High-throughput beeldvormings- en analyseworkflow voor het evalueren van fenotypes en proliferatietoestanden van huidcellen in weefselmonsters

Summary

De combinatie van iteratief-bleken-extends-multiplexity (IBEX) en een commerciële nucleotide-labelingtest (Click-iT EdU) maakt de detectie en categorisatie van delende celtypen mogelijk in zeer dynamische processen in gefixeerde ingevroren muizenweefselsecties. Bovendien biedt een nieuwe open-source beeldverwerkingspijplijn beeldacquisitie en -analyse met hoge doorvoer.

Abstract

Huidletsels initiëren een complexe regeneratieve cascade die verschillende celtypen aanspreekt. Daarvan spelen perifere gliacellen een cruciale rol bij het waarborgen van het succes van het herstelproces. Ons begrip van deze processen blijft echter onvolledig vanwege beperkingen in de huidige technologieën. Daarom werd de iteratieve bleking-extends-multiplexity (IBEX)-methode gebruikt om veranderingen in de cellulaire samenstelling van de huid te karakteriseren met behulp van antilichamen gericht tegen eiwitten die tot expressie worden gebracht door belangrijke celtypen en structuren die betrokken zijn bij weefselregeneratie. Belangrijk is dat antilichamen gericht tegen celproliferatiemarkers vaak het aantal delende cellen in de huid onderschatten. Om deze beperking te overwinnen, werd Click-iT EdU-chemie gecombineerd met de IBEX-methode, waardoor een gedetailleerde karakterisering van prolifererende celtypen mogelijk is. Met behulp van een volledig geautomatiseerde confocale microscoop met draaiende schijf werd een workflow met hoge doorvoer ontwikkeld voor iteratieve beeldvorming van monsters die zijn onderverdeeld in platen met 24 putjes. Naast het uitbreiden van de IBEX-methode om celtoestanden in situ te evalueren met Click-iT EdU, werd ook een nieuwe open-source beeldverwerkingspijplijn geïntroduceerd om beeldcorrectie, stitching en registratie uit te voeren, en die kan worden gebruikt door onderzoekers zonder uitgebreide programmeerervaring. Bovendien wordt ook een gedetailleerde documentatie verstrekt over het verwerken en visualiseren van sterk gemultiplexte beeldvormingsgegevens (met behulp van conventionele beeldanalysesoftware, waaronder Fiji en QuPath). Samenvattend benadrukt dit protocol de veelzijdigheid van het IBEX-protocol en demonstreert het de aanpassing ervan aan een gevestigd conventioneel beeldvormingsplatform. Met name de combinatie van IBEX met Click-iT EdU-labeling maakt de detectie en categorisatie mogelijk van actief delende celtypen in intacte weefsels en tijdens zeer dynamische processen met ruimtelijke resolutie.

Introduction

De huid is het grootste orgaan van het menselijk lichaam en de oerbarrière om het lichaam te beschermen tegen de buitenomgeving¹. Bijgevolg wordt het blootgesteld aan een overvloed aan externe uitdagingen die zijn barrièrefunctie in gevaar brengen. Daarom heeft de huid complexe mechanismen ontwikkeld om de integriteit en functionaliteit van het weefsel na beschadiging te herstellen. Huidwondgenezing vindt plaats in drie overlappende fasen: ontsteking, proliferatie en rijping/remodellering. Bij deze drie stadia zijn verschillende celtypen betrokken, zoals dermale fibroblasten en immuuncellen, die samenwerken om ....

Protocol

Alle fokkerijen, huisvesting en experimenten van dieren werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het veterinaire bureau van het kanton Zürich, Zwitserland.

1. Huidwonden over de volledige dikte (dag 0)

1. Induceer muizen van 8-10 weken oud met 5% isofluraan in 70% O₂ en onderhoud het met 2,5% isofluraan.
2. Scheer de achterhuid en reinig deze grondig.
3. Desinfecteer voorafgaand aan de operatie met antibacteriële zeep en 70% EtOH-oplossing.
4. Breng preoperatieve analgesie aan met behulp van een subcutane injectie van buprenorfine (30 μg∙mg∙kg⁻¹).
....

Results

Deze methode maakt een adequate detectie van prolifererende celtypen mogelijk door EdU Click-iT-chemie te combineren met IBEX in vaste bevroren huidsecties van muizen. Detectie van prolifererende celtypen werd vergeleken met behulp van verschillende methodologieën, met name het labelen van prolifererende celtypen met Ki-67-antilichamen en het detecteren van celproliferatie met behulp van de EdU Click-iT-chemiebenadering (Figuur 1

Discussion

Celproliferatie is een van de vier belangrijkste fasen van huidherstel, en de overgang tussen de ontstekingsfase en de proliferatieve fase is van cruciaal belang voor een succesvol herstelproces²⁰. Een goed gereguleerde immuunrespons is essentieel, aangezien langdurige ontsteking kan leiden tot chronische wonden, een belangrijk wereldwijd gezondheidsprobleem ^1,21. Proliferatie is een belangrijk biologisch .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies and reagents	SOURCE	IDENTIFIER	Comments
Antibodies
CD31 Alexa Fluor 647 (Cycle 2)	BioLegend	Cat#102516	1:100
AB_2161029
CD45 Alexa Fluor 488 (Cycle 2)	BioLegend	Cat#103122	1:100
AB_493531
Ki-67 FITC (Cycle 1)	BioLegend	Cat#151212	1:50
AB_2814055
Ki-67 chicken (ck)	LSBio	Cat#LS-C772946	1:800
Ki-67 rat (rt)	BioLegend	Cat#652402	1:100
AB_11204254
Neurofilament H&M (NF-H/NF-M) Alexa Fluor 647 (Cycle 3)	BioLegend	Cat#837710	1:300
AB_2734613
p75NTR (Cycle 1)	Cell Signaling Technology	Cat#8238                       AB_10839265	1:1500
Vimentin Alexa Fluor 488 (Cycle 3)	BioLegend	Cat#699305	1:100
AB_2888889
Alexa Fluor 647 donkey anti rabbit	Jackson ImmunoResearch	Cat#711-605-152
Reagents
Cellvis 24 well Glass Bottom Plate	Cellvis	P24-1.5H-N
Chrome alum gelatin	Newcomer Supply	Cat#1033A
Click-iT EdU kit	Thermo Fisher Scientific	C10637
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	Cat#14533; CAS# 23491-52-3
LiBH4, Lithium Borohydride, 95%	Thermo Fisher Scientific	Cat#10438443
Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura	Biosystems Switzerland	Cat#7109-4583
PBS	Thermo Fisher Scientific	Cat#10010-015
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	Cat#J1800AMNZ
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Cat#T8787
Equipment
Hair brush	Faust AG	Cat#9172051 and 9172050
Microtome blades	Biosystems Switzerland	Cat#207500011
Microscope	Molecular Devices, ImageXpress Confocal HT.ai
Oven	Thermo Fisher Scientific	Cat#HBMCR4220
Rocker shaker	Edmund Bühler GmbH	Cat#32310015