High-throughput beeldvormings- en analyseworkflow voor het evalueren van fenotypes en proliferatietoestanden van huidcellen in weefselmonsters

Summary

De combinatie van iteratief-bleken-extends-multiplexity (IBEX) en een commerciële nucleotide-labelingtest (Click-iT EdU) maakt de detectie en categorisatie van delende celtypen mogelijk in zeer dynamische processen in gefixeerde ingevroren muizenweefselsecties. Bovendien biedt een nieuwe open-source beeldverwerkingspijplijn beeldacquisitie en -analyse met hoge doorvoer.

Abstract

Huidletsels initiëren een complexe regeneratieve cascade die verschillende celtypen aanspreekt. Daarvan spelen perifere gliacellen een cruciale rol bij het waarborgen van het succes van het herstelproces. Ons begrip van deze processen blijft echter onvolledig vanwege beperkingen in de huidige technologieën. Daarom werd de iteratieve bleking-extends-multiplexity (IBEX)-methode gebruikt om veranderingen in de cellulaire samenstelling van de huid te karakteriseren met behulp van antilichamen gericht tegen eiwitten die tot expressie worden gebracht door belangrijke celtypen en structuren die betrokken zijn bij weefselregeneratie. Belangrijk is dat antilichamen gericht tegen celproliferatiemarkers vaak het aantal delende cellen in de huid onderschatten. Om deze beperking te overwinnen, werd Click-iT EdU-chemie gecombineerd met de IBEX-methode, waardoor een gedetailleerde karakterisering van prolifererende celtypen mogelijk is. Met behulp van een volledig geautomatiseerde confocale microscoop met draaiende schijf werd een workflow met hoge doorvoer ontwikkeld voor iteratieve beeldvorming van monsters die zijn onderverdeeld in platen met 24 putjes. Naast het uitbreiden van de IBEX-methode om celtoestanden in situ te evalueren met Click-iT EdU, werd ook een nieuwe open-source beeldverwerkingspijplijn geïntroduceerd om beeldcorrectie, stitching en registratie uit te voeren, en die kan worden gebruikt door onderzoekers zonder uitgebreide programmeerervaring. Bovendien wordt ook een gedetailleerde documentatie verstrekt over het verwerken en visualiseren van sterk gemultiplexte beeldvormingsgegevens (met behulp van conventionele beeldanalysesoftware, waaronder Fiji en QuPath). Samenvattend benadrukt dit protocol de veelzijdigheid van het IBEX-protocol en demonstreert het de aanpassing ervan aan een gevestigd conventioneel beeldvormingsplatform. Met name de combinatie van IBEX met Click-iT EdU-labeling maakt de detectie en categorisatie mogelijk van actief delende celtypen in intacte weefsels en tijdens zeer dynamische processen met ruimtelijke resolutie.

Introduction

De huid is het grootste orgaan van het menselijk lichaam en de oerbarrière om het lichaam te beschermen tegen de buitenomgeving¹. Bijgevolg wordt het blootgesteld aan een overvloed aan externe uitdagingen die zijn barrièrefunctie in gevaar brengen. Daarom heeft de huid complexe mechanismen ontwikkeld om de integriteit en functionaliteit van het weefsel na beschadiging te herstellen. Huidwondgenezing vindt plaats in drie overlappende fasen: ontsteking, proliferatie en rijping/remodellering. Bij deze drie stadia zijn verschillende celtypen betrokken, zoals dermale fibroblasten en immuuncellen, die samenwerken om de oorspronkelijke biologische eigenschappen van het beschadigde huidweefsel te herstellen ^1,2,3.

De huid is een dicht geïnnerveerd orgaan en het is bekend dat zenuwinnervatie cruciaal is voor een succesvol herstelproces ^4,5,6. Afgezien van axonale signalering ^4,7,8, nemen de perifere glia, die normaal gesproken de axonen omhult, deel aan succesvolle weefselregeneratie ^9,10,11. De rol van ondervertegenwoordigde celtypen, zoals perifere gliacellen, blijft echter slecht begrepen in dynamische processen zoals de regeneratie van huidweefsel. Om de functie van deze cellen beter te bepalen, is het van cruciaal belang om de cellulaire micro-omgeving en de naburige celtypen waarmee ze tijdens het regeneratieve proces kunnen interageren, te analyseren. Aangezien celproliferatie een belangrijke fase is voor weefselregeneratie, is het bovendien belangrijk om de prolifererende celtypen tijdens het herstelproces nauwkeurig te detecteren en te classificeren.

