Dit protocol beschrijft een efficiënte, niet-chirurgische methode voor de orthotope implantatie van xenotransplantaten afkomstig van borstkankerpatiënten bij muizen. De techniek omvat enzymatische tumordissociatie gevolgd door directe injectie in de borstvetkussens, waardoor implantatie met hoge doorvoer mogelijk is. Uitgebreide validatie zorgt voor modelgetrouwheid en maakt rigoureuze studies in verschillende subtypes van borstkanker mogelijk.
Methodenartikel
High-throughput dissociatie en orthotope implantatie van borstkanker Patiënt-afgeleide xenotransplantaten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Patiënt-afgeleide xenotransplantaten (PDX's) bieden een klinisch relevante methode voor het recapituleren van tumorbetrokken celtypen en de micro-omgeving van de tumor, wat essentieel is voor het bevorderen van de kennis van borstkanker (BC). Bovendien maken PDX-modellen het mogelijk om BC-systemische effecten te bestuderen, wat niet mogelijk is met in-vitromodellen. Traditionele methoden voor het implanteren van BC-xenotransplantaten omvatten doorgaans anesthesie en steriele chirurgische ingrepen, die tijdrovend en invasief zijn en de schaalbaarheid van PDX-modellen in BC-onderzoek beperken. Dit protocol beschrijft een eenvoudige en schaalbare methode voor de orthotope implantatie van BC PDX's bij muizen. De immunodeficiënte muizenstam NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) werd gebruikt voor PDX-implantatie. Menselijke BC-monsters verkregen van IRB-goedgekeurde patiënten werden mechanisch en enzymatisch gedissocieerd en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in een oplossing van basaalmembraanextract (BME) en RPMI 1640. Dieren werden in bedwang gehouden door te krabben en ontharingscrème werd aangebracht om het haar van de vetkussentjes bij de vierde liestepel te verwijderen, gevolgd door injectie. Ongeveer 2 miljoen cellen in een suspensie van 100 μl werden bilateraal orthotopisch in de borstvetkussentjes geïnjecteerd met behulp van een naald van 26 G. Er was met name geen verdoving nodig en de totale proceduretijd was minder dan 5 minuten, van celvoorbereiding tot injectie. Na een groeiperiode van enkele maanden werden tumoren weggesneden en verwerkt voor authenticatie. Validatie omvatte beoordeling van de receptorstatus met behulp van immunohistochemie met specifieke antilichamen voor traditionele BC-receptoren (d.w.z. ER, PR, HER2). De morfologie van de tumor werd bevestigd met hematoxyline- en eosine (H&E) kleuring, die werd geïnterpreteerd door een patholoog. Genetische gelijkenis met de patiëntensteekproef werd geverifieerd door middel van bulk-RNA-sequencing en korte tandemherhaling (STR)-analyse. Deze benadering van PDX-implantatie en -validatie ondersteunt de rigoureuze ontwikkeling van modellen en high-throughput tumorimplantatie, waardoor goed onderbouwde studies in verschillende BC-subtypes mogelijk zijn.
Inleiding
Borstkanker (BC) wordt elk jaar bij meer dan 2 miljoen vrouwen wereldwijd gediagnosticeerd1. Om het biologische basisbegrip van BC te bevorderen en nieuwe therapieën met succes te vertalen naar goedgekeurde behandelingen, zijn preklinische diermodellen nodig die de bepalende kenmerken van patiënttumoren behouden. Van patiënt-afgeleide xenotransplantaten (PDX's) is aangetoond dat ze tumorheterogeniteit met hoge getrouwheid samenvatten wanneer ze orthotopisch worden geïmplanteerd, inclusief histopathologie, receptorexpressie en genetische afwijkingen 2,3,4. Belangrijk is dat ze ook stromale cellen behouden die bijdragen aan de micro-omgeving van de tumor, zoals vasculatuur, immuuncellen en kanker-geassocieerde fibroblasten. Hoewel ze geleidelijk worden vervangen door stromale cellen van de muizengastheer met passaging5. PDX's maken het ook mogelijk om systemische complicaties als gevolg van tumorgroei te bestuderen, zoals vermoeidheid 6,7, wat momenteel niet mogelijk is met behulp van in vitro-modellen.
Succesvolle BC PDX-implantatie vereist echter een immunodeficiënte muizenstam, waarbij de meest gebruikte stam NSG is (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ). NSG-muizen zijn verstoken van adaptieve immuniteit en vertonen een zeer gebrekkige aangeboren immuniteit8. BC PDX-implantatie is bereikt in andere immunodeficiënte stammen, zoals SCID/Beige (CB17.Cg-PrkdcscidLystbg-J/Crl), met vergelijkbare implantatiesnelheden4.
