Methodenartikel

Analyse van menselijke T-celactiviteit in een allogene co-cultuursetting van voorbehandelde tumorcellen

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67643

⸱

7 maart 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Radiobiology, Department of Radiation Oncology, Uniklinikum Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, 2Comprehensive Cancer Center Erlangen-EMN, 3Bayerischerisches Zentrum für Krebsforschung, 4Department of Radiation Oncology, Uniklinikum Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een experimentele workflow die de ex vivo analyse van menselijke T-celstimulatie mogelijk maakt in een allogene co-cultuur

Samenvatting

Cytotoxische T-cellen spelen een sleutelrol bij de eliminatie van tumorcellen en worden daarom intensief bestudeerd in de kankerimmunologie. De frequentie en activiteit van cytotoxische T-cellen in tumoren en hun tumormicro-omgeving (TME) zijn nu gevestigde prognostische en voorspellende biomarkers voor tal van tumortypes. Het is echter algemeen bekend dat verschillende modaliteiten voor de behandeling van tumoren, waaronder radiotherapie, chemotherapie, immunotherapie en gerichte therapie, niet alleen de immunogeniciteit van de tumor moduleren, maar ook het immuunsysteem zelf. Bijgevolg vereist de interactie tussen tumorcellen en T-cellen intensiever onderzoek in verschillende therapeutische contexten om de complexe rol van T-cellen tijdens tumortherapie volledig te begrijpen. Om aan deze behoefte tegemoet te komen, werd een protocol ontwikkeld om de activiteit en proliferatieve capaciteit van menselijke cytotoxische (CD8+) T-cellen in co-cultuur met voorbehandelde tumorcellen te analyseren. In het bijzonder worden CD8+ T-cellen van gezonde donoren gekleurd met de niet-toxische proliferatiemarker carboxyfluoresceïnediacetaat succinimidylester (CFSE) en gestimuleerd met behulp van CD3/CD28-gecoate platen. Vervolgens worden T-cellen samen gekweekt met voorbehandelde tumorcellen. Als uitlezing wordt de proliferatie van T-cellen gekwantificeerd door de CFSE-signaaldistributie te meten en de expressie van oppervlakteactiveringsmarkers te beoordelen via flowcytometrie. Dit kan verder worden aangevuld door de afgifte van cytokines te kwantificeren met behulp van enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA). Deze methode vergemakkelijkt de evaluatie van door de behandeling geïnduceerde veranderingen in de interactie tussen tumorcellen en T-cellen, en biedt een basis voor meer gedetailleerde analyses van tumorbehandelingsmodaliteiten en hun immunogeniciteit in een menselijke ex vivo setting. Bovendien draagt het bij tot de vermindering van preklinische in vivo analyses.

Inleiding

Tegenwoordig wordt het steeds duidelijker dat de uitgroei en het verloop van tumoren sterk afhankelijk zijn van de effectieve manipulatie en onderdrukking van het immuunsysteem van de gastheer. Getransformeerde cellen komen elke dag tevoorschijn, zelfs in een gezond organisme. De vorming van macroscopische tumoren is echter een vrij zeldzame gebeurtenis, omdat opkomende getransformeerde cellen met een hoge efficiëntie uit het organisme worden verwijderd. Voor de verwijdering van kwaadaardige cellen komen verschillende immuunceltypen zoals cytotoxische T-cellen, natural killer (NK)T-cellen, NK-cellen of macrofagen in actie 1,2,3. Desalniettemin kunnen er soms getransformeerde celklonen ontstaan die overleven in een evenwichtstoestand met het immuunsysteem van de gastheer, dat wordt gekenmerkt door verschillende immunosuppressieve strategieën van de tumorcelkloon4. Uiteindelijk krijgen sommige getransformeerde cellen verdere functies die de tumorcellen in staat stellen de immuunrespons actief te onderdrukken, wat vervolgens leidt tot de uitgroei van de tumor. Deze immunosuppressie wordt gemedieerd door tal van mechanismen, waaronder de expressie van immunosuppressieve liganden op de tumorcellen of de actieve rekrutering of priming van immunoregulerende of immunosuppressieve immuuncelpopulaties. Dit zogenaamde immuunbewerkingsconcept toont de sleutelrol van immuunmodulatie tijdens tumorvorming en -uitgroei5.

Het is dan ook niet verwonderlijk dat het immuunsysteem tegenwoordig een belangrijk aandachtspunt is, niet alleen bij de behandeling van kanker, maar ook als een voorspellende en prognostische factor in veel tumorentiteiten en therapeutische settings. In de afgelopen jaren kwamen immuuncheckpointremmers (ICI's) naar voren als veelbelovende therapeutische opties in verschillende solide kankerentiteiten, zoals hoofd-halscelcarcinoom (HNSCC) of niet-kleincellige longkanker (NSCLC) met als doel de tumormicro-omgeving (TME) te moduleren in de richting van een efficiëntere antitumorimmuunrespons en een verminderde immunosuppressie van de tumorcellen6. De immuuncheckpointremmers zijn bedoeld om de T-cel-gemedieerde tumorceldoding te stimuleren door zich te richten op immuuncheckpointmoleculen zoals die van het geprogrammeerde doodseiwit 1 (PD-1) en zijn ligand 1 (PD1/PD-L1) as. Dit feit benadrukt de sleutelrol van T-cellen in de immuniteit tegen tumoren. In HNSCC zijn bijvoorbeeld ICI's met succes goedgekeurd als eerstelijnstherapie bij recidiverende en gemetastaseerde HNSCC7. In lijn daarmee kan de aanwezigheid van cytotoxische T-cellen in de TME, evenals de expressie van PD1 en PD-L1 op de tumorcellen en T-cellen dienovereenkomstig, dienen als voorspellende biomarkers in HNSCC 8,9,10.

Hoewel T-cellen een cruciale rol spelen in tumorimmunologie en tumortherapie, moeten veel open vragen over hun interacties met de tumor nog worden beantwoord. Tegenwoordig is het algemeen bekend dat de immuunrespons van de tumor een dynamisch proces is en dat de immunogeniciteit van tumoren in de loop van de ziekte en van de behandelingen kan veranderen. Het is vooral algemeen bekend dat verschillende behandelingsmodaliteiten, zoals chemotherapie (CT), bestralingstherapie (RT) of gerichte therapie (TT), het immunologische fenotype van tumorcellen moduleren. RT kan de opregulatie van immuuncheckpointmoleculen in het tumorweefsel stimuleren en de frequentie van tumor-infiltrerende cellen veranderen11,12. TT, aan de andere kant, kan ook gunstige veranderingen binnen de tumor en de TME onderschrijven door directe modulatie van de adaptieve immuunrespons 13,14,15,16. Deze modulaties zijn echter een uitdaging om bij patiënten te bestuderen, omdat dit een herhaald onderzoek van het tumorweefsel in de loop van de behandeling zou vereisen. Er zijn dus sluitende experimentele modelsystemen nodig om het dynamische immunologische fenotype van tumorcellen en T-cellen en, nog belangrijker, hun interacties te bestuderen.

Daarom is voor het analyseren van T-celactiviteit en de interacties van tumorcellen en T-cellen een uitgebreide ex vivo co-cultuurtest nodig die gemakkelijk te implementeren is in elk laboratorium op basis van eenvoudig celkweekwerk en veelgebruikte flowcytometrie-analyses. Op basis van de bestaande en beschikbare literatuur is er tot nu toe geen eenvoudig te gebruiken en veelgebruikt protocol met betrekking tot de co-cultuur van T-cellen en tumorcellen gepubliceerd. Hoewel er de laatste tijd verschillende co-cultuurtesten voor T-cellen en tumororganoïden zijn gepubliceerd, wordt de 3D-celkweektechniek nog steeds niet als standaardtechniek in elk laboratorium geïmplementeerd. Daarom bieden we een protocol voor het gebruik in 2D-celcultuur, dat in de toekomst net zo goed kan worden opgesteld voor 3D-celcultuur. Andere 2D-cocultuurprotocollen zijn vaak complexer, omdat ze bijvoorbeeld de transductie van tumorcellen met luciferase17 vereisen of alleen geschikt zijn voor hematologische maligniteiten (co-cultuur van ongeëvenaarde T-cellen met leukemiecellen)18. In de hier beschreven test worden T-cellen van normale gezonde donoren geïsoleerd uit perifeer bloed en gestimuleerd met anti-CD3- en anti-CD28-antilichamen. Vervolgens worden de T-cellen gekweekt met (voor)behandelde tumorcellen om de proliferatieve capaciteit van de T-cellen en hun activiteit via flowcytometrie te analyseren. Daardoor kunnen de effecten van verschillende behandelingsmodaliteiten op het immuunfenotype van de tumorcel, zoals RT, CT of TT, die op zijn beurt de activiteit en proliferatie van T-cellen beïnvloeden, gemakkelijk worden gescreend en gebruikt als basis voor diepere mechanistische analyses en daaropvolgende geselecteerde preklinische in vivo analyses. De hier beschreven test biedt een gebruiksvriendelijke opstelling, omdat er geen onconventionele apparaten, technieken of materialen nodig zijn. Bovendien kan de test gemakkelijk worden aangepast aan verschillende tumorcellijnen of specifieke T-celsubsets (bijv. CD4+ T-cellen). Met behulp van deze techniek wordt een hoge standaardisatie en reproduceerbaarheid bereikt.