Gemultiplexte, high-content, optische beeldvormingsmethoden, zoals IBEX¹², zijn ontwikkeld om de cellulaire samenstelling te karakteriseren, cel-celinteracties te visualiseren en te kwantificeren, en micro-omgevingspatronen in complexe weefsels met ruimtelijke resolutie te ontleden. Terwijl andere multiplexingmethoden gespecialiseerde instrumenten en eigen reagentia vereisen, is een bijzonder voordeel van IBEX dat het tegen relatief lage kosten kan worden vastgesteld met behulp van in de handel verkrijgbare antilichamen, reagentia en microscopen die toegankelijk zijn in een standaard onderzoeksomgeving. Terwijl anti-Ki-67-antilichamen, vaak gebruikt in IBEX-panels, prolifererende celtypen in veel weefsels betrouwbaar labelen^13,14, bleek het aantal Ki-67-positieve (Ki-67+) cellen te worden onderschat in vergelijking met andere methodologieën in gefixeerde ingevroren weefselsecties van acute huidwonden bij muizen. Daarom hebben we de Click-iT EdU-chemie gecombineerd met IBEX en ontdekten dat het aantal EdU⁺-cellen nauwkeuriger het totale aantal prolifererende cellen weergeeft dat met andere methodologieën is verkregen.

Bovendien werd door gebruik te maken van een volledig geautomatiseerde confocale microscoop met draaiende schijf een workflow met hoge doorvoer tot stand gebracht voor iteratieve beeldvorming van weefselsecties die in een plaat met 24 putjes zijn geplaatst. De resulterende afbeeldingen worden vervolgens verwerkt door meerdere open-source Python-tools te combineren in een nieuwe beeldverwerkingspijplijn die de afbeeldingen corrigeert voor ongelijkmatige verlichting, het samenvoegen van de afzonderlijke tegels uitvoert en uiteindelijk de beeldregistratie uitvoert. In detail werd de BaSiCPy-bibliotheek¹⁵ gebruikt voor verlichtingscorrectie, de m2stitch-bibliotheek voor het samenvoegen van de afbeeldingen en fase-kruiscorrelatie voor cyclusregistratie. De geregistreerde afbeeldingen worden opgeslagen als OME-TIFF's en kunnen vervolgens worden geladen in conventionele beeldanalysesoftware, zoals Fiji¹⁷ en QuPath¹⁸, waar de afbeeldingen vervolgens verder worden verwerkt en celtypecategorisatie en andere metingen, zoals intensiteits- en afstandsberekeningen, kunnen worden uitgevoerd. Alles bij elkaar stelde het huidige protocol ons in staat om een gedetailleerde, zeer efficiënte karakterisering uit te voeren van de belangrijkste celtypen van de regenererende huid, met een bijzondere focus op de cellulaire micro-omgeving rond de perifere gliacelpopulatie.

Protocol

Alle fokkerijen, huisvesting en experimenten van dieren werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het veterinaire bureau van het kanton Zürich, Zwitserland.

1. Huidwonden over de volledige dikte (dag 0)

1. Induceer muizen van 8-10 weken oud met 5% isofluraan in 70% O₂ en onderhoud het met 2,5% isofluraan.
2. Scheer de achterhuid en reinig deze grondig.
3. Desinfecteer voorafgaand aan de operatie met antibacteriële zeep en 70% EtOH-oplossing.
4. Breng preoperatieve analgesie aan met behulp van een subcutane injectie van buprenorfine (30 μg∙mg∙kg⁻¹).
5. Genereer vier cirkelvormige excisiewonden van volledige dikte met een diameter van 5 mm op de onderrughuid van elk dier, twee aan elke kant, 1 cm vanaf de middellijn van het dier en ongeveer 2 cm uit elkaar¹⁹.
6. Voer postoperatieve analgesie uit met een 3-daagse behandeling van buprenorfine via drinkwater (9 μg/ml met 2% sucrose).
7. Laat de wonden genezen zonder te verband.
8. Verzamel de wonden op gedefinieerde tijdstippen voor histologisch onderzoek en flowcytometrie-analyse.
9. Voor het IBEX-protocol worden de huidweefsels 's nachts bij 4 °C ontleed en gefixeerd met 4% paraformaldehyde (PFA)-oplossing. Gebruik een in de handel verkrijgbare biopsiecapsule om te voorkomen dat de monsters tijdens het fixeren omkrullen. Cryoprotecteer de 4% PFA-gefixeerde weefsels in 30% sucrose in PBS 's nachts bij 4 °C. Breng de weefsels over op een 1:1 mengsel van 30% sucrose met O.C.T. verbinding gedurende 2 uur bij RT en sluit ze uiteindelijk in O.C.T voordat ze snel worden ingevroren in isopentaan.

