Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Elektroporatie van gesneden menselijke corticale organoïden voor onderzoek naar de genfunctie

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67598

⸱

29 november 2024

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Therapies Dresden, TUD Dresden University of Technology

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we de acute genetische manipulatie van gesneden menselijke corticale organoïden door elektroporatie. Deze corticale organoïdemodellen zijn bijzonder vatbaar voor injectie, aangezien ventrikelachtige structuren gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd na het snijden, waardoor functioneel onderzoek naar de ontwikkeling van de menselijke corticale ontwikkeling, neurologische ontwikkelingsstoornissen en corticale evolutie mogelijk is.

Samenvatting

Menselijke corticale organoïden zijn belangrijke hulpmiddelen geworden voor het bestuderen van de ontwikkeling van het menselijk brein, neurologische ontwikkelingsstoornissen en de evolutie van het menselijk brein. Studies die de genfunctie analyseren door overexpressie of knock-out zijn instrumenteel geweest in diermodellen om mechanistische inzichten te verschaffen in de regulatie van de ontwikkeling van de neocortex. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor CRISPR/Cas9-gemedieerde acute genknock-out door elektroporatie van gesneden menselijke corticale organoïden. Het snijden van corticale organoïden helpt bij de identificatie van ventrikelachtige structuren voor injectie en daaropvolgende elektroporatie, waardoor dit een bijzonder geschikt model is voor acute genetische manipulatie tijdens de ontwikkeling van de menselijke corticale ontwikkeling. We beschrijven het ontwerp van gids-RNA's en de validatie van targeting-efficiëntie in vitro en in corticale organoïden. Elektroporatie van corticale organoïden wordt uitgevoerd in mid-neurogene stadia, waardoor de meeste belangrijke celklassen in de zich ontwikkelende neocortex kunnen worden aangevallen, waaronder apicale radiale glia, basale voorlopercellen en neuronen. Alles bij elkaar genomen vertegenwoordigt de elektroporatie van gesneden menselijke corticale organoïden een krachtige techniek om de genfunctie, genregulatie en celmorfologie tijdens de corticale ontwikkeling te onderzoeken.

Inleiding

De neocortex verwijst naar de buitenste laag van de hersenhelften en is een structuur die uniek is voor zoogdieren. De neocortex vertegenwoordigt de zetel van hogere cognitieve functies 1,2,3,4,5. Tijdens de ontwikkeling geven neurale stam- en voorlopercellen aanleiding tot neuronen in een proces dat neurogenese wordt genoemd. Functionele studies die de ontwikkeling van de menselijke neocortex onderzoeken, vormen de basis voor het ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulatie van menselijke neurale stamcellen, neurale pathologieën en de evolutie van het menselijk brein 2,6,7.

Historisch gezien waren studies naar de ontwikkeling van de menselijke hersenen gebaseerd op beschrijvende histologische benaderingen met behulp van post-mortem weefsel, met recentere vrij zwevende weefselkweeksystemen die functioneel onderzoek met menselijk foetaal weefsel mogelijk maakten 8,9. Bovendien werd aangetoond dat menselijk foetaal hersenweefsel het vermogen heeft om zichzelf te organiseren tot langdurig expanderende organoïden10. Onderzoek naar foetaal weefsel heeft belangrijke inzichten opgeleverd in de menselijke ontwikkeling11,12, maar de beperkte beschikbaarheid van weefsel en ethische overwegingen beperken de wijdverbreide toepassing ervan voor mechanistische studies van de ontwikkeling van de menselijke hersenen. In het afgelopen decennium zijn protocollen ontwikkeld die het mogelijk maken om driedimensionale neurale organoïden te genereren uit menselijke pluripotente stamcellen (hPSC), waaronder door mensen geïnduceerde PSC (hiPSC)13,14.

Cerebrale organoïden vertonen belangrijke kenmerken van de zich ontwikkelende hersenen, zoals de vorming van ventrikelachtige structuren, apicobasale polariteit, corticale cytoarchitectuur, interkinetische nucleaire migratie tijdens radiale gliadeling en neuronale migratie. Belangrijk is dat deze nieuwe humane organoïdemodellen kenmerken van de zich ontwikkelende hersenen van de mens recapituleren die niet goed zijn gemodelleerd in de muis, inclusief evolutionair relevante belangrijke neurale voorlopertypen, in het bijzonder basale radiale glia (of buitenste radiale glia)7,14,15. Verschillende beperkingen van vroege cerebrale organoïde-protocollen - zoals problemen met de heterogeniteit van organoïden, beperkte toevoer van voedingsstoffen naar de binnenkern en gevarieerde regionale identiteit - zijn aangepakt in recente protocolverbeteringen en verdere verbeteringen kunnen worden verwacht in de komende jaren 15,16,17,18,19. Menselijke cerebrale en corticale organoïden zijn snel sleutelmodellen geworden om de ontwikkeling van de menselijke corticale te bestuderen20, neurologische aandoeningen 21,22,23,24 en hersenevolutie 25,26,27,28,29, en om grootschalige screeningbenaderingen uit te voeren 30,31,32.

Voor acute genetische manipulatie zijn twee methoden voornamelijk gebruikt in diermodellen van de ontwikkeling van neocortex: virale afgifte door infectie van doelwitcellen33 en in utero of in vitro elektroporatie34,35. Injectie van DNA - en, meer recentelijk, CRISPR/Cas9 ribonucleoproteïne (RNP) complexen36 - in de laterale ventrikels, gevolgd door elektroporatie, biedt het voordeel dat specifieke delen van de hersenen kunnen worden aangevallen op basis van de oriëntatie van de elektroporatie-elektroden. Elektroporatie omvat korte elektrische pulsen die de permeabiliteit van het celmembraan tijdelijk verhogen, waardoor DNA en andere geladen moleculen in cellen kunnen worden geïntroduceerd. In utero werd elektroporatie voor het eerst uitgevoerd bij de muis37, waar het al snel een algemeen toegepaste methodologie werd voor ontwikkelingsneurobiologie. De methode werd vervolgens ook toegepast op andere soorten, zoals de rat38,39 en de fret 40,41,42, een gyrencephalische soort die wordt gebruikt om neocortexexpansie en corticale vouwing te bestuderen 3,43,44,45.