Protocol

Deze test omvat bloedafnames en de teelt van menselijke primaire cellen. Daarom is een ethische stemming verplicht voor deze analyses. Alle resultaten die in dit manuscript worden gepresenteerd, vallen onder de ethische goedkeuring van de IMMO-NHD-studie en er werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen van alle donoren. De goedkeuring werd op 9 november 2022 verleend door de institutionele beoordelingscommissie van Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (aanvraagnummer 21-415-B). De HSC4-tumorcellen die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn afkomstig van een in de handel verkrijgbare cellijn.

Deze test is een voorbeeld van alle stappen van de co-cultuurtest van T-cellen en tumorcellen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de cellijn HSC4 van het menselijk hoofd en hals plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) in een behandelingsomgeving met radiotherapie (RT) en twee specifieke kinaseremmers. Bijgevolg zijn parameters zoals celaantallen, trypsinisatietijden en behandelingsschema's specifiek voor deze co-cultuursetting en moeten ze worden aangepast voor andere tumorcellijnen (zie ook de sectie Discussie). Alle centrifugatiestappen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur. In deze studie werden de kinaseremmers AZD0156 en VE-822 gebruikt om zich te richten op het DNA damage repair (DDR)-systeem van HSC4-cellen. AZD0156 (Selleckchem) remt het ataxia telangiectasia mutated (ATM) eiwit, terwijl VE-822 (Selleckchem) zich richt op de ataxia telangiectasia en Rad3-related (ATR) eiwit. Beide remmers zijn besproken als potentiële middelen voor het verhogen van de stralingsgevoeligheid in tumorcellen. Ze worden opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO) en bewaard bij -20 °C. Figuur 1 geeft een stroomdiagram van de ex vivo-test , met details over de co-cultuur van voorbehandelde tumorcellen met CD3/CD28-gestimuleerde menselijke CD8+ T-cellen. De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

figure-protocol-1
Figuur 1: Stroomschema van de ex vivo assay van voorbehandelde tumorcellen in co-cultuur met (CD3/CD28) gestimuleerde menselijke CD8+ T-cellen. Dag 1: Zaaien van HSC4-tumorcellen. Dag 2: Behandeling van tumorcellen en isolatie, CFSE-kleuring en uitzaaien in CD3/CD28-gecoate platen van menselijke CD8+ T-cellen. Dag 3: Behandeling van de tumorcellen. Dag 4: Tellen van representatieve putjes van tumorcellen. Oogst en telling van alle T-cellen. Co-cultivatie van T-cellen en HSC4-tumorcellen in een verhouding van 1:1. Dag 5-Dag 8: Co-cultuur incubatie. Dag 8: Oogst van co-cultuur, bevriezing van supernatanten, kleuring op basis van antilichamen en analyse van de cellen door middel van flowcytometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Zaaien van tumorcellen (dag 1)

LET OP: Tijdsduur: 1 uur. Menselijke HSC4-tumorcellen worden uit T75-celkweekflessen in platen met 96 putjes gezaaid.

  1. Gooi het bovenstaande (D10 Medium) van de celcultuurfles weg.
  2. Was tumorcellen met 5 ml 37 °C warme PBS. Gooi PBS weg.
  3. Aangezien HSC4-tumorcellen de neiging hebben om zich stevig aan celkweekkolven te hechten, wordt trypsinisatie in twee stappen aanbevolen om ervoor te zorgen dat alle cellen worden losgemaakt. Voeg hiervoor 3 ml trypsine toe en plaats de fles gedurende 3 minuten op een verwarmingsplaat bij 37 °C en gooi de trypsine vervolgens met een pipet weg.
  4. Voeg nog eens 3 ml trypsine toe, plaats de fles op de verwarmingsplaat en wacht tot de eencellige suspensie is bereikt. Controleer microscopisch op eencellige suspensie.
  5. Stop de trypsine door het dubbele volume D10 Medium toe te voegen (DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine), resuspendeer grondig en breng de cellen over in een centrifugeerbuis van 50 ml.
  6. Bepaal het celaantal eencellige suspensie en bereken vervolgens het totale aantal tumorcellen op basis van het totale volume. Voor de bepaling van het celgetal wordt een Neubauer-celkamer aanbevolen.
  7. Centrifugeer de centrifugeerbuis van 50 ml met de tumorcellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande weg.
  8. Resuspendeer HSC4-tumorcellen in een geschikt volume D10-medium om een concentratie van 15.000 cellen in een medium van 200 μl te bereiken.
  9. Volgens de geplande behandelingen van tumorcellen, zaad voor elke aandoening ten minste 3 putjes met 15.000 HSC4-tumorcellen in een medium van 200 μL in twee platen met 96 putjes (1x monster, 1x controle met alleen tumorcellen, 1x celtelling goed voor de co-cultuurdag).
    OPMERKING: Het celnummer is afhankelijk van de cellijn en de verdubbelingstijd. Het aantal cellen voor verschillende behandelingen moet in pre-experimenten worden onderzocht om 100% samenvloeiing tijdens incubatie te voorkomen.
  10. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 en verzadigde vochtigheid.

2. Behandeling van tumorcellen (dag 2)

OPMERKING: Tijdsduur: 3-5 uur. Na een incubatietijd van 24 uur kunnen de eerder gezaaide HSC4-cellen worden behandeld volgens het gewenste behandelingsschema. In dit voorbeeldgeval worden de tumorcellen behandeld met een ATM- of ATR-remmer. Hierin wordt bovendien ook een van de twee platen met 96 putjes daarna bestraald met 2x 5 Gy.

  1. Bereid kinaseremmers voor om een concentratie van 1 μM AZD0156 (ATM-remmer) en 0,1 μM VE-822 (ATR-remmer) te krijgen om tumorcellen te behandelen.
  2. Behandel de tumorcellen dienovereenkomstig, bijvoorbeeld door een rij monsters te behandelen met 3,1 μL van de ATM-remmer en een tweede met 3,1 μL van de ATR-remmer in elke plaat.
  3. Bestraal na 3-5 uur incubatie bij 37 °C een plaat met 5 Gy.
  4. Bestraal na nog eens 24 uur dezelfde plaat opnieuw met 5 Gy.

3. T-cel isolatie (dag 2)

OPMERKING: timing: 4 uur. CD8+ T-cellen worden magnetisch geïsoleerd met anti-CD8 MicroBeads van PBMC's na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van perifeer bloed (PB) afkomstig van gezonde volwassen donoren. De geïsoleerde T-cellen worden vervolgens gekleurd met CFSE en geïncubeerd in een CD3/CD28-gecoate putplaat voor stimulatie. Om in latere stappen grondstof- en materiaalvriendelijk te kunnen werken, is het belangrijk om een schatting te maken van de hoeveelheid T-cellen die nodig zijn voor de co-cultuurexperimenten. Afhankelijk van de donor kunnen tussen de 50.000.000 en 100.000.000 PBMC's worden geïsoleerd uit ongeveer 45 ml EDTA-bloed. Ongeveer 10% van het totale aantal PBMC's zijn CD8+ T-cellen.