2. Monstervoorbereiding (dag 1)

1. Smeer de plaat met 24 putjes in met 200 μL chroomaluingelatine gedurende 15 minuten op een rocker shaker. Verwijder vervolgens de gelatine volledig en droog de gecoate putjes 60 minuten in een oven van 40 °C. Laag het dubbele van de putten die nodig zijn als back-up. Voeg 2 ml PBS per putje toe.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de coating volledig droog is voordat u de tissue plaatst. Putjes kunnen ook een dag van tevoren worden gecoat en een nacht worden gedroogd bij RT. Eenmaal gecoat, bewaar de gecoate putjes niet in de koelkast of vriezer, en voor het beste resultaat gebruikt u de gecoate plaat met 24 putjes binnen 1-2 dagen.
2. Snijd het in O.C.T ingebedde weefsel op de cryostaat tot een dikte van 15-30 μm en breng het snel over in een gecoate put met 2 ml PBS.
   OPMERKING: Het weefsel kan worden overgebracht met behulp van een metalen spatel of tang.
3. Verwijder de PBS voorzichtig met behulp van een pipet van 1 ml, met als doel het weefselgedeelte in het midden van het putje te houden. Om dit effectief te doen, zuigt u de PBS langzaam op vanaf de randen van de put en past u de pipetpositie indien nodig aan om te voorkomen dat het weefsel verschuift.
   OPMERKING: Nauwkeurige plaatsing van het weefsel is essentieel voor het succes van het protocol. Zodra het weefsel zich aan het gecoate oppervlak hecht, kan het niet meer worden verplaatst.
4. Droog de weefselsecties gedurende 1 uur in een oven van 37 °C.

3. Weefselblokkering, EdU Click-iT-reactie en immunolabeling van antilichamen, IBEX-cyclus 1 (dag 1)

1. Rehydrateer met 1 ml PBS gedurende 5 minuten.
2. Permeabiliseer het weefsel met 500 μL 0,5% Triton in PBS gedurende 30 minuten bij RT.
3. Was de tissue 2x kort met PBS.
4. Voer de Click-iT-reactie uit, volgens de instructies van de fabrikant, gedurende 30 minuten bij RT.
   OPMERKING: Houd de monsters beschermd tegen licht.
5. Was de tissue 2x kort met PBS.
6. Blokkeer het weefsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT) met behulp van een blokkeerbuffer.
   OPMERKING: Hier werd 10% ezelserum in PBS gebruikt voor dit experiment, maar dit kan indien nodig worden aangepast; Elke blokkerende buffer die compatibel is met standaard immunolabelingprotocollen is geschikt.
7. Breng primaire antilichamen (verdund in blokkeerbuffer; zie de materiaaltabel) gedurende de 1e cyclus 's nachts bij 4 °C aan.
   OPMERKING: Blokkering en immunolabeling kunnen ook gedurende ~1 uur worden uitgevoerd met behulp van een niet-verwarmende magnetron, zoals beschreven in Radtke et ^al.12. Voor huidwonden wordt echter de beste signaal-ruisverhouding verkregen wanneer primaire antilichamen 's nachts worden geïncubeerd. Immunogelabelde weefselsecties kunnen enkele dagen voorafgaand aan de beeldvorming in PBS worden bewaard. Beeldvorming wordt aanbevolen de volgende dag voor een optimale signaalkwaliteit.

4. Secundaire antilichaam immunolabeling en nucleaire tegenkleuring (dag 2)

1. Was de putjes met 3 x 1 ml PBS.
2. Incubeer de weefselsectie met de anti-konijn secundaire antilichaamkleuring (1:300) in blokkeeroplossing, samen met de nucleaire tegenkleuring Hoechst 1:1.000, gedurende 1 uur bij RT in het donker.
3. Was 3 x 5 minuten met 1 ml PBS bij RT.
4. Laat ~500 μL PBS in elk putje en breng de plaat naar de microscoop.
   OPMERKING: Dit kan een pauzepunt zijn: de monsters zijn enkele dagen stabiel bij 4 °C, maar de signaal-ruisverhouding is het beste wanneer ze binnen 24 uur na immunolabeling worden afgebeeld.

