Profilering van gepermethyleerde mucine O-glycanen met behulp van matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie Time-of-flight massaspectrometrie

Samenvatting

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de afgifte van O-glycanen uit mucines en de daaropvolgende ontzouting, permethylering en analyse met behulp van MALDI-TOF-massaspectrometrie.

Samenvatting

Matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) is een krachtig hulpmiddel voor het profileren van mucineglycanen dat een hoge gevoeligheid en doorvoer biedt. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de analyse van O-gebonden glycanen uit mucines met behulp van MALDI-TOF MS, dat glycaanafgifte, ontzouting, permethylering en data-acquisitie en -analyse omvat. Deze studie toont aan dat ontzouten op basis van ionenuitwisselingschromatografie leidt tot een beter herstel van grotere glycanen en een betere kwaliteit van de geproduceerde spectra in vergelijking met extractie in vaste fase met behulp van poreuze grafietkoolstof (PGC). Bovendien suggereert dit werk dat een langere permethylatiereactietijd dan momenteel wordt gebruikt, nodig kan zijn voor een efficiënte modificatie van gesialyleerde structuren. We tonen ook het belang en de noodzaak aan van fragmentatiegegevens en voorkennis van de O-glycaan biosynthetische routes voor de nauwkeurige identificatie van de glycaansamenstelling en -structuur en bespreken de inherente voordelen en beperkingen die MALDI-TOF biedt bij de analyse van mucine O-glycanen.

Inleiding

Mucines zijn grote glycoproteïnen die de meeste structurele componenten in slijm vormen. Ze worden geproduceerd door gespecialiseerde epitheelcellen, bekercellen genaamd, en ondergaan uitgebreide O-glycosylering voordat ze worden uitgescheiden aan het slijmvliesoppervlak. De glycosylering van mucines vindt plaats in het Golgi-apparaat, waar een familie van gespecialiseerde glycosyltransferasen, polypeptide-N-acetylgalactosamine transferasen (ppGalNAc-T) het proces initieert door een GalNAc-residu te hechten aan een serine (Ser) of een threonine (Thr)¹. Vervolgens breidt een arsenaal aan glycosyltransferasen de glycaanstructuren uit door galactose (Gal), N-acetylglucosamine (GlcNAc), GalNAc, N-acetylneuraminezuur (Neu5Ac) en fucose (Fuc) residuen toe te voegen, terwijl andere koolhydraatmodificerende enzymen reacties kunnen uitvoeren zoals sulfatering van de glycanen¹. De glycanen die de ruggengraat van mucine-eiwitten versieren, worden voornamelijk aangetroffen in clusters in eiwitgebieden die rijk zijn aan Ser- en Thr-residuen, aangezien de hydroxylgroepen op de zijketen van deze residuen dienen als O-glycosyleringsplaatsen. Deze dichte glycosylering geeft mucines het uiterlijk van een "flessenborstel" en is verantwoordelijk voor hun fysische eigenschappen, zoals het vermogen om grote hoeveelheden water vast te houden, hun gelvormend vermogen en hoge visco-elasticiteit ^2,3. Vanwege deze eigenschappen zorgen mucines voor smering, beschermen ze het epitheel tegen uitdroging en lichamelijk letsel en vormen ze een fysieke barrière tussen het epitheel en zijn micro-omgeving ^4,5. Mucineglycanen kunnen ook dienen als bindingsplaatsen en een koolstofbron voor commensale of pathogene bacteriën ^6,7,8. De organisatie en samenstelling van slijm zijn van groot belang bij de bescherming van het epitheel door microben in de buurt maar weg van het epitheeloppervlak te houden. Mucineglycanen nemen ook deel aan de communicatie en hechting tussen cellen^{en cellen 9}.

Mucineglycanen spelen een cruciale rol bij het handhaven van mucosale homeostase, en afwijkende mucineglycosyleringsprofielen worden in verband gebracht met een verminderde barrièrefunctie, veranderde samenstelling van de microbiota, verhoogde tumormetastase, inflammatoire darmaandoeningen (IBD) en andere ziekten 10,11,12. Daarom is de studie van mucineglycosylering belangrijk voor het begrijpen van de rol van slijm en mucines in de menselijke gezondheid en kan het leiden tot nieuwe benaderingen voor de behandeling of behandeling van ziekten.

