Methodenartikel

Efficiënte retrovirale transductie en competitieve homing voor het onderzoeken van GPCR-gemedieerde T-cellokalisatie in diverse weefselmicro-omgevingen

901 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67754

⸱

28 maart 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Palo Alto Veterans Institute for Research, 3Veterans Affairs Palo Alto Health Care System

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren verbeterde protocollen voor retrovirale transductie van transportreceptoren en competitieve homing om receptor-gemedieerde orgaan- en micro-omgevingsspecifieke lymfocytenpositionering te bestuderen. Deze methode biedt waardevolle inzichten in mechanismen voor het transport van immuuncellen en heeft potentiële toepassingen in toekomstig fundamenteel en therapeutisch onderzoek.

Samenvatting

Begrijpen hoe expressie van G-proteïne gekoppelde receptor (GPCR) de celpositionering binnen diverse weefselmicro-omgevingen beïnvloedt, is essentieel voor het ophelderen van mechanismen voor het transport van immuuncellen. We presenteren een competitieve homing-test die is ontworpen om GPCR-gemedieerde T-cellokalisatie te bestuderen naar organen die hun verwante chemoattractante liganden tot expressie brengen, toepasbaar voor zowel korte- als langetermijnstudies. De aanpak omvat een verbeterd protocol voor recombinante transductie van T-cellen door het muizenstamcelvirus (MSCV) om de GPCR van interesse of een controleconstruct tot expressie te brengen, gevolgd door competitieve homing bij ontvangende muizen. De celverdeling over verschillende organen wordt geanalyseerd met behulp van flowcytometrie en/of confocale microscopie. In kortetermijnexperimenten (10-12 uur) onthulde confocale microscopie verschillende cellokalisatiepatronen, waaronder naar longblaasjes, bronchiën submucosa, veneuze plaatsen en interstitium in de long, evenals het epitheel dat de luchtpijp, maag en baarmoederhoorn bekleedt. In langetermijnstudies (1-7 weken) gaf flowcytometrie inzicht in preferentiële celaccumulatie, waarbij dynamische veranderingen en mogelijke rijping of herpositionering in weefsels in de loop van de tijd werden onthuld. Deze competitieve homing-test is een robuust hulpmiddel voor het bestuderen van GPCR-gemedieerde celpositionering en biedt waardevolle inzichten in weefselspecifieke distributie en mogelijke toepassingen in immunologie en therapeutisch onderzoek.

Inleiding

G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCR's) zijn van fundamenteel belang bij het reguleren van een verscheidenheid aan cellulaire processen, waaronder signaaltransductie, neurotransmissie, hormoonregulatie en migratie van immuuncellen1. Ze spelen een cruciale rol in de spatiotemporele controle van lymfocytenmigratie en lokalisatie2. Tijdens de priming-fase van immuunresponsen zorgen de lokale micro-omgeving en cellulaire interacties ervoor dat T-lymfocyten een unieke set adhesiemoleculen en chemokinereceptoren tot expressie brengen die bekend staan als homing-receptoren. Deze aanpassing stelt antigeen-ervaren T-cellen in staat om zich aan te gaan met orgaanspecifieke endotheelcellen (EC's) en te migreren naar verschillende doelweefsels. Het vermogen van T-cellen om weefseltropisme te verwerven is van vitaal belang voor effectieve recall-reacties, vooral in de context van terugkerende infecties die hetzelfde orgaan aantasten 3,4.

GPCR's leiden immuuncellen naar specifieke weefsels en organen waar ze kritieke functies vervullen - zoals het leiden van CD8+ T- en NK-cellen naar tumorplaatsen voor cytotoxische werking of het helpen van CD4+ T-cellen bij het orkestreren van immuunresponsen door de activering van andere immuuncellen te ondersteunen. Begrijpen hoe GPCR's T-cellen naar hun precieze locaties leiden, is essentieel voor het bevorderen van gerichte immunotherapieën 5,6. De uitdaging ligt echter in het modelleren van deze complexe interacties in vitro, aangezien het moeilijk is om zowel ruimtelijk beperkte signalen als directionele chemotactische signalen tegelijkertijd te repliceren.

