Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Verzameling van natuurlijk vrijgekomen exosomen uit tumorweefsel

602 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67739

⸱

10 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Laboratory of Nursing & Materials, West China Hospital, Sichuan University/West China School of Nursing, Sichuan University, 2Department of Occupational Diseases, The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College Nuclear Industry 416 Hospital, 3Department of Plastic and Burn Surgery, West China School of Medicine, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol demonstreert een nieuwe methode voor het extraheren van exosomen uit tumorweefsels door ze op natuurlijke wijze vrij te geven en herhaaldelijk te verzamelen om een experimentele basis te bieden voor het bestuderen van de functie van exosomen bij de ontwikkeling van tumoren.

Samenvatting

Als blaasjes die door cellen worden uitgescheiden, omsluiten exosomen verschillende nucleïnezuren, eiwitten en lipiden en dragen ze deze over, en nemen ze deel aan de communicatie tussen verschillende cellen. Exosomen in de micro-omgeving van de tumor spelen een belangrijke rol in de biologische kenmerken van tumorcellen en kunnen de toestanden van andere cellen sterk beïnvloeden. Om de specifieke functies van exosomen bij de ontwikkeling van tumoren verder te bestuderen, is het daarom ongetwijfeld nodig om exosomen uit tumorweefsels te extraheren en te isoleren. Directe extractie van exosomen uit tumorweefsel vermindert de behoefte aan in vitro celcultuur, en exosomen uit tumorweefsel kunnen meer lijken op die in de natuurlijke staat. Daarom is het behoud van de natuurlijke toestand van exosomen in tumorweefsel de sleutel tot het extractieproces. Enzymatische vertering wordt vaak gecombineerd met ultracentrifugatie om exosomen uit tumorweefsels te extraheren. Hier bieden we een nieuwe methode om exosomen uit tumorweefsel te extraheren. We gebruikten een serumvrij medium om kleine stukjes tumorweefsel op een schudtafel te incuberen, verzamelden en extraheerden herhaaldelijk exosomen die van nature vrijkwamen uit tumorweefsel, en identificeerden de geëxtraheerde exosoomstructuur, concentratie en kenmerken, wat een nieuwe methode bood voor onderzoekers die de functie van exosomen bij de ontwikkeling van tumoren bestuderen.

Inleiding

Exosomen zijn een subtype van extracellulaire blaasjes die worden uitgescheiden door cellen, meestal variërend in grootte van 30 nm tot 200 nm 1,2. Ze nemen deel aan intercellulaire communicatie en leveren verschillende signaalmoleculen, waaronder nucleïnezuren (bijv. desoxyribonucleïnezuur (DNA), boodschapper-RNA (mRNA), microribonucleïnezuur (miRNA), lang niet-coderend RNA (lncRNA), circulair RNA (circRNA)), eiwitten en lipiden 1,3,4,5, aan ontvangende cellen om hun fysiologische functies te beïnvloeden 6,7. Aanvankelijk geïdentificeerd in reticulocyten van schapen8, zijn exosomen sindsdien geïdentificeerd in verschillende lichaamsvloeistoffen, waaronder bloed, speeksel, urine, hersenvocht, ascites, vruchtwater en moedermelk 9,10,11,12,13,14,15,16 . Bovendien kunnen exosomen worden uitgescheiden door vele soorten cellen, waaronder lymfocyten, macrofagen, mestcellen, vetcellen en tumorcellen17. Met hun brede verspreiding spelen exosomen een cruciale rol in verschillende pathologische processen, met name kanker, en in verschillende fysiologische processen, waaronder embryonale ontwikkeling, weefselherstel en -regeneratie en immuunregulatie 18,19,20.