5. Microscoopopstelling en beeldvorming van de eerste IBEX-cyclus (dag 2)

1. Meld u aan bij de microscoop, laad de software en meld u aan bij het gebruikersprofiel.
2. Voer de acquisitie-setup in (open via Screening | Acquisitie Setup) voor protocolconfiguratie en image-acquisitie.
3. Gebruik de uitwerpknop om de plaat in de microscoop te laden.
4. Reinig de onderkant van de 24-wells plaat met 70% ethanol net voordat u de plaat in de microscoop plaatst. Klik op de knop Laadplaat om de plaat in de microscoop te laden.
5. Selecteer de gewenste vergrotings- en acquisitiemodus onder Objectief en Camera. Selecteer als acquisitiemodus de confocale spleetmodus van 51 μm .
   OPMERKING: Hier werd voor het experiment een 20x wateronderdompelingsobjectief met een numerieke opening van 0,95 en een draaiende schijf met gaatjes van 50 μm gebruikt, op een afstand van 250 μm.
6. Selecteer op het tabblad Plaat het gebruikte plaatmodel.
7. Ga naar het tabblad Plaat/Sites om te bezoeken. Klik onder de Site-opties op Vast aantal sites. Kies het aantal kolommen en rijen zodanig dat ongeveer de hele put bedekt is. Klik op Sites 10% overlappen.
   OPMERKING: Deze knop moet worden geactiveerd om ervoor te zorgen dat de afzonderlijke tegels worden samengevoegd.
8. Selecteer alleen de eerste gevulde put voor acquisitie door met de rechtermuisknop op de bijbehorende put op de putkaart te klikken. Geselecteerde putten zijn groen en gedeselecteerde putten zijn grijs.
9. Verplaats de fase naar een positie waar weefsel zou moeten zijn door met de linkermuisknop te klikken op de eerste gevulde put in de plaatkaart en op een plaats nabij het midden in de sitemap. Zoek naar een donkerdere kleur van de put en de locatie die de huidige positie aangeeft.
10. Ga naar het tabblad Acquisitie . Selecteer de opties Lasergebaseerde scherpstelling inschakelen en Z-serie verkrijgen.
11. Ga naar het tabblad Acquisitie/Autofocus . Selecteer voor autofocus van bron tot put de optie Scherpstellen op plaat en putbodem en selecteer voor Autofocus van site de optie Alle sites .
12. Ga naar het tabblad Golflengten en kies het aantal kleurstoffen dat in de huidige cyclus moet worden afgebeeld. Zoek naar het bijbehorende aantal nieuwe tabbladen dat onder het tabblad Golflengten wordt geopend.
13. Ga naar het tabblad met de eerste golflengte. Selecteer onder Verlichting de filterinstellingen die het meest geschikt zijn voor de fluorofoor die van belang is (kies bijvoorbeeld DAPI als Hoechst is gebruikt).
14. Kies Laser met z-offset voor de z-positionering en klik op de knop Offset berekenen om de juiste beeldhoogte in te stellen. Een reeks beelden zal worden verkregen op verschillende z-posities. Kies degene waar het monster het beste in beeld is.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de podiumpositie is ingesteld op een locatie met tissue. Als er op deze positie geen weefsel zichtbaar is, selecteer dan een andere plaats en probeer het opnieuw (zie stap 4.9).
15. Druk op de focusknop en wacht tot er een scherp beeld van het weefsel wordt weergegeven.
16. Voor verlichtingsvermogen kiest u 50%. Voer 2000 in voor de maximale intensiteit van het doel en druk op Automatisch blootstellen om de belichtingstijd automatisch aan te passen.
    OPMERKING: Om de acquisitie te versnellen, kan het laservermogen worden verhoogd, wat de belichtingstijd zou moeten verkorten. Dit kan echter leiden tot meer fotoverbleking, wat zal leiden tot beeldartefacten waar de afzonderlijke tegels elkaar overlappen.
17. Kies voor de Z-serie de optie Z-serie en 2D-projectiebeeld en voor schaduwcorrectie de optie Alleen FL-arcering.
18. Herhaal stap 5.13-5.17 voor de andere golflengten, maar in plaats van Laser met z-offset, kiest u Z-offset van W1 en kiest u 0.
19. Ga naar het tabblad Z-serie . Voer de gewenste stapgrootte in (gebruik voor het 20x-objectief een stapgrootte van 0,5 μm).
    OPMERKING: De acquisitiesnelheid kan worden verhoogd door een stapgrootte te gebruiken die 2-3x de aanbevolen waarde is.
20. Klik op de knop Scherpstellen en wacht tot er een pijl met het label huidige positie verschijnt.
21. Klik op Start Live en wacht tot er een nieuw venster met live beelden verschijnt. Sleep de pijl voor de huidige positie totdat de onderkant van het weefsel is bereikt en klik op de knop Set B . Sleep de pijl voor de huidige positie totdat de bovenkant van het weefsel is bereikt en klik op de knop Instellen T . Klik op F2: Stop.
    OPMERKING: Men kan de golflengte kiezen die wordt gebruikt voor live beeldvorming onder Actieve golflengte.
22. Selecteer de sites die u wilt verwerven; zorg er eerst voor dat het podium zich bij het eerste putje bevindt door er met de linkermuisknop op te klikken en druk nogmaals op Start Live . Ga naar verschillende posities in de put door met de linkermuisknop op verschillende locaties in het siteoverzicht te klikken. Zoek de rand van het weefsel en markeer alle plaatsen die weefsel bevatten voor acquisitie door met de rechtermuisknop te klikken. Geselecteerde sites zijn groen en gedeselecteerde sites grijs.
    OPMERKING: Doe dit voorlopig alleen voor de eerste put en zorg ervoor dat alleen de eerste put is geselecteerd voor acquisitie.
23. Ga naar het tabblad Uitvoeren . Voor de plaatnaam, noem het "Cyclus{i}_Well{w}_{description}"; Vervang {i}, {w} en {description} door de bijbehorende waarden/description.
24. Klik op Protocol opslaan en sla het op, opnieuw met "Cyclus{i}_Well{w}" in de naam.
25. Stel de acquisitieregio's in voor alle andere putten. Herhaal hiervoor stap 5.22-5.24.
    OPMERKING: Voor elke put om te verkrijgen, moet een afzonderlijk protocolbestand worden opgeslagen. Zorg ervoor dat de juiste put is geactiveerd voordat u de nieuwe ROI tekent. Het resultaat zou één opgeslagen protocol per put moeten zijn om te verwerven. Dit is nodig omdat de weefsels verschillende vormen hebben, van goed tot goed. Als de ROI en z-stack identiek zijn tussen de putten, kunnen de herhalende stappen 5.22-5.24 worden overgeslagen en kunnen de stappen 5.26-5.29 ook worden overgeslagen. Selecteer in dat geval gewoon alle putten die moeten worden afgebeeld (zie stap 5.22), ga naar het tabblad Uitvoeren en druk op Plaat verkrijgen.
26. Klik op Besturing | Tijdschrift | Begin met opnemen en dan direct Control | Tijdschrift | Stop met opnemen. Sla het aangemaakte journaal op en open het opnieuw via Control | Tijdschrift | Dagboek bewerken.
27. Zoek in het linkerdeelvenster naar en dubbelklik op Plaatacquisitie - Laadprotocol uit bestand en op Plaatacquisitie om deze stappen aan het journaal toe te voegen; Zoek ze op in het rechterpaneel. Dubbelklik op het toegevoegde Plate Acquisition - Load Protocol From File en kies het protocol dat voor de eerste put is opgeslagen (zie stap 5.24).
28. Herhaal stap 5.27 voor elke put die moet worden verkregen, waarbij u altijd het respectieve protocol laadt.
29. Klik op Opslaan en ten slotte op Run Journal om de acquisitie te starten (duurt ongeveer 3 uur om 180 tegels te verkrijgen met een z-stack van 15 μm).