Het ophelderen van de rol van specifieke leukocytenreceptoren is ook vaak een uitdaging vanwege hun beperkte expressiefrequentie in endogene populaties en het feit dat deze receptoren doorgaans verschillende celtypen versieren. Deze complexiteit maakt het moeilijk om de rol van een specifieke receptor te isoleren van andere celsubset-specifieke mechanismen. Idealiter zouden methoden vergelijkbare populaties moeten vergelijken, die alleen verschillen in de receptor van interesse om duidelijke inzichten te verschaffen.

Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, hebben we een competitieve homing-test aangenomen die gebruik maakt van recombinante MSCV-retrovirale transductie voor efficiënte GPCR-expressie in T-cellen. MSCV retrovirale vectoren, die elementen combineren van het myeloproliferatieve sarcoomvirus (PCMV)-gebaseerde MESV-vectoren en de Moloney muizenleukemievirus (MMLV)-gebaseerde LN-vectoren, bevatten een uitgebreid hybride verpakkingssignaal dat is afgeleid van de LN-vectoren7. Deze modificatie verbetert de efficiëntie van de genafgifte, waardoor zowel korte- als langetermijnstudies van T-cellokalisatie in vivo mogelijk zijn. Door gebruik te maken van retrovirale deeltjes met een hoge titer en confocale microscopie, maakt de aanpak een nauwkeurige visualisatie mogelijk van de positionering en interacties van T-cellen binnen complexe weefselomgevingen. We presenteren gedetailleerde protocollen voor de retrovirale transductie van transportreceptoren en de uitvoering van intern gecontroleerde (zogenaamde competitieve) homing-assays om receptor-gemedieerde orgaan- en micro-omgevingsspecifieke lymfocytenpositionering te bestuderen. Het algemene doel van deze methode is om waardevolle inzichten te verschaffen in mechanismen voor het transport van immuuncellen en om toekomstige toepassingen in zowel fundamenteel onderzoek als therapeutische ontwikkeling mogelijk te maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle muizen in deze studie werden gehouden in specifieke pathogeenvrije (SPF) faciliteiten van het Veterans Affairs Palo Alto Health Care System (VAPAHCS). B6/SJL Prprc Pep3BoyJ (CD45.1), C57B6/J (CD45.2) en Rag1-/- muizen werden gekocht bij Jackson Laboratories. Hoewel we PepBoy hebben gebruikt om CD45.1-cellen te verkrijgen, raden we aan om JAXBoy te gebruiken (C57BL/6J-Ptprcem6Lutzy/J). JAXBoy is een volledig coisogene stam die wordt gegenereerd via CRISPR in plaats van traditionele terugkruising, wat de genetische consistentie verbetert. Historisch gezien omvatten CD45-allotype-gemarkeerde onderzoeken met PepBoy-muizen (CD45.1), die niet volledig congeenisch zijn, controle-homing- en recirculatietests met wildtype (WT/WT) vergelijkingen om mogelijke variabiliteit aan te pakken. Nu JAXBoy-muizen beschikbaar zijn als een volledig isogeen alternatief, zijn deze extra controles mogelijk niet langer nodig. Onderzoekers moeten er nog steeds rekening mee houden dat verschillen tussen CD45.1- en CD45.2-varianten - zoals hun rol als eiwittyrosinefosfatasen - cellulair gedrag en homing-patronen kunnen beïnvloeden. Alle protocollen die in de tekst en hieronder worden besproken, zijn goedgekeurd of voldoen aan de richtlijnen van de geaccrediteerde afdeling Proefdiergeneeskunde en het Administratief Panel voor Laboratoriumdierverzorging van het VA Palo Alto Health Care System (VAPAHCS). Dieren werden geofferd volgens goedgekeurde procedures. Muizen van beide geslachten, in de leeftijd van 8-12 weken, werden in de experimenten opgenomen.

