We presenteren verbeterde protocollen voor retrovirale transductie van transportreceptoren en competitieve homing om receptor-gemedieerde orgaan- en micro-omgevingsspecifieke lymfocytenpositionering te bestuderen. Deze methode biedt waardevolle inzichten in mechanismen voor het transport van immuuncellen en heeft potentiële toepassingen in toekomstig fundamenteel en therapeutisch onderzoek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Efficiënte retrovirale transductie en competitieve homing voor het onderzoeken van GPCR-gemedieerde T-cellokalisatie in diverse weefselmicro-omgevingen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Begrijpen hoe expressie van G-proteïne gekoppelde receptor (GPCR) de celpositionering binnen diverse weefselmicro-omgevingen beïnvloedt, is essentieel voor het ophelderen van mechanismen voor het transport van immuuncellen. We presenteren een competitieve homing-test die is ontworpen om GPCR-gemedieerde T-cellokalisatie te bestuderen naar organen die hun verwante chemoattractante liganden tot expressie brengen, toepasbaar voor zowel korte- als langetermijnstudies. De aanpak omvat een verbeterd protocol voor recombinante transductie van T-cellen door het muizenstamcelvirus (MSCV) om de GPCR van interesse of een controleconstruct tot expressie te brengen, gevolgd door competitieve homing bij ontvangende muizen. De celverdeling over verschillende organen wordt geanalyseerd met behulp van flowcytometrie en/of confocale microscopie. In kortetermijnexperimenten (10-12 uur) onthulde confocale microscopie verschillende cellokalisatiepatronen, waaronder naar longblaasjes, bronchiën submucosa, veneuze plaatsen en interstitium in de long, evenals het epitheel dat de luchtpijp, maag en baarmoederhoorn bekleedt. In langetermijnstudies (1-7 weken) gaf flowcytometrie inzicht in preferentiële celaccumulatie, waarbij dynamische veranderingen en mogelijke rijping of herpositionering in weefsels in de loop van de tijd werden onthuld. Deze competitieve homing-test is een robuust hulpmiddel voor het bestuderen van GPCR-gemedieerde celpositionering en biedt waardevolle inzichten in weefselspecifieke distributie en mogelijke toepassingen in immunologie en therapeutisch onderzoek.
Inleiding
G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCR's) zijn van fundamenteel belang bij het reguleren van een verscheidenheid aan cellulaire processen, waaronder signaaltransductie, neurotransmissie, hormoonregulatie en migratie van immuuncellen1. Ze spelen een cruciale rol in de spatiotemporele controle van lymfocytenmigratie en lokalisatie2. Tijdens de priming-fase van immuunresponsen zorgen de lokale micro-omgeving en cellulaire interacties ervoor dat T-lymfocyten een unieke set adhesiemoleculen en chemokinereceptoren tot expressie brengen die bekend staan als homing-receptoren. Deze aanpassing st....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle muizen in deze studie werden gehouden in specifieke pathogeenvrije (SPF) faciliteiten van het Veterans Affairs Palo Alto Health Care System (VAPAHCS). B6/SJL Prprc Pep3BoyJ (CD45.1), C57B6/J (CD45.2) en Rag1-/- muizen werden gekocht bij Jackson Laboratories. Hoewel we PepBoy hebben gebruikt om CD45.1-cellen te verkrijgen, raden we aan om JAXBoy te gebruiken (C57BL/6J-Ptprcem6Lutzy/J). JAXBoy is een volledig coisogene stam die wordt gegenereerd via CRISPR in plaats van traditionele terugkruising, wat de genetische consistentie verbetert. Historisch gezien omvatten CD45-allotype-gemarkeerde onderzoeken met PepBo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In deze studie presenteren we een gedetailleerd protocol voor het onderzoeken van het vermogen van specifieke receptoren om T-cellokalisatie in vivo te sturen. Als demonstratie van dit protocol hebben we GPR2513 gebruikt. Met dit protocol zijn we in staat om een transductie-efficiëntie van 30%-40% te bereiken, zoals beoordeeld door Thy1.1-kleuring door flowcytometrie. We voerden in vitro transwell-gebaseerde chemotaxis-assays uit met behulp van GPR25-getr.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De intern gecontroleerde homing-test die in deze studie wordt beschreven, is een uitgebreide methode voor het onderzoeken van GPCR-gemedieerd T-celtransport en -positionering binnen diverse organen en weefselmicro-omgevingen. Deze aanpak integreert verschillende cruciale optimalisaties om de reproduceerbaarheid, nauwkeurigheid en efficiëntie te verbeteren.
Een cruciaal aspect van dit protocol is de efficiënte transductie van T-cellen met behulp van MSCV retrov.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Ondersteund door NIH-subsidies R01 AI178113 en R01 AI047822, Grant 1903-03787 van The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust en Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) subsidies T31IP1880 en T33IR6609 aan E.C.B.; Y.B. werd ondersteund door een Research Fellows Award van de Crohn's and Colitis Foundation of America (835171). B.O. werd ondersteund door een postdoctorale fellowship van de Ramon Areces Foundation (Madrid, Spanje) en een Research Fellows Award van de Crohn's and Colitis Foundation of America (574148). AA werd ondersteund door het California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) - EDUC2-12677.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| AF647 anti mouse CD90.1-Thy1.1 (OX-7) | Biolegend | 202507 | |
| anti-CD31 (DyLight 633, clone 390) | InvivoMab | BE0377 | |
| anti-mouse CD28 37.51 | eBiosciences | ||
| anti-mouse CD3 145-2c11 | eBiosciences | ||
| APCCy7 anti mouse CD3 (145-2c11) | Biolegend | 100329 | |
| BV421 anti mouse CD8b (Ly-3) | Biolegend | 126629 | |
| BV711 anti mouse CD4 (RM4-5) | Biolegend | 100549 | |
| CD90.1 microbeads | Miltenyi | 130-121-273 | |
| CFSE | Thermoscientific | C34554 | |
| FITC anti mouse CD45.2 (104) | BD | AB_395041 | |
| mouse IL2 | Peprotech | 200-02-50UG | |
| mouse IL7 | Peprotech | 217-17-10UG | |
| Mouse T CD4 isolation kit | STEMCELL technologies | 18000 | |
| MSCV-IRES- Thy1.1 GPR25 | Vectorbuilder | ||
| MSCV-IRES- Thy1.1 Stuffer | Vectorbuilder | ||
| PE-CD45 (30-F11) antibody | Biolegend | 103105 | |
| PECy7 anti mouse TCRb (H57-597) | Tonbo | ||
| PercpCy5.5 anti mouse CD45.1 (A20) | eBiosciences | ||
| Platinum-E (Plat-E) | cell Biolabs. Inc | RV-101 | |
| Yellow fluorescent dye | Thermoscientific |
Referenties
- Cheng, L., et al. Structure, function and drug discovery of GPCR signaling. MolBiomed. 4 (1), 46(2023).
- Lammermann, T., Kastenmuller, W. Concepts of GPCR-controlled navigation in the immune system. Immunol Rev. 289 (1), 205-231 (2019).
- Fu, H., Ward, E. J.,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