In de afgelopen jaren is aangetoond dat exosomen het voorkomen, invasie, metastase, resistentie tegen chemotherapie en anti- of pro-tumorimmuniteit bevorderen 20,21,22. Van kanker afgeleide exosomen kunnen genexpressie in receptoren of naburige kankercellen activeren om hun biologische fenotypes te veranderen, en kankercellen kunnen interageren met stromale cellen in de micro-omgeving van de tumor om de proliferatie, invasie en angiogenese van kankercellen te bevorderen 23,24,25. Exosomen die door tumorcellen worden vrijgegeven, kunnen hen helpen giftige medicijnen uit te scheiden, en van stromale cellen afgeleide exosomen kunnen de vorming van kankercellen bevorderen20. Van kanker afgeleide exosomen zijn betrokken bij verschillende stadia van metastase van kankercellen, waaronder invasie van naburige weefsels, overdracht door de bloedsomloop en verspreiding naar verre organen20. Ten slotte vervullen exosomen zowel immunoactiverings- als immunosuppressiefuncties bij kanker, afhankelijk van de liganden, eiwitten en miRNA's die ze dragen20. Vanwege de belangrijke functies van van tumorweefsel afgeleide exosomen, vertonen ze potentiële toepassingswaarde bij vroege diagnose, nauwkeurige behandeling en prognostische monitoring van tumoren21,22.

Gezien het belang van exosomen die zijn afgeleid van tumorweefsel, hebben veel onderzoekers geprobeerd ze te extraheren om hun eigenschappen en functies verder te bestuderen. Directe extractie van exosomen uit tumorweefsels vermindert niet alleen de behoefte aan in vitro celcultuur, maar lijkt ook meer op de natuurlijke staat van exosomen. Daarom is het behoud van de natuurlijke toestand van exosomen in tumorweefsel de sleutel tot het extractieproces. De fysische eigenschappen van exosomen vormen de basis van gebruikelijke extractiemethoden, en zelden worden de veranderingen in exosoomcomponenten veroorzaakt door stimulatie tijdens het extractieproces in overweging genomen. In feite wordt de kwaliteit van exosomen sterk beïnvloed door verschillende exosoomextractieprocedures 26,27. Momenteel worden tumorweefsels verteerd door enzymen en onderworpen aan methoden zoals dichtheidsgradiëntcentrifugatie, ultracentrifugatie, ultrafiltratie, grootte-uitsluitingschromatografie (SEC), polymeerprecipitatie, immunoaffiniteitschromatografie en microfluïdische methoden, vóór scheiding 2,21,28,29 . Hier bieden we een methode voor het extraheren van exosomen uit tumorweefsel. We gebruikten een serumvrij medium om kleine tumorweefselblokken in een shaker te kweken, verzamelden en extraheerden vervolgens exosomen die op natuurlijke wijze door tumorweefsel werden vrijgegeven en identificeerden de concentratie en kenmerken van de geëxtraheerde exosomen, waarbij we basismateriaal en experimenteel bewijs leverden voor het bestuderen van de functie van exosomen bij tumorontwikkeling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle exosoomgerelateerde experimenten met tumorweefsel zijn uitgevoerd volgens de relevante richtlijnen en voorschriften. Deze studie werd goedgekeurd en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de ethische commissie van het West China Hospital, Sichuan University (20220301101). Vier weken na inoculatie met SGC-7901-cellen werd één naakte muis (BALB/c, man, 8 weken oud, 26 g) geëuthanaseerd via cervicale dislocatie.

1. Verwerving van tumorweefsel

  1. Week 5 minuten in 75% alcohol.
  2. Ga naar een steriele operatietafel, gebruik een steriele chirurgische schaar om de buitenste huid van de ectopische tumor te openen.
  3. Pel het ectopische tumorweefsel af, snijd en weeg om twee stukken van gelijk gewicht te verkrijgen.
    OPMERKING: Een stuk tumorweefsel wordt gebruikt voor exosoomextractie volgens dit protocol, en een ander stuk tumorweefsel van gelijk gewicht wordt gebruikt voor exosoomextractie door enzymvertering30.

2. Preconditionering van tumorweefsel

OPMERKING: Voer deze stappen uit op ijs en in een steriele omgeving.

  1. Pipetteer 10 ml voorgekoelde fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) (0,01 M) om het tumorweefsel te wassen om oppervlaktebloed en vet te verwijderen.
  2. Knip het tumorweefsel (~400 mm3) in stukken van 1-2 mm met behulp van een oogheelkundige schaar in 20 ml PBS met 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) in een steriel petrischaaltje van 10 cm. Breng het bovenstaande mengsel over in een conische buis van 50 ml.

