Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Stabiele isotoop in-vivo labeling voor massaspectrometrie-identificatie van vaderlijke metabolieten die tijdens de bevruchting van sperma naar eicel worden overgebracht

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67765

⸱

17 juni 2025

 ,  ,  ,  , 
1Biogem Scarl, Institute of Molecular Biology and Genetics Research, 2Department of Experimental Medicine, University della Campania Luigi Vanvitelli, 3Department of Biology, University of Naples "Federico II ", 4Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Salerno, 5Department of Pharmacy, University of Naples "Federico II "

In dit artikel

Samenvatting

Deze procedure heeft tot doel metabolieten te identificeren die tijdens de bevruchting van sperma naar eicellen worden overgebracht door gebruik te maken van stabiele isotopenlabeling met 2H2O of U13C glucose gevolgd door metabolomische analyse. Stieren met een deuteriumlabel worden gedekt door niet-gelabelde moederdieren. Verzamelde pre-implantatie-embryo's worden geanalyseerd door middel van massaspectrometrie om vaderlijke (gedeutereerde) metabolieten te sorteren van maternale (niet-gedeutereerde) metabolieten.

Samenvatting

De bijdrage van de vader aan de embryogenetica is tot nu toe decennialang beperkt gebleven tot allelische sequenties. Een decennium aan resultaten suggereert in plaats daarvan dat epigenetische factoren - DNA-methylering, histonmodificaties, chromosomale organisatie en regulerende RNA's - een cruciale rol spelen bij de overerving van de vader en de embryonale ontwikkeling en zygote genexpressie beïnvloeden. Samen met nucleïnezuren kan het metaboloom van sperma (lipiden, koolhydraten, vrije aminozuren) fungeren als epigenetisch signaal. Dit protocol heeft tot doel metabolieten die van sperma naar eicel zijn overgebracht, te identificeren door middel van massaspectrometrie. De procedure omvat stabiele isotopenlabeling van zaadcellen met 2H2O of U13C glucose om, door metabolomics, paternale metabolieten te traceren die tijdens de bevruchting naar de eicel zijn overgebracht. Het algemene doel van het protocol is om de rol van het metaboloom van het sperma van de vader in de gevoeligheid van het nageslacht voor dysmetabolisme te onthullen, en het kan worden aangepast om inzicht te geven in hoe omgevingsomstandigheden, zoals voeding en blootstelling aan verontreinigende stoffen, de metabole boodschappen van het vaderland veranderen, wat mogelijk van invloed is op de gezondheid van het nageslacht en de aanleg voor diabetes, obesitas en hart- en vaatziekten.

Inleiding

Vaderlijk epigenoom beïnvloedt de gevoeligheid van nakomelingen voor dysmetabolisme
Anders dan de overvloed aan pre- en postconceptierollen die door moeders tijdens de embryonale ontwikkeling worden benut, wordt al tientallen jaren gedacht dat de bijdrage van zaadcellen uitsluitend genetisch is. Volgens de genetische overervingstheorie moest de bijdrage van de vader aan de fenotypische variabiliteit van een individu (inclusief zijn vatbaarheid voor ziekten) uitsluitend worden toegeschreven aan de genetische sequentie van vaderlijk overgeërfde allelische varianten en aan hun interacties met de door de moeder overgeërfdevarianten. Tegenwoordig is het duidelijk dat allelen niet de enige genetische boodschappen zijn die door de vader aan zijn nakomelingen worden doorgegeven tijdens de bevruchting en dat in plaats daarvan een veelheid aan epigenetische signalen bijdraagt aan de vaderlijke overerving 2,3,4. Epigenetische signalen die tot nu toe zijn geïdentificeerd, zijn onder meer: (1) methylgroepen die covalent zijn toegevoegd aan cytosines van het ouderlijk genoom 5,6,7, (2) posttranslationele modificaties (acetylering, methylering) van histonen geassocieerd met spermachromosomen en afgeleverd aan de eicellen8, (3) de 3D-organisatie van vaderlijke chromosomen die leiden tot intrachromosomale interactie (ook bekend als topologisch associatiedomeinen, TAD) die aanhoudt in de zygote9,10, en (4) regulerende RNA-moleculen (miRNA's, tRNA-afgeleide fragmenten en piwi-interagerende RNA's)11,12 evenals rRNA's13 en tRNA's14 die tijdens de bevruchting uit sperma in de eicel worden vrijgegeven.