Elektroporatie is ook een belangrijke methode geworden in het onderzoek naar organoïden van de menselijke hersenen46. In cerebrale organoïden is elektroporatie toegepast om celmorfologie en neuronale axonen te visualiseren14,47, om gen-knockdown-reagentia af te leveren 22,48,49 en voor onderzoek naar genfunctie door overexpressie50. De methode is niet beperkt tot menselijke modellen, maar is ook toegepast voor genetische modificatie van cerebrale organoïden van primaten50,51. Bovendien is de elektroporatie van corticale organoïden gegenereerd in een Spin Ω draaiende bioreactor beschreven52.

In dit protocol schetsen we de elektroporatie van gesneden menselijke corticale organoïden15 voor studies naar de genfunctie in de corticale ontwikkeling. Hersenregio-specifieke organoïden verhogen de reproduceerbaarheid en consistentie, die cruciaal zijn voor het succes van kwantitatieve analyse, bijvoorbeeld bij ziektemodellering. In het gesneden humane corticale organoïde protocol15 worden krachtige patroonsignalen toegepast tijdens iPSC-differentiatie om een homogene populatie van dorsale voorhersenvoorlopers te verkrijgen, gevolgd door de toepassing van kweekmedia die weefselgroei bevorderen met minder instructieve signalen53,54. Het is aangetoond dat het snijden van corticale organoïden de celdood vermindert als gevolg van een verminderde beschikbaarheid van voedingsstoffen en zuurstof in de organoïdekern15. Bovendien ondersteunt slicing de ontwikkeling van ventrikelachtige structuren die overvloedige basale radiale glia bevatten, met aanhoudende neurogenese die leidt tot de vorming van een geëxpandeerd corticaal plaatachtig gebied15. Het herhaalde snijden in dit protocol maakt deze corticale organoïden ook bijzonder geschikt voor elektroporatie, omdat de lumen van het ventrikel gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd en aangepakt door middel van injectie. Elektroporatie van gesneden corticale organoïden is toegepast om genregulerende regio's en corticale evolutie te bestuderen26,55.

Tijdens de elektroporatieprocedure wordt het injectiemengsel afgeleverd in het lumen van ventrikelachtige structuren. Bij toepassing van een gepulseerd elektrisch veld wordt het mengsel opgenomen door apicale radiale glia die langs het ventrikel lopen. Naarmate apicale radiale glia zich delen en aanleiding geven tot meer toegewijde celtypen4, worden de geëlektroporiseerde middelen doorgegeven aan basale voorlopercellen en neuronen. Geëlektroporeerde nakomelingen worden na 3 dagen verdeeld in de ventriculaire zone (VZ) en subventriculaire zone (SVZ) en beslaan het grootste deel van de corticale wand, inclusief de corticale plaat (CP)-achtige regio, 7 dagen na elektroporatie tijdens mid-neurogene stadia26,55.

Hier beschrijven we CRISPR/Cas9-gemedieerde genverstoring56 door elektroporatie in gesneden menselijke corticale organoïden26. Daarnaast kan de elektroporatiemethode ook worden toegepast voor genoverexpressie, visualisatie van celmorfologie en cellulaire processen door expressie van fluorescerende eiwitten, levering van plasmidebibliotheken voor Massive Parallel Reporter Assays (MPRA), levering van hulpmiddelen voor het bewerken van epigenoom en labeling van cellen voor live beeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten met door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen die zijn uiteengezet in de Verklaring van Helsinki van 1964 en zijn goedgekeurd door de ethische toetsingscommissie van het Universitair Ziekenhuis van Dresden (IRB00001473; IORG0001076; ethisch goedkeuringsnummer SR-EK-456092021).

1. Ontwerp van gids-RNA's voor acute CRISPR/Cas9-gemedieerde gen-knock-out

  1. Ontwerp een paar gids-RNA's (gRNA's) gericht op hetzelfde exon met een afstand van idealiter 7-11 bp (vermijd veelvouden van 3 bp) tussen de protospacer aangrenzende motieven (PAM's) om de kans op eiwitverstoring te vergroten met behulp van software of online tools.
    OPMERKING: Idealiter zouden exonen die functionele domeinen coderen het doelwit moeten zijn. Als alternatief kunnen de eerste exonen van het transcript worden gekozen (Figuur 1A). Selecteer de gids-RNA's op basis van de activiteitsscore (dicht bij 1)57 en de specificiteitsscore (dicht bij 100%)58.

2. Cultuur van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

  1. Om menselijke corticale organoïden te genereren en de gRNA-functie te valideren, gebruikt u de hiPSC-lijn CRTDi004-A59 die is afgeleid van een gezonde donor.
  2. Kweek de iPSC's zoals eerder beschreven60 op basale membraanmatrix gecoate 6-putjes platen in stamcelmedium onder standaardomstandigheden (37 °C, 5% CO2). Geïnduceerde PSC's moeten worden gepasseerd met 80% confluentie met behulp van een enzym voor eencellige dissociatie met suppletie van ROCK-routeremmer (1:1.000) gedurende de eerste 24 uur.
    OPMERKING: Andere iPSC-lijnen kunnen worden gebruikt voor het genereren van organoïden en gRNA-validatie.

3. Extractie van genomisch DNA uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

  1. Gebruik 2 putjes van 80%-90% confluente hiPSC van een plaat met 6 putjes voor genomische DNA-extractie. Dissocieer de cellen van de plaat met een enzym om een eencellige suspensie te maken. Neem de cellen op in 1 ml stamcelmedium (totaal volume), draai vervolgens 10 minuten op 600 x g en verwijder het supernatant.
  2. Resuspendeer de celpellet in 250 μL lysisbuffer (50 mM TrisHCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 0,5 % SDS, 5 mM EDTA in H2O) en 12,5 μL proteïnase K (10 mg/ml bouillon). Incubeer gedurende 2 uur bij 55 °C en 250 tpm.
  3. Meng in 100 μL 5 mM NaCl. Draai gedurende 10 minuten bij 18.000 x g bij 4 °C en breng het bovenstaande over in nieuwe reactiebuizen van 1,5 ml.
  4. Voeg 250 μL isopropanol toe, keer de buisjes meerdere keren om en draai gedurende 15 minuten op 18.000 x g bij 4 °C.
  5. Verwijder het supernatant, was met 500 μl 70 % EtOH (graad moleculaire biologie), keer de buisjes om en centrifugeer gedurende 10 minuten op 18.000 x g op 4 °C.
  6. Verwijder ten slotte het bovenstaande volledig door het voorzichtig af te pipetteren en de geopende reactiebuisjes op keukenpapier te drukken.
  7. Laat de pellet 10 minuten aan de lucht drogen bij RT en los de pellet vervolgens 30 minuten op in 100 μL nucleasevrij water bij 37 °C.
  8. Meet de concentratie van het DNA met een spectrometer. Geïsoleerd genomisch DNA is gedurende enkele maanden stabiel bij -20 °C.