Traditionele methoden voor het implanteren van BC PDX's omvatten het chirurgisch implanteren van een tumorfragment in het borstvetkussen9, en deze aanpak leidt tot succesvolle implantatie tegen gunstige tarieven. De noodzaak van steriele chirurgische ingrepen en het gebruik van verdoving maakt het echter tijdrovend, waardoor het aantal muizen dat in een bepaald tijdsbestek kan worden geïmplanteerd, wordt beperkt. Gezien de potentiële voorspellende voordelen van PDX's voor geneesmiddelresponsen in tumoren en gebruik in precisiegeneeskunde10, is het van vitaal belang om een eenvoudige en reproduceerbare workflow te hebben voor het homogeen implanteren van PDX's bij muizen. Dit artikel demonstreert de dissociatie van menselijke borsttumoren in een eencellige suspensie en de daaropvolgende orthotope injectie in borstvetkussentjes van immunodeficiënte muizen.
Protocol
Dit protocol voldoet aan de richtlijnen die zijn opgesteld door de Institutional Animal Care and Use Committee van de West Virginia University (WVU). Vrouwelijke NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) muizen, 8 weken of ouder en met een gewicht van ongeveer 25 g, werden gebruikt voor tumorcelinjecties. Borstkankertumorweefsel werd verkregen in het West Virginia University Cancer Institute (Morgantown, WV) en door het NCI Cooperative Human Tissue Network onder het goedgekeurde WVU Institutional Review Board-protocol en het WVU Cancer Institute Protocol Review and Monitoring Committee. Er werd geïnformeerde schriftelijke toestemming verkregen van de patiënten. Alle procedures werden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden in een biologische veiligheidskast van klasse II, volgens de juiste protocollen voor persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). De details van de dieren, reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn te vinden in de materiaaltabel.
1. High-throughput enzymatische dissociatie van tumorweefsel
- Ontdooi en combineer de enzymen H, R en A uit de dissociatiekit voor menselijke tumoren in een steriele C-buis. Voeg 200 μL enzym H, 100 μL enzym R en 25 μL enzym A toe. Breng het uiteindelijke volume op ~5 ml door 4,7 ml steriel RPMI 1640 medium aan de C-tube toe te voegen.
OPMERKING: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) kan worden gebruikt in plaats van RPMI 1640. - Tumorfragmenten kunnen worden gesneden en ingevroren zoals beschreven in bestaande protocollen9. Breng de ontdooide tumorfragmenten en het bijbehorende vriesmedium over op de ene helft van een steriel kweekschaaltje van 100 mm. Breng de tumorfragmenten met een steriele tang over naar een steriel microbuisje van 5 ml.
OPMERKING: Een steriele injectienaald kan worden gebruikt als alternatief voor een tang. Een schotel van 35 mm kan worden gebruikt in plaats van een microbuisje van 5 ml. - Was de tumorfragmenten met 1-3 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 1x). Manipuleer de fragmenten in de oplossing met een tang om ervoor te zorgen dat het resterende vriesmedium grondig wordt verwijderd.
- Breng de gewassen fragmenten met een tang over in een microbuisje van 2 ml. Breng 1 ml drievoudige antibioticaoplossing (TAB) aan op de tumorfragmenten en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Deze stap kan indien gewenst worden overgeslagen. 10x TAB-bouillon kan worden gemaakt door 1% gentamicine, 1% clindamycine en 0,5% polymyxine B-sulfaat op te lossen in steriel 1x PBS. Verdun tot 1x TAB-oplossing in steriel 1x PBS. - Breng de gedesinfecteerde fragmenten met een steriele tang over in een nieuw microbuisje van 5 ml. Voer een tweede wasbeurt uit met 1-3 ml steriele PBS. Breng de gewassen fragmenten over naar de droge helft van de 100 mm kweekschaal uit stap 1.2.
- Hak met behulp van twee steriele scalpelmesjes nr. 10 het tumorweefsel grondig fijn. Breng de gehakte tumorfragmenten over op één mesje en deponeer ze in de C-buis met de bereide enzymoplossing. Maak het deksel van de buis stevig vast totdat u een laatste klik voelt.
- Keer de C-tube meerdere keren om om een gelijkmatige verdeling van de tumorfragmenten in de enzymoplossing te garanderen.
- Plaats de C-buis in de mechanische dissociator. Keer de buis om en zorg ervoor dat alle inhoud in het medium is ondergedompeld. De buis bevindt zich in een omgekeerde positie in de machine.
- Zet de buis vast in een gleuf met het ingesprongen deel naar de bediener gericht. Plaats indien van toepassing de kachel om de buis.