  1. Centrifugatie van de dichtheidsgradiënt
    1. Breng 3-5 EDTA-bloedbuisjes van 9 ml afkomstig van een gezonde donor over in twee centrifugatiebuisjes van 50 ml.
    2. Vul beide centrifugatiebuisjes tot 50 ml met PBS + 2% FBS.
    3. Bereid zes centrifugatiebuizen voor (met plastic inleg voor de scheiding van PBMC's) en vul ze elk met 15 ml + 4 °C koudedichtheidgradiëntmedium.
    4. Bedek de media met de dichtheidsgradiënt voorzichtig met 12-15 ml verdund bloed uit stap 3.1.2.
    5. Centrifugeer op 1200 x g gedurende 10 minuten (geen vertraging nodig).
  2. Bereiding van een plaat met 6 putjes voor T-celstimulatie
    1. Bereid antilichamen aan: Bereid een anti-CD3 (kloon OKT3) oplossing van 1 mg/ml met PBS. Bereid een anti-CD28 (kloon 28.2) oplossing van 0,1 mg/ml met PBS.
    2. Aanbeveling: gebruik de tijd tijdens het centrifugeren (stap 3.1.5) voor de bereiding van coatingoplossingen en de coating van de putjes zelf voor de stimulatie van T-cellen.
    3. Meng 5 μl CD3-antilichaamoplossing met 4,995 μl PBS en 50 μl CD28-antilichaamoplossing met 4,950 μl PBS (eindconcentratie: 1 μg/μl).
    4. Voeg 1.000 μL van beide antilichaamoplossingen toe aan elk putje van de plaat met 6 putjes.
    5. Smeer 2 of 3 putjes, afhankelijk van de verwachte hoeveelheid T-cellen, van de plaat met 6 putjes en incubeer gedurende ten minste 2 uur bij 37 °C.
  3. Bereiding van het medium T-cel
    OPMERKING: Bereiding van 100x L-Lysine: Los 200 mg L-Lysinehydrochloride op in 50 ml gedestilleerd water in een centrifugebuis van 50 ml. Steriliseer de oplossing met behulp van een spuitfilter van 0,2 μm en breng deze over in een nieuwe buis van 50 ml met behulp van een perfusiespuit van 50 ml. Bewaar de oplossing bij 4-8 °C en gebruik deze binnen 3 maanden. Bereiding van 15 mM L-Arginine: Los 26 mg L-Arginine op in 10 ml DPBS. Steriliseer de oplossing met behulp van een spuitfilter van 0,2 μm en breng deze over in een nieuwe buis met behulp van een spuit van 10 ml. Bewaar de oplossing bij 4-8 °C en gebruik deze binnen 3 maanden.
    1. Gebruik de centrifugatietijd zoals vermeld in stap 1.5 om het T-celmedium voor te bereiden.
    2. Bereid ongeveer 10-30 ml T-celmedium voor, afhankelijk van de verwachte hoeveelheid T-cellen.
    3. Meng het L-Arginine en L-Lysine vrije RPMI medium met 10% door warmte geïnactiveerde FBS, 1% penicilline-streptomycine, 1% L-Arginin, 1% L-Lysine en 1% L-Glutamine. Voorbeeld: 25,8 ml RPMI-medium + 3 ml FBS + 0,3 ml pen/streptokokken + 0,3 ml L-Arginin + 0,3 ml L-lysine + 0,3 ml L-glutamine.
    4. Bewaar het resterende medium de volgende twee dagen bij 4 °C om te gebruiken op dag 4 - Begin van de co-cultuur. Voor elke nieuwe run van het hele experiment wordt aanbevolen om een verse voedingsbodem te bereiden.
  4. PBMC-isolatie
    1. Breng na het centrifugeren (stap 3.1.5) het bovenstaande over in vier nieuwe centrifugatiebuisjes van 50 ml en gooi de gebruikte buisjes weg.
    2. Vul de centrifugatiebuisjes tot 50 ml met PBS + 2% FBS.
    3. Centrifugeer op 300 x g gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Gooi het supernatant weg, suspendeer de celpellet in 1 ml PBS + 2% FBS elk en combineer ze in twee centrifugatiebuisjes.
    5. Vul de tubes bij tot 50 ml met PBS + 2% FCS.
    6. Centrifugeer op 120 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    7. Gooi het supernatant weg, suspendeer de celpellet voorzichtig in 1 ml PBS +2% FBS en combineer de twee pellets in één valk.
    8. Vul de centrifugeerbuis tot 50 ml met PBS + 2% FBS.
    9. Tel het totale aantal PBMC's met behulp van een Neubauer-telkamer. Aanbeveling: verdun de celsuspensie 1:10 met trypanblauw voor de telling.
  5. Scheiding van CD8+ T-cellen
    OPMERKING: Gebruik CD8 MicroBeads human samen met magnetische scheiding (MS) kolommen en magnetisch geactiveerde celsortering plus (MACS+) buffer om CD8+ T-cellen magnetisch te scheiden volgens het protocol van de fabrikant (zie materiaaltabel).
    1. Centrifugeer de PBMC's (na celtelling) gedurende 10 minuten bij 300 x g .
    2. Gooi het supernatans weg en suspendeer de celpellet opnieuw in 80 μL MACS+-buffer (500 ml PBS aangevuld met 10 mM EDTA en 0,5% BSA) per 107 cellen (bijvoorbeeld 60.000.000 PBMC's worden geresuspendeerd in 6 x 80 μL = 480 μL buffer).
      OPMERKING: Voorbeeld: 465 ml PBS + 10 ml (0,5 M) EDTA en 25 ml BSA-Stock oplossing.
    3. Voeg 20 μL CD8 MicroBeads toe per 107 cellen en meng voorzichtig door op en neer te pipetteren. Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C.
    4. Was de cellen na incubatie door 2 ml MACS+-buffer per 10-7 cellen toe te voegen.
    5. Centrifugeer op 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen opnieuw in 1.000 μL MACS+-buffer.
    6. Plaats twee MS-kolommen in de magneet en plaats er twee centrifugatiebuisjes van 15 ml onder.
    7. Bereid de kolommen voor met 500 μL MACS+ buffer. De buffer loopt door de kolommen en kan worden opgevangen in de centrifugeerbuisjes eronder. Deze stap kan ook parallel aan stap 3.5.6 worden uitgevoerd.
    8. Pipetteer vervolgens de cellensuspensie gelijkmatig in de voorbereide MS-kolommen. De doorstroming kan worden opgevangen in dezelfde centrifugatiebuizen. Het bevat nu alle niet-gelabelde, CD8-negatieve cellen.
    9. Spoel de kolommen door 3x 500 μL MACS+ buffer toe te voegen. Voeg pas een nieuwe buffer toe bovenop de kolommen zodra ze zijn opgedroogd of gestopt met druppelen.
    10. Label de uiteindelijk verzamelde cellen als "Doorstroom" of "CD8-negatief" en combineer ze in één enkele centrifugatiebuis. Dit kan later worden gebruikt om de zuiverheid van de isolatie te meten via flowcytometrie.
    11. Neem een nieuwe centrifugatiebuis van 15 ml met het label "CD8+ T-cellen". De kolommen worden uit de magneet gehaald en op de centrifugatiebuis geplaatst.
    12. Spoel beide kolommen met de magnetisch gelabelde CD8-positieve T-cellen met elk 1.000 μL MACS+-buffer. Pipetteer daarom de buffer in de kolommen en begin onmiddellijk met het voorzichtig uit de kolommen duwen met behulp van de door de fabrikant meegeleverde plunjer.
      OPMERKING: Doe dit voor beide kolommen en verzamel 2 ml totale T-celsuspensie tijdens het centrifugeren.
    13. Tel het totale aantal T-cellen met behulp van een Neubauer-telkamer. Aanbeveling: Gebruik een verdunning van 1:4 met trypanblauw.
  6. Kleuring van T-cellen met CFSE
    1. Centrifugeer de geïsoleerde T-cellen bij 300 x g gedurende 5 min.
    2. Bereid tijdens het centrifugeren de CFSE-kleuringsoplossing voor door 1,1 μl CFSE-oplossing te mengen in 10 ml PBS. De uiteindelijke concentratie moet 1 μM zijn.
    3. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de celpellet in 1.000 μl PBS. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 min.
    4. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de celpellet opnieuw in 2000 μL CFSE-kleuringsoplossing (1 μM). Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C.
    5. Centrifugeer de gekleurde cellen op 300 x g gedurende 5 min. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de celpellet in 1.000 μl PBS.
    6. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 min. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de celpellet opnieuw in de juiste hoeveelheid T-celmedium om een concentratie van 1,5-2 x 106 T-cellen te bereiken in ongeveer 3-4 ml T-celmedium.
  7. Zaaien van T-cellen in een plaat met 6 putjes
    1. Gooi de coatingoplossing van de plaat met 6 putjes.
    2. Zaad 1,5-2 miljoen geïsoleerde en gekleurde T-cellen in 3-4 ml T-celmedium per putje.
    3. Incubeer T-cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende de volgende 48 uur
      OPMERKING: Stel de zaaidichtheid altijd in op 1,5 miljoen cellen / 3 ml. Vermijd het zaaien van T-cellen in een lagere dichtheid. Een hogere dichtheid is mogelijk, maar moet worden getest.

4. Begin van de co-cultuur (dag 4)

LET OP: Tijdsduur: 2 uur. Na het bepalen van het celgetal van de HSC4-tumorcellen, worden T-cellen in een verhouding van 1:1 toegevoegd aan de platen met 96 putjes.