Het vaderlijke epigenoom is een belangrijk informatiemiddel voor het nageslacht. Vaderlijke informatie zal van invloed zijn op de zygote, het embryo tijdens zijn ontwikkeling en, na de geboorte, de neiging van het nageslacht tot dysmetabolisme en ziekten. Deze niet-Mendeliaanse erfenis (aangeduid als intergenerationeel of transgenerationeel, afhankelijk van of het één of meerdere opeenvolgende generaties treft), wordt door veel auteurs beschouwd als een van de undercover bijdragende factoren die verantwoordelijk zijn voor de drastische toename van dysmetabole ziekten die zich voordoen in ontwikkelde westerse landen15. Volgens de PoHaD (Paternal Origin of Health and Disease) en DoHaD (Developmental Origin of Health and Disease) theorieën is de epigenetische bijdrage van de ouders inderdaad een van de factoren die nakomelingen vatbaar maken voor het ontwikkelen van diabetes, obesitas en hart- en vaatziekten op volwassen leeftijd16,17. Interessant is dat het epigenoom van de ouders uitzonderlijk gevoelig is voor prikkels uit de omgeving en kan worden beïnvloed door metabole omstandigheden (zoals drugsgebruik, voedingsgewoonten en metabole fitheid)18 en door strikt omgevingsparameters (zoals blootstelling aan verontreinigende stoffen, sociale relaties en mentale en relationele stress)5,11. Elk van de bovengenoemde stimuli kan dus het epigenomen van kiemcellen (sperma en eicellen) veranderen en toekomstige generaties beïnvloeden.

De consumptie van een vetrijk dieet (HFD) is een van de meest uitgebreid bestudeerde omgevingsstimuli die in staat zijn om het epigenoom van de vader te veranderen en te leiden tot schadelijke berichten die aan het nageslacht worden afgeleverd19. Deze stimulus beïnvloedt het fenotype van het nageslacht (tot de derde generatie), die vaak een grotere neiging vertonen om dysmetabolisme te ontwikkelen, ongeacht hun calorie-inname. Nakomelingen van vader die HFD gebruikt, vertonen groeiachterstand, glucose-intolerantie en insulineresistentie bij zowel muizen als ratten20,21. Bij mensen is epigenetische overerving voornamelijk bestudeerd in generaties geboren tijdens en onmiddellijk na perioden van hongersnood of overvoeding22. In het Överkalix-cohort was de beschikbaarheid van voedsel van grootouders van vaderskant tijdens hun langzame groeiperiode gecorreleerd met het totale sterfterisico, hart- en vaatziekten, BMI, middelomtrek en vetmassa van hun kleinkinderen23. Onlangs is bewijs van intergenerationele overdracht van vaders bevestigd in andere cohorten24.

Paternale metabolieten die betrokken zijn bij intergenerationele overerving
Ondanks klinisch en epidemiologisch bewijs blijven de moleculaire details van vaderlijke intergenerationele overerving onduidelijk. In eerste instantie moet de identificatie van alle moleculaire transducers van epigenetische informatie nog worden voltooid. Wetenschappelijk bewijs suggereert dat de nucleïnecomponent van spermatozoa op zichzelf de complexiteit van de intergenerationele overerving niet kan verklaren. Variaties in DNA-methylatie zijn inderdaad gemeten in de spermatozoa van muizen en ratten die HFD kregen, maar in zo'n laag percentage van de spermapopulatie dat dit de hoge penetrantie van het dysmetabole fenotype die bij de nakomelingen werd waargenomen niet kan verklaren25. Aan de andere kant heeft de pool van signaal-RNA's die van sperma naar eicellen worden overgebracht een zeer korte halfwaardetijd en, hoewel in staat om zygote genexpressie te beïnvloeden, lijkt het onwaarschijnlijk dat deze na de bevruchting op effectieve concentraties wordt gehandhaafd, in de zygote in embryo's van dag 2, dag 3, in morulae en in blastocysten. Het lijkt dus duidelijk dat nieuwe moleculaire determinanten betrokken moeten zijn bij het intergenerationele overervingsmechanisme.

Samen met nucleïnezuren draagt het sperma ook metabolomische componenten bij aan de zygote, zoals lipiden, koolhydraten en aminozuren 26,27,28,29. Deze metabolieten, met name die welke begiftigd zijn met modulerende activiteiten, kunnen zygote genexpressie en embryonale ontwikkeling beïnvloeden en kunnen dus fungeren als epigenetische signalen30. Bovendien kan, net als bij nucleïnezuren, de concentratie en de relatieve overvloed van deze metabolieten in sperma worden beïnvloed door omgevingsomstandigheden die de vader ervaart en dus voertuigen van informatie voor het nageslacht vertegenwoordigen 28,30,31,32,33,34 . Het is inderdaad aangetoond dat het spermametaboloom van rijpe spermatozoa afhankelijk is van de gezondheidstoestand van de vader en wordt beïnvloed door omgevingsfactoren zoals voeding, lichaamsbeweging, giftige stoffen en hormoonontregelaars.

