Cryosectie en immunokleuring van het netvlies van de muis

Samenvatting

Er wordt een protocol beschreven voor het voorbereiden van retinale cryosecties van muizen en het uitvoeren van immunokleuring op fotoreceptoren. Dit artikel stelt onderzoekers in staat om consequent bevroren secties van het netvlies van muizen te produceren met goed bewaarde morfologie en hoogwaardige immunokleuringsresultaten.

Samenvatting

Weefselcoupering en immunohistochemie zijn essentiële technieken in histologische en pathologische studies van netvliesaandoeningen met behulp van diermodellen. Deze methoden maken gedetailleerd onderzoek van weefselmorfologieën en de lokalisatie van specifieke eiwitten in het weefsel mogelijk, die waardevolle inzichten verschaffen in ziekteprocessen en -mechanismen. Muizen zijn het meest gebruikte model voor dit doel. Omdat de oogbollen van muizen echter klein zijn en het netvlies van muizen uiterst delicate weefsels zijn, is het verkrijgen van hoogwaardige netvliessecties en immunokleuringsbeelden van muizenoogbollen doorgaans een uitdaging. Deze studie beschrijft een verbeterd protocol voor het cryosectieren van het netvlies van muizen en het uitvoeren van immunohistochemie. Een essentieel punt van dit protocol is het coaten van de oogbol met een laag superlijm, die vervorming van de oogbollen voorkomt tijdens het proces van verwijdering van het hoornvlies, lensextractie en inbedding. Deze stap zorgt ervoor dat de integriteit van de morfologieën van het netvlies goed behouden blijft. Dit protocol belicht kritische technische overwegingen en optimalisatiestrategieën voor het consequent produceren van hoogwaardige netvliessecties en het bereiken van uitstekende immunokleuringsresultaten.

Inleiding

Cryosectie en immunohistochemie (IHC) zijn onmisbare technieken in biomedisch onderzoek, met name voor het bestuderen van complexe biologische structuren zoals het netvlies¹. Deze geavanceerde methodologieën zijn een integraal onderdeel van het begrijpen van de ingewikkelde cellulaire samenstelling en moleculaire organisatie van het netvlies. Ze bieden onderzoekers de mogelijkheid om de functionaliteit en pathologie van het netvlies op een gedetailleerd niveau te onderzoeken en bieden inzichten die cruciaal zijn voor het bevorderen van kennis op dit gebied.

Cryosectie speelt een cruciale rol bij het behoud van de morfologische integriteit van netvliesweefsel. Het zorgt ervoor dat de delicate structuur van het netvlies intact blijft, waardoor secties met hoge nauwkeurigheid en betrouwbaarheid kunnen worden gebruikt in latere immunofluorescerende onderzoeken. In vergelijking met andere methoden, zoals paraffine-inbedding, heeft cryosectie aanzienlijke voordelen omdat het zowel de weefselmorfologie als de antigeniciteit beter behoudt, waardoor het bijzonder geschikt is voor immunohistochemische kleuring². De techniek van de bevroren sectie wordt veel gebruikt voor het bestuderen van een reeks complexe weefsels en zelfs fijne cellulaire structuren³, waardoor nauwkeurige analyses van hun architectuur mogelijk zijn.

IHC is een krachtige en veelzijdige laboratoriumtechniek die het mogelijk maakt om de lokalisatie van specifieke eiwitten in weefsels te visualiseren. Deze techniek is een hoeksteen geworden in zowel klinische als onderzoeksomgevingen, waar het op grote schaal wordt gebruikt voor diagnostiek, ziektemonitoring en biologisch onderzoek. Het succes van een IHC-experiment hangt sterk af van een nauwgezette monstervoorbereiding, een zorgvuldige behandeling van het weefsel en een nauwkeurige controle van de immunokleuringsomstandigheden. Kleine variaties in het protocol kunnen een grote invloed hebben op de kwaliteit van de resultaten, wat het belang van standaardisatie en optimalisatie onderstreept¹.