  1. Eén putje per conditie oogsten om een representatief celgetal te bepalen
    1. Gooi het bovenstaande weg van de put die voorbeeldig is gezaaid voor de bepaling van het celgetal.
    2. Was de cellen eerst met 100 μL PBS en gooi vervolgens de PBS weg.
    3. Voeg 100 μL trypsine toe en incubeer gedurende 5 minuten op een verwarmingsplaat. Breng vervolgens de eencellige suspensie opnieuw in suspensie en controleer deze onder de microscoop; als de cellen niet loskomen, voeg dan nog eens 50 μL trypsine toe.
    4. Zodra alle cellen zijn losgekomen, stopt u de trypsinereactie door 100 μl (of 150 μl als er eerder 50 μl trypsine extra is toegevoegd) van het D10-medium toe te voegen en opnieuw te suspenderen.
    5. Breng het volledige volume van 200 μl uit het putje over in een monsterbuisje van 1,5 ml en gebruik 100 μl om het celgetal te meten. Vergeet niet om het gemeten celnummer aan te passen aan het samplevolume.
  2. Kleuring van HSC4-tumorcellen met een niet-toxische fluorescerende kleurstof voor het volgen van cellen
    1. Bereid de cell tracker voor (zie materiaaltabel) door 2 μl op te lossen in 20 ml PBS (eindconcentratie 0,1 μM volgens de fabrikant).
    2. Pipeer het D10-medium uit alle putjes met tumorcellen en gooi het weg.
    3. Voeg 200 μL van de cell tracker-oplossing toe aan de tumorcelputjes. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C.
    4. Gooi na de incubatie de kleuroplossing weg en was door 100 μL PBS toe te voegen. Gooi vervolgens ook de PBS weg.
    5. Voeg 200 μL verse D10 medium toe.
  3. Oogsten van T-cellen (plaat met 6 putjes)
    1. Resuspendeer de T-cellen voorzichtig in hun medium; de meeste T-cellen zijn in suspensie en kunnen worden geoogst door simpelweg uit hun putje te worden gepipetteerd.
    2. Controleer microscopisch of de putjes leeg zijn; zo niet, oogst dan met behulp van 1.000 μL trypsine, plaats de plaat op een verwarmingsplaat bij 37 °C totdat de T-cellen zijn losgekomen en stop vervolgens de reactie door 1.000 μL PBS of T-celmedium toe te voegen (optioneel).
    3. Tel de T-cellen met behulp van een Neubauer-telkamer. Centrifugeer vervolgens de T-cellen op 300 x g gedurende 5 minuten.
    4. Resuspendeer de T-cellen in T-celmedium (gebruik hetzelfde medium dat op dag 2 T-celisolatie is bereid) tot een uiteindelijke concentratie van 10.000 T-cellen per 20 μl.
  4. T-cellen toevoegen aan HSC4-tumorcellen (plaat met 96 putjes)
    1. Voeg de gewenste hoeveelheid T-cellen toe aan de tumorcelputjes volgens het eerder bepaalde aantal tumorcellen in een verhouding van 1:1.
    2. Houd één tumorcel goed per aandoening vrij van T-cellen als een "alleen tumorcellen" controle. Deze "enige tumorcel"-controle maakt het mogelijk om de stroomgegevens nauwkeurig af te schermen.
    3. Voeg 200 μL van de T-celsuspensie toe aan een leeg putje als een "enige T-cel"-controle (200.000 T-cellen). Deze "enige T-cel"-besturing maakt een nauwkeurige gating van de stroomgegevens mogelijk.
    4. Incubeer van de co-cultuur gedurende 96 uur (37 °C, 5% CO2)

5. Kwantificering van T-celproliferatie door flowcytometrie (dag 7)

LET OP: Timing: 3 uur. Na nog eens 96 uur de co-cultuur te hebben geïncubeerd, worden de putjes geoogst en gekleurd door een antilichaammix die verschillende antilichamen bevat, afhankelijk van de onderzoekshypothese (bijvoorbeeld anti-CD3-, CD8-, HLA-DR- en CD25-antilichamen). Vervolgens worden de cellen geanalyseerd door middel van meerkleurige flowcytometrie.

  1. Bereid een partij FACS-buisjes en microcentrifugebuisjes voor en schrijf ze in voor elke te oogsten put.
  2. Oogsten van cellen
    1. Resuspendeer de cellen in hun medium en breng ze over in de FACS-buisjes.
    2. Was de cellen met 100 μL PBS en breng dit vervolgens over in de FACS-buisjes.
    3. Voeg 100 μL trypsine toe aan de putjes en incubeer op de verwarmingsplaat (37 °C) gedurende 5 min.
    4. Breng de cellen opnieuw in suspensie en controleer vervolgens microscopisch of alle cellen zijn losgemaakt. Als dit het geval is, brengt u de gesuspensie van trypsinated cellen over in de FACS-buisjes.
    5. Controleer microscopisch of alle putjes leeg zijn; Als dit niet het geval is, herhaalt u de stappen 5.2.3-5.2.4.
  3. Het verzamelen van het supernatans van de co-cultuur voor verdere experimenten
    1. Centrifugeer de buisjes gevuld met cellen op 300 x g gedurende 5 min.
    2. Pipetteer voorzichtig ongeveer 300 μL van het bovenstaande uit de buisjes en in een andere batch microcentrifugebuisjes om te worden ingevroren bij -20° C. Het supernatans kan later worden gebruikt om bijvoorbeeld ELISA-testen uit te voeren om uitgescheiden cytokines te kwantificeren.
  4. Kleuring van de cellen met antilichamen om flowcytometrie uit te voeren
    1. Bereid antilichaammix voor: Voeg 5 μL anti-CD3-Krome Orange, 0,5 μL anti-CD8-PerCE-Cyp5.5, 1 μL anti-HLA-DR-APCVio770, 2,5 μL anti-CD25-PE-Dazzle toe aan 91 μL PBS/FACS-buffer.
    2. Voeg 200 μL FACS-buffer (PBS aangevuld met 2% FBS en 2% EDTA) toe aan elk buisje en suspendeer opnieuw.
    3. Centrifugeer opnieuw op 300 x g gedurende 5 min. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen in 100 μl van het eerder bereide antilichaammengsel (stap 5.4.1). Incubeer gedurende 30-45 minuten bij 4 °C in de koelkast beschermd tegen licht.
    4. Na de incubatie centrifugeren op 300 x g gedurende 5 min. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen in 100 μl FACS-buffer.
    5. Voer flowcytometrie uit op een cytometer die in staat is om alle bovengenoemde fluorescerende antilichamen en het CSFE-signaal te onderscheiden.

6. Gating strategie en data-analyse

  1. Doubletten uitsluiten en de juiste T-celpopulatie identificeren (Figuur 2A).
    1. Sluit de doubletpopulatie uit op basis van voorwaarts vs. zijwaarts verstrooiingsgebied (FSC-A vs. SSC-A) (hemden).
    2. Plot "Singlets" voor identificatie van T-cellen op basis van voorwaartse vs. zijwaarts verstrooiingsgebied (FSC-A vs. SSC-A) (T-cellen).
      OPMERKING: Voor de beste uitsluiting van de grootte, meet u de monsters "Alleen T-cellen" en "Alleen tumorcellen" parallel (Figuur 2B).
    3. Zet de CD3-expressie uit tegen de SSC-A om de T-cellen te onderscheiden. Verder kunnen de CD8-positieve T-cellen worden geïdentificeerd door het CD8-signaal uit te zetten tegen de SSC-A. Alle T-cellen zijn CD3+/CD8+ (CD8+ T-cellen) (Figuur 2A).
    4. Teken het CFSE-signaal van alle "CD8+ T-cellen" uit als een histogram.
      OPMERKING: Afscherming van de niet-proliferatieve subpopulatie (hoogste CFSE-signaal), de proliferatieve subpopulatie (alle T-cellen met verminderd CFSE-signaal) en de zeer proliferatieve subpopulatie (alle T-cellen van de4e of minder intensieve CFSE-piek).
  2. Analyse van activiteit-geassocieerde oppervlaktemarkers op de T-celpopulatie
    1. Volg de poortstappen (stap 6.1) (Figuur 3A).
    2. Optie A: Kies de "CD8+ T-cellen" als invoer en analyseer ze op hun CD25- of HLA-DR-expressie door de fluorescentie van de respectieve oppervlaktemarkers uit te zetten tegen de SSC-A-kenmerken.
      OPMERKING: Als er een duidelijke CD25-hoge subpopulatie detecteerbaar is, wordt gating voor de CD25-hoge populatie aanbevolen. Hetzelfde geldt voor de gating/analyse van HLA-DR op T-cellen (Figuur 3B).
    3. Optie B: Kies de "CD8+ T-cellen" als invoer en analyseer ze op hun CD25- of HLA-DR-expressie door de fluorescentie van de respectieve oppervlaktemarkers uit te zetten tegen de SSC-A-kenmerken.
      OPMERKING: Als er geen afzonderlijke subpopulatie detecteerbaar is (afhankelijk van de geanalyseerde oppervlaktemarker), wordt de analyse van de verschuiving van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van de gehele T-celpopulatie aanbevolen (Figuur 3C).