Het begrijpen van de rol van spermametabolieten in de embryonale ontwikkeling wordt bemoeilijkt door verschillende technische beperkingen: (1) het verschil in grootte tussen het sperma en de eicel, wat resulteert in een minimale bijdrage van het sperma aan de metabolische massa voor de zygote, en (2) de verschillende metabolomische variaties die het sperma ondergaat tijdens de productiestadia (spermatogenese), epididymale rijping, ejaculatie en fusie met de eicel.

Fluctuatie van het spermametaboloom tijdens de rijping van het sperma
Bij zoogdieren worden spermatozoa in de testis geproduceerd door middel van spermatogenese, een spermatogoniaal stamcelafhankelijk proces waarbij toegewijde spermatogonia zich ontwikkelen tot primaire spermatocyten die meiose ingaan en ronde haploïde spermatiden produceren. Morfogenese van deze cellen tot spermatozoa vindt plaats door spermiogenese, een enorme morfo-functionele remodellering van spermatiden, van ronde cellen tot langwerpige/gecondenseerde/zeer gespecialiseerde cellen, overeenkomend met de laatste fase van spermatogenese. De resulterende spermatozoa zijn echter onbeweeglijk en nog niet in staat tot bevruchting35. Na spermiatie, wanneer spermatozoa uit de rete testis in de bijbal worden vrijgegeven, interageren zaadcellen met epitheliale epididymale cellen en verbinden ze zich met eiwitten en exosomale blaasjes die door deze cellen worden uitgescheiden (epididysomen, rijk aan sfingomyeline en arachidonzuur). Passage door de bijbal stelt het sperma in staat om volledig rijp te zijn en, zelfs als het in een pre-capacitieve toestand wordt gehouden, verwerven ze competentie voor beweeglijkheid36. Tijdens de epididymale transit wordt het spermamembraan negatiever geladen en verrijkt met sfingomyeline. Het spermamembraan wordt ook vloeibaarder door een progressieve verlaging van cholesterol en een gelijktijdige toename van meervoudig onverzadigde vetzuren (voornamelijk arachidonzuur, docosapentaeenzuur en docosahexaeenzuur). Na de ejaculatie in het vrouwelijk geslachtsorgaan bevorderen zaadvloeistofeiwitten en albumine de capaciteit van het sperma door hyperpolarisatie en calciuminstroom te bevorderen om de beweeglijkheid van het sperma te activeren. Het plasmamembraan van gecapaciteerd sperma vertoont een verder verhoogde vloeibaarheid, een lage cholesterol-tot-fosfolipideverhouding en een verlaagd gehalte aan siaalzuur, GM1-ganglioside en triglyceriden31,37.

Voordat het de eicel tegenkomt, ondergaat het sperma de acrosoomreactie, een fusie van het acrosoom (een van Golgi afgeleid vliezig organel dat het voorste deel van de spermakern bedekt en wordt gevormd tijdens spermiogense) met het plasmamembraan van het sperma, dat de reorganisatie van het plasmamembraan van het sperma vergemakkelijkt en het vermogen om door te dringen in de zona pellucida (ZP), een matrix van glycoproteïnen rond de eicel35, 38. okt. Als laatste stap resulteert hemifusie tussen het sperma- en eicelmembraan, bevorderd door sperma-eiwitten IZUMO1, SPACA6 en TMEM9539, in de opname van spermalipiden in de eicelmembranen en de overdracht van de nucleïne- en metabolische inhoud naar de eicel.

Grondgedachte van de procedure
Het doel van deze procedure is het identificeren van metabolieten die door het sperma worden getransporteerd en bij de bevruchting in de eicel worden overgebracht (Figuur 1). Om onderscheid te maken tussen metabolieten afkomstig van sperma en eicellen in de zygote, worden spermacellen gelabeld met deuterium (2H, een waterstofisotoop) of 13C (een koolstofisotoop) met behulp van in vivo metabole etikettering met deuteriumoxide, 2H2O40, of uniform gelabeld U13C Glucose41. Isotoop-gelabelde mannelijke muizen worden vervolgens gepaard met niet-gelabelde vrouwtjes om uiteindelijk zygoten, morulae en blastocysten te verzamelen. Embryo's in een vroeg stadium worden verwerkt om (1) polaire, (2) niet-polaire metabolieten en (3) sterolen te extraheren. Metabolomen worden vervolgens geanalyseerd met behulp van massaspectrometrietechnieken. Isotopisch gelabelde (vaderlijke) metabolieten zullen worden geïdentificeerd en onderscheiden van niet-gelabelde (maternale metabolieten), waarbij hun vaderlijke oorsprong ondubbelzinnig wordt aangetoond.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Napels Federico II, Italië. De reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Selectie en groepering van C57BL/6J mannetjes