Wanneer ze worden gecombineerd, bieden cryosectie en IHC ongeëvenaarde voordelen voor onderzoekers die de ruimtelijke verdeling, expressieniveaus en cellulaire interacties van verschillende eiwitten in het netvlies willen onderzoeken. Deze methodologieën maken gedetailleerd onderzoek mogelijk naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling, functie en ziekte van het netvlies. Dergelijke inzichten zijn vooral waardevol bij het bestuderen van netvliesaandoeningen, waaronder leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, diabetische retinopathie en retinitis pigmentosa. Door de pathofysiologie van deze aandoeningen op te helderen, dragen cryosectie en IHC bij aan het identificeren van potentiële biomarkers en het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën.

Ondanks het nut ervan brengt het werken met het netvlies van muizen unieke uitdagingen met zich mee. Muizen worden veel gebruikt als diermodellen in oogheelkundig onderzoek vanwege hun genetische gelijkenis met mensen en hun goed gekarakteriseerde netvliesstructuur. Het verkrijgen van cryosecties van hoge kwaliteit is echter inherent moeilijk vanwege het kleine formaat en de delicate aard van het netvliesweefsel van muizen. Deze studie biedt een gedetailleerde methodologie voor cryosectie en het uitvoeren van IHC op het netvlies van muizen, waarbij kritische technische overwegingen worden benadrukt en optimalisatiestrategieën worden aangeboden om deze uitdagingen aan te gaan. Door deze technieken te verfijnen, kunnen onderzoekers consistente en hoogwaardige resultaten bereiken, waardoor de studie van retinale biologie en pathologie wordt bevorderd.

Protocol

De procedure voldeed aan de richtlijnen die zijn opgesteld door de Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Research. Goedkeuring werd verkregen van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Sichuan Provincial People's Hospital. Voor dit protocol werden mannelijke C57Bl/6J-muizen van twee tot drie maanden oud en met een gewicht van 25-30 g gebruikt. Een uitgebreide lijst van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, vindt u in de materiaaltabel.

1. Bereiding van reagens

1. 1x PBS-buffer
   1. Weeg met behulp van een weegschaal 8 g NaCl, 1,42 g Na₂HPO₄, 0,42 g KH₂PO₄ en 0,2 g KCl af. Doe deze in een bekerglas en voeg een geschikte hoeveelheid dubbel gedestilleerd water (ddH₂O) toe om de bestanddelen op te lossen. Giet de oplossing in een maatkolf van 1 l en stel het volume in op 1 l met_{ddH 2}O.
2. 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing
   1. Voeg 0,4 g PFA-poeder en 15 μl 1 M NaOH toe aan een conische buis van 15 ml met 8 ml 1x PBS-buffer. Plaats de tube in een waterbad dat is ingesteld op 60 °C om het PFA-poeder volledig op te lossen. Stel het uiteindelijke volume in op 10 ml met 1x PBS.
3. IHC-blokkerende oplossing
   1. Combineer 1 ml normaal ezelserum, 20 μl 20% NaN₃, 200 μl 20% Triton X-100 en 18,78 ml 1x PBS-buffer. Meng.
4. 30% sucrose-oplossing
   1. Los 15 g sucrose op in 40 ml 1x PBS-buffer. Stel het volume in op 50 ml met 1x PBS-buffer en mix tot het volledig is opgelost.
5. IHC secundaire antilichaamoplossing
   1. Verdun Alexa Fluor 488-geconjugeerd geitenanti-konijn-antilichaam in een verhouding van 1:300 en DAPI in een verhouding van 1:2.000 met behulp van de voorbereide blokkeerbuffer.