6. Fluorofoor bleken (dag 2)

1. Bereid het bleekreagens ongeveer 30 minuten voor het einde van het dagboek voor. Los 10 mg lithiumboorhydride op in 10 ml ddH₂O en passeer door een filter van 0,22 μm. Laat 10 minuten intrekken en wacht tot er belletjes ontstaan. Om een efficiënt bleken te garanderen, gebruikt u het bleekreagens binnen 4 uur na bereiding.
   LET OP: Werk onder een chemische kap bij het hanteren van de lithiumboorhydride, omdat deze kan reageren met lucht en waterstofgas kan produceren dat ontvlambaar is.
2. Bleekmiddel de fluoroforen met 1 ml 1 mg/ml lithiumboorhydride gedurende 15 minuten terwijl u wordt blootgesteld aan standaard omgevingslicht. Zoek tijdens het bleken naar kleine belletjes op het weefsel.
   NOTITIE: Als u onder een chemische kap werkt, zorg er dan voor dat de verlichting niet automatisch wordt uitgeschakeld tijdens het bleken.
3. Herhaal het bleken met nog eens 1 ml 1 mg/ml lithiumborohydride (bereid uit dezelfde oplossing) gedurende 15 minuten.
4. Was het putje 3 x 5 minuten met 1 ml PBS.
   OPMERKING: Verkort de wastijden niet, aangezien onvolledige verwijdering van het bleekreagens het volgende paneel antilichamen kan beschadigen.