figure-protocol-2
Figuur 2: Poortstrategie van CFSE-gekleurde, voorgestimuleerde T-cellen voor analyse van de proliferatie na 96 uur co-cultuur met voorbehandelde HNSCC-tumorcellen. T-cellen en tumorcellen worden 96 uur na co-cultuur geoogst van een plaat met 96 putjes, gekleurd met een T-celspecifieke oppervlaktemarker en gemeten met behulp van een flowcytometrie-apparaat. (A) Doubletten werden uitgesloten op basis van FSC-A/FSC-H, en T-cellen werden eerst afgeschermd op grootte (FSC-A/SSC-A). T-cellen werden verder geanalyseerd op hun CD3 (anti-CD3 Krome Orange) en CD8 (anti-CD8 PerCP-Cy5.5) expressie. CD3+/CD8+ T-cellen werden uitgezet in een histogram en de CFSE-signaalintensiteit werd geanalyseerd. Het CFSE-signaal vertegenwoordigt T-celsubgroepen met divers proliferatiegedrag. T-cellen met het hoogste CFSE-signaal werden gedefinieerd als "niet-proliferatief". Alle subpopulaties die een verlies van het CFSE-signaal vertoonden, veroorzaakt door celdeling die leidde tot de helft van het signaal, in verschillende pieken, werden samengevat als "proliferatief". T-cellen die zich meer dan drie keer deelden (meer dan drie CSFE-signaalpieken) werden gedefinieerd als "zeer proliferatief". (B) Als controle worden monsters die bestaan uit alleen voorgestimuleerde T-cellen en alleen voorbehandelde tumorcellen aanvullend gemeten. T-cellen en HSC4-tumorcellen kunnen worden onderscheiden op basis van grootte met behulp van FSC-A vs. SCC-A-signaal. Verder werden niet-gestimuleerde CD8+ T-cellen geanalyseerd om te controleren op T-celactivering op basis van co-cultivatie met allogene tumorcellen alleen. (C) Als controle werd incubatie van niet-gestimuleerde CFSE-gekleurde T-cellen gedurende 96 uur parallel aan de co-cultuur opgenomen. (D) Niet-gestimuleerde, met CFSE gekleurde T-cellen werden samen gekweekt met voorbehandelde tumorcellen. Na 96 uur werden de cellen geoogst en werd het CFSE-signaal gemeten met behulp van de standaardprocedure. Niet-gestimuleerde T-cellen vertoonden geen proliferatie, alleen of na co-cultivatie met voorbehandelde tumorcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 3: Poortstrategie van de expressie van de oppervlaktemarker (CD25 en HLA-DR) geassocieerd met T-celactiviteit na 96 uur co-teelt met voorbehandelde HNSCC-cellen. (A) Doubletten werden uitgesloten op basis van hun FSC-A/FSC-H-kenmerken, en T-cellen werden eerst afgeschermd op grootte (FSC-A/SSC-A). T-cellen werden verder geanalyseerd op hun CD3 (anti-CD3 Krome Orange) en CD8 (anti-CD8 PerCP-Cy5.5) expressie. Het afschermen van de activiteitsmarkers CD25 (anti-CD25, PEDazzle594) en HLA-DR (anti-HLA-DR, APC-Vio770) op het T-celoppervlak kan in twee verschillende instellingen worden uitgevoerd. (B) Gating van alle CD8+ T-cellen voor het percentage van een specifieke CD25hoge of HLA-DRhoge subpopulatie op basis van dichtheidsgrafieken. (C) Als alternatief wordt voor beide activiteitsmarkers een MFI-verschuiving van de gehele CD8+ T-celpopulatie gemeten. Representatieve beelden van de analyse van de expressie van T-celoppervlaktemarkers na co-cultivatie met HSC4-tumorcellen worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

HSC4-tumorcellen afgeleid van een HNSCC werden 's nachts gezaaid en geïncubeerd. Na 24 uur werden de cellen behandeld met een kinaseremmer. Na 3 uur werden de eerste twee doses van 5 Gy per fractie aangebracht. Na 24 uur werd de tweede dosis toegediend en werden de cellen opnieuw 's nachts geïncubeerd. Tegelijkertijd werden 48 uur voor de start van de co-cultuur T-cellen geïsoleerd uit het bloed van een gezonde donor. Eerst werden PBMC's geïsoleerd met behulp van centrifugatiebuizen met dichtheidsgradiënt en een steriel scheidingsmedium. PBMC's werden geteld met behulp van een celtelkamer en CD8+ T-cellen werden geïsoleerd met behulp van de CD8+ T-celisolatiekit. Geïsoleerde CD8+ T-cellen werden vervolgens gekleurd met CFSE (1 μM) en vervolgens geteld. T-cellen werden gezaaid in CD3/CD28 voorgecoate putplaten met een dichtheid van 1,5 x 106 cellen/3 ml. Na 48 uur stimulatie werden de T-cellen geoogst, geteld en opnieuw gesuspendeerd in een dichtheid van 10.000 cellen/10 μL. Bovendien werden representatieve putjes van de gezaaide tumorcellen geoogst en geteld, en het medium werd uitgewisseld voor alle resterende putjes. T-cellen werden in een verhouding van 1:1 aan de tumorcellen toegevoegd. De co-cultuur werd na 96 uur geoogst, het bovenstaande werd bewaard bij -20 °C en de cellen werden gekleurd en gemeten met behulp van flowcytometrie (Figuur 1).

T-cellen werden geïdentificeerd aan de hand van uitsluiting van grootte en CD3/CD8-positiviteit. CFSE-signaal van CD3+/CD8+ positieve cellen toonde de verdeling van niet-proliferatieve T-cellen (hoog CFSE-signaal) en verschillende subpopulaties van prolifererende T-cellen (verlies van CFSE-signaalintensiteit). Het aandeel prolifererende T-cellen werd voorbeeldig gemeten voor de HSC4 HNSCC-cellijn (Figuur 4A). Alle T-cellen die ten minste één deling vertoonden, werden gedefinieerd als "proliferatief". T-cellen die meer dan 3 delingen vertoonden, werden gedefinieerd als "zeer proliferatief" (Figuur 4B). Voor de HPV-negatieve cellijn HSC4 werd een lichte toename van de proliferatiesnelheid gedetecteerd wanneer T-cellen samen werden gekweekt met bestraalde tumorcellen. RT en RT plus remming van ATR resulteerden in een significant verhoogde opeenvolgende T-celproliferatie in vergelijking met co-culturen van RT plus ATM-remming die met HSC4-cellen werden behandeld met T-cellen. Wat betreft de "zeer proliferatieve" fractie van T-cellen, was voorbehandeling van HSC4-cellen met RT plus remming van ATR het meest effectief bij het stimuleren van T-celproliferatie (Figuur 4B).

figure-results-1
Figuur 4: Proliferatie van CFSE-gekleurde T-cellen voor analyses van HSC4-behandelingsafhankelijke veranderingen in T-celproliferatie. (A) Aandeel prolifererende T-cellen na 96 uur co-cultuur met voorbehandelde HPV-negatieve HSC4-tumorcellen. De proliferatie van T-cellen was significant lager na co-cultuur met RT+ATMi behandelde HSC4-tumorcellen in vergelijking met RT of RT plus ATRi-behandeling. (B) RT van HSC4-tumorcellen induceerde een hogere fractie van sterk prolifererende T-cellen (meer dan drie celdelingen. Na co-cultuur van RT+ATRi voorbehandelde HSC4-tumorcellen met T-cellen, was het percentage sterk proliferatieve T-cellen het hoogst. De balken tonen gegevens van vier onafhankelijke experimenten met de T-cellen van vier onafhankelijke, gezonde donoren (n = 4; Gemiddelde ± SD). (*p≤ 0,05, **p≤ 0,01, ***p≤ 0,001, ****p≤ 0,0001; statistische significantie getest door alle experimentele omstandigheden te vergelijken met elke met behulp van tweezijdige Mann-Whitney-U voor niet normaal verdeelde gegevens). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Op proliferatie gebaseerd CFSE-verlies kan worden gebruikt om de proliferatiesnelheid van T-cellen te kwantificeren. Verder worden verschillende celoppervlaktemarkers beschreven als geassocieerd met T-celactiviteit, zoals CD25 en HLADR. Daarom werd een analyse van CD25 en HLA-DR op het oppervlak van alle CD3+ en CD8+ T-cellen door middel van flowcytometrie uitgevoerd (Figuur 5). De expressie kan worden gekwantificeerd als er verschillende CD25hoge of HLA-DRhoge subpopulaties detecteerbaar zijn en kunnen worden onderscheiden door deze zeer positieve cellen af te schermen (Figuur 3B). Als er geen afzonderlijke subpopulaties detecteerbaar zijn, kan de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van de hele populatie worden gemeten en kunnen op omstandigheden gebaseerde verschuivingen van de MFI worden gekwantificeerd (Figuur 3C).