2. Cryosectie van de oogbol van de muis

1. Oogbol ontleden
   1. Verdoof een 3 maanden oude C57Bl/6-muis (ongeveer 25 g) via intraperitoneale injectie van 2% tribroomethanol in een dosering van 15 μL/g lichaamsgewicht. Offer de muis met behulp van cervicale dislocatie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
   2. Markeer de bovenste kant van de oogbol met een blauwe stift op de sclera (Figuur 1A). Verwijder de oogbollen met een schaar.
   3. Als er bloed op het oogboloppervlak aanwezig is, veeg dit dan voorzichtig weg met een pluisvrij doekje. Verwijder onder een ontleedmicroscoop voorzichtig de extraoculaire spieren die aan de oogbollen vastzitten.
2. Fixatie
   1. Breng de ontlede oogbollen over naar een microcentrifugebuis van 2 ml met ronde bodem die 1 ml 4% PFA bevat. Fixeer de oogbollen gedurende 10 minuten. Breng vervolgens de oogbollen over naar een omgekeerd petrischaaltje van 3 of 6 cm.
   2. Maak onder een ontleedmicroscoop een kleine incisie (ongeveer 1-2 mm) op het hoornvlies met behulp van een fijne tang en een oogheelkundige schaar. Plaats de oogbollen terug in de 4% PFA-oplossing voor nog eens 2 uur fixatie op ijs (Figuur 1B).
3. Cryoprotectie
   1. Verwijder het fixeermiddel en was de oogbollen drie keer met 1x PBS-bufferoplossing. Breng de oogbollen over in een microcentrifugebuis van 2 ml met ronde bodem die 1 ml 30% sucroseoplossing bevat voor cryoprotectie bij 4 °C. Laat de oogbollen zich op de bodem van de tube nestelen of laat ze een nacht staan.
4. Coating van de oogbol
   1. Breng een oogbol over op een omgekeerd petrischaaltje met de hoornvlieszijde naar boven. Dep de overtollige oplossing van het hoornvlies met een pluisvrij doekje. Dompel een stuk tennissnaar van 2-3 cm in de lijm (bestaande uit cyanoacrylaten) in een microcentrifugebuisje van 0,2 ml en verwijder deze snel.
   2. Bevestig onder een ontleedmicroscoop het ene uiteinde van de tennissnaar met resterende superlijm aan het midden van het vochtige hoornvlies. Laat de lijm 10-20 s stollen. Pak het andere uiteinde van de tennissnaar vast en dompel de oogbol in een microcentrifugebuisje van 200 μl gevuld met superlijm, zodat de sclera ongeveer 1 s volledig wordt ondergedompeld.
   3. Verwijder snel de oogbol en dompel deze onder in PBS (Figuur 1C). De lijm op het sclera-oppervlak zal onmiddellijk stollen.
5. Verwijdering van het hoornvlies
   1. Dep het overtollige PBS op het oppervlak van de gestolde lijm met een pluisvrij doekje. Verwijder onder een ontleedmicroscoop het hoornvlies met een oogheelkundige schaar terwijl u de bijgevoegde tennissnaar vasthoudt.
6. Insluiten
   1. Haal met een tang de lens voorzichtig uit de oogschelp. Absorbeer overtollige sucroseoplossing die in de oogschelp vastzit met een strook pluisvrij doekje. Breng de oogschelp over naar een inbeddingsmal gevuld met de optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding.
   2. Vul de oogschelp volledig met OCT. Plaats de oogschelp zo dat deze naar de zijwand van de inbeddingsmal is gericht en zorg ervoor dat het sagittale vlak evenwijdig is aan de onderkant van de mal. Gebruik de blauwe markering op de sclera als referentie. Breng de inbeddingsvorm met de oogschelp over naar een vriezer van -80 °C (Figuur 1D). De oogschelp is binnen vijf minuten bevroren.
7. Cryosectie
   1. Breng de bevroren oogschelp over naar een cryostaat die is ingesteld op -20 °C en laat deze gedurende 30 minuten in de kamer balanceren. Snijd de oogschelp door met een dikte van 12 μm. Monteer de secties op positief geladen glasgeleiders voor later gebruik.