  1. Selecteer C57BL/6J mannetjes van ongeveer 12 weken.
  2. Verdeel mannetjes in twee groepen en noem ze LABELED (die een stabiele isotopenlabeling ondergaan) of UNLABELED (gebruikt als controle en voor het meten van de werkzaamheid van isotopenlabeling in zaadcellen en morulae).
  3. Om de bijbal te legen van niet-gelabelde zaadcellen, laat de mannetjes paren met gepaarde vrouwtjes.

2. Stabiele isotopenlabeling van C57BL/6J mannetjes

  1. Als u 2H2O gebruikt voor in-vivo etikettering, bereid dan 10% v/v 2H2O -verrijkt water voor gebruik als drinkwater door 100 ml 2H2O te mengen met 900 ml kraanwater. Als uU 13C-glucose gebruikt voor in-vivo-etikettering , bereid dan 5%-15% U13C-glucosewater voor gebruik als drinkwater door 50-150 g U13C-glucose op te lossen in 1 l kraanwater;
    LET OP: Langdurige consumptie van 2H2O is giftig voor muizen. Stel voor elke specifieke muizenstam de maximale hoeveelheid van 2H2O in om toe te voegen aan drinkwater om maximale etiketteringsefficiëntie en minimale bijwerkingen te bereiken. Langdurige consumptie van glucose veroorzaakt hyperglykemie en diabetes bij muizen. Stel de maximale hoeveelheid U13C-glucose in die aan drinkwater moet worden toegevoegd om een maximale etiketteringsefficiëntie en minimale bijwerkingen te bereiken.
  2. Vervang de waterflessen door flessen met isotoop-gelabeld drinkwater en laat muizen het 2,5-5 weken drinken (met ten minste de helft van de spermatogenese), waarbij u de vloeistof twee keer per week ververst.
  3. Laat aan het einde van de behandelingsperiode de gelabelde mannetjes paren met superovulerende vrouwtjes.

3. Superovulatie van C57BL/6J vrouwtjes

  1. Selecteer vrouwtjes van ongeveer 4 weken met een gewicht tussen 12,5-14 g, in de prepuberale leeftijd.
  2. Induceer de follikelrijping door intraperitoneale injectie van 5 IE/50 μL/muis PMSG (serum van drachtige merries).
  3. Injecteer na 47 uur intraperitoneaal luteïniserend hormoon HCG (humaan choriongonadotrofine, 5 IE/50 μl/muis) om de voltooiing van de rijping van de follikel te bevorderen en de eisprong en de vorming van het corpus luteum te induceren.
  4. Laat de vrouwtjes na de HCG-injectie paren met GELABELDE en NIET-gelabelde muizen, volgens stap 1 van figuur 1.
  5. Voer na het paren de vaginale plugcontroleuit 42. Scheid de positieve vrouwtjes en kooi ze.

4. Pre-implantatie embryoverzameling door spoelen

  1. Offer vaginale plug-positieve vrouwtjes op volgens institutioneel goedgekeurde protocollen (2,5 dag na Coitum om morulae te verzamelen).
  2. Leg de dieren in ruglighouding op de tafel; Maak de buik nat met 70% ethanol en voer een brede laparotomie uit.
  3. Verwijder de baarmoeder aan één kant door in de baarmoederhals te knijpen en aan het caudale uiteinde van de baarmoederhals te snijden; aan de andere kant, door aan het einde van de baarmoederhoorn te snijden (infundibulair gedeelte).
  4. Plaats de baarmoeder in de petrischaal met PBS om ze af te spoelen en breng ze vervolgens over naar een andere schone petrischaal om de aanwezigheid van resten te voorkomen.
  5. Om de baarmoeder te spoelen, vult u een spuit van 2,5 ml met het kweekmedium en bevestigt u deze aan een Hamilton-naald met stompe punt van 33 G.
  6. Steek de naald in het infundibulum van de eileider, bereid zoals hierboven beschreven en was de hele baarmoeder.
  7. Verzamel de morulae in een druppel kweekmedium om ze te wassen van eventueel achtergebleven slijmvliezen en bloed.
  8. Breng verzamelde monsters over in nieuwe verzamelbuisjes en groepeer ze in LABELED MORULAE en UNLABELED MORULAE, afhankelijk van of ze afkomstig zijn van paringsgebeurtenissen waarbij GELABELDE of NIET-GELABELDE stieren betrokken zijn. Vries de monsters in vloeibare stikstof in.
  9. Offer een groep ongepaarde superovulated vrouwtjes (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) om onbevruchte eicellen te verzamelen. Breng de verzamelde monsters over naar nieuwe verzamelbuisjes en label ze als NIET-GELABELDE EICYTEN. Vries de monsters in vloeibare stikstof in.