Voorbeeldig werd de expressie geïdentificeerd door de MFI van CD25 en HLA-DR geanalyseerd na 96 uur co-cultuur met voorbehandelde HSC4-tumorcellen (Figuur 5). Na co-cultuur van T-cellen met RT-behandelde HSC4-tumorcellen was de expressie van CD25 op de T-cellen sterk neerwaarts gereguleerd. Met name voorbehandeling van de tumorcellen met alleen ATMi resulteerde in een significant verminderde expressie van CD25 in vergelijking met ATRi-voorbehandeling. In de gecombineerde setting met RT, hoewel RT resulteerde in verminderde expressie van CD25 op T-cellen, resulteerde de combinatie van RT met ATMi in een verhoogde expressie van CD25 in vergelijking met RT plus ATRi (Figuur 5A). Met betrekking tot de expressie van HLA-DR op T-cellen leidde RT over het algemeen tot opregulatie van HLA-DR, maar nogmaals, in combinatie met ATMi of ATRi, werd een ander gedrag waargenomen (Figuur 5B). T-cellen die samen werden gekweekt met HSC4-cellen die waren voorbehandeld met een combinatie van RT+ATRi verhoogden de expressie van HLA-DR in vergelijking met RT alleen of RT+ATMi.

figure-results-2
Figuur 5: Expressie van de activeringsmarkers CD25 en HLA-DR op het oppervlak van T-cellen na 96 uur co-cultuur met voorbehandelde HSC4-tumorcellen. De expressie van CD25 en HLA-DR werd geanalyseerd op basis van de verschuiving van de MFI van de hele T-celpopulatie. RT van HSC4 resulteerde in een verminderde expressie van CD25 op T-cellen en een verhoogde expressie van HLA-DR. De combinatie van RT met ATMi resulteerde in significant verschillende expressiepatronen in vergelijking met RT plus ATRi. De boxplots tonen gegevens van vier onafhankelijke experimenten met de T-cellen van vier onafhankelijke, gezonde donoren (n = 4; Gemiddelde ± SD). De gegevens werden geanalyseerd door alle experimentele omstandigheden met elkaar te vergelijken met behulp van een tweezijdige Mann-Whitney-U-test voor niet-normaal verdeelde gegevens (*p≤ 0,050). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Deze gegevens geven exemplarisch aan dat de behandeling van tumorcellen, in dit geval van HSC4 HNSCC-cellen, invloed heeft op de immunogeniciteit van de tumorcellen. Dit kan worden gecontroleerd door co-cultivatie van de tumorcellen met voorgestimuleerde T-cellen, wat leidt tot een divers proliferatiegedrag en expressie van activeringsmarkers op menselijke T-cellen op basis van het toegepaste behandelingsregime voor tumorcellen.

Discussie

Het hier gepresenteerde protocol biedt een snelle en gemakkelijke methode om de proliferatieve capaciteit van T-cellen te analyseren, samen met hun activeringsstatus in een co-cultuursetting met voorbehandelde tumorcellen. Daardoor kunnen de effecten van verschillende behandelingsmodaliteiten, zoals RT, CT of TT, op de activiteit en proliferatie van T-cellen gemakkelijk worden gescreend, waardoor de basis wordt gelegd voor latere diepere immunologische analyses van veelbelovende benaderingen. De representatieve resultaten in dit manuscript bewijzen dat deze allogene T-cel co-cultuurtest goed presteert. Significante verschillen in T-celproliferatie, evenals in T-celactiviteit, werden waargenomen voor de co-cultuur met differentieel voorbehandelde menselijke HSC4 (HNSCC) cellen (Figuur 4 en Figuur 5). Er werd vastgesteld dat de behandeling van de HSC4 met RT alleen of in combinatie met TT resulteerde in een verhoogde proliferatie van de T-cellen, met name met betrekking tot de sterk proliferatieve fractie van de T-cellen (Figuur 4). In overeenstemming met de kwantificering van de proliferatiesnelheid werd de activeringstoestand van de T-cellen ook differentieel beïnvloed door de verschillende behandelingsregimes. Samenvattend resulteerde de toepassing van RT in een sterke downregulatie van de expressie van CD25 op T-cellen, terwijl de expressie van HLA-DR werd opgereguleerd. RT induceert DNA-schade in de bestraalde tumorcellen, wat op zijn beurt leidt tot cellulaire stressreacties die het vrijkomen van stress- en schade-geassocieerde moleculen en cytokines omvatten, evenals de expressie van immuunmodulerende liganden op het celoppervlak19.

De combinatie van RT met TT in de vorm van DNA-reparatieremmers versterkt en behoudt die effecten verder, aangezien de tumorcellen de door RT geïnduceerde DNA-schade niet efficiënt kunnen herstellen. Dit kan de secretie van immunogene factoren en de expressie van immunogene liganden op het celoppervlak verder bevorderen en behouden20. In overeenstemming hiermee hebben we eerder aangetoond dat de behandeling van tumorcellen (HNSCC) met RT- en DNA-schaderemmers het immuunfenotype op het oppervlak van de tumorcel verandert. De modulatie van het immuunfenotype omvatte de regulatie van het immuunstimulerende molecuul ICOS-L en het immuunonderdrukkende molecuul PD-L111. Als reactie op deze modulatie van het immuunfenotype van de tumorcel kunnen T-cellen ook de expressie van activeringsmarkers op hun celoppervlak reguleren. Verder is bekend dat RT de afgifte van pro-inflammatoire cytokines stimuleert, zoals IFNγ of IL-6, die op hun beurt de proliferatie en activiteit van T-cellen beïnvloeden21. De expressie van activeringsmarkers op T-cellen is een zeer dynamisch proces. Gegevens van Zimmerman et al.22 toonden aan dat CD25 24 uur na stimulatie sterk tot expressie komt, maar 96 uur na stimulatie weer neerwaarts wordt gereguleerd. Dit is in lijn met onze bevindingen. HLA-DR daarentegen is een activeringsmarker in de late fase en wordt doorgaans voorafgegaan door een toename van CD25 en CD6923. Opvallend is dat de combinatie van RT + ATRi leidt tot een significante opregulatie van HLA-DR op T-cellen in vergelijking met RT + ATMi. Deze bevinding is in lijn met het werk van Dillion et al. die synergetische effecten van ATRi + RT aantoonden bij het induceren van een inflammatoire TME24. Een minder uitgesproken modulatie van de T-celactiviteit en proliferatie werd bereikt door de tumorcelbehandeling met alleen de kinaseremmers (Figuur 5). Dit kan te wijten zijn aan het feit dat de DNA-reparatieremmers ATMi en ATRi functioneren als een versterker van de RT-geïnduceerde DNA-schade en daarom niet erg immunogeen zijn wanneer ze als monotherapie worden toegepast. We hebben de minimale toxiciteit van ATMi of ATRi alleen al aangetoond11. Samenvattend bevestigen de resultaten het immunogene potentieel van RT (en TT met DNA-schaderemmers) en geven ze verder aan dat dit experimentele systeem geschikt is voor het screenen van de immunostimulerende capaciteiten van verschillende behandelingsmodaliteiten in menselijke hoofd-halskankercellen.

Hoewel de hier gepresenteerde methode eenvoudig en robuust is, zijn er enkele cruciale stappen in het protocol die vooraf moeten worden overwogen. De aanwezigheid van hoge EDTA-concentraties tijdens het isolatieproces, evenals tijdens de flowcytometrische analyse van de T-cellen, is noodzakelijk. Daarom wordt aanbevolen om het donorbloed op te vangen in met EDTA gecoate verzamelbuisjes en een MACS-buffer te gebruiken aangevuld met 10 mM EDTA om een efficiënte T-celisolatie en het genereren van een homogene eencellige suspensie voor de flowcytometrische evaluatie te garanderen. Daarnaast is de samenstelling van het medium T-cellen van groot belang voor het proliferatieve vermogen van T-cellen. Na het testen van verschillende samenstellingen van kweekmedia, resulteert een medium met lage concentraties L-Arginine en L-Lysine in het beste T-celproliferatiesignaal, aangezien L-Arginine van cruciaal belang is voor het metabolisme en de overleving van T-cellen en in een geschikte concentratie moet worden toegediend25,26. Desalniettemin moet men er rekening mee houden dat L-Arginine- en L-lysine-oplossingen niet stabiel zijn op lange termijn en dus binnen 3 maanden moeten worden gebruikt. Voor een optimale stimulatie moet het T-celmedium aangevuld met de aminozuren vers worden bereid voor elk T-celkweekexperiment. Bovendien zijn de celaantallen van de T-cellen, evenals die van de tumorcellen, kritische factoren waarmee rekening moet worden gehouden omdat ze van invloed zijn op de uitlezing van het experiment.