1. MSCV vector voorbereiding

  1. Koop MSCV-IRES-Thy1.1 retrovirale vector met het coderende gebied van het muizengen van belang (GOI) of een ORF_Stuffer (negatieve ORF-controle)
    OPMERKING: Dit construct omvat de Thy1.1-oppervlaktemarker naast het GPCR-gen van belang. De linker van de Internal Ribosome Entry Site (IRES) maakt de co-expressie van de GPCR met de Thy1.1 mogelijk, waardoor de identificatie van getransduceerde cellen door flowcytometrie of zuivering en isolatie door magnetische kralen wordt vergemakkelijkt. Dit is vooral handig wanneer antilichamen die specifiek zijn voor de GPCR niet beschikbaar zijn, zoals vaak het geval is bij slecht bestudeerde GPCR's.
  2. Verkrijg het MSCV-plasmide in bacteriële vorm en cultuur door Luria-Bertani (LB)-bouillon te inoculeren, aangevuld met de juiste antibioticaselectie op basis van het resistentiegen dat wordt gecodeerd door het plasmide (bijv. ampicilline, kanamycine of chlooramfenicol). LB-medium bestaat uit trypton (10 g/L), gistextract (5 g/L) en NaCl (10 g/L), aangepast aan pH 7,0 en gesteriliseerd door autoclaveren. Incubeer de cultuur een nacht bij 37 °C in een schudbroedmachine (220 RPM).
  3. Bereid plasmidevoorraden voor met behulp van standaard moleculair-biologische technieken met behulp van een DNA-voorbereidingskit.
  4. Meet na DNA-isolatie de DNA-concentratie met een spectrofotometer en bereid werkende plasmideoplossingen voor met een concentratie van 1 μg/μl. Bewaar plasmiden bij -20 °C voor toekomstig gebruik.

2. Opzetten van een verpakkingscellijncultuur

LET OP: We hebben Platinum E (Plat-E) cellen van Cell Biolabs gebruikt. Plat-E-cellen zijn een op 293T gebaseerde cellijn met een EF1α-promotor, die zorgt voor een stabiele en hoogrenderende expressie van retrovirale structurele eiwitten (gag-, pol- en env-genen), waardoor retrovirale verpakking met een enkele plasmidetransfectie mogelijk is8. Hoewel andere cellijnen, zoals NIH-3T3 of 293T, kunnen worden gebruikt, hebben we deze alternatieven niet getest.

  1. Bereid Plat-E-celmedia voor door DMEM, 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine, blasticidine (10 μg/ml) en puromycine (1 μg/ml) toe te voegen. Gebruik blasticidine en puromycine voor celonderhoud maar laat ze tijdens en na transfectie weg.
  2. Plaat Plat-E-cellen worden diepgevroren verzonden in 1,0 ml, op >3 x 106 cellen/ml in DMEM, 20% FBS en 10% DMSO. Ontdooi ze snel in een waterbad van 37 °C. Breng alle ontdooide cellen over in een conische buis van 15 ml met Plat-E kweekmedium.
  3. Centrifugeer bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de celpellet in 1 ml Plat-E-medium door voorzichtig te pipetteren om een eencellige suspensie te creëren.
  4. Voeg 9 ml Plat-E medium toe aan een kweekschaal van 10 cm en breng vervolgens de 1 ml geresuspendeerde cellen over in de schaal. Bevestig dat de ontdooide cellen levensvatbaar zijn door een gelijk volume celsuspensie en Trypan Blue te mengen en de levensvatbare (niet-bevlekte) en dode (blauw gekleurde) cellen te tellen met behulp van een hemocytometer of celteller, waarbij wordt gestreefd naar een levensvatbaarheid van >70%.
  5. Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 . Verander het medium de eerste 3 dagen niet; Het is normaal om drijvende en dode cellen te observeren bij de eerste dooi.
  6. Wanneer de cellen 85%-90% samenvloeiing bereiken, wassen met DMEM/PBS Ca-/Mg-. Maak de cellen los met 2 ml 0,05% trypsine/0,5 mM EDTA en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 °C. Voeg 8 ml Plat-E-medium toe, verzamel de cellen in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij 4 °C.
  7. Splits in een oppervlakteverhouding van 1:10 of 1:5 (d.w.z. zaai nieuwe borden met 1/10 of 1/5 van het totale volume van het oorspronkelijke gerecht). Resuspendeer in een eindvolume van 10 ml Plat-E-medium en incubeer bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO2 .
  8. Verdeel de rest van de cellen in 1 ml FBS met 10% DMSO en vries in bij -80 °C en vervolgens in vloeibare stikstof voor langdurig gebruik.
    OPMERKING: Behandel cellen zoals hierboven beschreven wanneer ze in de buurt van 85% confluent zijn. Om een optimale gezondheid van de cellen te behouden, vermijdt u overmatige samenvloeiing en streeft u naar 3-daagse splitsingen met een verdunning van 1:10. Als de groei vertraagt, gebruik dan een nieuwe aliquot. De celprestaties nemen doorgaans af bij volgende passages. Wij raden aan cellen voor transfectie tussen passages 4 en 15 voor beste resultaten te gebruiken.