3. Vrijkomen van exosomen

  1. Centrifugeer de buis vanaf stap 1.2 bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  2. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet opnieuw met 20 ml Minimum Essential Medium α (α-MEM) medium. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C bij 100 tpm in een shaker met constante temperatuur.
  3. Centrifugeer 5 minuten bij 200 × g bij 4 °C.
  4. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet opnieuw met 10 ml α-MEM-medium. Incubeer gedurende 6 uur bij 37 °C bij 100 tpm in een shaker met constante temperatuur.
    OPMERKING: Wees voorzichtig met alle stappen. Een korte incubatie en één wasbeurt met α-MEM-medium is voldoende om intracellulaire componenten te verwijderen die lekken als gevolg van snijden, inclusief intracellulaire blaasjes en organellen.
  5. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 min, 4 °C en vang het bovenstaande op in een nieuwe buis.
  6. Resuspendeer het tumorweefsel met 10 ml α-MEM-medium.
  7. Herhaal de incubatie vanaf stap 2.4 gevolgd door stap 2.5.
  8. Meng de medium supernatanten die in de stappen 2.5 en 2.7 zijn verzameld.
    OPMERKING: Wees voorzichtig met alle stappen. Twee incubaties van 6 uur induceerden de natuurlijke afgifte van exosomen uit de stukjes tumorweefsel.

4. Ultracentrifugeren

  1. Filtreer het bovenstaande door een microporeus filter van 0,45 μm.
  2. Centrifugeer het bovenstaande gedurende 30 minuten bij 12.000 × g bij 4 °C om de grote blaasjes te verwijderen.
  3. Breng het bovenstaande over in een nieuwe buis en centrifugeer bij 120.000 g × gedurende 90 minuten bij 4 °C om exosomen te verzamelen.
  4. Was het exosoomprecipitaat met PBS (0,01 M) en centrifugeer opnieuw bij 140.000 × g gedurende 60 minuten bij 4 °C.
  5. Onderbreek de geprecipiteerde exosomen in PBS (0,01 M) voor onmiddellijk gebruik of opslag bij -80 °C.
    OPMERKING: Wees voorzichtig met alle stappen. Voer elke stap uit met de kleinst mogelijke middelpuntvliedende kracht en de kortste centrifugaaltijd.

5. Presentatie van de resultaten van de exosoomidentificatie

  1. Identificeer de morfologie van exosomen uit tumorweefsel via transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)30.
  2. Bepaal de grootte en concentratie van exosomen uit tumorweefsel via Nanoparticle tracking analysis (NTA)30.
  3. Identificeer de exosomale eiwitmarkers CD9 en CD63 via western blot (WB)30.
    OPMERKING: Recente richtlijnen voor exosoomonderzoek, waaronder het gebruik van CD63, CD9, als criteria voor exosoommarkers31.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

TEM onthulde dat de exosomen die via deze methode uit tumorweefsel waren afgeleid, typische bekerachtige structuren hadden (Figuur 1A), en dat er geen significant verschil was tussen de vorm van exosomen die met deze methode werden geëxtraheerd en door enzymvertering (Figuur 1B). Uit de NTA-resultaten bleek dat de gemiddelde exosoomdiameter 172,8 nm was, wat in het bereik van 30-200 nm lag en consistent was met de grootte van de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Bij deze methode werden exosomen afgeleid van tumorweefsel geëxtraheerd uit het ectopische maagkankerweefsel van naakte muizen, en de belangrijkste stappen waren het vrijkomen, exsuderen, scheiden en zuiveren van de exosomen. Er zijn verschillende exosoomscheidingsmethoden ontworpen en geverifieerd op basis van de fysische eigenschappen en samenstelling van exosomen 2,21,28,29, elk met voor- en nadelen, maar het doel is om de impact van verschillende e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Sichuan Province Science and Technology Support Program (2024NSFSC0592, 2023YFS0064).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
α-MEMHyCloneSH30265.01B
Anti-CD63 antibodyBiossbsm-43117M
Anti-CD9 antibodyBiossbs-2489R
Centrifuge tubeThermo339650
Constant temperature shakerThermoMAXQ4450
Disposable sterile pipette-10 mLJETGSP01001
EDTABiosharpBS107
Electric pipetteThermo9501
Horizontal controlled temperature centrifugeThermoSorvall ST1R plus
Nanoparticle tracking analyzerMalvinNanoSight Pro
Ophthalmic scissorJinzhongY3D010
PBSHyCloneSH30256.01B
Phosphotungstic acid  Sigma455970-10G
Surgical scissorJinzhongJ21010
Secondary antibodyBiossBs-0295GGeit Anti-Rabbit IgG H&L/FITC
Transmission Electron MicroscopeNikonPlan Apo WF
Ultracentrifugal tubeBeckman355618