Voor de tumorcellen is enerzijds een celconfluency van 70% tot 80% gewenst aan het einde van het co-cultuurexperiment. Een overgroei van de tumorcellen kan leiden tot de afscheiding van factoren die de celgroei remmen en zou vervolgens ook van invloed zijn op de proliferatiesnelheid van T-cellen. Omdat de groei van de tumorcel sterk afhankelijk is van de individuele cellijn, raden we aan om het groeigedrag van de betreffende tumorcellijn grondig te testen in verschillende putplaten en voor de verschillende behandelingsregimes. Verder moeten de tumorcellen en de T-cellen samen worden gekweekt in een verhouding van 1:1. Daarom is het verplicht om voor elke behandelingsconditie een extra putje tumorcellen te zaaien, dat kan worden gebruikt voor de bepaling van het celgetal op de dag van het begin van de co-cultuur. Op die manier kan men ervoor zorgen dat een geschikt aantal T-cellen wordt gezaaid voor de verschillende behandelingsomstandigheden. Wat het celaantal van de T-cellen betreft, moet er rekening mee worden gehouden dat de hoeveelheid T-cellen die uit een gezonde donor kan worden geïsoleerd, zeer individueel is. De T-cellen zijn goed voor ongeveer 45% tot 70% van de PBMC's van een gezonde donor27. De benodigde hoeveelheid T-cellen moet dus al in grote lijnen worden geschat op het moment van de bloedafname. Bovendien is de dichtheid van de T-cellen belangrijk voor de efficiëntie van de activering van de T-cellen en hun overleving. Bijgevolg moeten de T-cellen worden gezaaid in een concentratie van ten minste 1,5 miljoen cellen per putje van een plaat met 6 putjes in 3 ml T-celmedium voor de eerste stimulatie vóór het begin van de co-cultuur. Een hogere T-celdichtheid is mogelijk, maar een lagere dichtheid moet worden vermeden. De activering van de T-cellen kan ook morfologisch onder de microscoop worden geëvalueerd, aangezien geactiveerde T-cellen de neiging hebben om celclusters te vormen.

Aangezien deze methode een vereenvoudigd experimenteel systeem is voor het bestuderen van de immunostimulerende capaciteiten van verschillende tumorcellijnen en behandelingsmodaliteiten, heeft het enkele beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden. Ten eerste is deze test gebaseerd op een allogene system, wat betekent dat de donor-T-cellen niet HLA-gematcht zijn met de respectieve tumorcellijn. Deze HLA-mismatch kan dus al T-celstimulatie induceren en vervolgens T-celproliferatie zonder verdere stimulatie van de tumorcelbehandeling28. Om dit ongewenste effect te kwantificeren, werden geïsoleerde T-cellen samen gekweekt met de HSC4-cellijn zonder voorafgaande stimulatie met CD28- en CD3-antilichamen. Er werd vastgesteld dat er in deze setting bijna geen proliferatie werd geïnduceerd, wat aangeeft dat de HLA-mismatch slechts kleine effecten heeft op de T-celactivering in deze specifieke experimentele setting. Bovendien werden significante verschillen gevonden in de proliferatie en activering van T-cellen op basis van de tumorcelbehandeling, ondanks de allogene setting. Niettemin moet voor het opzetten van deze test de potentiële allogene-geïnduceerde proliferatie van T-cellen eenmaal aan het begin van de experimenten worden getest en gekwantificeerd. De aanbevolen "alleen T-cel" en "alleen tumorcel" controles zijn nodig voor voldoende gating en zijn verplicht bij elke replicatie van de experimenten. Desalniettemin moet men in gedachten houden dat een allogene co-cultuur Het is dus mogelijk dat dit systeem de specifieke antitumorrespons niet nauwkeurig weergeeft zoals deze in vivo zou optreden bij patiënten29,30. Voor verdere verbetering zou een meer verfijnde setting een autologe co-cultuurbenadering zijn. In deze setting moeten van de patiënt afgeleide tumorbiopten worden gekweekt en in cultuur worden gebracht met T-cellen geïsoleerd uit het perifere bloed van dezelfde patiënt28. Deze experimentele benadering kan echter een uitdaging zijn, niet alleen in termen van het kweken van primaire tumorcellen, maar ook in termen van de beschikbaarheid van biomateriaal afkomstig van patiënten. Een andere beperking waarmee rekening moet worden gehouden, is de verhouding tussen de tumorcellen en de T-cellen in de co-cultuur. Aangezien de aanbevolen verhouding van de cellen 1:1 is, weerspiegelt de verhouding niet de fysiologische situatie van de TME bij patiënten31. Deze beperking moet echter worden geaccepteerd, aangezien bij lagere T-celtellingen de veranderingen in de proliferatiesnelheid en activeringsstatus niet kwantificeerbaar zijn.

Op het gebied van tumorimmunologie biedt deze test de mogelijkheid om te screenen op de immunogeniciteit van verschillende behandelingsmodaliteiten in een eenvoudige en snelle experimentele in vitro setting. Daarom kan niet alleen tijd worden bespaard door de meest veelbelovende benaderingen op het gebied van immunogeniciteit vooraf te screenen, maar ook door in vivo experimenten. Diermodellen kunnen worden verminderd, omdat alleen veelbelovende behandelingsschema's verder kunnen worden nagestreefd in diermodellen om het immuunsysteem als geheel in een organisme weer te geven. Verder, aangezien deze test is gebaseerd op menselijke primaire cellen en menselijke kankercellijnen, kunnen de resultaten beter te vertalen zijn naar de kliniek dan tests die zijn gebaseerd op andere modelsystemen en soorten.

In de toekomst kan deze test worden gemoduleerd en aangepast om meer specifieke onderzoeksvragen te beantwoorden. Men zou bijvoorbeeld een behandeling van de T-cellen kunnen opnemen om een behandelingsscenario weer te geven dat dichter bij de situatie bij de patiënten ligt. Aangezien tumorreactieve T-cellen meestal in de TME worden aangetroffen, worden ze in gelijke mate beïnvloed door lokale therapieën zoals RT en worden ze waarschijnlijk ook beïnvloed door systemische therapieën zoals CT of TT32. Een verdere verbetering van de test is de co-cultivatie van T-cellen met tumorsferoïden uit tumorcellijnen of zelfs de co-cultivatie met van patiënten afgeleide tumororganoïden. Deze driedimensionale culturen zijn meer vergelijkbaar met de structuur van een tumor bij een patiënt28. Ten slotte kan ook de uitlezing van het experiment via flowcytometrie gemakkelijk worden aangepast om verdere moleculen op het oppervlak van T-cellen te onderzoeken of door de expressie van immuuncheckpointmoleculen op de tumorcellen te analyseren. Naast de bepaling van het immuunfenotype van de T-cellen, zou men de celkweeksupernatanten uit de co-cultuurexperimenten kunnen gebruiken voor de kwantificering van uitgescheiden cytokines of chemokinen om meer inzicht te krijgen in de T-celactiviteit. Samenvattend levert dit protocol een uitgebreide, robuuste en gemakkelijke co-cultuurtest van T-cellen en tumorcellen die screening op de immunogeniciteit van verschillende behandelingsmodaliteiten voor kanker mogelijk maakt. Omdat deze test kan worden aangepast aan specifieke onderzoeksvragen, is deze zeer geschikt voor toepassing in het brede veld van de tumorimmunologie.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd mede gefinancierd door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek Erlangen (IZKF Erlangen) en het Bayerisches Zentrum für Krebsforschung (BZKF).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL Cellstar tubesGreiner Bio-One GmbH188271
50 mL Cellstar tubesGreiner Bio-One GmbH227261
6 well cell culture plate sterile, with lidGreiner Bio-One GmbH657160
96 well cell culture plate sterile, F-bottom, with lidGreiner Bio-One GmbH655180
AZD0156Selleck Chemicals GmbHS8375
Berzosertib (VE-822)Selleck Chemicals GmbHS7102
CASYcupsOMNI Life Science GmbH & Co KG 5651794
CASYtonOMNI Life Science GmbH & Co KG 5651808
CD25a, PE-Dazzle594, Mouse IgG1Biolegend356126
CD28-UNLBBeckmann Coulter, Inc.IM1376
CD3a,Krome Orange, Mouse IgG1Beckmann Coulter, Inc.B00068
CD3e Monoclonal AntibodyThermo-Fisher Scientific, Inc.MA1-10176
CD4, APC, Mouse Anti-Human Mouse IgG1BD Pharmingen555349
CD8 MicroBeads, humanMiltenyi Biotec, Inc.130-045-201
CD8a, PerCP-Cy5.5, Mouse IgG1Biolegend300924
CellTracker Deep Red DyeThermo Fisher Scientific, Inc.C34565
CFSE Merck KGaA (Sigma-Aldrich)21888
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium)PAN-Biotech GmbHP04-02500
DxFlex Flow Cytometer (with Auto Loader)Beckmann Coulter, Inc.C44326, C02846
EDTA disodium salt dihydrateCarl Roth GmbH + Co. KG8043.2
FBS superior  Merck KGaA (Sigma-Aldrich)S0615-500ML
FBS superior  Merck KGaA (Sigma-Aldrich) S0615-100MLVoor productie van heat-inactivated FBS. Verhit gedurende 30 min op 56 °C met mengen om complementeiwitten te inactiveren.
Graph Pad Prism (version number 9)GraphPad Software-
HLA-DR, DP, DQ Antibody, anti-human, APC-Vio770Miltenyi Biotec, Inc.130-123-550
Kaluza (version number 2.1)Beckmann Coulter, Inc.-
L-ArgininMerck KGaA (Sigma-Aldrich)A8094-25G
L-Lysin-monohydrochlorideMerck KGaA (Sigma-Aldrich)L5626-100G
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec, Inc.130-091-376
MS ColumnsMiltenyi Biotec, Inc.130-042-201
Neubauer-improved counting chamberPaul Marienfeld GmbH & Co. KG 640010
PBSMerck KGaA (Sigma-Aldrich)D8537-500mL
Penicillin-StreptomycinThermo-Fisher Scientific, Inc.1514-122
ROTISep 1077Carl Roth GmbH + Co. KG0642.2
RPMI-1640 MediumMerck KGaA (Sigma-Aldrich)R1790
SepMate 50mL tubesStemcell Technologies85450
Trypan blueMerck KGaA (Sigma-Aldrich)T6146-25G
TrypsinThermo-Fisher Scientific, Inc.15400054