4. Verificatie van sjabloonherkenning door gRNA (in vitro)

OPMERKING: Als de eerste benadering om succesvolle sjabloonherkenning door gRNA's te valideren, voert u een in vitro Cas9-reactie uit waarbij dubbelstrengs DNA wordt gesplitst in twee fragmenten die kunnen worden onderscheiden door agarosegelelektroforese 40,61,62.

  1. Om de sjabloon te genereren, voert u een polymerasekettingreactie (PCR) uit met een high-fidelity PCR-mastermix en 10 μM-primers op genomisch DNA geïsoleerd uit hiPSC (sectie 3) onder de volgende cyclusomstandigheden: initiële denaturatie bij 98 °C gedurende 30 s, 40 cycli [98 °C, 10 s; 60 °C, 30 s; 72 °C, 1 min] en uiteindelijke rek bij 72 °C gedurende 5 min.
    1. Pas de gloeitemperatuur aan volgens de PCR-primers. Zorg ervoor dat het amplicon 800 bp tot 1,5 kb groot is met asymmetrische lokalisatie van de gRNA-bindingsplaatsen.
    2. Los het PCR-product op door middel van gelelektroforese op een 1,5% agarosegel, knip de overeenkomstige band van de gel door en extraheer het DNA26.
    3. Meet de DNA-concentratie van het geëxtraheerde PCR-product met een spectrometer.
  2. Stel het functionele gRNA samen door 10 μM CRISPR-RNA (crRNA, aangepaste sequentie, 100 μM-voorraad) en 10 μM tracrRNA (100 μM-voorraad) te combineren in nucleasevrije duplexbuffer (5 μL totaal volume). Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij 95 °C en laat het vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur (RT).
  3. Creëer het ribonucleoproteïne (RNP)-complex door 10 μM van het gRNA uit stap 4.2 en 1 μM Cas9-enzym (van Streptococcus pyogenes, 62 μM-voorraad) te combineren in PBS gedurende 15 minuten bij RT (25 μL totaal volume).
  4. Om de in-vitrodigestiereactie uit te voeren, mengt u 1 μM van het RNP-complex (vanaf stap 4.3) met 0,1 μM DNA-sjabloon (PCR-product uit stap 4.1) en 1x Cas9-nucleasereactiebuffer (met 200 mM HEPES, 1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM EDTA; pH 6,5; kan in hoeveelheden worden opgeslagen bij -20 °C).
    1. Vul tot een eindvolume van 10 μL met nucleasevrij water.
    2. Incubeer de reactie gedurende 1 uur bij 37 °C.
    3. Voeg 2 mg/ml proteïnase K toe en incubeer nog 10 minuten bij 56 °C om het DNA-substraat van het Cas9-enzym vrij te maken. Bewaar het verteerde reactiemengsel bij 4 °C of -20 °C tot de definitieve analyse.
      OPMERKING: Het gebruik van een molaire verhouding van 10:1 van Cas9-RNP:DNA-substraat wordt aanbevolen om de beste splitsingsefficiëntie te verkrijgen. Verdun het PCR-product indien nodig in nucleasevrij water tot de vereiste concentratie. Als negatieve controle kan een reactiemix zonder het gRNA- of Cas9-enzym worden meegenomen.
  5. Visualiseer gesplitste producten door agarosegelelektroforese op een 2% agarosegel.
    OPMERKING: Idealiter zouden twee banden van verschillende grootte zichtbaar moeten zijn en zou de sjabloonband moeten zijn verdwenen of sterk verkleind voor efficiënte gRNA's (Figuur 1B).

5. Verificatie van de gRNA-functie in door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen

OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de efficiëntie te testen van gRNA's die gericht zijn op dezelfde cellijn waaruit corticale organoïden zullen worden gegenereerd26. Hiervoor worden RNP-complexen die de relevante gRNA's bevatten, samen met een GFP-expressieplasmide getransfecteerd in hiPSC's, de cellen worden gedurende 3 dagen gekweekt en genomisch DNA wordt vervolgens geïsoleerd voor sequencing-analyse. Voor elke gRNA-test zijn ongeveer 200.000 cellen nodig. Cellen mogen niet meer dan 70%-80% confluent zijn en moeten na ontdooien minstens twee keer zijn gepasseerd. Het is belangrijk om een negatieve controle (gLACZ)36,63 en een schijntoestand (nucleofectieoplossing zonder RNP) mee te nemen.