5. Spermaverzameling van epididymale cauda

  1. Sacrifice GELABELDE of NIET-gelabelde stieren.
  2. Leg de dieren in rugligging op de tafel, maak de buik nat met 70% ethanol en voer een brede laparotomie uit.
  3. Verwijder de bijbal en dompel ze onmiddellijk onder in 3 ml PBS (pH 7,6) en snijd ze losjes om het sperma uit de kanalen te laten lopen.
  4. Filter de spermamonsters door de kaasdoek.
  5. Centrifugeer de zaadcellen op 800 x g gedurende 10 minuten (bij kamertemperatuur).
  6. Resuspendeer de pellet in 1 ml koud gedeïoniseerd water. Alleen zaadcellen zullen de hypotone oplossing weerstaan, terwijl niet-zaadcellen zullen barsten.
  7. Centrifugeer de zaadcellen bij 800 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Label de buisjes en groepeer ze als GELABELD SPERMA en NIET-GELABELD SPERMA, afhankelijk van of ze zijn verzameld van GELABELDE of NIET-GELABELDE stieren.
  9. Vries de monsters snel in vloeibare stikstof in en bewaar de monsters bij -80 °C.

6. Extractie van lipiden en polaire metabolieten

  1. Breng het monster uit de stappen 1-5 in evenwicht bij 4° C op ijs.
  2. Voeg 225 μL ijskoude methanol (MeOH) toe aan de monsters en incubeer gedurende 1 minuut bij -30 °C en zet ze daarna 10 minuten in een sonisch bad.
    1. Optioneel: voeg bij het instellen van de experimentele conditie 0,1-2 ppm van zowel C16-Ceramide-13 C3-15 N als L-Lysine-ε-15N hydrochloride toe als interne standaarden om de efficiëntie van extractie voor respectievelijk apolaire en polaire metabolieten te meten.
  3. Voeg 750 μL ijskoude methyl-tert-butylether (MTBE) toe in een thermomixer gedurende 1 uur bij 4 °C (550 rpm).
  4. Voeg 188 μL H2O toe aan de monsters nadat u ze hebt gecentrifugeerd. Scheid de bovenste fasen (lipiden) van de onderste fase (polaire metabolieten) en droog ze.
    LET OP: MeOH veroorzaakt blindheid en schade aan de lever, nieren en hart bij inslikken. Overmatige blootstelling heeft een accumulatief effect op het centrale zenuwstelsel. MTBE kan huid-, oog- en ademhalingsirritatie veroorzaken. Werk onder een zuurkast.
  5. Droog het monster met behulp van een vacuümconcentrator. Bewaar gedroogde monsters bij -80 °C tot massa-/spectrometrieanalyse.
    OPMERKING: Gedroogde monsters kunnen maximaal 6 maanden bij -80 °C worden bewaard, in afwachting van massa-/spectrometrieanalyse. Voor de identificatie van metabolieten die minder vertegenwoordigd zijn in pre-implantatie-embryo's, kan het nodig zijn om monsters te verzamelen die zijn verkregen van hetzelfde paringspaar en dezelfde paringsgebeurtenis.

7. Extractie van sterolen

OPMERKING: Vermijd het gebruik van plastic buizen en tips [deze worden opgelost door het niet-polaire organische oplosmiddel]; Gebruik in plaats daarvan glazen buisjes en glazen pasteurpipetten om vloeistoffen af te geven.