3. Productie van getransduceerde cellen

  1. Dag 1: Zaad Plat E-cellen
    OPMERKING: Bereken het aantal benodigde Plat E-cellen en -platen. We gebruikten 1 ml viraal supernatans per putje in een plaat met 24 putjes om cellen 2x te transfecteren. We gebruiken meestal ongeveer twee 10 cm petrischaaltjes getransfecteerde platen met Plate-E-cellen per plaat met 24 putjes met T-cellen in cultuur.
    1. Begin met het coaten van 10 cm weefselkweekplaten met 5 ml 50 μg/ml poly-D-lysine in steriel water. Incubeer 45 minuten bij kamertemperatuur. Was 2x met steriel PBS Ca-/Mg -- om ervoor te zorgen dat er geen resten achterblijven.
      OPMERKING: We raden aan om de platen te coaten, omdat Plat-E-cellen de neiging hebben om na transfectie los te komen, wat leidt tot slechte celprestaties en verminderde virale titerproductie.
    2. Maak Plat-E-cellen los zoals hierboven beschreven in stap 2.6 en voer een trypanblauwuitsluitingstest uit om de levensvatbaarheid te garanderen. Meng een gelijk volume celsuspensie en Trypan Blue. Tel de levensvatbare (niet-gekleurde) en dode (blauw gekleurde) cellen met behulp van een hemocytometer/celteller. Zaai 3 x 10⁶levende cellen in een petrischaaltje van 10 cm in weefselkweek met antibioticavrij Plat-E medium.
      OPMERKING: Gezaaide platen moeten de volgende dag een samenvloeiing van 85%-90% bereiken. Als dit niet wordt bereikt, overweeg dan om een ander celaliquot te gebruiken. Pas de zaaidichtheid aan op basis van de timing van het plateren; Voor het uitplateren in de avond kunnen 3,5 x 106 cellen worden gebruikt.
  2. Dag 2: Transfectie van Plat-E-cellen en coatingplaten voor T-cellen met anti-CD3- en anti-CD28-antilichamen
    1. Vervang het medium op Plat-E-celculturen door 6,5 ml gereduceerde serummedia.
    2. Bereid de transfectiemix voor volgens de instructies van de fabrikant voor het Lipofectamine-reagens (Lipofectamine 2000 werd in deze studie gebruikt).
    3. Meng voor elke plaat 45 μl Lipofectamine 2000 met 210 μl gereduceerd serummedium in één buisje en 15 μg DNA met 235 μl gereduceerd serummedium in een ander buisje. Combineer de inhoud van de buisjes door 3x-4x te pipetteren.
    4. Incubeer het mengsel gedurende 5-20 minuten bij kamertemperatuur zodat Lipofectamine/DNA-complexen kunnen worden gevormd en voeg vervolgens druppelsgewijs toe aan de platen. Incubeer de platen gedurende 16 uur bij 37 °C.
    5. T-cel activeringsputjes: Smeer 24 putjes platen in met 5 μg/ml anti-muis CD28 (37.51) en 10 μg/ml anti-muis CD3 (145-2c11) in 375 μL/well PBS 's nachts bij 4 °C of gedurende 3-4 uur in de incubator bij 37 °C op dag 3.
      OPMERKING: Wikkel platen in transparante folie als u 's nachts incubeert om verdamping te voorkomen. Dynabeads muisactivator CD3/CD28 kan als alternatief worden gebruikt met vergelijkbare resultaten.
  3. Dag 3: Verander Plat-E media en isoleer en activeer T-cellen
    1. Verander de Plat-E transfectiemedia in 14 ml DMEM volledig medium in de ochtend. Bereid T-celmedia voor door RPMI-10 toe te voegen: RPMI 1640 met L-glutamine, 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine, 1x MEM niet-essentiële aminozuren, 1 mM natriumpyruvaat, 50 μM β-mercaptoethanol en 1 mM HEPES.
    2. Euthanaseer JAXBoy (CD45.1) en C57B6/J (CD45.2) muizen met behulp van CO2-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie. Isoleer milten en lymfeklieren onder steriele omstandigheden.
    3. Pureer de milten voorzichtig op een 100 μm nylon gaascelzeef met RPMI-medium in een plaat met 6 putjes met behulp van een spuitzuiger.
    4. Breng de oplossing door een 40 μm nylon gaascelzeef voor een eencellige suspensie over in een conische buis van 50 ml. Centrifugeer bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en was ze met PBS Ca-/Mg-.
    5. Voer magnetische negatieve selectie uit met behulp van de Mouse T/T CD4 Isolation Kit volgens de instructies van de fabrikant, of sorteer de cellen met behulp van steriele FACS
    6. Tel de T-cellen met behulp van een cellenteller en plaats ze in de T-celactiveringsputjes op 1-1,5 x 106 per putje in 1 ml RPMI-10-medium per putje. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ in een bevochtigde incubator. Wacht 24-48 uur voor een juiste activering, zoals beoordeeld onder de microscoop, zoals uitgelegd in de onderstaande opmerkingen.
      OPMERKING: De vernetting van CD3 en CD28 activeert effectief de T-cellen in deze opstelling. Eén muizenmilt levert doorgaans ongeveer 1 x 108 splenocyten op. CD4+ T-cellen vormen over het algemeen ongeveer 10% van de totale splenocytenpopulatie. Daarom, om een plaat met 24 putjes te bereiden met 1-1,5 x 106 CD4+ T-cellen per putje, wordt geschat dat cellen van 2-3 muizen voldoende zullen zijn.
  4. Dag 4: Transductie
    1. Controleer de T-cellen na 24 uur onder een microscoop. Zorg ervoor dat T-cellen zich in een explosieve toestand bevinden (clusters vormen en vergroot lijken door activering) vóór transductie. Het stralen van T-cellen zorgt ervoor dat ze zich in een delende toestand bevinden, wat cruciaal is voor MSCV-transductie9.