- Selecteer het 37C_h_TDK_3 programma in de touchscreen-interface. Dit programma werkt 60 minuten bij 37 °C. Voor zachtere tumoren kan 37C_h_TDK_1 of 2 worden gebruikt.
OPMERKING: Voor de grootste efficiëntie wordt aanbevolen dat de muizen tijdens deze dissociatieperiode worden voorbereid op injectie door ontharingscrème op de injectieplaatsen aan te brengen. - Na voltooiing van het dissociatieprogramma inspecteert u de inhoud van de buis. Er mogen geen zichtbare tumorfragmenten achterblijven.
OPMERKING: Als er fragmenten aanwezig zijn, kan extra dissociatietijd nodig zijn. Voer in dergelijke gevallen het programma nog 20-30 minuten uit. - Zodra een adequate dissociatie is bereikt, centrifugeert u de C-buis bij 200 x g gedurende 5-8 minuten bij 4 °C om gedissocieerde cellen te pelleteren. Verwijder het bovenstaande voorzichtig met behulp van vacuümaspiratie of een pipet.
- Resuspendeer de celpellet in 5-10 ml vers RPMI-medium. Breng de celsuspensie over naar een conische buis van 15 ml voor eenvoudigere manipulatie. Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 5-8 minuten bij 4 °C. Aspireer voorzichtig het bovenliggende op.
OPMERKING: Deze stap kan worden weggelaten als de celpellet klein is. In dergelijke gevallen worden de cellen direct opnieuw gesuspendeerd in het gewenste volume media en vervolgens gecombineerd met basaalmembraanextract (Matrigel) om celverlies te minimaliseren. - Resuspendeer de celpellet in een volume van RPMI 1640, overeenkomend met de helft van het gewenste uiteindelijke injectievolume. RPMI 1640 en Matrigel zullen worden gecombineerd in een verhouding van 1:1 v/v, met een uiteindelijk injectievolume van 100 μl per injectieplaats.
OPMERKING: Voor bilaterale injectie bij 4 muizen is het totale vereiste volume 800 μL. Resuspendeer de cellen daarom in ten minste 400 μl RPMI 1640. Om rekening te houden met mogelijk volumeverlies, is het raadzaam om 20% extra toe te voegen aan het uiteindelijke volume, waarbij de verhouding van 1:1 v/v behouden blijft. Als alternatief kan DMEM of 1x PBS worden gebruikt in plaats van RPMI 1640. - Tel de geresuspendeerde cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde methode. Verdun indien nodig om de gewenste concentratie voor injectie te bereiken. Een startpunt van ongeveer 1-2 miljoen cellen per injectieplaats wordt voorgesteld.
- Meng in een microcentrifugebuis van 2 ml met ronde bodem de gewenste hoeveelheid verdunde celsuspensie in RPMI met een gelijk volume Matrigel. Meng de suspensie voorzichtig door herhaaldelijk te pipetteren om homogeniteit te garanderen.
OPMERKING: Voeg na de vorige stap 400 μl verdunde celsuspensie toe aan 400 μl Matrigel. Houd rekening met het aantal te gebruiken injectienaalden en houd rekening met de bijbehorende volumeverliezen. Houd Matrigel te allen tijde op ijs. Ontdooi het pas als de cellen weer in suspenie zijn, omdat het snel zal stollen. Aanbevolen om kleine hoeveelheden (bijv. 120 μL) te bewaren voor snel ontdooien en combineren in een tube van 2 ml. - Houd de celsuspensie op ijs totdat deze klaar is voor injectie.
2. Orthotope inguinale borst vetkusseninjectie van gedissocieerde PDX
- Bepaal de massa van elke muis met behulp van een gekalibreerde balans. Breng een dun laagje ontharingscrème aan op de beoogde injectieplaats(en). Masseer de crème met een steriel wattenstaafje afwisselend met de klok mee en tegen de klok in om de vacht snel te kunnen verwijderen.
- Verwijder overtollige vacht en ontharingscrème met een steriele met zoutoplossing doordrenkte gaasspons. Zorg voor volledige ontharing in het injectiegebied.
OPMERKING: Overschrijd niet meer dan 60 s blootstelling aan ontharingscrème om huidirritatie te voorkomen. Muizen kunnen worden geschoren voordat ze worden aangebracht Deze stap kan worden uitgevoerd tijdens tumordissociatie om de tijdsefficiëntie te optimaliseren en de duur van de opslag van celsuspensies op ijs te minimaliseren.
- Verwijder overtollige vacht en ontharingscrème met een steriele met zoutoplossing doordrenkte gaasspons. Zorg voor volledige ontharing in het injectiegebied.