Op massaspectrometrie gebaseerde technieken behoren tot de meest populaire opties voor het bestuderen van mucineglycanen. MALDI-TOF MS is een zachte ionisatietechniek die de analyse van grote, niet-vluchtige biomoleculen zoals glycanen en glycoproteïnen¹³ mogelijk maakt. Deze benadering biedt een hoge gevoeligheid en een breed massabereik, waardoor de detectie en identificatie van laagovervloedige en diverse glycaanmengsels mogelijk is. Bovendien kunnen de fragmentatiepatronen die zijn verkregen uit experimenten met tandemmassaspectrometrie (MS/MS) waardevolle structurele informatie opleveren over de glycaansamenstelling en -sequentie¹³.

Doorgaans omvat de analyse van O-gebonden glycanen uit mucines door MALDI-TOF MS een workflow in meerdere stappen, waarbij de O-glycanen eerst chemisch worden vrijgegeven uit de eiwitruggengraat met behulp van methoden zoals reductieve β-eliminatie, vervolgens worden ontzout om de zouten uit de chemische afgifte te verwijderen en worden gederivatiseerd om ionisatie en detectie te verbeteren. De gezuiverde, afgeleide glycanen worden vervolgens geco-gekristalliseerd met een geschikte MALDI-matrix op een MALDI-doelplaat en er worden massaspectra verkregen die informatie geven over de massa's van de intacte glycaanionen. Hierna worden de glycanen gefragmenteerd in MS/MS-experimenten om informatie te verkrijgen over de structuur van de glycanen¹⁴. Hier bieden we een gedetailleerd protocol om glycanen vrij te maken, te ontzouten en te permethyleren en deze te analyseren door MALDI-TOF MS.

Protocol

OPMERKING: Zie Figuur 1 voor een schematische weergave van de workflow.

Figuur 1: Schematische weergave van de experimentele workflow. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Afgifte van glycaan

