605
pENTER-MDA5Vigene Biosciences Inc.CH863586
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch109-035-003
pipette controllerThermo Scientific130165
Pipettes GILSON
Pipettes and pipette tips (10 µL)QSP104-Q
Pipettes and pipette tips (200 µL)QSPT090-Q
Pipettes and pipette tips (1000 µL)QSP111-Q
Serological pipettes (5 mL)SPL91005
Serological pipettes (10 mL)SPL91010
Serological pipettes (25 mL)SPL91025
SignalStain DAB substrate kitCellsignaling80590.3% in PBS

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mehta, P., Machado, P. M., Gupta, L. Understanding and managing anti-MDA5 dermatomyositis, including potential COVID-19 mimicry. Rheumatol Int. 41 (6), 1021-1036 (2021).
  2. Tansley, S. L., McHugh, N. J., Wedderburn, L. R. Adult and juvenile dermatomyositis: are the distinct clinical features explained by our current understanding of serological subgroups and pathogenic mechanisms. Arthritis Res Ther. 15 (2), 211(2013).
  3. Fujisawa, T. Management of myositis-associated interstitial lung disease. Medicina. 57 (4), 347(2021).
  4. Sasaki, N., et al. Early initiation of plasma exchange therapy for a patient with anti-MDA5 autoantibody-positive dermatomyositis developing rapidly progressive interstitial lung disease. Mod Rheumatol Case Rep. 5 (1), 87-92 (2021).
  5. Go, D. J., et al. Survival benefit associated with early cyclosporine treatment for dermatomyositis-associated interstitial lung disease. Rheumatol Int. 36 (2), 125-132 (2015).
  6. Tsuji, H., et al. Multicenter prospective study of the efficacy and safety of combined immunosuppressive therapy with high-dose glucocorticoid, tacrolimus, and cyclophosphamide in interstitial lung diseases accompanied by anti-melanoma differentiation-associated gene 5-positive dermatomyositis. Arthritis Rheumatol. 72 (3), 488-498 (2020).
  7. Hozumi, H., et al. Comprehensive assessment of myositis-specific autoantibodies in polymyositis/dermatomyositis-associated interstitial lung disease. Respir Med. 122, 1-8 (2016).
  8. Nakashima, R., Hosono, Y., Mimori, T. Clinical significance and new detection system of autoantibodies in myositis with interstitial lung disease. Lupus. 25 (8), 925-933 (2016).
  9. Koga, T., et al. The diagnostic utility of anti-melanoma differentiation-associated gene 5 antibody testing for predicting the prognosis of Japanese patients with DM. Rheumatology. 51 (7), 1278-1284 (2012).
  10. Fuzzi, E., et al. Anti-MDA5 dermatomyositis: an update from bench to bedside. Curr Opin Rheumatol. 34 (6), 365-373 (2022).
  11. Sato, S., et al. Autoantibodies to a 140-kd polypeptide, CADM-140, in Japanese patients with clinically amyopathic dermatomyositis. Arthritis Rheum. 52 (5), 1571-1576 (2005).
  12. Tansley, S. L., Diederichsen, L. P., Zampeli, V. A., McHugh, N. J. The reliability of immunoassays to detect autoantibodies in patients with myositis is dependent on autoantibody specificity. Rheumatology. 59 (5), 1029-1034 (2020).
  13. Chen, Y. L., Li, A. Positive predictive value of myositis antibody line blot testing in patients with suspected idiopathic inflammatory myopathy. Muscle Nerve. 69 (3), 345-350 (2024).
  14. Nombel, A., Pin, J. J., Fabien, N., Miossec, P., Coutant, F. Evaluation of the performance of an indirect immunofluorescence assay for the detection of anti-MDA5 antibodies. Biomedicines. 10 (12), 3125(2022).
  15. Nakashima, R., Hosono, Y., Mimori, T. Clinical significance and new detection system of autoantibodies in myositis with interstitial lung disease. Lupus. 25 (8), 925-933 (2016).
  16. Sato, S., et al. Autoantibodies to a 140-kd polypeptide, CADM-140, in Japanese patients with clinically amyopathic dermatomyositis. Arthritis Rheum. 52 (5), 1571-1576 (2005).
  17. Chang, Y. C., Yang, L., Budhram, A. Positive predictive value of myositis antibody line blot testing in patients with suspected idiopathic inflammatory myopathy. Muscle Nerve. 69 (5), 626-630 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Immunocytochemische assayinterstiti le longziektedermatomyositis biomarkerspermeabilisatie met Triton X 100detectie met mierikswortelperoxidaseDAB chromogeenkleuringlabeling met secundaire antilichamen

Gerelateerde artikelen