- Voer een grondige visuele inspectie van elke muis uit om de geschiktheid voor injectie te beoordelen. Evalueer op tekenen van pijn, angst, ziekte of andere contra-indicaties.
- Gebruik een spuit van 1 ml zonder bevestigde naald om de celsuspensie voorzichtig op en neer te zuigen om homogeniteit te garanderen. Bevestig een naald van 26 g op de spuit van 1 ml en zuig het gewenste injectievolume op. Verwijder eventuele luchtbellen uit de spuit door zachtjes te tikken of te tikken.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om niet meer dan 600 μl per spuit te gebruiken om injectie met één hand te vergemakkelijken. - Plaats de voorbereide spuit horizontaal op de ijscontainer, met de naald van de bediener af gericht. Plaats de ijscontainer en de naald aan dezelfde kant als de dominante hand van de bediener of de voorkeursinjectiehand. Haal de muis uit zijn behuizing en desinfecteer het injectiegebied met behulp van een alcoholreinigingspad.
- Houd de muis stevig in bedwang door de rughuid stevig vast te pakken in de nek en op de rug. Zorg voor voldoende immobilisatie om de borstvetkussentjes duidelijk bloot te leggen. Het inguinale borstvetkussen strekt zich uit van de tepel tot de bovenkant van de heup. Het kan worden waargenomen als zacht, roze weefsel in het beschreven gebied onder de huid.
OPMERKING: Een assistent-bediener kan een platte tang gebruiken om de huid met het vetkussentje samen te knijpen en op te tillen. Deze techniek helpt ervoor te zorgen dat de operator die de injectie uitvoert, zich met succes op het vetkussen richt. - Plaats de muis in rugligging. Steek de naald (schuine kant naar boven) in een hoek van 45 graden, wijzend naar de heup ongeveer 0,5-1 cm caudaal ten opzichte van het vetkussen, en pas de naaldlengte aan.
- Steek de naald in het vetkussentje. Injecteer op een gecontroleerde manier het gewenste volume celsuspensie. Efficiënte injectiesnelheid helpt de agitatie van dieren door langdurige fixatie tot een minimum te beperken.
OPMERKING: Om dierenleed tot een minimum te beperken, mag de maximale duur van voortdurende handmatige fixatie niet langer zijn dan 30 s. Als de fixatieduur langer is dan 30 s, moet het dier in de kooi worden vrijgelaten om te herstellen voordat een tweede poging wordt ondernomen.
- Steek de naald in het vetkussentje. Injecteer op een gecontroleerde manier het gewenste volume celsuspensie. Efficiënte injectiesnelheid helpt de agitatie van dieren door langdurige fixatie tot een minimum te beperken.
- Draai de naald na de injectie 180 graden (schuine kant naar beneden). Houd de naaldpositie kort vast voordat u de naald langzaam terugtrekt om celverlies van de injectieplaats te minimaliseren. Als er een bloeding optreedt, breng dan indien nodig een standaardgaasje of hemostatisch gaas aan.
- Herhaal stap 2.6 en 2.7 voor het contralaterale vetkussentje als bilaterale injecties nodig zijn. Herhaal voor meerdere dieren stap 2.2-2.7 indien nodig.
3. Follow-up procedures
- Gooi alle scherpe voorwerpen weg in de daarvoor bestemde naaldencontainers. Gooi alle andere inhoud weg in de daarvoor bestemde afvalcontainers.
- Als er tijdens de injectie een bloeding optreedt, controleer de muizen dan gedurende ten minste 1 uur daarna om hemostase te garanderen.
- Controleer de lichaamsmassa wekelijks. Beoordeel het tumorvolume zodra de groei voelbaar wordt.
Resultaten
Deze studie schetst een efficiënte en niet-chirurgische benadering voor de orthotope implantatie van xenotransplantaten van borstkanker bij muizen. Borsttumorweefsel werd gedissocieerd met behulp van mensspecifieke enzymen en mechanische agitatie, opnieuw gesuspendeerd in een verhouding van 1:1 v/v van Matrigel: RPMI 1640, en orthotopisch geïnjecteerd in de inguinale borstvetkussentjes van NSG-muizen (Figuur 1 en Figuur 2). Om de getrouwheid van de PDX-modellen te garanderen, werd de concordantie van het oorspronkelijke tumormonster van de patiënt met de gepassageerde tumoren gevalideerd met gevestigde histopathologische en genomische technieken. Receptorexpressie werd geprofileerd met behulp van immunohistochemie (IHC)-kleuring van standaard borstkankerreceptoren, waaronder oestrogeenreceptor (ER), progesteronreceptor (PR) en humane epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2) (Figuur 3). Cellulaire morfologie werd beoordeeld met behulp van hematoxyline en eosine (H&E) kleuring van doorsneden van tumorschijfjes en deskundige patholooginterpretatie van de gekleurde secties. Het behoud van het genetische landschap en de retentie van menselijke cellen werd gevalideerd met behulp van bulk-RNA-sequencing en korte tandemherhaling (STR) authenticatie (Figuur 4 en Tabel 1). Bovendien identificeerden testen op ziekteverwekkers geen besmetting van de patiënt of gepassageerde tumormonsters, wat een essentiële verificatiestap is gezien het gebruik van immunodeficiënte muizen.