1. Voorbereiding van de β-eliminatiebuffer
   OPMERKING: Dit moet voor elk gebruik vers worden bereid.
   1. Weeg een pellet natriumhydroxide (NaOH) af en los deze op in een geschikte hoeveelheid H₂O in een tube van 50 ml om een oplossing van 0,1 M te verkrijgen.
   2. Los in een buisje van 5 ml 189 mg natriumboorhydride (NaBH₄) op in 5 ml van de alkalische oplossing die hierboven in stap 1.1.1 is bereid.
      LET OP: NaOH is bijtend en NaBH₄ is bijtend, giftig, ontvlambaar en vormt een gevaar voor de gezondheid. Beide chemicaliën moeten onder een zuurkast worden gehanteerd met behulp van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Los NaBH₄ niet direct op in H₂O, omdat het ontleedt en waterstof vrijgeeft dat zichzelf kan ontbranden.
2. Opzet van de β-eliminatiereactie
   1. Los in een glazen injectieflacon van 4 ml tot 100 μg gezuiverd mucines op in 250 μl H₂O.
      OPMERKING: Sommige mucines lossen mogelijk niet volledig op en vormen in plaats daarvan een suspensie van zeer kleine deeltjes.
   2. Voeg 250 μL van de β-eliminatiebuffer toe en sluit de injectieflacon goed af met een met PTFE beklede dop. Incubeer de reactie bij 45 ^°C gedurende 16 uur.
3. De reactie stoppen
   1. Voeg in een glazen fles van 100 ml 5 ml ijsazijn toe aan 95 ml H₂O (5% (v/v) concentratie).
      OPMERKING: Dit kan bij kamertemperatuur worden bewaard en opnieuw worden gebruikt.  LET OP: Azijnzuur is ontvlambaar en bijtend en moet worden gebruikt in een zuurkast met de nodige persoonlijke beschermingsmiddelen.
   2. Voeg op ijs 1 ml van de 5% azijnzuuroplossing toe aan elke reactie (stap 1.2.3) op druppelsgewijze wijze. Zoek op dit punt naar bruisen van het vrijkomen van waterstof uit de overmaat NaBH₄. Als het bruisen niet is gestopt na toevoeging van 1 ml 5% azijnzuur, herhaal dan deze stap.
      OPMERKING: Als er geen bruisen is bij toevoeging van 5% azijnzuur, kan de β-eliminatiereactie onvolledig of niet succesvol zijn.
4. Ontzouten van de monsters
   1. Bereid in een glazen fles van 100 ml een dichte suspensie van kationenuitwisselingshars, H⁺ -vorm, 200-400 mesh in 5% (v/v) azijnzuur.
   2. Steek een glazen pipet aan met een kleine hoeveelheid glaswol. Voeg 1,5 ml van de harssuspensie toe aan de glazen pipet vanaf de bovenkant en laat het bezinken en uitlekken. Hierdoor wordt de ontziltingskolom gemaakt.
   3. Was de hars met 2 ml 5% azijnzuur. Gooi de doorstroom weg.
   4. Voeg het mucinemonster toe aan de ontziltingskolom. Vang de doorstroming op in een buis van 5 ml.
   5. Spoel de monsterflesjes met 1 ml 5% azijnzuur en vul dit in de ontziltingskolom. Vang de doorstroming op in dezelfde buis.
   6. Was de zuil 2x met 1 ml 5% azijnzuur. Vang de doorstroming op in dezelfde buis.
   7. Gebruik een centrifugale verdamper om het azijnzuur te verwijderen en concentreer de monsters (5 mbar, 30 ^°C, 2 uur).
   8. Vries de monsters in bij -80 ^°C en droog ze een nacht in een vriesdroger.
      OPMERKING: Als alternatief kan de centrifugale verdamping blijven drogen, maar dit zal het oplossen van de monsters bemoeilijken.
   9. Voeg in een glazen fles van 100 ml 5 ml azijnzuur toe aan 95 ml methanol (concentratie van 5% (v/v).
      LET OP: Methanol is ontvlambaar en giftig. Het moet worden gebruikt in een zuurkast met de nodige persoonlijke beschermingsmiddelen.
   10. Los de monsters op in 0,5 ml methanolazijnzuur en droog de monsters onder een stroom stikstof. Herhaal deze stap 3-5x. Bewaar de gedroogde monsters bij 4 ^°C.
5. Permethylering van de glycanen
   1. Meng in een glazen injectieflacon van 8 ml 50% NaOH-oplossing (0,2 ml) met 0,4 ml methanol en vortex grondig. Er vormt zich een wit neerslag dat snel weer oplost.
   2. Voeg met een glazen spuit 4 ml watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) toe en draai grondig.
   3. Centrifugeer de oplossing gedurende 2 minuten bij 2.000 × g. Dit vormt een gel op de bodem van de tube, een vloeibare fase in het midden en opgehoopte zouten aan de bovenkant.
   4. Decanteer voorzichtig het bovenstaande en de zouten, zonder de gel te verstoren.
   5. Herhaal stap 1.5.2-1.5.4 5x totdat er geen zouten meer worden gevormd. Als de zouten aan de wanden van de tube blijven kleven, draai de tube dan voorzichtig rond om de zouten in suspensie te brengen, zonder de gel op de bodem te verstoren, of verwijder ze met een glazen pasteurpipet.
   6. Nadat er geen zouten meer zijn gevormd, resuspendeert u de gel in 4 ml watervrije DMSO. Deze suspensie is de permethyleringsbasis.
      OPMERKING: Deze hoeveelheid permethyleringsbasis is voldoende voor ~25 monsters. Hoeveelheden kunnen dienovereenkomstig worden aangepast.
   7. Voeg aan de gedroogde monsters 100 μL watervrije DMSO en 150 μL permethyleringsbase toe. Voeg met behulp van een glazen pipet zo snel mogelijk 80 μL jodomhaan toe om vochtopname uit de omgeving te voorkomen.
      LET OP: Jodomethaan is giftig en vormt een gevaar voor de gezondheid en het milieu. Het moet worden gebruikt in een zuurkast met de nodige persoonlijke beschermingsmiddelen.
   8. Incubeer de permethyleringsreacties gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en schud krachtig.
   9. Voeg 0,5 ml H₂O toe om de reactie te beëindigen. De monsters zullen troebel worden.
      OPMERKING: Als de monsters niet troebel worden, is het mogelijk dat de permethyleringsreactie onvolledig was.
   10. Spoel de monsters met stikstof totdat ze helder worden.
   11. Laad de monsters op een hydrofiel-lipofiel-gebalanceerde (HLB) extractieplaat met 96 putjes (60 mg) of HLB-patronen. Oefen positieve druk uit om de monsters door de vaste fase te duwen met een debiet van ~1 ml/min. Als u HLB-cartridges gebruikt, gebruik dan een rubberen speen of vacuümspruitstuk om druk uit te oefenen op de monsters. Gooi de doorstroom weg.
   12. Spoel de putjes met 2 x 1 ml H₂O. Oefen positieve druk uit en gooi de doorstroming weg.
   13. Elueer de glycanen van de HLB-plaat met 1 ml methanol. Oefen druk uit totdat methanol uit de plaat begint te komen. Dan is de zwaartekrachtstroom voldoende om het vereiste debiet te geven. Verzamel de doorstroom.
   14. Herhaal de elutiestap nog een keer.
   15. Droog de monsters met behulp van een centrifugaalverdamper
   16. Bereid in een glazen injectieflacon van 4 ml TA50-buffer voor door 1 ml acetonitril, 998 μl H₂O en 2 μl trifluorazijnzuur te mengen.
       LET OP: Acetonitril is ontvlambaar en trifluorazijnzuur is bijtend. Beide moeten worden gebruikt in een zuurkast, met behulp van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
   17. Bereid de matrixoplossing in een microcentrifugebuis voor door 10 mg super-DHB [9:1 (m/g) mengsel van 2,5-dihydroxybenzoëzuur en 2-hydroxy-5-methoxybenzoëzuur] op te lossen in 1 ml TA50.
   18. Los de gedroogde monsters op in 10 μL TA50.
   19. Meng 1 μL van het monster met 1 μL van de matrixoplossing, spot het op een stalen MALDI-richtplaat en laat het drogen.