Referenties

  1. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  2. Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduct Target Ther. 5, 144(2020).
  3. Rani, S., O'Brien, K., Kelleher, F., Corcoran, C., Germano, S., Radomski, M., et al. Isolation of exosomes for subsequent mRNA, MicroRNA, and protein profiling. Methods Mol Biol. 784, 181-195 (2011).
  4. Zhou, L., et al. The biology, function and clinical implications of exosomes in lung cancer. Cancer Lett. 407, 84-92 (2017).
  5. D'Agostino, E., et al. Exosomal microRNAs: Comprehensive methods from exosome isolation to miRNA extraction and purity Analysis. MicroRNA Profiling. 2595, 75-92 (2022).
  6. Whiteside, T. Tumor-derived exosomes and their role in cancer progression. Adv Clin Chem. 74, 103-141 (2016).
  7. Ludwig, N., Whiteside, T., Reichert, T. Challenges in exosome isolation and analysis in health and disease. Int J Mol Sci. 20 (19), 4684(2019).
  8. Johnstone, R., Adam, M., Hammond, J., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 262, 9412-9420 (1987).
  9. Li, B., Cao, Y., Sun, M., Feng, H. Expression, regulation, and of exosome-derived miRNAs in cancer progression and therapy. FASEB J. 35 (10), e21916(2021).
  10. Caby, M., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17, 879-887 (2015).
  11. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  12. Street, J., et al. Identification and proteomic profiling of exosomes in human cerebrospinal fluid. J Transl Med. 10, 5(2012).
  13. Palanisamy, V., et al. Nanostructural and transcriptomic analyses of human saliva derived exosomes. PLoS ONE. 5, e8577(2010).
  14. Runz, S., et al. Malignant ascites-derived exosomes of ovarian carcinoma patients contain CD24 and EpCAM. Gynecol Oncol. 107, 563-571 (2007).
  15. Keller, S., et al. CD24 is a marker of exosomes secreted into urine and amniotic fluid. Kidney Int. 72, 1095-1102 (2007).
  16. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  17. Simpson, R., Lim, J., Moritz, R., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6 (3), 267-283 (2009).
  18. Sung, B. H., Parent, C. A. Extracellular vesicles: Critical players during cell migration. Dev Cell. 56, 1861-1874 (2021).
  19. Xie, Q., et al. Exosome-mediated immunosuppression in tumor microenvironments. Cells. 11 (12), 1946(1946).
  20. Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
  21. Jiang, Z., Wang, H., Mou, Y., Li, L., Jin, W. Functions and clinical applications of exosomes in pancreatic cancer. Mol Biol Rep. 49 (11), 11037-11048 (2022).
  22. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annu Rev Biochem. 88 (1), 487-514 (2019).
  23. Al-Nedawi, K., et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFR VIII by microvesicles derived from tumour cells. Nat Cell Biol. 10, 619-624 (2008).
  24. Nazarenko, I., et al. Cell surface tetraspanin Tspan8 contributes to molecular pathways of exosome-induced endothelial cell activation. Cancer Res. 70, 1668-1678 (2010).
  25. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
  26. Macias, M., et al. Liquid biopsy: from basic research to clinical practice. Adv Clin Chem. 83, 73-119 (2018).
  27. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 10, 1039(2020).
  28. Hu, J., et al. Application exosomes as nanocarriers in cancer therapy. J Mater Chem B. 11 (44), 10595-10612 (2023).
  29. Wang, C., et al. A light-activated magnetic bead strategy utilized in spatio-temporal controllable exosomes isolation. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1006374(2022).
  30. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  31. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  32. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (Unit 3.22), (2006).
  33. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. J Extracell Vesicles. 5, 32945(2016).
  34. Li, W., et al. Comparison of the yield and purity of plasma exosomes extracted by ultracentrifugation, precipitation, and membrane-based approaches. Open Chem. 20, 182-191 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Tumorexosomenisolatie van exosomenextractie van exosomentumormicro-omgevingultracentrifugatieenzymatische digestiecelcommunicatiekarakterisering van exosomenserumvrij medium

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.