  1. Breng het monster uit de stappen 1-5 in evenwicht bij 4 °C op ijs. Resuspendeer de verzamelde monsters in 500 μl van een oplossing van methanol/H20 70% v/v en breng de suspensie over in een glazen buis.
    1. Homogeniseren door 30 s te vortexen. Laat het homogenaat 16 uur bij 4 °C staan.
    2. Optioneel: voeg bij het instellen van de experimentele conditie 0,1-2 ppm van het plantensterol Sitostanol-5,6,22,23-d4 toe als interne standaarden om de efficiëntie van de extractie voor sterolen te meten.
      LET OP: MeOH veroorzaakt blindheid en schade aan de lever, nieren en hart bij inslikken. Overmatige blootstelling heeft een accumulatief effect op het centrale zenuwstelsel.
  2. Centrifugeer het monster bij 3.220 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Breng het bovenstaande over in een schone glazen buis en vul deze aan met 500 μL PBS.
  3. Voeg 7 ml ijskoude diethylether en vortex toe gedurende 1 min. Laat het monster 1-2 minuten staan en wacht op de fasescheiding. Bevries door de buis onder te dompelen in een droogijs/acetonbad. Breng de niet-bevroren diethyletherfase over in een nieuw geëtiketteerde glazen buis.
    LET OP: Diethylether is een uiterst ontvlambare vloeistof en damp en ontleedt tot explosieve peroxiden in lucht en licht. Werk niet in nauw contact met vlammen. Diethylether is gevaarlijk bij inslikken en schadelijk voor de huid.
  4. Ontdooi de waterfase bij 37 °C en herhaal stap 4.3. Combineer de diethyletherfasen die in de stappen 4.3-4.4 zijn verzameld in een enkele glazen buis.
  5. Droog het monster met behulp van een vacuümconcentrator. Bewaar gedroogde monsters bij -80° C tot massa-/spectrometrieanalyse.

8. Monster derivatisering

OPMERKING: Monsters zouden baat hebben bij TMS-derivatisering voor de analyse van specifieke metabolieten (cholesterol, vetzuren, aminozuren).

  1. Breng de monsters in evenwicht bij kamertemperatuur
    LET OP: Onvolledige evenwicht kan condensatie van atmosferisch water op buiswanden en monsters veroorzaken. Water concurreert sterk om TMS-derivatisering.
  2. Solubiliseer de monsters in 50 μL pyridine en derivatiseer ze door 25 μL N,O-Bis(trimethylsilyl(TMS)trifluoroacetamide (BSTFA) toe te voegen. Incubeer de monsters gedurende 90 minuten bij 60 °C. Draai de monsters rond en ga onmiddellijk verder met GC-MS-analyse.
    LET OP: Pyridine is ontvlambaar, irriterend en giftig. BSTFA is ontvlambaar, bijtend en irriterend. Werk onder een zuurkast en gebruik beschermende handschoenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de overdracht van metabolieten van sperma naar eicel te monitoren, worden morulae geïsoleerd uit C57 BL/6J-vrouwtjes die zijn gedekt met stieren uit LABELED- en UNLABELED-groepen verzameld en geanalyseerd door op massaspectrometrie gebaseerde metabolomics. Metabolieten werden geëxtraheerd zoals beschreven in stap 6-7 en gederivatiseerd met TMS zoals beschreven in stap 8. Metabolomische en lipidomische profilering van GELABELDE morulae, NIET-GELABELDE morulae, NIET-GELABELDE eicellen, ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het beschreven protocol maakt de identificatie mogelijk van metabolieten die tijdens de bevruchting van sperma naar eicellen worden overgedragen door gebruik te maken van stabiele isotopenlabeling van mannelijke muizen met 2H2O of U13C glucose gevolgd door metabolomische analyse. Isotopisch gelabelde metabolieten die in morulae worden aangetroffen, zijn van vaderlijke oorsprong.

Hoewel waterstof en deuterium isotopen zijn, zijn...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2H2O gefilterd, 99,8 atoom % 2HSigma Aldrich756822
AcetonSigma Aldrich179124
Agilent  SIL-8Agilent (Santa Clara, CA, U.S.A.)
C16-Ceramide-13C3-15NLGC standardTRC-C342770-25MG
dichloormethaanSigma Aldrich34856
Diethylether Sigma Aldrich673811
ethanolSigma Aldrich1,11,727
HCG (Human chorionic gonadotropin,Sigma AldrichCG5-1VL
L-Lysine-ε-15N hydrochlorideSigma Aldrich608971
Mannelijke en vrouwelijke  C57BL/6JOlaHsd muizenInotiv C57BL/6JOlaHsd
methyl tert-butylether (MTBE)Sigma Aldrich306975
MetOHSigma Aldrich1,06,035
N,O-Bis(trimethylsilyl(TMS)
trifluoraceetamide (BSTFA)		Supelco15238
PBSApplichemA0965-9010
PMSG (Pregnant mare’s serum)Lee Biosolutions493-10
pyridineSigma Aldrich360570
Shimadzu GCMS 2010plus Shimadzu
Sitostanol-5,6,22,23-d4Sigma Aldrich680028
natriumtrifluoracetaatSigma Aldrich1615138
SolariX XR 7T Bruker Daltonics
TimsTOF Pro Q-TOF Bruker Daltonics
U13C glucose Sigma Aldrich389374
Ultimate RS3000 UHPLC Thermo Fisher Scientific
VanGuard CSHTM precolumn (5.0 × 2.1 mm; 1.7 μm, 130 Å)Waters