    2. Verzamel ~10 ml viraal supernatans van de platen van 10 cm in een conische buis. Vervang de Plat-E kweekplaten door nog eens 10 ml Plat-E medium zonder antibiotica om ervoor te zorgen dat er voldoende media zijn om meer media te genereren voor een tweede transductie de volgende dag. Pas het mediavolume in PLAT-E-platen aan op basis van het aantal T-celputjes dat de volgende dag moet worden getransfecteerd.
      OPMERKING: 2x transduceren verbetert de efficiëntie aanzienlijk.
    3. Filtreer het virale supernatans door het door een spuitfilter van 0,45 μm te halen. Voeg 8 μg/ml polybreen en 1:100 HEPES toe.
    4. Draai de 24-wells T-celplaat 7 minuten rond op 950 x g. Verzamel en bewaar het bovenstaande zorgvuldig zonder de cellen los te maken. Dit supernatans bevat cytokinen en andere factoren die na activering door de T-cellen worden uitgescheiden en na de spinfection worden vervangen door dit supernatant om het cytokine- en factorenprofiel te behouden om de proliferatie en groei van T-cellen te ondersteunen.
    5. Voer de spinfectie uit door 1 ml viraal supernatans aan elk putje toe te voegen en gedurende 4 uur bij 32 °C op 1.150 x g te draaien. Sluit de platen af met plasticfolie tijdens het spuiten.
    6. Vervang na spinfectie de media voorzichtig door de eerder opgeslagen T-celsupernatant.
  5. Dag 5: Herhaalde transductie
    1. Herhaal de transfectie zoals beschreven op dag 4. Meng eventueel het opgeslagen supernatans in stap 3.4.3 van de aanvankelijk geactiveerde T-cellen met nieuwe media in een verhouding van 1:1 als de media uitgeput lijken.
  6. Dag 6: Cellen wassen en uitbreiden
    1. Cellen wassen met PBS Ca+/Mg+. en breng ze over naar een nieuwe kweekplaat met 130 E/ml muis IL2 en 10 ng/ml muis IL7. Incubeer de cellen gedurende ten minste 2 dagen of totdat ze het gewenste expansieniveau bereiken, op basis van het aantal cellen dat nodig is voor injectie.
  7. Dag 8: Oogst en zuivering
    1. Oogst cellen en zuiveren met een histopake dichtheidsgradiënt van 1.077.
      OPMERKING: Deze techniek helpt bij het isoleren van levensvatbare cellen (zoals lymfocyten of andere immuuncellen) uit dode cellen of puin. Dode cellen, die een hogere dichtheid hebben, zullen zich op de bodem van de buis nestelen, terwijl levensvatbare cellen doorgaans in de interfacelaag blijven.
    2. Voeg 5 ml Histopaque 1.077 toe aan een tube van 15 ml. Oogst de cellen door ze 5 minuten bij 450 x g bij 4 °C te centrifugeren om de cellen te pelleteren.
    3. Resuspendeer de celpellet in 5 ml PBS Ca+/Mg+. Breng de celsuspensie voorzichtig aan op 5 ml Histopaque 1.077 in de centrifugebuis.
    4. Centrifugeer bij 400-500 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en zorg ervoor dat de onderbreking/versnelling van de centrifuge op nul staat.
    5. Na centrifugatie zullen cellen zich scheiden in verschillende lagen op basis van dichtheid. De gewenste cellen bevinden zich meestal op de interfacelaag tussen het histopaak en het bovenste medium, terwijl dode cellen zich onderaan nestelen. Verzamel de cellaag voorzichtig op de interfacelaag met behulp van een pipet en vermijd besmetting met andere lagen. De verzamelde cellen zijn nu klaar en schoon voor injecties.
    6. Beoordeel de transductie-efficiëntie door Thy1.1-kleuring en flowcytometrie-analyse uit te voeren. Zie de poortstrategie in figuur 1.
      OPMERKING: Na transductie kunnen cellen worden gebruikt in chemotaxistesten om hun migratie naar specifieke chemokines te beoordelen in vergelijking met controlevectorcellen om hun activiteit in vitro functioneel te bevestigen voordat wordt doorgegaan met injecties.
  8. In-vivo-lokalisatietest op lange termijn
    1. Gebruik voor langdurige homing CD45.1 voor de GPCR van de muis die van belang is en CD45.2 voor lege vector (of vice versa) getransduceerde cellen. Meng de twee celpopulaties in een verhouding van 1:1.
    2. Injecteer intraveneus 20-30 x 106 cellen in totaal voor elke Rag1-/- volwassen ontvangende muis gedurende 1 week tropisme en 5 x 106 voor 7 weken lang tropisme. We gebruiken lymfocytendeficiënte Rag1-/- ontvangers om de concurrentie met endogene T-cellen te verminderen.
    3. Injecteer na 1 tot 7 weken (afhankelijk van het onderzoek) 5 minuten voor de oogst intraveneus (i.v.) anti-CD45-antilichaam in de muizen om door bloed overgedragen cellen te labelen.
    4. Euthanaseer de muizen met behulp van CO2 -inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie.
      OPMERKING: Er zijn onderzoeken van 1 week en 7 weken uitgevoerd; Langere studies zijn misschien mogelijk, maar moeten nog worden getest.
    5. Oogst cellen van verschillende organen van belang en controles. Verteer de weefsels volgens de standaard protocollen voor de bereiding van lymfocyten voor elk orgaan 10,11.