Figuur 1: Overzicht van het protocol. Weergave van de workflow voor tumordissociatie en injectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
NSG-muizen werden voorbereid op injectie met behulp van een ontharingscrème die afwisselend met de klok mee en tegen de klok in werd aangebracht om de vacht grondig uit het gebied van de liesborst te verwijderen (Figuur 2A). Overtollige ontharingscrème werd met een steriel gaasje van de blootgestelde buikhuid afgeveegd en het gebied werd gedesinfecteerd met een alcoholdoekje (Figuur 2B). Een steriele naald geladen met gedissocieerde tumorcellen werd in een hoek van ongeveer 45 graden van 0,5-1 mm caudaal ten opzichte van de vierde inguinale tepel borstvetkussentjes geplaatst (Figuur 2C). Tumorcellen werden op een gecontroleerde manier geïnjecteerd in de vetkussentjes van de borst van de vierde liesknobbel (Figuur 2D). Tumorgroei werd aanvankelijk gedetecteerd door digitale palpatie van de vetkussentjes. Vervolgens werd de progressie van het tumorvolume kwantitatief gevolgd met behulp van magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) (Figuur 2E). Zowel het lichaamsgewicht (Figuur 2F) als de tumorvolumes (Figuur 2G) werden wekelijks gemeten om te controleren op fluctuaties in gewicht en progressie van tumorvolumes. Tumoren werden visueel geïnspecteerd om te controleren op wonden zoals ulceratie die voortijdige beëindiging noodzakelijk zouden maken. Succesvolle bilaterale implantatie van de PDX in de inguinale borstvetkussentjes wordt weergegeven in figuur 2H en de vetkussentjes na de excisie van de tumoren worden weergegeven in figuur 2I.
Figuur 2: Voorbereiding van muizen, PDX-injectie en monitoring van tumorprogressie. (A) Borstvetkussentjes werden grondig onthaard. (B) Presentatie van de injectieplaats met duidelijk zicht op de beoogde injectiegebieden. (C) Positie van de spuit op het vetkussentje, meestal 0,5-1 mm caudaal tot vetkussen, afhankelijk van de naaldlengte. De witte pijl geeft het doelgebied voor de naald aan bij het inbrengen. (D) Afbeelding van gedissocieerde celinjectie in het linker vierde liesbitel borstvetkussen. De naald moet in een hoek van ongeveer 45 graden worden gehouden, zoals aangegeven voor injectie. (E) Representatief MRI-beeld van bilateraal getransplanteerde tumoren op de injectieplaats. Tumoren zijn groen gemarkeerd. (F) Representatieve progressie van het lichaamsgewicht in grammen na injectie van tumorcellen (n = 5). De donkerblauwe lijn vertegenwoordigt een eenvoudige lineaire regressie, die aanzienlijk niet-nul is (p < 0,0001); Muizen kregen gemiddeld 22 mg.dag-1. Donkerblauwe arcering is een betrouwbaarheidsinterval van 95%, lichtblauwe arcering is een voorspellingsinterval van 95% en oranje lijnen zijn longitudinale metingen van het lichaamsgewicht. (G) Representatieve progressie van individuele tumorvolumes in mm3 na injectie van tumorcellen (n = 10). De donkerblauwe lijn staat voor exponentiële regressie; de verdubbelingstijd van het tumorvolume was 19,08 dagen. Donkerblauwe arcering is een betrouwbaarheidsinterval van 95%, lichtblauwe arcering is een voorspellingsinterval van 95% en oranje lijnen zijn longitudinale tumorvolumes. (H) Succesvolle bilaterale implantatie van PDX-cellen in de inguinale borstvetkussens. Merk op dat vascularisatie kan worden gezien die elke tumor voedt. De witte pijlen identificeren de tumoren. (I) Het gebied van het inguinale borstvetkussen na de excisie van tumoren. (H,I) De eenheden op de liniaal zijn in cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De representatieve PDX (PEN_056) is afkomstig van een 31-jarige blanke vrouw met stadium 3A invasief borstcarcinoom. De primaire tumor, verzameld uit de rechterborst, had een receptorstatus van ER en PR-negatief, HER2-positief (ER-PR-HER2+). IHC-kleuring voor ER-, PR- en HER2-receptoren toonde overeenstemming tussen de patiënt en PDX-tumoren (Figuur 3). De PDX vertoont echter wel een grotere expressie van HER2, wat mogelijk het gevolg kan zijn van een selectieve groei van HER2+-cellen. Pathologisch onderzoek van H&E gekleurde coupes bevestigde slecht gedifferentieerd carcinoom met consistente morfologie en cytologie in zowel de patiënt als de PDX-monsters (Figuur 3).