3. Immunohistochemische kleuring

1. Bakken
   1. Leg de bevroren delen op glaasjes en bak ze 30-60 minuten in een oven van 37 °C om ervoor te zorgen dat het weefsel goed aan de objectglaasje hecht.
2. Was
   1. Teken met een PAP-pen een cirkel rond de secties op de dia. Dompel het glaasje onder in een Coplin-pot met 1x PBS-buffer. Plaats de Coplin-pot op een langzame shaker en was de secties 2 × 10 minuten om de OCT-verbinding te verwijderen.
3. Blokkering en permeabilisatie
   1. Plaats de dia horizontaal in een vochtkamer. Voeg de blokkeeroplossing toe aan de omcirkelde secties en laat 30 minuten blokkeren en permeabiliseren bij kamertemperatuur.
4. Incubatie van primaire antilichamen
   1. Zuig de blokkeeroplossing voorzichtig uit het objectglaasje. Voeg het primaire antilichaam, verdund in de blokkeeroplossing, toe aan de secties. Incubeer de coupes in de vochtkamer een nacht bij 4 °C om te zorgen voor een optimale binding van het antilichaam aan het doelantigeen.
5. Incubatie van secundaire antilichamen
   1. Zuig de primaire antilichaamoplossing op en was het glaasje twee keer met 1x PBS gedurende 2 × 10 minuten. Voeg het juiste secundaire antilichaam toe, gemengd met DAPI en verdund in de blokkerende oplossing.
   2. Incubeer de secties gedurende 1 uur in een donkere vochtkamer bij kamertemperatuur om secundaire antilichaambinding en tegenkleuring met DAPI mogelijk te maken.
6. Montage
   1. Zuig de secundaire antilichaamoplossing op en spoel het glaasje gedurende 2 × 10 minuten af met 1x PBS. Gebruik een Kimwipe om eventuele resterende PBS op de dia te wissen.
   2. Breng een geschikte hoeveelheid antifade-montagemedium aan op de secties en bedek ze met een dekglaasje. Bewaar de gemonteerde monsters bij 4 °C in het donker om de fluorescentie te behouden en fotobleken te voorkomen.

4. Beeldvorming

1. Verkrijg fluorescentiesignalen van de immunogekleurde netvliessecties met behulp van een confocale lasermicroscoop. Pas de instellingen aan voor een optimale resolutie en gevoeligheid om heldere en duidelijke fluorescentiesignalen vast te leggen.
2. Zorg ervoor dat de juiste filters worden gebruikt om de specifieke golflengten van de fluoroforen die in het experiment worden gebruikt, te detecteren.

Resultaten

Volgens het hierboven beschreven protocol werden de ogen van 1 maand oude wildtype C57Bl/6J-muizen gefixeerd op 4% PFA. De vaste monsters werden vervolgens ingebed in OCT en gecryosectieerd. De secties werden immuungekleurd met een anti-PDE6B-antilichaam en geantikleurd met DAPI om de kernen te labelen. PDE6B is een fototransductie-eiwit dat specifiek tot expressie komt in staaffotoreceptorcellen⁴. In vergelijking met traditionele protocollen verbetert dit protoco...

Discussie

Een aantal factoren is van invloed op de kwaliteit van weefselcoupes, waaronder de samenstelling van de fixatieoplossing, de fixatie- en cryobeschermingstijd en de inbeddingsmethoden⁵. Bij het verwijderen van de oogbol van de muis, is het essentieel om de extraoculaire spieren en ander bindweefsel dat aan de oogbol vastzit te verwijderen. Als ze niet op de juiste manier worden verwijderd, kunnen deze weefsels vervorming van de oogbol veroorzaken tijdens extractie ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
-80 °C vriezer	Haier	DW-86L626
Adhesie microscoopglaasjes	CITOTEST	80312-3161
Alexa488-Geit anti-Konijn	Proteintech	SA00006-2
C57BL/6J muis	The Jackson Laboratory	664
Cryosectom	Leica	N/A
Cryostat	LEICA	N/A
DAPI	Cell Signaling Technology	4083S
Dissectiemicroscoop	ZEISS	3943030830
Ezelsserum	Solarbio	S9100
Inbedding mallen	Thermo Fisher Scientific	1841
Fijne dissectie schaar	RWD	S13001-10
Fijne pincetten	RWD	F11020-11
Fluoromount waterig montagemedium	Sigma-Aldrich	F4680
Incubator	Shanghai Yuejin	N/A
KCl	Sigma-Aldrich	1049330500
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1048771000
Kimwipes	Thermo Fisher Scientific	FIS-06666
Laser confocale microscoop	ZEISS	N/A
Microscoop dekglas	CITOTEST	80340-3610
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	1065860500
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Sigma-Aldrich	1091371003
O.C.T compound	Sakura	4583
Pap pen	Sigma-Aldrich	Z672548
PFA	Sigma-Aldrich	441244
Konijn anti-PDE6B	Proteintech	22063-1-AP
Schudden	SCILOGEX	8042210200
Federas	RWD	S11036-08
Sucrose	BioFroxx	1245GR500
Superlijm	Deli	7147S
Tennissnaar (1,24 mm)	Gosen	TS761
Tribromoethanol	Macklin	T831042
Triton X-100	Solarbio	IT9100