Referenties

  1. Hiam-Galvez, K. J., Allen, B. M., Spitzer, M. H. Systemic immunity in cancer. Nat Rev Cancer. 21 (6), 345-359 (2021).
  2. Mantovani, A., Allavena, P., Marchesi, F., Garlanda, C. Macrophages as tools and targets in cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 21 (11), 799-820 (2022).
  3. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: From t cell basic science to clinical practice. Nat Rev Immunol. 20 (11), 651-668 (2020).
  4. Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting. Immunity. 21 (2), 137-148 (2004).
  5. Mittal, D., Gubin, M. M., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. New insights into cancer immunoediting and its three component phases--elimination, equilibrium and escape. Curr Opin Immunol. 27, 6-25 (2014).
  6. Irianto, T., Gaipl, U. S., Ruckert, M. Immune modulation during anti-cancer radio(immuno)therapy. Int Rev Cell Mol Biol. 382, 239-277 (2024).
  7. Burtness, B., et al. Pembrolizumab alone or with chemotherapy versus cetuximab with chemotherapy for recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (keynote-048): A randomized, open-label, phase 3 study. Lancet. 394 (10212), 1915-1928 (2019).
  8. Hecht, M., et al. Safety and efficacy of single cycle induction treatment with cisplatin/docetaxel/ durvalumab/tremelimumab in locally advanced HNSCC: First results of checkered-CD8. J Immunother Cancer. 8 (2), e001378(2020).
  9. Chen, J. A., Ma, W., Yuan, J., Li, T. Translational biomarkers and rationale strategies to overcome resistance to immune checkpoint inhibitors in solid tumors. Cancer Treat Res. 180, 251-279 (2020).
  10. Solomon, B., Young, R. J., Rischin, D. Head and neck squamous cell carcinoma: Genomics and emerging biomarkers for immunomodulatory cancer treatments. Semin Cancer Biol. 52 (Pt 2), 228-240 (2018).
  11. Meidenbauer, J., et al. Inhibition of atm or atr in combination with hypo-fractionated radiotherapy leads to a different immunophenotype on transcript and protein level in HNSCC. Front Oncol. 14, 1460150(2024).
  12. Kumari, S., et al. Immunomodulatory effects of radiotherapy. Int J Mol Sci. 21 (21), 8151(2020).
  13. Wimmer, S., et al. Hypofractionated radiotherapy upregulates several immune checkpoint molecules in head and neck squamous cell carcinoma cells independently of the HPV status while icos-l is upregulated only on HPV-positive cells. Int J Mol Sci. 22 (17), 9114(2021).
  14. Derer, A., et al. Chemoradiation increases pd-l1 expression in certain melanoma and glioblastoma cells. Front Immunol. 7, 610(2016).
  15. Schatz, J., et al. Normofractionated irradiation and not temozolomide modulates the immunogenic and oncogenic phenotype of human glioblastoma cell lines. Strahlenther Onkol. 199 (12), 1140-1151 (2023).
  16. Xu, M. M., Pu, Y., Zhang, Y., Fu, Y. X. The role of adaptive immunity in the efficacy of targeted cancer therapies. Trends Immunol. 37 (2), 141-153 (2016).
  17. Olivo Pimentel, V., Yaromina, A., Marcus, D., Dubois, L. J., Lambin, P. A novel co-culture assay to assess anti-tumor cd8(+) t cell cytotoxicity via luminescence and multicolor flow cytometry. J Immunol Methods. 487, 112899(2020).
  18. Kulp, M., Diehl, L., Bonig, H., Marschalek, R. Co-culture of primary human t cells with leukemia cells to measure regulatory t cell expansion. STAR Protoc. 3 (3), 101661(2022).
  19. Ruckert, M., et al. Immune modulatory effects of radiotherapy as basis for well-reasoned radioimmunotherapies. Strahlenther Onkol. 194 (6), 509-519 (2018).
  20. Samstein, R. M., Riaz, N. The DNA damage response in immunotherapy and radiation. Adv Radiat Oncol. 3 (4), 527-533 (2018).
  21. Meeren, A. V., Bertho, J. M., Vandamme, M., Gaugler, M. H. Ionizing radiation enhances il-6 and il-8 production by human endothelial cells. Mediators Inflamm. 6 (3), 185-193 (1997).
  22. Zimmerman, M., et al. Ifn-gamma upregulates survivin and ifi202 expression to induce survival and proliferation of tumor-specific T cells. PLoS One. 5 (11), e14076(2010).
  23. Saraiva, D. P., et al. Expression of HLA-dr in cytotoxic t lymphocytes: A validated predictive biomarker and a potential therapeutic strategy in breast cancer. Cancers (Basel). 13 (15), (2021).
  24. Dillon, M. T., et al. Atr inhibition potentiates the radiation-induced inflammatory tumor microenvironment. Clin Cancer Res. 25 (11), 3392-3403 (2019).
  25. Geiger, R., et al. L-Arginine modulates T cell metabolism and enhances survival and anti-tumor activity. Cell. 167 (3), 829-842.e13 (2016).
  26. Rodriguez, P. C., Quiceno, D. G., Ochoa, A. C. L-Arginine availability regulates t-lymphocyte cell-cycle progression. Blood. 109 (4), 1568-1573 (2007).
  27. Lozano-Ojalvo, D., López-Fandiño, R., López-Expósito, I., et al. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Springer International Publishing. Cham. 169-180 (2015).
  28. Gronholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer Res. 81 (12), 3149-3155 (2021).
  29. Perez, C., Gruber, I., Arber, C. Off-the-shelf allogeneic t cell therapies for cancer: Opportunities and challenges using naturally occurring "universal" donor t cells. Front Immunol. 11, 583716(2020).
  30. Martinez Bedoya, D., Dutoit, D., Migliorini, D. Allogeneic car t cells: An alternative to overcome challenges of car t cell therapy in glioblastoma. Front Immunol. 12, 640082(2021).
  31. Schnellhardt, S., et al. The prognostic value of FOXP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in rectal cancer depends on immune phenotypes defined by CD8+ cytotoxic T cell density. Front Immunol. 13, 781222(2022).
  32. Zitvogel, L., Kroemer, G. Oncoimmunology: A practical guide for cancer immunotherapy. , Springer International Publishing. Cham. 23-39 (2018).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Pre behandeling van tumorcellencytotoxische T cellenflowcytometrieCD8 positieve T cellenCFSE kleuringkinaseremmersradiotherapietumormicro omgeving

Gerelateerde artikelen