2. MALDI TOF-analyse van de monsters

1. Instellen om ouder-iongegevens te verkrijgen
   1. Vuur 1.000 schoten af met de laser met een intensiteit van 50%.
      OPMERKING: Deze kunnen variëren afhankelijk van de algemene instrumentinstellingen en kunnen naar behoefte worden aangepast.
   2. Stel op het tabblad Laserdrager de instelling voor willekeurig lopen in op monster voltooien.
   3. Stel op het tabblad Detectie het massabereik in op 500 - 3.000; Vergroot dit bereik als sterke pieken worden waargenomen bij 2.500-3.000 m/z. Stel de detectorversterking in op 20x.
      OPMERKING: De versterking kan variëren op basis van de algemene instellingen van het instrument en kan naar behoefte worden aangepast.
   4. Stel onder het tabblad Spectrometer de polariteit in op positief en de Matrixonderdrukking op Afbuiging, 300 Da.
   5. Klik op Start | zodra de gegevensverzameling is voltooid, Opslaan als om de gegevens op te slaan in een geschikte map.
2. Het openen van de moederspectra om fragmentatiespectra te verkrijgen
   1. Nadat u met de rechtermuisknop op de spectra hebt geklikt, selecteert u Lijst Massa zoeken.
   2. Selecteer in de gegenereerde lijst de relevante ionen voor fragmentatie en klik op toevoegen aan MS/MS-lijst nadat u met de rechtermuisknop op de geselecteerde pieken hebt geklikt.
   3. Klik nogmaals met de rechtermuisknop op de massalijst en selecteer MS/MS-lijst.
   4. Klik op Verzenden naar flexControl.
   5. Laad op flexControl de LIFT-methode en navigeer naar het tabblad LIFT.
   6. Selecteer elke geladen piek één voor één en verkrijg zowel ouder- als fragmentionen door te schakelen tussen de modi Ouder en Fragmenten. Pas de laserintensiteit en het aantal opnamen naar wens aan. Klik op Opslaan om de gegevens op te slaan na de fragmentatie van elk bovenliggend ion.
   7. Exporteer de spectra in '.ascII' formaat.
      OPMERKING: Dit kan later worden geïmporteerd in Glycoworkbench voor verdere analyse.
3. Gegevensanalyse met behulp van glycoworkbench
   1. Laad in Glycoworkbench het geëxporteerde .ascII-bestand van het massaspectrum en voer een basislijncorrectie en ruisfiltering uit met behulp van de relevante knoppen onder aan het venster, voordat u de piekzwaartepunten berekent. Kies in het pop-upvenster het juiste massabereik, de minimale signaal/ruisverhouding en de minimale MS-piekintensiteit.
   2. Zodra de piekzwaartepunten zijn berekend, gebruikt u de Glyco-Peakfinder-tool om structuursamenstellingen te vinden die overeenkomen met de pieklijst. Selecteer perMe als de derivatisering, redEnd als de reducerende kant en het minimale en maximale aantal verwachte residuen.
      1. Selecteer voor mucines Hexose, N-acetyl-hexosamine, deoxy-hexose en N-acetyl-neurinaminezuur. Gebruik voor gesulfateerde glycanen de andere residuoptie met een massa van 87,9. Voor MALDI-TOF-gegevens stelt u Max # Na-ionen en Max # ladingen in op 1 en de nauwkeurigheid op 0,5 Da.
         OPMERKING: De nauwkeurigheid moet mogelijk verder worden verhoogd, afhankelijk van de kalibratie van de massaspectrometer.
   3. Selecteer alle juiste annotaties door de Control-toets ingedrukt te houden en op elke annotatie te klikken; klik vervolgens met de rechtermuisknop op de annotatie en klik op Toevoegen aan de geannoteerde pieklijst.
   4. Als u een rapport wilt genereren waarin meerdere geannoteerde spectra worden vergeleken, selecteert u op het tabblad Extra onder Rapportage de optie Een rapport maken waarin verschillende profielen worden vergeleken. Druk het rapport af als PDF om het op te slaan.
   5. Bereken na het identificeren van de glycaanpieken de relatieve abundantie van elke individuele structuur als een percentage van de totale oppervlakte onder de curve van alle glycaanpieken.
   6. Voor de analyse van fragmentatiespectra laadt u de spectra op de Glycoworkbench en genereert u de pieklijst zoals in stap 2.3.1.
   7. Teken vermeende glycaanstructuren die overeenkomen met de geannoteerde glycaansamenstellingen. Genereer fragmenten voor elke getekende structuur door de relevante optie voor rekenfragmenten te selecteren onder het hulpprogramma Fragmenten . Selecteer vervolgens alle fragmenten, klik er met de rechtermuisknop op en klik op Fragmenten naar canvas kopiëren.
   8. Om de analyse van fragmentatie verder te ondersteunen, selecteert u een interessante piek door erop te klikken in de spectrumviewer. Door vervolgens met de rechtermuisknop te klikken en Find all structures matching the peaks te selecteren, ondervraagt u de m/z van de geselecteerde piek aan de hand van online databases voor vermeende glycaanstructuren.
   9. Selecteer vermeende interessante structuren en kopieer ze naar het canvasvenster van de software door met de rechtermuisknop te klikken en de juiste optie te selecteren.
   10. Als u de mogelijke fragmenten wilt berekenen die uit elke glycaanstructuur kunnen worden gegenereerd, selecteert u de gewenste structuur in het canvas en kiest u vervolgens op het tabblad Extra de optie Fragmenten en Fragmenten berekenen voor de huidige structuur.
   11. Als er fragmenten voor meer dan één glycaanstructuur zijn berekend, bekijkt u de vergelijkingstabel op het tabblad Samenvatting, onder de tabelweergave Fragmenten.
   12. Selecteer de fragmenten die overeenkomen met de pieklijst voor elke potentiële glycaanstructuur en selecteer Fragmenten naar canvas kopiëren in het vervolgkeuzemenu met de rechtermuisknop.
   13. Selecteer op het tabblad Extra onder profiler de optie Pieken annoteren met alle structuren en klik vervolgens op Extra | Rapportage | Maak een rapport van de annotaties. Druk het rapport af als PDF om het op te slaan.