7. IBEX-cycli (dag 2)

1. Breng primaire antilichamen aan voor de volgende immunolabelingscyclus (stap 3.7) en incubeer 's nachts bij 4 °C. Herhaal stap 4.4-5.4.
   OPMERKING: Stappen 4.2-4.3 worden niet herhaald omdat een ontkoppeld konijnenantilichaam alleen wordt gebruikt in de eerste IBEX-cyclus. Ongekoppelde antilichamen die zijn gekweekt in minder voorkomende soorten zoals kip of cavia, kunnen echter ook in latere cycli worden gebruikt, omdat hun secundaire antilichaam niet zal kruisreageren met de gekoppelde primaire antilichamen. Exacte details van de antilichamen die in elke cyclus worden gebruikt, zijn te vinden in de Tabel met materialen.
2. Laad op de microscoop de protocolinstellingen van de vorige IBEX-cyclus voor de bijbehorende put door te klikken op het laadprotocol, opgeslagen op de lokale pc als cyclus{i}_Well{w} (stap 5.24). De protocolinstellingen bevatten de ROI (geselecteerde tegels om te verwerven), vergroting, autofocusinstellingen en eventuele aanvullende acquisitie-instellingen die zijn opgeslagen van de vorige IBEX-cyclus (stappen 5.5-5.25).
3. Selecteer de golflengtetabbladen en pas de belichting en het verlichtingsvermogen aan voor het nieuwe paneel met antilichamen (stappen 5.12-5.18). Zorg ervoor dat u tijdens alle cycli één markering (meestal DAPI of Hoechst) afbeeldt om de cycli daarna uit te lijnen.
   OPMERKING: Zoals gerapporteerd in Radtke et ^al.18, zijn veelgebruikte fluorescerende eiwitten, zoals GFP en tdTomato, niet gevoelig voor het bleken van lithiumboorhydride. Bij het werken met weefsel dat endogene fluorescerende eiwitten bevat, zoals tdTomato, kan de overeenkomstige golflengte na cyclus 1 worden weggelaten uit de acquisitie, als deze niet nodig is voor beeldregistratie - dit zal de beeldvorming versnellen. Golflengten kunnen worden verwijderd op het tabblad Totale golflengte door het aantal acquisitiekanalen te verminderen. Bovendien werd een consistente toename van autofluorescentie van weefsel niet waargenomen tijdens de beeldvormingscycli; Dit is echter waarschijnlijk afhankelijk van het weefseltype¹⁸.
4. Controleer of de z-Stack-instellingen nog steeds redelijk zijn en pas deze dienovereenkomstig aan (stappen 5.19-5.21).
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de stapgrootte van de z-stack voor alle cycli hetzelfde is.
5. Werk de plaatnaam bij op het tabblad Uitvoeren en sla het protocol opnieuw op.
6. Herhaal stap 7.2-7.5 voor alle putten om te verkrijgen.
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de belichtingsinstelling op te schrijven voor alle golflengten die in de eerste put worden gebruikt en dezelfde instelling te gebruiken in alle volgende putjes.
7. Bewerk het journaal, selecteer de nieuwe protocolbestanden en sla het journaal op voor deze cyclus.
8. Voer het dagboek uit.
9. Herhaal stap 6.1-6.4 om de fluoroforen te bleken.
10. Herhaal de stappen 7.1-7.9 totdat de gewenste hoeveelheid immunolabeling is bereikt.

8. Beeldverwerking (dag 2)

1. Nadat de beeldacquisitie van de IBEX-cycli is voltooid, exporteert u beeldgegevens:
   1. Selecteer Screening | Hulpprogramma's voor plaatgegevens | Afbeeldingen exporteren.
   2. Klik op Selecteer plaat(en) en kies alle verkregen platen voor elke cyclus en put.
   3. Kies Alle Z-vlakken, selecteer een uitvoermap en druk op OK om de gegevens te exporteren.
      OPMERKING: De gegevens worden geëxporteerd als individuele tiff-bestanden voor elke tegel en elk vlak. Om alle tegels en cycli te combineren, werden de volgende verwerkingsstappen uitgevoerd.
2. Rangschik de geëxporteerde gegevens in mappen volgens het volgende schema: zorg ervoor dat elke cyclus één map is, die elk weer een map voor elke put bevat. Noem de volgende naam: "\cycle{i}\{well}\*_Plate_*", waarbij {i} en {well} de corresponderende cyclus en well zijn, en * elk teken is. Bijvoorbeeld: "\cycle1\A01\some_name_Plate_8654"
   OPMERKING: Voor de volgende verwerkingsstappen is een correcte naamgeving en mappenstructuur vereist.
3. Installeer de benodigde python-pakketten: gebruik Miniforge voor het beheren van de Python-omgeving. Zie https://github.com/conda-forge/miniforge voor installatie-instructies.
   OPMERKING: De code voor de verwerkingsstappen wordt verstrekt in de vorm van Jupyter Notebooks. Ze zijn te vinden op https://github.com/ZMB-UZH/zmb-ibex-jove of als aanvullende bestanden (Aanvullend Bestand 1, Aanvullend Bestand 2, Aanvullend Bestand 3, Aanvullend Bestand 4 en Aanvullend Bestand 5).
4. Wanneer u de code van Github downloadt, downloadt u alle bestanden door op Code | Download ZIP en volg de installatie-instructies in het README.md bestand.
5. Start Jupyter-Lab (aanvullend bestand 2):
   1. Activeer de geïnstalleerde conda-omgeving door conda in te voeren, activeer zmb-ibex-jove in een terminal.
   2. Ga in de terminal naar de gedownloade map door bijvoorbeeld cd C:\path\to\zmb-ibex-jove in te voeren.
   3. Start Jupyter-Lab door jupyter-lab in de terminal binnen te gaan. Er wordt een browservenster geopend met jupyter-lab.
6. Bereken de verlichtingscorrectie:
   1. Navigeer op het linkertabblad naar het notitieblok " examples/01_get_flatfield_BaSiC.ipynb" en open het door erop te dubbelklikken . Dit notitieboekje berekent de belichtingscorrectiebeelden met behulp van de BaSiCPy-bibliotheek (aanvullend bestand 3).
   2. Verander de "base_dir" en "save_dir" in de juiste paden, waar de gegevens zich bevinden en waar de afbeeldingen van de verlichtingscorrectie moeten worden opgeslagen.
   3. Als u de code in het notitieblok wilt uitvoeren, selecteert u elke cel en drukt u op Shift+Enter om deze uit te voeren. Voer de notebook van boven naar beneden uit.
7. Voer het hechten uit voor elke afzonderlijke cyclus (aanvullend bestand 4):
   1. Navigeer op het linkertabblad naar het volgende notitieblok en open het: "02_stitching_MD.ipynb". In dit notitieblok worden voor elke cyclus de afzonderlijke tegels geladen, de verlichting gecorrigeerd en aan elkaar genaaid, wat resulteert in één afbeeldingsbestand per put en cyclus. Gebruik de m2stitch-bibliotheek (https://github.com/yfukai/m2stitch) om te naaien.
   2. Wijzig de invoer in de eerste cel in de juiste bestandspaden. Voer het notitieblok opnieuw uit van boven naar beneden.
8. Voer beeldregistratie uit tussen cycli (aanvullend bestand 5):
   1. Navigeer op het linkertabblad naar het volgende notitieblok en open het: "03_registration_pcc.ipynb". In dit notebook worden de afzonderlijke cycli met elkaar uitgelijnd met behulp van alleen translationele transformaties, die worden berekend met het fase-kruiscorrelatie-algoritme uit de open access scikit-image library (https://scikit-image.org/).
   2. Wijzig de invoer in de eerste cel in de juiste bestandspaden. Kies een referentiecyclus en referentiekanaal om te gebruiken (meestal DAPI). Voer het notitieblok opnieuw uit van boven naar beneden.
      OPMERKING: Slechts één van de hoofdstukken "Optie 1: Alle kanalen samen laden en opslaan" en "Optie 2: Kanalen laden en opslaan als afzonderlijke bestanden" hoeft te worden uitgevoerd. Het eerste hoofdstuk maakt één groot bestand aan, met daarin alle kanalen van alle cycli. In het tweede hoofdstuk wordt voor elk kanaal een afzonderlijk bestand gemaakt. De tweede optie vereist minder geheugen om te verwerken.