    6. Kleur de verzamelde cellen met monoklonale antilichamen (mAbs) voor flowcytometrische analyse.
  9. Competitieve homing op korte termijn: positionering en beeldvorming van T-cellen
    1. We raden aan om C57B6/J-muizen als donoren te gebruiken, aangezien we de cellen fluorescerend zullen labelen. Voor zeer korte homing-tests tot enkele uren kan echter elke stam worden gebruikt.
    2. Isoleer op dag 8 van de kweek magnetisch getransduceerde (Thy1.1+) cellen met behulp van CD90.1-microbeads, volgens de instructies van de fabrikant12.
    3. Houd na dit punt gedurende 2 dagen alleen getransduceerde cellen (>95% zuiverheid) in cultuur onder IL2 en IL7 zoals hierboven aangegeven en laat uitbreiden. De microbeads zijn biologisch afbreekbaar en zullen na 48 uur de normale celfunctie niet aantasten.
    4. Label op dag 11 de cellen die de GPCR van belang tot expressie brengen met carboxyfluoresceïne-succinimidylester (CFSE is een fluorescerende kleurstof voor celkleuring). Gebruik voor Stuffer-cellen een gele fluorescerende kleurstof, of vice versa. U kunt desgewenst alternatieve kleurstoffen gebruiken.
      1. Bereid een celsuspensie aan in een concentratie van 1 x 106 cellen/ml in RPMI met 2% FBS. Incubeer de cellen met de kleurstof in een eindconcentratie van 5 μM bij 37 °C in een waterbad met zacht roeren gedurende 20 minuten. Om vergelijkbare resultaten te garanderen, wisselt u de kleurstoftoewijzingen af in afzonderlijke experimenten. U kunt ook een enkele kleurstof gebruiken om een gemeenschappelijk celtype als interne standaard te labelen, inclusief experimentele en controlecellen in verschillende ontvangers.
      2. Was de gelabelde cellen en meng ze in een verhouding van 1:1. Schat de celconcentratie met behulp van een cellenteller. Injecteer 15-30 x 106 cellen intraveneus in ontvangende muizen (WT of transgene ontvangende muizen, afhankelijk van het doel van het experiment).
    5. Injecteer de muizen ongeveer 10-12 uur later met anti-CD31 (bijv. DyLight 633 gelabeld, kloon 390) antilichaam, dat 10-15 minuten voor het offeren moet zijn om bloedvaten af te bakenen en intravasculaire van geëxtravaseerde cellen te onderscheiden.
    6. Euthanaseer de muizen met behulp van CO2 -inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie. Analyseer cellokalisatie door FACS van celsuspensies zoals beschreven in stap 3.8 hierboven of door weefsels in zijn geheel in beeld te brengen zoals in stap 3.9.8 of stap 3.9.7 voor interessante organen met behulp van confocale microscopie.
    7. Voor dunne organen zoals de luchtpijp, baarmoederhoorn of lymfeklieren, bereid squashbevestigingen voor. Plaats de tissue op een dia met dubbelzijdige tape aan de zijkanten, voeg een paar druppels Fluoromount-G-montageoplossing toe, dek af met een dekglaasje en druk voorzichtig en gelijkmatig om het dekglaasje op de tape te bevestigen met behulp van een apart glaasje of een ander plat voorwerp.
    8. Voor bevroren secties moet het weefsel worden ingebed in de compound met optimale snijtemperatuur (OCT). Voor longen, perfuseer met 50% OCT/PBS voordat u het inbedt.
    9. Gebruik flowcytometrie voor controleorganen zoals perifere lymfeklieren (PLN), milt of bloed om de transductie-efficiëntie (% Thy1,1+) te beoordelen, zoals weergegeven in figuur 1 , en normaliseer de resultaten. Visualiseer PLN met squashbevestigingen of -secties met behulp van confocale microscopie. Tel cellen met behulp van confocale microscopie met Imaris software.
    10. Bepaal de verhouding van GPCR-getransduceerde cellen tot controlecellen (Stuffer-getransduceerde) cellen in hele organen of specifieke orgaancompartimenten. Normaliseren naar inputratio's bepaald door FACS en/of naar de ratio hersteld van controleorganen waarvan de GPCR bekend is of waarvan wordt aangenomen dat deze niet relevant is.
    11. Voor de analyse van de lokalisatie van de micro-omgeving in de longen, meet u de afstand van cellen tot histologische oriëntatiepunten (bijv. bronchiale basaalmembranen of aders) met behulp van Imaris-software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In deze studie presenteren we een gedetailleerd protocol voor het onderzoeken van het vermogen van specifieke receptoren om T-cellokalisatie in vivo te sturen. Als demonstratie van dit protocol hebben we GPR2513 gebruikt. Met dit protocol zijn we in staat om een transductie-efficiëntie van 30%-40% te bereiken, zoals beoordeeld door Thy1.1-kleuring door flowcytometrie. We voerden in vitro transwell-gebaseerde chemotaxis-assays uit met behulp van GPR25-getr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De intern gecontroleerde homing-test die in deze studie wordt beschreven, is een uitgebreide methode voor het onderzoeken van GPCR-gemedieerd T-celtransport en -positionering binnen diverse organen en weefselmicro-omgevingen. Deze aanpak integreert verschillende cruciale optimalisaties om de reproduceerbaarheid, nauwkeurigheid en efficiëntie te verbeteren.