Resultaten

In de volgende resultaten werd varkensmaagslijmvlies (PGM) gebruikt om de ontzoutings- en permethyleringsstappen te optimaliseren. Om twee veelgebruikte ontzoutingsbenaderingen te vergelijken, werden de monsters na het vrijkomen van de glycanen ontzout, hetzij door kationenuitwisseling (zoals beschreven in het bovenstaande protocol) en co-verdamping van boraat met methanol, hetzij door extractie in vaste fase met poreuze grafietkoolstof (PGC) patronen. Dit vereist voorconditionering van de cartridge met 80% acetonitril en 100% H₂O, een wasstap met 0,1% (v/v) trifluorazijnzuur (TFA) en elutie van de glycanen met 2 ml 25% acetonitril in 0,1% TFA, 2 ml 50% acetonitril in 0,1% TFA en 2 ml 80% acetonitril in 0,1% TFA.

De resulterende spectra na permethylering werden geanalyseerd in het bereik van m/z 500 tot m/z 2.500. In totaal werden 33 glycaanstructuren geïdentificeerd in het monster dat werd ontzouten door ionenuitwisseling en boraatverwijdering, terwijl 32 structuren werden geïdentificeerd in het monster dat werd ontzouten door PGC-extractie (Figuur 2A). Eén glycaanstructuur werd niet geïdentificeerd in het ontzoute PGC-monster (gemarkeerd met een asterisk in figuur 2A). Deze vergelijkende analyse toonde aan dat het herstel van grotere glycanen niet zo efficiënt was na PGC-extractie in vergelijking met ionenuitwisseling. Dit blijkt ook uit de relatieve overvloed aan grotere glycanen, die goed zijn voor 21% van de totale glycanen na PGC-extractie, in tegenstelling tot 31% voor ionenuitwisseling. Bovendien leidde ontzouting door ionenwisseling en boraatverwijdering tot spectra met verhoogde signaal-ruisverhoudingen in vergelijking met die geproduceerd na ontzouting door vastefase-extractie met PGC (Figuur 2B).