  1. Verander het medium van de hiPSC om ROCK-remmer (1:1.000) 2 uur voorafgaand aan het experiment op te nemen om de levensvatbaarheid van de cellen in een celkweekkap te vergroten.
  2. Smeer het juiste aantal putjes van een plaat met 6 putjes in met een basale membraanmatrix.
  3. Start de nucleofectoreenheid ("X-eenheid" voor strips met 16 putjes) en selecteer het programma "ES-cellen, H9" als voorgeprogrammeerd (puls CB150). Selecteer het juiste aantal putjes van de strip.
  4. Bereid de RNP-complexen voor door 24 μM crRNA en 24 μM tracrRNA in duplexbuffer te combineren.
    1. Incubeer gedurende 5 minuten bij 95 °C en laat vervolgens afkoelen tot RT, zoals beschreven in stap 4.2.
    2. Verdun intussen het Cas9-enzym tot 8 μM in PBS.
    3. Combineer 3 μL gRNA en 3 μL Cas9 en incubeer 15 minuten bij RT om de RNP samen te stellen.
      OPMERKING: Een molaire verhouding van 3:1 gRNA:Cas9 geeft een optimale splijtingsefficiëntie. Om gRNA's als een paar te testen, bereidt u elke RNP afzonderlijk voor en combineert u aan het einde 1,5 μL van elke RNP.
  5. Bereid tijdens de 15 minuten durende RNP-incubatie de hiPSC voor op nucleofectie onder een celkweekkap.
    1. Vervang de basale membraancoating door 1,5 ml stamcelmedium aangevuld met ROCK-remmer (1:1.000) en 1x penicilline/streptomycine per putje.
    2. Bereid de nucleofectieoplossing als een mastermix op ijs volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Maak hiPSC's los van de plaat om een suspensie met één cel te maken (zoals beschreven in sectie 2) en tel de cellen met Trypan Blue-kleuring in een Neubauer-telkamer.
    4. Pellet 200.000 levende cellen per gRNA-paar bij 600 x g gedurende 5 min.
  6. Voeg in de celkweekkap, op ijs, 3 μL RNP toe aan 20 μL nucleofectieoplossing plus 0,2 μg/μL pCAG-GFP plasmide.
  7. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in de 23 μL van de uiteindelijke nucleofectiemix en breng ze over in 1 putje van een nucleofectiestrip met 16 putjes op ijs.
  8. Zodra alle omstandigheden in de strip zitten, plaatst u deze in de nucleofector machine X-eenheid buiten de kap en drukt u op de Start-knop om de nucleofectie te starten.
  9. Transporteer vervolgens de nucleofectiestrip terug onder de celkweekkap en breng de nucleofectieve cellen over naar de voorbereide plaat met 6 putjes door de stripputjes uit te spoelen met wat medium van de plaat.
  10. Kweek de hiPSC gedurende 3 dagen, verwisselend medium met 1x penicilline/streptomycine per dag. Na 24 uur is de ROCK-remmer niet meer nodig.
  11. Controleer op GFP-signaal onder een conventionele fluorescentiemicroscoop (Figuur 1C).
    1. Sorteer en verzamel op dag 3 GFP-positieve cellen door middel van fluorescerend geactiveerde celsortering (FACS).
    2. Bereid de sorteerbuffer voor met 2% FBS in PBS en houd deze op 4 °C.
    3. Koel een tafelcentrifuge af tot 4 °C. Bereid reactiebuisjes van 1,5 ml met 50 μl sorteerbuffer met ROCK-remmer (1:1.000) voor voor het verzamelen van cellen na FACS op ijs en 5 ml polystyreenbuisjes met ronde bodem met celzeefdoppen op ijs.
    4. Maak eencellige suspensies van de nucleofecte cellen.
    5. Resuspendeer de cellen in 1 ml stamcelmedium met ROCK-remmer (1:1.000) per monster en centrifugeer op 600 x g gedurende 5 minuten.
    6. Verwijder het bovenstaande en suspendeer de cellen opnieuw in 200 μL sorteerbuffer met ROCK-remmer (1:1.000), voeg vervolgens 0,4 μL DAPI (2 ng/μL) toe om levende cellen te identificeren met FACS.
    7. Pipetteer de celoplossing door de celzeefdop van de gekoelde buizen met ronde bodem om eventuele resterende celklonten te verwijderen.
      OPMERKING: DAPI kan de levensvatbaarheid van de cellen in de loop van de tijd in gevaar brengen, en daarom is het het beste om vers aan elk monster toe te voegen voordat u het sorteert.
    8. Sorteer 10.000 levende GFP-positieve levende (DAPI-negatieve) cellen in de eerder voorbereide reactiebuisjes van 1,5 ml met 50 μL sorteerbuffer die ROCK-remmer bevat (op ijs).
  12. Extraheer na FACS direct genomisch DNA uit gesorteerde cellen.
    1. Draai de verzamelde, gesorteerde cellen in de sorteerbuffer gedurende 10 minuten op 600 x g naar beneden.
    2. Verwijder het bovenstaande en neem de celpellet op in 250 μL lysisbuffer plus 12,5 μL proteïnase K per monster.
    3. Ga verder zoals beschreven in sectie 3.
    4. Los ten slotte de DNA-pellet op in 50 μL nucleasevrij water.
  13. Voer een PCR uit om een sjabloon voor Sanger-sequencing te genereren, zoals beschreven in stap 4.1. Gebruik als controle het DNA van de gLACZ-conditie en de primers gericht op het gen van interesse (dezelfde primers als gebruikt in sectie 4). Extraheer de juiste banden uit de agarosegelelektroforese, zuiver deze over een kolom en stuur deze op voor Sanger-sequencing.
  14. Lijn de resultaten van de Sanger-sequencing uit met behulp van een paarsgewijze, globale uitlijning.
    OPMERKING: Succesvolle targeting kan worden geïdentificeerd aan de hand van gesuperponeerde signalen of onvolledige sequenties als gevolg van willekeurige inserties/deleties rond de gRNA-bindingsplaats (Figuur 1D).

6. Genereren van gesneden menselijke corticale organoïden

OPMERKING: Menselijke corticale organoïden (hCO) worden gegenereerd volgens de gesneden neocorticale organoïde (SNO) methode, zoals eerder in detail beschreven15,60.