Een cruciaal aspect van dit protocol is de efficiënte transductie van T-cellen met behulp van MSCV retrov...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Ondersteund door NIH-subsidies R01 AI178113 en R01 AI047822, Grant 1903-03787 van The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust en Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) subsidies T31IP1880 en T33IR6609 aan E.C.B.; Y.B. werd ondersteund door een Research Fellows Award van de Crohn's and Colitis Foundation of America (835171). B.O. werd ondersteund door een postdoctorale fellowship van de Ramon Areces Foundation (Madrid, Spanje) en een Research Fellows Award van de Crohn's and Colitis Foundation of America (574148). AA werd ondersteund door het California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) - EDUC2-12677.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AF647 anti mouse CD90.1-Thy1.1 (OX-7)Biolegend 202507
anti-CD31 (DyLight 633, clone 390)InvivoMab BE0377
anti-mouse CD28 37.51eBiosciences 
anti-mouse CD3 145-2c11eBiosciences 
APCCy7 anti mouse CD3 (145-2c11)Biolegend 100329
BV421 anti mouse CD8b (Ly-3)Biolegend 126629
BV711 anti mouse CD4 (RM4-5) Biolegend 100549
CD90.1 microbeads Miltenyi 130-121-273
CFSE Thermoscientific C34554
FITC anti mouse CD45.2 (104)BDAB_395041
mouse IL2 Peprotech 200-02-50UG
mouse IL7 Peprotech  217-17-10UG
Mouse T CD4 isolation kit STEMCELL technologies 18000
MSCV-IRES- Thy1.1 GPR25Vectorbuilder 
MSCV-IRES- Thy1.1 StufferVectorbuilder 
PE-CD45 (30-F11) antibody Biolegend 103105
PECy7 anti mouse TCRb (H57-597)Tonbo
PercpCy5.5 anti mouse CD45.1 (A20)eBiosciences 
Platinum-E (Plat-E) cell Biolabs. Inc RV-101
Yellow fluorescent dye Thermoscientific 