Om de permethyleringsreactietijd te optimaliseren, werden aliquots van dezelfde permethyleringsreactie gedoofd door H₂O op verschillende tijdstippen toe te voegen (d.w.z. 5 min, 30 min of 90 min). De resultaten toonden aan dat 33 glycaanpieken konden worden geïdentificeerd in het bereik van m/z 500 tot m/z 2.500, in de monsters die gedurende 30 of 90 minuten waren gepermethyleerd, waarbij de resulterende spectra vergelijkbaar waren. Daarentegen konden slechts 31 glycaanpieken worden geïdentificeerd wanneer permethylering gedurende 5 minuten werd uitgevoerd (Figuur 3). Interessant is dat de twee structuren die niet werden geïdentificeerd in deze kortere reactietijd (gemarkeerd met een asterisk in figuur 3) de twee gesiyleerde structuren zijn, wat suggereert dat de modificatie van siaalzuren niet efficiënt is in 5 minuten, onder de geteste omstandigheden.

Fragmentatie werd gebruikt voor elke PGM-glycaanpiek om de glycaansamenstelling te bevestigen en de glycaanstructuur te bepalen. Hier worden twee voorbeelden gegeven (Figuur 4). In Figuur 4A wordt het fragmentatiespectrum van een piek bij 983 m/z weergegeven. De glycaansamenstelling wordt toegewezen als HexNAc₂Hex₂. Er zijn twee potentiële structuren voor deze glycaansamenstelling, ofwel Gal-(Gal-GlcNAc-Gal-)-GalNAc (glycaan 1) of Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc (glycaan 2). Fragmentatie van deze verbinding produceerde een massaspectrum met pieken die kunnen worden toegewezen aan verschillende fragmenten van het glycaan. De piek op m/z 529 en de piek op m/z 708 zijn kenmerkend voor respectievelijk structuur 1 en 2, en we kunnen concluderen dat zowel glycanen 1 als 2 aanwezig zijn in de PGM-glycaanmix.

In Figuur 4B wordt het fragmentatiespectrum van een piek bij m/z 2.026 weergegeven. Glycoworkbench berekende twee potentiële glycaansamenstellingen voor deze piek, Hex₃HexNAc₁Neu5Ac₃ en Hex₃HexNAc₄dHex₂. De gesialyleerde samenstelling heeft een lagere nauwkeurigheid (respectievelijk ~160 ppm en 178 ppm), wat suggereert dat de eerste de juiste keuze moet zijn. Het fragmentatieprofiel geeft echter de aanwezigheid van Fuc aan, niet Neu5Ac; Daarom is de tweede samenstelling de juiste. Hier worden vier vermeende glycaanstructuren gepresenteerd en is het spectrum geannoteerd met de berekende fragmenten van elke vermeende glycaanstructuur. In het geannoteerde spectrum kunnen we zien dat er alleen pieken aanwezig zijn die kenmerkend zijn voor glycanen 4 en 6, terwijl er geen pieken zijn die kenmerkend zijn voor glycanen 3 en 5. Op basis van deze gegevens kunnen we concluderen dat glycanen 4 en 6 aanwezig zijn.

Figuur 2: Vergelijking van de glycaanpieken volgens de ontzouting en de vastefase-extractie. (A) Vergelijking van het PGM-glycaanprofiel na ontzouting door middel van kationenuitwisselingschromatografie en boraatverwijdering of door PGC-extractie in vaste fase. (B) Vergelijking van de twee ontzoutingsbenaderingen in de resulterende signaal-ruisverhouding voor elke geïdentificeerde glycaanpiek. Het sterretje geeft het glycaan aan dat alleen werd geïdentificeerd in de monsters die werden ontzouten door kationenuitwisseling en verwijdering van boraat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Vergelijking van het PGM-glycaanprofiel na permethylering gedurende 5, 30 of 90 minuten. De sterretjes geven de gesialyleerde glycanen aan die pas na 30 of 90 minuten permethylering werden geïdentificeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Voorbeelden van fragmentatiespectra van PGM-glycanen. (A) Fragmentatie van de glycaanpiek bij m/z 983. (B) Fragmentatie van de glycaanpiek bij m/z 2026. De vakjes geven mogelijke glycaanstructuren aan. De getallen over de fragmenten geven aan uit welke glycaanstructuur ze zouden kunnen worden afgeleid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Om glycanen te bestuderen, gebruiken onderzoekers een verscheidenheid aan methodologieën, variërend van het gebruik van lectines om specifieke epitopen te identificeren tot meer geavanceerde vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS) en nucleaire magnetische resonantie (NMR) om gedetailleerde karakterisering van glycaanstructuren te verkrijgen. De belangrijkste voordelen van MALDI-TOF MS ten opzichte van alternatieve benaderingen zijn de gevoeligheid en de high-throughput aard van de methode¹³. Omdat er echter geen mogelijkheid is om isobare verbindingen te scheiden, produceren verschillende glycaanstructuren met dezelfde m/z-waarde een mix van fragmenten onder MS/MS die vervolgens moeilijk te ontwarren is¹³. Als het bepalen van de exacte structuur van mucineglycanen nodig is, zou LC-MS de voorkeursmethode moeten zijn.