  1. Maak kleine hiPSC-kolonies los van 1 putje van een plaat met 6 putjes met 1 mg/ml collagenase door 30-40 minuten bij 37 °C in een incubator te incuberen. Smeer intussen een nieuwe 6-puts plaat in met de basale membraanmatrix.
    1. Stop het enzym met 1 ml stamcelmedium en verzamel de kolonies met een brede punt in 5 ml stamcelmedium in een conische buis van 15 ml.
      OPMERKING: Alle stappen die "pipetpunten met brede boring" vermelden, kunnen ook worden uitgevoerd met punten die tot een opening van ten minste 2 mm in diameter zijn gesneden.
    2. Zodra de kolonies zich op de bodem hebben gevestigd, verwijdert u het oude medium en vervangt u het door vers stamcelmedium.
    3. Verdeel de kolonies met een brede punt gelijkmatig over de gecoate plaat met 6 putjes met 1,5 ml stamcelmedium per putje.
    4. Kweek de hiPSC gedurende 2-3 dagen onder standaardomstandigheden.
  2. Zodra de hiPSC-kolonies een diameter van ongeveer 1,5 mm hebben bereikt, worden alle kolonies opnieuw losgemaakt met 1 mg/ml collagenase door gedurende maximaal 1 uur bij 37 °C te incuberen.
    1. Stop het enzym met 6 ml voorhersenmedium 11 15 en verzamel losgemaakte kolonies in een conische buis van 15 ml met behulp van brede uiteinden.
    2. Zodra de kolonies zich hebben gevestigd, verwijdert u het oude medium en wast u het met 5 ml voorhersenmedium 1.
    3. Breng ten slotte de kolonies over naar een ultra-lage gehechtheid 6-wells plaat met 3 ml voorhersenmedium, 1 per putje met brede uiteinden, en laat ze embryoïde lichamen (EB's) vormen. Deze stap geeft dag 0 van het protocol voor menselijke corticale organoïden aan. Volg vanaf hier het protocol zoals gepubliceerd15.
  3. Veranker op dag 7 EB's in een basale membraanmatrix, met ongeveer 20 EB's per "koekje" en kweek gedurende 1 week in het medium van de voorhersenen 2 15. Maak op dag 14 mechanisch organoïden los uit de matrix en ga verder met kweken in 6-well ultra-lage hechtingsplaten in voorhersenmedium 315 op een orbitale schudder bij 120 tpm.
  4. Vanaf dag 35 wordt 1% v/v basale membraanmatrix aangevuld met het medium.
  5. In week 6 worden de organoïden ingebed in agarose met een laag smeltpunt van 3% en snijdt u op een vibratoom in plakjes van 500 μm dik (Figuur 2A, B), die de zuurstof- en voedingsstoffentoevoer door de organoïden ondersteunt. Herhaal indien nodig het snijden van organoïden elke 4 weken.
  6. Vanaf dag 70 worden organoïden in het voorhersenmedium 415 gekweekt.

7. Elektroporatie van gesneden menselijke corticale organoïden

OPMERKING: Menselijke corticale organoïden kunnen worden geïnjecteerd en geëlektropoleerd zodra ventrikelachtige structuren zichtbaar zijn, ongeveer vanaf week 2. Voor organoïden in een later stadium (week 5 en ouder) is de elektroporatie het meest efficiënt en is de levensvatbaarheid van de cellen het beste wanneer de procedure 2 dagen na het snijden van de organoïden wordt uitgevoerd26,55. Na het snijden zijn ventrikelachtige structuren gemakkelijk te herkennen, wat de injectieprocedure vergemakkelijkt (Figuur 2C, D). Bovendien blijven ventrikelachtige structuren enige tijd na het snijden gedeeltelijk open, waardoor overtollige injectieoplossing kan ontsnappen, wat de integriteit van de adherens-verbindingsriem langs de ventrikels beschermt. Het snijschema kan worden verschoven om overeen te komen met de experimentele tijdlijn. Het snijden moet elke 3-4 weken worden herhaald voor langdurige culturen.

  1. Trek aan de capillairen van borosilicaatglas voor injecties aan een microcapillaire trekker met de volgende instellingen: P 500, warmte 600, trek 30, snelheid 40, tijd 1. Bewaar de haarvaten in een grote petrischaal met behulp van tape voor fixatie.
  2. Bereid op de dag van elektroporatie het CRISPRR/Cas9 RNP-complex vers zoals beschreven in stap 5.4 met een eindconcentratie van 24 μM RNP. Co-elektroporatie van 0,1 μg/μL pCAG-GFP-plasmide (of van een andere fluorescerende reporter) ondersteunt de identificatie van geëlektroporeerde cellen. Voeg bovendien 0,1% Fast Green-oplossing in water toe aan het uiteindelijke injectiemengsel, waardoor de succesvolle levering van het mengsel kan worden bevestigd.
    OPMERKING: Maak afzonderlijke mengsels voor elk gen van belang en de gLACZ-controle .
  3. Verwarm de oplossing van Tyrode (één pak Tyrode's zout, 1 g NaHCO3, 13 ml 1 M HEPES pH 7,25 in 1 L dH2O) voor tot 37 °C. Bewaar de resterende Tyrode's oplossing enkele maanden bij 4 °C.
  4. Selecteer hCO met goed ontwikkelde ventrikelachtige structuren (Figuur 2E) en gooi alle organoïden weg die geen ventrikelachtige structuren vertonen (Figuur 2F). Breng maximaal 10 organoïden over in een petrischaaltje van 6 cm met Tyrode-oplossing en bewaar de resterende hCO's in de incubator.
  5. Vul een glazen microcapillair met 10 μl injectieoplossing met behulp van een microloader-pipetpunt en open het capillair door het dunne uiteinde met een pincet af te knijpen. Controleer of het capillair open is door wat injectiemix in de Tyrode-oplossing te laten vloeien. Voer de injecties uit met een microinjector in een continue instelling met gecontroleerde poort via een voetschakelaar.
  6. Breng het capillair in het midden van ventrikelachtige structuren (Figuur 2C) en injecteer 0,2-0,5 μL van het mengsel door op de voetschakelaar te drukken.
    OPMERKING: Er kunnen maximaal 5 ventrikels per hCO worden geïnjecteerd, met een totaal van 7-8 hCO's verwerkt per duplicaat. Idealiter zouden ventrikels die naar de buitenkant van de hCO zijn gericht, moeten worden gericht, aangezien deze over het algemeen het best ontwikkeld zijn (Figuur 2G, H).
  7. Gebruik een fijne tang om de organoïde tegen te duwen om de beweging te beperken. Pak de organoïden niet echt vast (Figuur 2C).
  8. Gebruik na injectie een pipetpunt met brede boring om 1-2 organoïden over te brengen naar een elektroporatiekamer met Tyrode's oplossing (Figuur 2C, D).
  9. Oriënteer de geïnjecteerde organoïden naar de elektroden toe, zodat apicale radiale glia in ventrikelachtige gebieden die naar de buitenkant van de organoïde zijn gericht, worden aangevallen.
  10. Bevestig de kabels aan de elektroporatiekamer met de geïnjecteerde kant van de organoïde naar de positieve pool (anode; Figuur 2D).
  11. Druk op de pulsknop van de elektroporatormachine om te elektroporeren met vijf pulsen van 38 V gedurende elk 50 ms met tussenpozen van 1 s.
    OPMERKING: De elektroporatie-instellingen kunnen afhankelijk zijn van de beschikbare elektroporator en moeten mogelijk worden geoptimaliseerd.
  12. Herhaal de injectie- en elektroporatiestappen totdat het gewenste aantal organoïden is verwerkt.
  13. Verzamel de geëlektroporeerde organoïden in een medium bij RT totdat alle monsters voor dezelfde aandoening zijn verwerkt. Zorg ervoor dat ze zich in totaal niet langer dan 30 minuten buiten de couveuse bevinden.
  14. Breng de geëlektropoleerde hCO's vervolgens terug in de daarvoor bestemde voedingsbodem en kweek ze de eerste 24 uur zonder te schudden.
    OPMERKING: Na 2-3 dagen moet het GFP-signaal zichtbaar zijn in geëlektropoleerde hCO's onder een fluorescerende stereoscoop (Figuur 2H). Het tijdstip van de analyse na elektroporatie moet worden gekozen afhankelijk van de biologische vraag die moet worden beantwoord. Na 3-7 dagen bevinden GFP-positieve cellen zich in de VZ, SVZ en CP15,60.