Figuur 3: IHC-receptor en H&E-kleuring. (Linkerkolom) IHC-kleuring van ER-, PR- en HER2-receptoren en H&E-kleuring in de tumor van de patiënt. ER- en PR-vlekken vertonen geen duidelijke positieve kleuring, zoals verwacht. HER2-vlekken tonen positiviteit voor HER2 (bruin). (Rechterkolom) IHC-kleuring van ER-, PR- en HER2-receptoren en H&E-kleuring in het gepassageerde PDX-monster. De receptorkleuring lijkt sterk op die in de patiëntensteekproef, hoewel HER2 een grotere expressie vertoont na het passeren. Schaal balk: 50 μm; vergroting: 20x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Genotypering met korte tandemherhaling (STR) bevestigde >80% gelijkenis tussen de 13 autosomale loci gedefinieerd door de American Type Cell Culture Collection (ATCC) ASN-0002-2022 consensusrichtlijnen plus 3 extra loci (Tabel 1). Bulk RNA-sequencing (RNA-seq) van het tumormonster van de patiënt en PDX bevestigden equivalente niveaus van uitlijning met het nieuwste menselijke referentiegenoom (T2T CHM13v2.0), waarbij respectievelijk 82,3% en 79,1% van de reads op één lijn lagen. Bovendien vertoonden de tumor en PDX van de patiënt een sterke positieve correlatie met een Pearson r-waarde van 0,9559 (Figuur 4A). Uit een analyse van gensetverrijking waarin PDX versus patiënttumor werd vergeleken, bleek dat de top 10 significant verrijkte routes van biologische processen in de genontologie voornamelijk immunologische genensets waren, wat suggereert dat het grootste deel van de transcriptionele variantie tussen PDX en patiënttumor voortkomt uit het ontbreken van immuuncellen in het PDX-monster (Figuur 4B).
| D5S818 | D13S317 | D7S820 | VWA | TH01 | BEN | TPOX | CSF1PO | D3S1358 | D21S11 | D18S51 | Penta_E | Penta_D | D8S1179 | FGA | |
| Tumor van de patiënt | 12 13 | 8 8 | 8 9 | 17 17 | 9 9.3 | X X | 8 10 | 15 16 | 29 31.2 | 16 19 | 12 13 | 14 14 | 10 14 | 21 25 | |
| PDX-tumor | 13 14 | 8 8 | 8 9 | 17 17 | 9 9.3 | X X | 10 10 | 15 15 | 29 29 | 16 19 | 12 13 | 14 14 | 10 14 | 21 25 |
Tabel 1: Authenticatie met korte tandemherhaling (STR).
Figuur 4: RNA-sequencing correlatie en genenset verrijking. (A) Spreidingsdiagram dat de log2 genormaliseerde tellingen per miljoen (CPM) visualiseert voor alle genen van de tumor van de patiënt (x-as) en PDX (y-as). Er werd een sterke positieve correlatie gevonden, met een Pearson r-waarde van 0,9559. (B) Ridge-plots voor de top 10 verrijkte genensets van ontologie van biologische processen bij het vergelijken van PDX vs. tumor van de patiënt. Curven geven de verdeling van de verrijkingsscore voor elke genenset weer; kleur vertegenwoordigt de FDR q-waarde voor elke genenset. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussie
Dit artikel presenteert een efficiënte, high-throughput methode voor het orthotopisch implanteren van BC PDX's in de inguinale borstvetkussentjes van immunodeficiënte muizen. Deze geoptimaliseerde workflow stelt de enkele onderzoeker in staat om PDX's per dag in tientallen muizen te implanteren, ter ondersteuning van grootschalige en adequaat aangedreven studies. Het vermogen om tegelijkertijd meerdere unieke PDX's te dissociëren en te implanteren, maakt ook precisie-oncologische benaderingen mogelijk. Naast tijdsefficiëntie creëert de dissociatie van de tumoren een homogene suspensie van celtypen die gelijkmatig over muizen wordt verdeeld. Onze ervaring is dat deze homogeniteit bijdraagt aan consistente implantatie- en tumorgroeisnelheden.