Referenties

  1. Wang, Y., Liu, H., Sun, Z. Lamarck rises from his grave: Parental environment-induced epigenetic inheritance in model organisms and humans. Biol Rev. 92 (4), 2084-2111 (2017).
  2. Champroux, A., Cocquet, J., Henry-Berger, J., Drevet, J. R., Kocer, A. A decade of exploring the mammalian sperm epigenome: Paternal epigenetic and transgenerational inheritance. Front Cell Dev Biol. 6, 50(2018).
  3. Horsthemke, B. A critical view on transgenerational epigenetic inheritance in humans. Nat Commun. 9 (1), 2973(2018).
  4. Schagdarsurengin, U., Steger, K. Epigenetics in male reproduction: Effect of paternal diet on sperm quality and offspring health. Nat Rev Urol. 13 (10), 584-595 (2016).
  5. Skinner, R. C., Gigliotti, J. C., Ku, K. -M., Tou, J. C. A comprehensive analysis of the composition, health benefits, and safety of apple pomace. Nutr Rev. 76 (12), 896-909 (2018).
  6. King, S. E., Skinner, M. K. Epigenetic transgenerational inheritance of obesity susceptibility. Trends Endocrinol Metab. 31 (7), 478-494 (2020).
  7. Martínez Duncker Rebolledo, E., et al. Sperm DNA methylation defects in a new mouse model of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase 677C>T variant and correction with moderate dose folic acid supplementation. Mol Hum Reprod. 30 (4), gaae008(2024).
  8. Lismer, A., et al. Histone H3 lysine 4 trimethylation in sperm is transmitted to the embryo and associated with diet-induced phenotypes in the offspring. Dev Cell. 56 (5), 671-686.e6 (2021).
  9. Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodeling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
  10. Diaz-Castillo, C., Chamorro-Garcia, R., Shioda, T., Blumberg, B. Transgenerational self-reconstruction of disrupted chromatin organization after exposure to an environmental stressor in mice. Sci Rep. 9 (1), 13057(2019).
  11. Gapp, K., et al. Implication of sperm RNAs in transgenerational inheritance of the effects of early trauma in mice. Nat Neurosci. 17 (5), 667-669 (2014).
  12. Chen, Q., et al. Sperm tsRNAs contribute to intergenerational inheritance of an acquired metabolic disorder. Science. 351 (6271), 397-400 (2016).
  13. Liberman, N., et al. 18S rRNA methyltransferases DIMT1 and BUD23 drive intergenerational hormesis. Mol Cell. 83 (18), 3268-3282.e7 (2023).
  14. Tomar, A., et al. Epigenetic inheritance of diet-induced and sperm-borne mitochondrial RNAs. Nature. 630 (8017), 720-727 (2024).
  15. Pinhas-Hamiel, O., Zeitler, P. The global spread of type 2 diabetes mellitus in children and adolescents. J Pediatr. 146 (5), 693-700 (2005).
  16. Galan, C., Krykbaeva, M., Rando, O. J. Early life lessons: The lasting effects of germline epigenetic information on organismal development. Mol Metab. 38, 100924(2020).
  17. Rando, O. J., Simmons, R. A. I'm eating for two: Parental dietary effects on offspring metabolism. Cell. 161 (1), 93-105 (2015).
  18. Perez, M. F., Lehner, B. Intergenerational and transgenerational epigenetic inheritance in animals. Nat Cell Biol. 21 (2), 143-151 (2019).
  19. Carone, B. R., et al. Paternally induced transgenerational environmental reprogramming of metabolic gene expression in mammals. Cell. 143 (7), 1084-1096 (2010).
  20. Pastore, A., et al. Pre-conceptional paternal diet impacts on offspring testosterone homoeostasis via epigenetic modulation of cyp19a1/aromatase activity. NPJ Metab Health Dis. 2 (1), 8(2024).
  21. Fullston, T., et al. Paternal obesity initiates metabolic disturbances in two generations of mice with incomplete penetrance to the F2 generation and alters the transcriptional profile of testis and sperm microRNA content. FASEB J. 27 (10), 4226-4243 (2013).
  22. Lumey, L., et al. Cohort profile: The Dutch Hunger Winter Families Study. Int J Epidemiol. 36 (6), 1196-1204 (2007).
  23. Pembrey, M. E., et al. Sex-specific, male-line transgenerational responses in humans. Eur J Hum Genet. 14 (2), 159-166 (2006).
  24. Comas-Armangue, G., Makharadze, L., Gomez-Velazquez, M., Teperino, R. The legacy of parental obesity: Mechanisms of non-genetic transmission and reversibility. Biomedicines. 10 (10), 2461(2022).
  25. Shea, J. M., et al. Genetic and epigenetic variation, but not diet, shape the sperm methylome. Dev Cell. 35 (6), 750-758 (2015).