8. Fixatie en cryosectie van geëlektropoleerde menselijke corticale organoïden

  1. Fixeer geëlektropoleerde organoïden in 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 30 minuten bij RT in een reactiebuis van 2 ml.
    LET OP: PFA is giftig en kankerverwekkend. Voer alle stappen met PFA uit onder een zuurkast. Het gebruik van nitrilhandschoenen en een veiligheidsbril wordt sterk aanbevolen.
  2. Eenmaal 5 minuten in PBS wassen en bewaren in steriel gefilterde 30% sucrose in PBS bij 4 °C tot het weefsel volledig verzadigd is met sucrose.
  3. Veranker vaste organoïden in een inbeddingsmedium voor ingevroren weefselmonsters plus 15% sucrose in PBS in blokken op droogijs.
  4. Bereid secties van 20-30 μm voor in een cryostaat en verzamel het weefsel op zelfklevende dia's26,64.
    OPMERKING: Het protocol kan worden gepauzeerd zodra de vaste organoïden in sucrose zijn (stabiel bij 4 °C gedurende enkele maanden) of ingebed in een inbeddingsmedium (ingevroren blokken kunnen enkele maanden tot jaren in luchtdichte zakken bij -20 °C worden bewaard).

9. Immunohistochemische analyse van geëlektroporeerde menselijke corticale organoïden

  1. Voor immunohistochemische analyse26,64 wordt het antigeen opgehaald in citraatbuffer (10 mM natriumcitraat, 0,05% polysorbaat 20 in dH2O, pH 6,0) gedurende 1 uur bij 70 °C in een waterbad.
  2. Was eenmaal in PBS gedurende 5 minuten, droog de dia's kort en omcirkel de secties met een waspen.
  3. Blus af met 0,1 M glycine in PBS (pH 7,4) gedurende 30 minuten bij RT en was het vervolgens twee keer met PBS gedurende elk 5 minuten.
  4. Bedek de secties met blokkeerbuffer (10% paardenserum, 0,1% Octoxinol 9 in PBS) en incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
  5. Bereid de primaire antilichamen in blokkeerbuffer en incubeer op secties gedurende een nacht bij 4 °C.
  6. Was de volgende dag drie keer met PBS gedurende 5 minuten elk, incubeer met secundaire antilichamen en DAPI in blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij RT en was drie keer opnieuw met PBS gedurende elk 5 minuten.
  7. Monteer de dia's in het montagemedium en beeld ze af met een fluorescentiemicroscoop (Afbeelding 3).
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een antilichaam tegen de fluorofoor op te nemen die in het injectiemengsel wordt gebruikt om gerichte cellen te identificeren, aangezien het natieve signaal vaak wordt gedoofd na fixatie. Antilichamen en kleurstoffen die worden gebruikt voor immunofluorescentiekleuring, zoals weergegeven in figuur 3, worden vermeld in tabel 1.

10. Verificatie van CRISPR/Cas9-gemedieerde knock-out op eiwitniveau

  1. Om de knock-out op eiwitniveau te verifiëren, voert u immunohistochemie uit voor het doeleiwit op de geëlektroporeerde organoïden (Figuur 3I).
  2. Beeld zowel de gLACZ-regeling als de beoogde organoïden af met dezelfde instellingen om de fluorescentie-intensiteit te kunnen vergelijken (Figuur 3I, J). Doe dit op een zonespecifieke manier om het effect op de verschillende celtypen van de zich ontwikkelende neocortex te vergelijken. Tel cellen in ImageJ/Fiji (plugin Cell Counter) of door te segmenteren met behulp van de StarDist plugin65.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

CRISPR/Cas9-gemedieerde genablatie vereist het ontwerp van gRNA's. Over het algemeen werkt het goed om een van de eerste exonen van een interessant gen te targeten met een paar gRNA's op een afstand van 7-11 bp (waarbij veelvouden van 3 bp worden vermeden) (Figuur 1A). Als eerste test kan de efficiëntie van sjabloonherkenning door gRNA's in vitro worden ondervraagd met behulp van een PCR-sjabloon 26,40,62.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Menselijke cerebrale en corticale organoïden zijn sleutelmodellen geworden om de ontwikkeling van de menselijke neocortex te onderzoeken 7,16,17. Voor het modelleren van menselijke aandoeningen zijn isogene hiPSC-lijnen en organoïden de gouden standaard geworden68. Aangezien het genereren van nieuwe iPSC-lijnen echter tijdrovend en kostbaar is, is de acute manipulatie van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