Referenties

  1. Cheng, L., et al. Structure, function and drug discovery of GPCR signaling. MolBiomed. 4 (1), 46(2023).
  2. Lammermann, T., Kastenmuller, W. Concepts of GPCR-controlled navigation in the immune system. Immunol Rev. 289 (1), 205-231 (2019).
  3. Fu, H., Ward, E. J., Marelli-Berg, F. M. Mechanisms of t cell organotropism. Cell Mol Life Sci. 73 (16), 3009-3033 (2016).
  4. Cinalli, R. M., et al. T cell homeostasis requires g protein-coupled receptor-mediated access to trophic signals that promote growth and inhibit chemotaxis. Eur J Immunol. 35 (3), 786-795 (2005).
  5. Wu, V., et al. Illuminating the onco-GPCRome: Novel g protein-coupled receptor-driven oncocrine networks and targets for cancer immunotherapy. J Biol Chem. 294 (29), 11062-11086 (2019).
  6. Wu, V. H., et al. The GPCR-alpha(s)-pka signaling axis promotes T-cell dysfunction and cancer immunotherapy failure. Nat Immunol. 24 (8), 1318-1330 (2023).
  7. Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Stable gammaretroviral vector expression during embryonic stem cell-derived in vitro hematopoietic development. Mol Ther. 14 (2), 245-254 (2006).
  8. Plat-E retroviral packaging cells (RV-101) user manual. , Cell Biolabs. https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/RV-101-plat-e-retroviral-packaging-cells.pdf (2024).
  9. Anderson, J., Hope, T. Intracellular trafficking of retroviral vectors: obstacles and advances. Gene Ther. 12, 1667-1678 (2005).
  10. Kim, E., et al. Isolation and analyses of lamina propria lymphocytes from mouse intestines. STAR Protoc. 3 (2), 101366(2022).
  11. Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
  12. Miltenyi Biotec. CD90.1 MicroBeads mouse and rat. , https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_3ea1u0fdf5423ci3qg8mc8rl4c?content-disposition=inline accessed (2024).
  13. Ocón, B., et al. A lymphocyte chemoaffinity axis for lung, non-intestinal mucosae and CNS. Nature. 635, 736-745 (2024).
  14. Sumida, H., et al. Gpr55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), eaao1135(2017).
  15. Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J. Cell Biol. 139 (5), 1349-1360 (1997).
  16. Alawar, N., et al. A solution for highly efficient electroporation of primary cytotoxic T lymphocytes. BMC Biotechnol. 24 (1), 16(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

GPCR gemedieerde lokalisatieT celtraffickingflowcytometrieconfocale microscopiestamcelviruscelpositioneringimmuuncelmigratie

Gerelateerde artikelen