9. Beeldanalyse (dag 2)

1. Download en open Fiji (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
   OPMERKING: De resulterende afbeeldingen zijn afbeeldingen met meerdere vlakken en meerdere kanalen, die kunnen worden geanalyseerd als 3D-afbeeldingen. Hier wordt een voorbeeldanalyseworkflow getoond voor alleen 2D-gegevens, waarvoor eerst een maximale intensiteitsprojectie wordt berekend.
2. Open het bestand in Fiji door het bestand naar het Fiji-venster te slepen.
3. Bereken de projectie met maximale intensiteit door Afbeelding | Stapels | Z Project..., kies Max Intensity en druk op ok. Sla de afbeelding opnieuw op via Bestand | Opslaan als | OME-TIFF".
4. Gebruik de open-source software QuPath om de cellen te analyseren; Download en installeer het vanaf https://qupath.github.io/.
5. Open QuPath en maak een nieuw project door een lege map naar het venster te slepen.
6. Importeer alle bestanden in het project door ze naar het QuPath-venster te slepen en op Importeren te drukken met de standaardinstellingen.
7. Dubbelklik op een afbeelding in het linkerdeelvenster om deze te openen. Specificeer het als Fluorescentie wanneer daarom wordt gevraagd.
8. Open het venster Helderheid/Contrast door op Shift+C te drukken.
   OPMERKING: Hier kan men selecteren welke kanalen worden weergegeven en de helderheid en het contrast aanpassen. Men kan ook de kanaalnamen en kleuren wijzigen door te dubbelklikken op de namen.
9. Selecteer de Tools | Polygoon tool en annoteer het weefselgebied. Zoek naar een nieuwe aantekening op het tabblad Aantekeningen. Stel het in op een specifieke klasse door de annotatie te selecteren, een klasse te selecteren (bijvoorbeeld Overig) en op Klasse instellen te drukken.
10. Cellen detecteren: Ga naar Analyseren | Cel detectie | Cel detectie.
    1. Kies een nucleair kanaal.
    2. Laat de meeste instellingen zoals ze zijn, maar pas de drempel aan door met de muis over een kern te zweven en de intensiteit te noteren die in de rechterbenedenhoek wordt weergegeven. Beweeg de muisaanwijzer over een achtergrondgebied en noteer de intensiteit opnieuw. Kies een waarde die het midden houdt tussen de achtergrond en de voorgrond als drempelwaarde.
    3. Klik op Uitvoeren.
11. Inspecteer cellen en afmetingen:
12. Door te dubbelklikken op een cel of door deze te selecteren op het tabblad Hiërarchie , inspecteert u de afmetingen in het deelvenster linksonder. Er moeten verschillende vorm- en intensiteitsmetingen worden toegevoegd voor cel, kern en cytoplasma.
13. Cellen classificeren:
    1. Als u de gedetecteerde cellen wilt classificeren op basis van de intensiteit in een kanaal, gaat u naar Classificeren | Object classificatie | Maak een enkele meetclassificatie.
    2. Selecteer het gewenste kanaal onder Kanaalfilter en een geschikte meting onder Meting (bijv. Cel: Kanaalgemiddelde).
    3. Pas de drempel aan door de muisaanwijzer opnieuw op een positieve cel en op een negatieve cel te plaatsen en een waarde tussen de twee te kiezen.
    4. Selecteer bijvoorbeeld Positief voor boven de drempel en Negatief voor onder de drempelwaarde. Controleer het resultaat door Live preview aan te vinken.
    5. Druk op Toepassen om de cellen te classificeren.
14. Meet de afstand tot geannoteerde objecten (bijv. zenuwbanen):
    1. Selecteer de Tools | Penseel .
    2. Teken over interessegebieden (bijv. zenuwbundels).
    3. Ga naar het tabblad Annotaties . Selecteer alle nieuwe annotaties, selecteer een bijbehorende klasse en druk op Klasse instellen.
       OPMERKING: Men kan een nieuwe klasse maken door met de rechtermuisknop in het klasvenster te klikken en Toevoegen/Verwijderen | Klasse toevoegen.
    4. Ga naar Ruimtelijke analyse analyseren | Ondertekende afstand tot annotaties 2D en druk op Ja wanneer daarom wordt gevraagd.
    5. Voeg een nieuwe meting toe aan elke cel, die de afstand aangeeft tot de dichtstbijzijnde annotatie van een bepaalde klasse.
15. Afmetingen exporteren:
    1. Ga naar Meten | Toon detectiemetingen en wacht tot een lijst met alle metingen van alle detecties verschijnt.
    2. Exporteer de tabel als .txt via de knop Opslaan .
    3. Importeer de gegevens in de gegevensverwerkingssoftware van uw keuze om verder te worden geanalyseerd.