Hoewel dit protocol over het algemeen effectief is, kan het in bepaalde scenario's nodig zijn om wijzigingen aan te brengen. Zo blijkt de standaard looptijd van 1 uur op de mechanische dissociator af en toe onvoldoende voor volledige dissociatie van tumorweefsel. Terwijl u de C-buis stevig vastpakt, tikt u deze meerdere keren naar beneden om verdwaald weefsel op de bodem op te hopen. Als er zichtbare weefselfragmenten achterblijven, ga dan door met dissociatie en inspecteer deze opnieuw met tussenpozen van 15 minuten. Het is belangrijk op te merken dat sommige weefsels, met name vezelig of vetweefsel, bestand kunnen zijn tegen dissociatie en handmatig moeten worden verwijderd om verstopping van de naald tijdens de injectie te voorkomen.
We raden aan om de kleinst mogelijke naald te gebruiken (27 G of 26 G) om dierenleed te minimaliseren en het risico op terugstroming van cellen vanaf de injectieplaats te verminderen, wat van invloed kan zijn op het succes van de implantatie en de groeisnelheid van de tumor. Als er echter niet-gedissocieerd weefsel of vetfragmenten achterblijven, kan een naald met een grotere dikte (16 G of 18 G) nodig zijn, zij het met een verhoogd risico op bloedingen of celverlies. Ongeacht de gekozen naaldmeter is de vaardigheid in het omgaan met dieren het belangrijkste onderdeel om de injecties effectief uit te voeren. In dit protocol wordt geen anesthesie gebruikt, en hoewel dit tijd bespaart, zorgt het er ook voor dat het dier een zekere mate van mobiliteit heeft wanneer injecties worden uitgevoerd. Als er geen adequate fixatie wordt bereikt bij het krabben, kunnen abrupte bewegingen van de ledematen leiden tot het doorboren van bloedvaten, het ontstaan van een uitgangswond die celretentie voorkomt, of doorboringen in de buikwand. Het wordt sterk aanbevolen om voldoende ervaring te hebben met injecteren voordat waardevolle cellen worden geïnjecteerd.
De beschreven dissociatietechniek is in hoge mate overdraagbaar en kan worden gebruikt bij de implantatie van tal van andere tumortypen voor zowel orthotope als subcutane modellen. Echter, althans in de context van BC, moet subcutane implantatie worden vermeden. Orthotope BC PDX-injectie resulteert in superieure vascularisatie van de getransplanteerde tumor van de getransplanteerde tumor in vergelijking met subcutane, en implantatie van liesvetkussentjes leidt tot grotere implantatiepercentages dan thoracale vetkussentjes11. Bovendien hebben orthotopisch geïmplanteerde PDX's een kortere implantatietijd en een snellere groeisnelheid in vergelijking met subcutane injecties12. Er moet ook worden opgemerkt dat hoewel dissociatie snelle injectie van tumorcellen vergemakkelijkt, dit inherent resulteert in het verlies van cel-tot-cel context; Het is dus misschien niet in alle gevallen een geschikte aanpak. Voor bijvoorbeeld het vereisen van authentieke celinteractie (bijv. ruimtelijke transcriptomics van de tumoren), kan het injecteren van gehakte tumorstukjes of het implanteren van fragmenten de voorkeur hebben.
Hoewel essentieel voor PDX-studies, introduceert het gebruik van immunodeficiënte muizen bepaalde beperkingen. Vanuit logistiek oogpunt is een volledig steriele omgeving, inclusief huisvesting, voedsel en water, vereist. Dit vereist verder speciale huisvestingsgebieden voor immunodeficiënte dieren om het risico op infectie te verminderen, waardoor de huisvestingskosten mogelijk stijgen. Deze verhoogde vatbaarheid voor infecties is de reden waarom een antibiotische incubatiestap voor de tumorfragmenten wordt voorgesteld voorafgaand aan dissociatie. Sommige onderzoeken hebben echter aangetoond dat het gebruik van antibiotica in celcultuur leidt tot veranderingen in genexpressieprofielen13. Daarom moeten onderzoekers het gebruik van antibiotica voor elk onderzoek evalueren. Hoewel de effectieve afwezigheid van een immuunsysteem het mogelijk maakt dat PDX's zich kunnen incorrigeren, sluit het ook de studie uit van de talrijke effecten van het immuunsysteem op BC-progressie14.