Hier presenteren we een protocol voor de analyse van mucineglycanen door MALDI-TOF MS dat alle kritieke stappen in het proces omvat, van glycaanafgifte, ontzouting en permethylering tot gegevensverzameling en -analyse. Het is belangrijk om te erkennen dat elk van deze stappen kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende benaderingen, en ze hebben allemaal bijbehorende voordelen en beperkingen.

In dit protocol gebruikten we reductieve β-eliminatie om de glycanen vrij te maken. De reactie vindt plaats onder basisomstandigheden. Als de mucinemonsters al in suspensie zijn en niet eerder zijn gezuiverd, moet de pH worden gecontroleerd met behulp van een pH-indicatorpapier; als het zuur is, moet het worden verhoogd tot een pH van ~8-9. Een beperking van deze benadering is dat de basisvoorwaarden die nodig zijn voor het vrijkomen van de glycanen ook leiden tot de hydrolyse en dus tot het verlies van O-acetylgroepen die vaak worden aangetroffen op siaalzuren, in een reactie die bekend staat als verzeping.

Hoewel in de literatuur andere methoden zijn beschreven voor het vrijkomen van glycanen 15,16,17,18, waarvan sommige de labiele O-acetylgroepen kunnen behouden, blijft reductieve β-eliminatie de gouden standaard in het veld. Deze aanpak vereist een hoge concentratie zouten. Zouten en andere ionenonderdrukkende verontreinigingen moeten vervolgens worden verwijderd voorafgaand aan MALDI-TOF-analyse¹⁹, omdat ze de ionisatie-efficiëntie en kwantificering van glycanen kunnen beïnvloeden. Hier bleek kationenuitwisselingschromatografie, gevolgd door verwijdering van boraat door methanolverdamping, de meest efficiënte benadering te zijn voor het ontzouten van de vrijgekomen glycanen uit mucine. In dit geval hebben de glycanen geen interactie met de hars en stromen ze er in plaats daarvan doorheen, terwijl natriumionen op de hars worden opgesloten. De voorbereiding van de ionenuitwisselingskolommen is echter omslachtig en maakt deze aanpak inefficiënt voor grootschalige experimenten met talrijke monsters. In dergelijke gevallen kan PGC-ontzouten de voorkeur hebben, aangezien deze hars ook verkrijgbaar is in een plaatformaat met 96 putjes. Zoals hierboven uiteengezet, kan ontzouting door PGC-extractie echter leiden tot inefficiënte elutie, met name van grotere glycanen, en hiermee moet rekening worden gehouden bij het interpreteren van de resultaten.

Hoewel natieve glycanen ook kunnen worden geanalyseerd door MALDI-TOF, wordt meestal permethylering gebruikt, omdat deze reactie de detectiegevoeligheid aanzienlijk verhoogt, aangezien natieve glycanen een lage ionisatie-efficiëntie hebben²⁰. Bovendien zorgt permethylering ervoor dat negatief geladen glycanen, zoals gesulfateerde of gesialyleerde glycanen, gemakkelijker te detecteren zijn in positieve modus en blijven labiele glycaanepitopen, zoals siaalzuren of fucose²⁰, behouden. Meestal wordt permethylering toegestaan om 5-10 minuten^14,21 te duren, waarbij sommige rapporten toestaan dat de reactie tot 40 minuten²² kan doorgaan. Hier hebben we aangetoond dat, onder de geteste omstandigheden, gesialyleerde glycanen niet efficiënt werden gedetecteerd na 5 minuten permethylering en dat een langere incubatie nodig was.

Naast de reactietijd is een andere factor die de permethyleringsefficiëntie kan beïnvloeden, het watergehalte in de reactie. De aanwezigheid van water kan leiden tot ondermethylering of gedeeltelijke methylering van de glycanen, waarbij niet alle hydroxylgroepen zijn omgezet in methylgroepen²³. Dit kan gemakkelijk worden bepaald alsof er ondermethylering is opgetreden, groepen pieken die 14 Da verschillen (het massaverschil tussen hydroxyl- en methylgroepen) kunnen worden waargenomen in de massaspectra. Dit probleem kan worden aangepakt door de permethyleringsreactie te herhalen en de gegevens opnieuw te analyseren.