We zijn de faciliteiten van de CRTD- en Dresden Concept-partners dankbaar voor de uitstekende ondersteuning, met name K. Neumann en haar team bij de Stem Cell Engineering Facility, H. Hartmann en haar team bij de Light Microscopy Facility, A. Gompf en haar team bij de Flow Cytometry Facility en Hartmut Wolf van de MPI-CBG-werkplaats voor de bouw van de elektroporatiekamers. We danken Joshua Schmidt voor zijn feedback op het manuscript. MA erkent financiering van het Center for Regenerative Therapies TU Dresden, de DFG (Emmy Noether, AL 2231/1-1) en de Schram Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL PP Centrifuge Tubes, conicalCorning430791
4D-Nucleofector Core UnitLonza
4D-Nucleofector X UnitLonza
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer capCorningFalcon 352235
6-well plate, nunclon treatedThermo Fisher140675Voor hiPSC-kweek
6-well plate, ultra low attachmentCorning3471Voor organoïdkweek
A83-01STEMCELL Technologies72022Forebrain medium 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Air compressorAerotec
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)Jackson Immuno Research703-545-155Secundaire antistof, RRID: AB_2340375; verdunning 1:1000
Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)InvitrogenA-31572Secundaire antistof, RRID: AB_162543; verdunning 1:1000
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmolIntegrated DNA technologiesAangepaste ontwerp (bestel als 2 nmol)
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNAIntegrated DNA technologies10725325 nmol
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3Integrated DNA technologies1081060100 µg, van Streptococcus pyogenes
Amphotericin B (Fungizone)Gibco15290018Forebrain medium 2, 3, en 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Anti-GFP primaire antistof (kip, polyklonaal)Abcamab13970RRID: AB_300798; verdunning 1:2000
Anti-PCGF4 primaire antistof (muis, monoklonaal)Millipore05-637 RRID: AB_309865; verdunning 1:300
ApoTome fluorescente microscoopZeiss
Ascorbic AcidSigma Aldrich1043003Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
B27-supplement (+ vitamin A)Gibco17504044Forebrain medium 3, 4   (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Banana to Micrograbber Cable KitHarvard Apparatus BTX45-0216
Biometra TRIO-Thermocycler (PCR-machine)Analytik Jena846-2-070-723
Capillaries, borosilicaatglas met filament, OD 1.2 mm; ID 0.69 mm; 10 cm lengteScience ProductsBF120-69-10Moet getrokken worden tot specifieke dikte
CHIR-99021STEMCELL Technologies72052Forebrain medium 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Collagenase Type IVGibco17104019
CRTDi004-AStem Cell Engineering Facility at CMCB DDhttps://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-ASingle-cell aangepaste hiPSC-lijn van gezonde donor
DAPIRoche102362760011 mg/mL stock, gebruik 1:1000 verdund voor IF
Dibutyryl-cAMPSTEMCELL Technologies73884Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2650
DMEM/F-12, HEPESFisher Scientific31330095Forebrain medium 1, 2, en 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
DorsomorphinSTEMCELL Technologies72102Forebrain medium 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dumont #55 Forceps, straigth, 11 cmFine Science Tools11295-51
ECM 830 Square Wave Electroporation SystemHarvard Apparatus BTX45-2052
EthanolSigma Aldrich32205-1L-M
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma AldrichEDS-500G
Fast Green FCFSigma AldrichF7252
Fetal Bovine Serum (FBS)GE Healthcare SH30070.03 
Flaming/Brown Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-97Voor het trekken van microcapillairen
Geneious PrimeGraphPad Software LLC d.b.a GeneiousSoftware versie 2024.0.5
gLACZKalebic et al., 2016; Platt et al., 20145'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; onderstreepte nucleotiden = PAM
GlutaMAXGibco 35050038Forebrain medium 1, 2, 3, en 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
GlycineSigma AldrichG8898
gPCGF4 KO1this paper5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (komt overeen met de KO-beelden in figuur 3I+J)
gPCGF4 </