  26. Dupont, J., Bertoldo, M. J., Rak, A. Energy sensors in female and male reproduction and fertility. Int J Endocrinol. 2018, 8285793(2018).
  27. Guiton, R., Henry-Berger, J., Drevet, J. R. The immunobiology of the mammalian epididymis: The black box is now open. Basic Clin Androl. 23 (1), 8(2013).
  28. Jarvis, S., et al. High fat diet causes distinct aberrations in the testicular proteome. Int J Obes. 44 (9), 1958-1969 (2020).
  29. Liu, L. -L., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma signaling in human sperm physiology. Asian J Androl. 17 (6), 942(2015).
  30. Masaki, H., et al. Long-chain fatty acid triglyceride metabolism disorder impairs male fertility: A study using adipose triglyceride lipase deficient mice. Mol Hum Reprod. 23 (7), 452-460 (2017).
  31. Cheng, X., et al. Lipidomics profiles of human spermatozoa: Insights into capacitation and acrosome reaction using UPLC-MS-based approach. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1273878(2023).
  32. Collodel, G., Castellini, C., Lee, J. C. -Y., Signorini, C. Relevance of fatty acids to sperm maturation and quality. Oxid Med Cell Longev. 2020, 7038124(2020).
  33. Watkins, A. J., et al. Paternal diet programs offspring health through sperm- and seminal plasma-specific pathways in mice. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (40), 10064-10069 (2018).
  34. Darbandi, M., et al. Oxidative stress-induced alterations in seminal plasma antioxidants: Is there any association with keap1 gene methylation in human spermatozoa. Andrologia. 51 (1), e13159(2019).
  35. Deneke, V. E., Pauli, A. The fertilization enigma: How sperm and egg fuse. Annu Rev Cell Dev Biol. 37 (1), 391-414 (2021).
  36. Cobellis, G., et al. A gradient of 2-arachidonoylglycerol regulates mouse epididymal sperm cell start-up. Biol Reprod. 82 (2), 451-458 (2010).
  37. Kawano, N., Yoshida, K., Miyado, K., Yoshida, M. Lipid rafts: Keys to sperm maturation, fertilization, and early embryogenesis. J Lipids. 2011, 264706(2011).
  38. Rubinstein, E., Ziyyat, A., Wolf, J., Lenaour, F., Boucheix, C. The molecular players of sperm-egg fusion in mammals. Semin Cell Dev Biol. 17 (2), 254-263 (2006).
  39. Satouh, Y., Inoue, N., Ikawa, M., Okabe, M. Visualization of the moment of mouse sperm-egg fusion and dynamic localization of IZUMO1. J Cell Sci. 125 (pt 3), 498-506 (2012).
  40. Kim, J., Seo, S., Kim, T. -Y. Metabolic deuterium oxide (D2O) labeling in quantitative omics studies: A tutorial review. Anal Chim Acta. 1242, 340722(2023).
  41. Li, X., et al. Sustained high glucose intake accelerates type 1 diabetes in NOD mice. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1037822(2022).
  42. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538(2012).
  43. Katz, J. J. Chemical and biological studies with deuterium. , Sigma Xi, The Scientific Research Honor Society. (2024).
  44. Oakberg, E. F., Hughes, A. M. Deuterium oxide effect on spermatogenesis in the mouse. Exp Cell Res. 50 (2), 306-314 (1968).
  45. Sumiyoshi, M., Sakanaka, M., Kimura, Y. Chronic intake of high-fat and high-sucrose diets differentially affects glucose intolerance in mice. J Nutr. 136 (3), 582-587 (2006).
  46. Aragno, M., Mastrocola, R. Dietary sugars and endogenous formation of advanced glycation endproducts: Emerging mechanisms of disease. Nutrients. 9 (4), 385(2017).
  47. Wilkinson, D. J., Brook, M. S., Smith, K. Principles of stable isotope research-with special reference to protein metabolism. Clin Nutr Open Sci. 36, 111-125 (2021).
  48. Wilkinson, D. J., et al. A validation of the application of D2O stable isotope tracer techniques for monitoring day-to-day changes in muscle protein subfraction synthesis in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 306 (5), E571-E579 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Stabiele isotopenmarkeringsperma o cyttransferepigenetische overervingmetabolomische analyselipidextractiepolaire metabolietendeuteriummarkeringprincipale componentenanalyse
Stabiele isotoop in-vivo labeling voor massaspectrometrie-identificatie van vaderlijke metabolieten die tijdens de bevruchting van sperma naar eicel worden overgebracht
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.