Een beperkende factor bij de glycaananalyse is de interpretatie van de spectra. Ondanks recente ontwikkelingen is dit proces nog steeds grotendeels handmatig en vereist het een goede kennis en begrip van de biosynthetische routes van glycaan om de spectra nauwkeurig te annoteren. Tools zoals Glycoworkbench²⁴ kunnen helpen door mogelijke annotaties, glycaanstructuren en samenstellingen te bieden, maar vanwege de inherente heterogeniteit van glycaanmengsels moeten onderzoekers nog steeds de beslissing nemen welke keuze de juiste is. In het hierboven gepresenteerde voorbeeld met behulp van PGM, bood Glycoworkbench twee potentiële glycaansamenstellingen voor de piek bij mz 2,025.7620, en op basis van het fragmentatieprofiel concludeerden we dat de fucosyleerde structuur aanwezig was, in plaats van de gesialyseerde. Als er echter geen fragmentatiespectrum beschikbaar was (wat vaak het geval is voor glycanen met een lage abundantie), kunnen onderzoekers de annotatie baseren op de wetenschap dat glycanen met een samenstelling van Hex3HexNAc1Neu5Ac3 worden aangetroffen op gangliosiden, in plaats van mucines, en deze optie moet daarom niet worden overwogen in de context van PGM. Geïdentificeerde glycaanstructuren of -samenstellingen moeten dus worden vergeleken met eerdere publicaties en moeten in overeenstemming zijn met de principes van de biosynthese van O-glycaan. Over het algemeen dient dit protocol als een waardevolle bron, vooral voor onderzoekers die nieuw zijn op het gebied van glycobiologie en geïnteresseerd zijn in de studie van interacties die plaatsvinden op het slijmvliesgrensvlak.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
150 mm glazen pasteurpipetten	Fisher Scientific	15202699	Consumables Verwijzing in de tekst (indien van toepassing): glazen pipet
5 mL buisjes	Eppendorf	30122305	Consumables
96-well HLB-extractieplaat	Fisher Scientific	16553290	Consumables
azijnzuur	Sigma-Aldrich	A6283	Reagens
acetonitril	Fisher Scientific	15624520	Reagens
watervrij DMSO	Sigma-Aldrich	5.89569	Reagens
watervrij methanol	Sigma-Aldrich	5.89596	Reagens
Autoflex massaspectrometer	Bruker		Apparatuur
DOWEX 50w x8 hars, H+-vorm, 200-400 mesh	Sigma-Aldrich	44519	Reagens Verwijzing in de tekst (indien van toepassing): kationenuitwisselingshars
drogblokverwarmer	Grant	QBD2	Apparatuur
Verdamper/Concentrator voor Blokverwarmers	Cole-Palmer	WZ-36610-99	Apparatuur
flexAnalysis	Bruker		Software, eigendom
flexControl	Bruker		Software, eigendom
Genevac EZ-2	Biopharma	EZ-2	Apparatuur Verwijzing in de tekst (indien van toepassing): centrifugale verdamper
glazen flesjes met bijpassende PTFE-doppen (4 mL)	Wheaton	DWKW224582-144EA	Consumables
glazen flesjes met bijpassende PTFE-doppen (8 mL)	Fisher Scientific	11587413	Consumables
glaswol	Supelco	1.04086	Consumables
Glycoworkbench	NA		Software; downloadbaar van https://glycoworkbench.software.informer.com/
HLB SPE-cartridges	Supelco	57493-U	Consumable, als alternatief voor de 96-well HLB-extractieplaat
jodomethaan	Sigma-Aldrich	289566	Reagens
MALDI-doelplaat	Bruker		Apparatuur
ModulyoD vriesdroogmachine	Thermo Fisher	ModulyoD-230	Apparatuur Verwijzing in de tekst (indien van toepassing): vriesdroogmachine
NaBH4	Sigma-Aldrich	452882	Reagens
NaOH-pellets	Sigma-Aldrich	567530	Reagens
NaOH-oplossing 50%	Sigma-Aldrich	415413	Reagens
positive Pressure-96 Processor	Waters	186006961	Apparatuur
super DHB	Sigma-Aldrich	50862	Reagens
trifluorazijnzuur	Sigma-Aldrich	T6508	Reagens