Results

Deze methode maakt een adequate detectie van prolifererende celtypen mogelijk door EdU Click-iT-chemie te combineren met IBEX in vaste bevroren huidsecties van muizen. Detectie van prolifererende celtypen werd vergeleken met behulp van verschillende methodologieën, met name het labelen van prolifererende celtypen met Ki-67-antilichamen en het detecteren van celproliferatie met behulp van de EdU Click-iT-chemiebenadering (Figuur 1

Discussion

Celproliferatie is een van de vier belangrijkste fasen van huidherstel, en de overgang tussen de ontstekingsfase en de proliferatieve fase is van cruciaal belang voor een succesvol herstelproces²⁰. Een goed gereguleerde immuunrespons is essentieel, aangezien langdurige ontsteking kan leiden tot chronische wonden, een belangrijk wereldwijd gezondheidsprobleem ^1,21. Proliferatie is een belangrijk biologisch ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies and reagents	SOURCE	IDENTIFIER	Comments
Antilichamen en reagentia
CD31 Alexa Fluor 647 (Cycle 2)	BioLegend	Cat#102516	1:100
AB_2161029
CD45 Alexa Fluor 488 (Cycle 2)	BioLegend	Cat#103122	1:100
AB_493531
Ki-67 FITC (Cycle 1)	BioLegend	Cat#151212	1:50
AB_2814055
Ki-67 chicken (ck)	LSBio	Cat#LS-C772946	1:800
Ki-67 rat (rt)	BioLegend	Cat#652402	1:100
AB_11204254
Neurofilament H&M (NF-H/NF-M) Alexa Fluor 647 (Cycle 3)	BioLegend	Cat#837710	1:300
AB_2734613
p75NTR (Cycle 1)	Cell Signaling Technology	Cat#8238                      AB_10839265	1:1500
Vimentin Alexa Fluor 488 (Cycle 3)	BioLegend	Cat#699305	1:100
AB_2888889
Alexa Fluor 647 donkey anti konijn	Jackson ImmunoResearch	Cat#711-605-152
Reagentia
Cellvis 24 well Glass Bottom Plate	Cellvis	P24-1.5H-N
Chrome alum gelatine	Newcomer Supply	Cat#1033A
Click-iT EdU kit	Thermo Fisher Scientific	C10637
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	Cat#14533; CAS# 23491-52-3
LiBH4, Lithium Borohydride, 95%	Thermo Fisher Scientific	Cat#10438443
Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura	Biosystems Switzerland	Cat#7109-4583
PBS	Thermo Fisher Scientific	Cat#10010-015
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	Cat#J1800AMNZ
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Cat#T8787
Apparatuur
Haar borstel	Faust AG	Cat#9172051 en 9172050
Microtome blades	Biosystems Switzerland	Cat#207500011
Microscoop	Molecular Devices, ImageXpress Confocal HT.ai
Oven	Thermo Fisher Scientific	Cat#HBMCR4220
Rocker shaker	Edmund Bühler GmbH	Cat#32310015