Referenties

  1. Rakic, P. Evolution of the neocortex: A perspective from developmental biology. Nat Rev Neurosci. 10 (10), 724-735 (2009).
  2. Pollen, A. A., Kilik, U., Lowe, C. B., Camp, J. G. Human-specific genetics: New tools to explore the molecular and cellular basis of human evolution. Nat Rev Genet. 24, 687-711 (2023).
  3. Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Deconstructing cortical folding: Genetic, cellular and mechanical determinants. Nat Rev Neurosci. 20 (3), 161-176 (2019).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141 (11), 2182-2194 (2014).
  5. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  6. Bölicke, N., Albert, M. Polycomb-mediated gene regulation in human brain development and neurodevelopmental disorders. Dev Neurobiol. 82 (4), 345-363 (2022).
  7. Arlotta, P., Pasca, S. P. Cell diversity in the human cerebral cortex: From the embryo to brain organoids. Curr Opin Neurobiol. 56, 194-198 (2019).
  8. Long, K. R., et al. Extracellular matrix components HAPLN1, lumican, and collagen I cause hyaluronic acid-dependent folding of the developing human neocortex. Neuron. 99 (4), 702-719.e6 (2018).
  9. Namba, T., et al. Human-specific arhgap11b acts in mitochondria to expand neocortical progenitors by glutaminolysis. Neuron. 105 (5), 867-881.e9 (2020).
  10. Hendriks, D., et al. Human fetal brain self-organizes into long-term expanding organoids. Cell. 187 (3), 712-732.e38 (2024).
  11. Voices: The importance of fetal tissue research. Cell Stem Cell. 24 (3), 357-359 (2019).
  12. Temple, S., Goldstein, L. S. B. Why we need fetal tissue research. Science. 363 (6424), 207(2019).
  13. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  14. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  15. Qian, X., et al. Sliced human cortical organoids for modeling distinct cortical layer formation. Cell Stem Cell. 26 (5), 766-781.e9 (2020).
  16. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Dev Biol. 420 (2), 199-209 (2016).
  17. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  18. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
  19. Andrews, M. G., et al. Lif signaling regulates outer radial glial to interneuron fate during human cortical development. Cell Stem Cell. 30 (10), 1382-1391.e5 (2023).
  20. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  21. Bershteyn, M., et al. Human ipsc-derived cerebral organoids model cellular features of lissencephaly and reveal prolonged mitosis of outer radial glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449.e4 (2017).
  22. Klaus, J., et al. Altered neuronal migratory trajectories in human cerebral organoids derived from individuals with neuronal heterotopia. Nat Med. 25 (4), 561-568 (2019).
  23. Qian, X., et al. Loss of non-motor kinesin KIF26A causes congenital brain malformations via dysregulated neuronal migration and axonal growth as well as apoptosis. Dev Cell. 57 (20), 2381-2396.e13 (2022).
  24. Watanabe, M., et al. Self-organized cerebral organoids with human-specific features predict effective drugs to combat zika virus infection. Cell Rep. 21 (2), 517-532 (2017).
  25. Benito-Kwiecinski, S., et al. An early cell shape transition drives evolutionary expansion of the human forebrain. Cell. 184 (8), 2084-2102.e19 (2021).
  26. Cubillos, P., et al. The growth factor epiregulin promotes basal progenitor cell proliferation in the developing neocortex. EMBO J. 43 (8), 1388-1419 (2024).
  27. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  28. Mora-Bermudez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. Elife. 5, e18683(2016).
  29. Pollen, A. A., et al. Establishing cerebral organoids as models of human-specific brain evolution. Cell. 176 (4), 743-756.e17 (2019).
  30. Esk, C., et al. A human tissue screen identifies a regulator of ER secretion as a brain-size determinant. Science. 370 (6519), 935-941 (2020).
  31. Fleck, J. S., et al. Resolving organoid brain region identities by mapping single-cell genomic data to reference atlases. Cell Stem Cell. 28 (6), 1177-1180 (2021).
  32. Li, C., et al. Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism. Nature. 621 (7978), 373-380 (2023).
  33. Janson, C. G., Mcphee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends Neurosci. 24 (12), 706-712 (2001).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
  35. Li, S., Li, Y., Li, H., Yang, C., Lin, J. Use of in vitro electroporation and slice culture for gene function analysis in the mouse embryonic spinal cord. Mech Dev. 158, 103558(2019).
  36. Kalebic, N., et al. CRISPR/cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Rep. 17 (3), 338-348 (2016).
  37. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  38. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of e16 rat embryos. J Vis Exp. 6, e236(2007).
  39. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
  40. Kalebic, N., Langen, B., Helppi, J., Kawasaki, H., Huttner, W. B. In vivo targeting of neural progenitor cells in ferret neocortex by in utero electroporation. J Vis Exp. (159), e61171(2020).
  41. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Mol Brain. 5, 24(2012).
  42. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biol Open. 2 (1), 95-100 (2013).
  43. Reillo, I., De Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
  44. Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, e41241(2018).
  45. Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
  46. Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Front Cell Neurosci. 13, 558(2019).
  47. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  48. O'neill, A. C., et al. A primate-specific isoform of plekhg6 regulates neurogenesis and neuronal migration. Cell Rep. 25 (10), 2729-2741.e26 (2018).
  49. Buchsbaum, I. Y., et al. Ece2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Rep. 21 (5), e48204(2020).
  50. Fischer, J., et al. Human-specific arhgap11b ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Rep. 23 (11), e54728(2022).
  51. Tynianskaia, L., Esiyok, N., Huttner, W. B., Heide, M. Targeted microinjection and electroporation of primate cerebral organoids for genetic modification. J Vis Exp. 193, e65176(2023).
  52. Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protoc. 3 (1), 101129(2022).
  53. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nat Protoc. 13 (3), 565-580 (2018).
  54. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling zikv exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  55. Noack, F., et al. Joint epigenome profiling reveals cell-type-specific gene regulatory programmes in human cortical organoids. Nat Cell Biol. 25 (12), 1873-1883 (2023).
  56. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with crispr-cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  57. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgrnas for crispr-cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  58. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of crispr-cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  59. Völkner, M., et al. Hbegf-tnf induce a complex outer retinal pathology with photoreceptor cell extrusion in human organoids. Nat Commun. 13 (1), 6183(2022).
  60. Schütze, T. M., Bölicke, N., Sameith, K., Albert, M. Brain Organoid Research. , Springer US. New York, NY. (2022).
  61. ALT-R CRISPR-cas9 system-in vitro. cleavage of target DNA with RNP complex. , At https://eu.idtdna.com/pages/products/crispr-genome-editing/alt-r-crispr-cas9-system#resources (2022).
  62. Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO J. 36 (17), 2642-2658 (2017).
  63. Platt, R. J., et al. CRISPR-cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  64. Florio, M., et al. Human-specific gene ARHGAP11B promotes basal progenitor amplification and neocortex expansion. Science. 347 (6229), 1465-1470 (2015).
  65. Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell Detection with Star-Convex Polygons. , Springer International Pubs. Cham. (2018).
  66. Wang, J. Y., Doudna, J. A. CRISPR technology: A decade of genome editing is only the beginning. Science. 379 (6629), eadd8643(2023).
  67. Hoffmann, J., et al. Canonical and non-canonical PRC1 differentially contribute to the regulation of neural stem cell fate. bioRxiv. , 2024(2024).
  68. Celotti, M., et al. Protocol to create isogenic disease models from adult stem cell-derived organoids using next-generation crispr tools. STAR Protoc. 5 (3), 103189(2024).
  69. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: Toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
  70. Arai, Y., et al. Neural stem and progenitor cells shorten s-phase on commitment to neuron production. Nat Commun. 2, 154(2011).
  71. Bedbrook, C. N., Deverman, B. E., Gradinaru, V. Viral strategies for targeting the central and peripheral nervous systems. Annu Rev Neurosci. 41, 323-348 (2018).
  72. Coquand, L., et al. A cell fate decision map reveals abundant direct neurogenesis bypassing intermediate progenitors in the human developing neocortex. Nat Cell Biol. 26 (5), 698-709 (2024).
  73. Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human brain organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2023).
  74. Andersen, J., et al. Generation of functional human 3D cortico-motor assembloids. Cell. 183 (7), 1913-1929.e26 (2020).
  75. Nwokoye, P. N., Abilez, O. J. Bioengineering methods for vascularizing organoids. Cell Rep Methods. 4 (6), 100779(2024).
  76. Cakir, B., Park, I. H. Getting the right cells. Elife. 11, e80373(2022).
  77. Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Menselijke hersenontwikkelingelectroporatietechniekgene knockoutCRISPR Cas9neurale progenitorcellenorganoïde-snedenimmunohistochemieapicale radiale gliaventrikelachtige structuren
Elektroporatie van gesneden menselijke corticale organoïden voor onderzoek naar de genfunctie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.