Deze methode toont een hoge getrouwheid aan de tumormonsters van de patiënt. Histopathologische authenticatie bevestigde de concordantie van de gepasseerde PDX ten opzichte van het tumormonster van de patiënt, zoals verwacht. De hoge uitlijning van de lezingen met het menselijk genoom suggereert sterk dat de PDX een hoog percentage menselijke cellen behoudt na passage. Dit wordt verder ondersteund door de >80% gelijkenis in STR-profielen en sterke positieve correlatie in de RNA-seq-gegevens tussen de tumor van de patiënt en PDX. Moleculaire aanpassingen in perifere weefsels van PDX-muizen na de groei van borsttumoren zijn ook consistent met moleculaire aanpassingen bij menselijke BC-patiënten. Bulk RNA-seq en proteomische analyses van skeletspieren van BC PDX-muizen zijn opvallend concordant met moleculaire veranderingen in spierbiopten verkregen van patiënten met de diagnose BC in een vroeg stadium 6,7. Gezamenlijk levert de gelijkenis van STR-profilering en RNA-seq, in combinatie met consistente aanpassingen in perifere weefsels, overtuigende gegevens op voor het gebruik van BC PDX-muizen in preklinische onderzoeken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben om bekend te maken.
Dankbetuigingen
We willen graag de genereuze bijdragen erkennen van de patiënten die tumormonsters hebben geleverd voor de ontwikkeling van PDX's. Emidio Pistilli erkent de belangrijke eerdere bijdragen van Hannah Wilson, MD/PhD. Dit onderzoek werd ondersteund door de volgende organisaties: National Institutes of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) onder toekenningsnummer R01AR079445 (Pistilli); de WVU Genomics Core Facility (U54GM104942); de WVU Animal Model and Imaging Facility (P20GM121322, U54GM104942, P20GM144230, P30GM103488); Nationale Instituten voor Algemene Medische Wetenschappen onder toekenningsnummer P20GM121322 (Lockman). Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 mL tuberculin syringe | BD | 305945 | steriel |
| 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | steriel |
| 2,0 mL microcentrifugebuisje met ronde bodem | Eppendorf | 0030123620 | steriel |
| 26 G naald, ½ in. | BD | 305111 | steriel |
| 5,0 mL microbuisje | Eppendorf | 0030119401 | steriel |
| NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) muizen ouder dan 8 weken | The Jackson Laboratory | #005557 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | steriel |
| Basal membraan extract (Matrigel) | Cultrex | 3632-005-02 | |
| Wattenstaafjes met katoen, 6 inch | Fisher Scientific | 22-029-553 | steriel |
| Gebogen pincet met middelgrote niet-gekartelde punten, 152 mm | Electron Microscopy Sciences | 50-365-845 | steriel |
| Ontharingscrème | Nair | ||
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo dissociator met verwarmers | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| No. 10 scalpelbladen | Fisher Scientific | 12-000-162 | steriel |
| Niet-geweven gaasjes, 4x4 inch | Fisher Scientific | 22-028-558 | steriel |
| RPMI 1640 1x + L-Glutamine | Gibco | 11875093 | steriel |
| Tumor dissociatiekit, menselijk | Miltenyi Biotec | 130-095-929 |
Referenties
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 3 (3), 209-249 (2021).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 1-16 (2020).
- Wilson, H. E., et al. Human breast cancer xenograft model implicates peroxisome proliferator-activated receptor signaling as driver of cancer-induced muscle fatigue. Clin Cancer Res. 25 (7), 2336-2347 (2019).
- Wilson, H. E., et al. Skeletal muscle reprogramming by breast cancer regardless of treatment history or tumor molecular subtype. NPJ Breast Cancer. 6 (1), 18(2020).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: Protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. 14, Unit14.23(2013).
- Whittle, J. R., Lewis, M. T., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. Patient-derived xenograft models of breast cancer and their predictive power. Breast Cancer Res. 17 (1), 17(2015).
- Fleming, J. M., Miller, T. C., Meyer, M. J., Ginsburg, E., Vonderhaar, B. K. Local regulation of human breast xenograft models. J Cell Physiol. 224 (3), 795-806 (2010).
- Okano, M., et al. Orthotopic implantation achieves better engraftment and faster growth than subcutaneous implantation in breast cancer patient-derived xenografts. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).
- Ryu, A. H., Eckalbar, W. L., Kreimer, A., Yosef, N., Ahituv, N. Use antibiotics in cell culture with caution: Genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep. 1 (1), 7533(2017).
- Amens, J. N., Bahçecioglu, G., Zorlutuna, P. Immune system effects on breast cancer. Cell Mol Bioeng. 14 (4), 279-292 (2021).
Herprints en machtigingen
