Deze procedure heeft tot doel metabolieten te identificeren die tijdens de bevruchting van sperma naar eicellen worden overgebracht door gebruik te maken van stabiele isotopenlabeling met 2H2O of U13C glucose gevolgd door metabolomische analyse. Stieren met een deuteriumlabel worden gedekt door niet-gelabelde moederdieren. Verzamelde pre-implantatie-embryo's worden geanalyseerd door middel van massaspectrometrie om vaderlijke (gedeutereerde) metabolieten te sorteren van maternale (niet-gedeutereerde) metabolieten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Stabiele isotoop in-vivo labeling voor massaspectrometrie-identificatie van vaderlijke metabolieten die tijdens de bevruchting van sperma naar eicel worden overgebracht
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De bijdrage van de vader aan de embryogenetica is tot nu toe decennialang beperkt gebleven tot allelische sequenties. Een decennium aan resultaten suggereert in plaats daarvan dat epigenetische factoren - DNA-methylering, histonmodificaties, chromosomale organisatie en regulerende RNA's - een cruciale rol spelen bij de overerving van de vader en de embryonale ontwikkeling en zygote genexpressie beïnvloeden. Samen met nucleïnezuren kan het metaboloom van sperma (lipiden, koolhydraten, vrije aminozuren) fungeren als epigenetisch signaal. Dit protocol heeft tot doel metabolieten die van sperma naar eicel zijn overgebracht, te identificeren door middel van massaspectrometrie. De procedure omvat stabiele isotopenlabeling van zaadcellen met 2H2O of U13C glucose om, door metabolomics, paternale metabolieten te traceren die tijdens de bevruchting naar de eicel zijn overgebracht. Het algemene doel van het protocol is om de rol van het metaboloom van het sperma van de vader in de gevoeligheid van het nageslacht voor dysmetabolisme te onthullen, en het kan worden aangepast om inzicht te geven in hoe omgevingsomstandigheden, zoals voeding en blootstelling aan verontreinigende stoffen, de metabole boodschappen van het vaderland veranderen, wat mogelijk van invloed is op de gezondheid van het nageslacht en de aanleg voor diabetes, obesitas en hart- en vaatziekten.
Inleiding
Vaderlijk epigenoom beïnvloedt de gevoeligheid van nakomelingen voor dysmetabolisme
Anders dan de overvloed aan pre- en postconceptierollen die door moeders tijdens de embryonale ontwikkeling worden benut, wordt al tientallen jaren gedacht dat de bijdrage van zaadcellen uitsluitend genetisch is. Volgens de genetische overervingstheorie moest de bijdrage van de vader aan de fenotypische variabiliteit van een individu (inclusief zijn vatbaarheid voor ziekten) uitsluitend worden toegeschreven aan de genetische sequentie van vaderlijk overgeërfde allelische varianten en aan hun interacties met de door de moeder overgeë....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Napels Federico II, Italië. De reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Selectie en groepering van C57BL/6J mannetjes
- Selecteer C57BL/6J mannetjes van ongeveer 12 weken.
- Verdeel mannetjes in twee groepen en noem ze LABELED (die een stabiele isotopenlabeling ondergaan) of UNLABELED (gebruikt als controle en voor het meten van de werkzaamheid van isotopenlabeling in zaadcellen en mor....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de overdracht van metabolieten van sperma naar eicel te monitoren, worden morulae geïsoleerd uit C57 BL/6J-vrouwtjes die zijn gedekt met stieren uit LABELED- en UNLABELED-groepen verzameld en geanalyseerd door op massaspectrometrie gebaseerde metabolomics. Metabolieten werden geëxtraheerd zoals beschreven in stap 6-7 en gederivatiseerd met TMS zoals beschreven in stap 8. Metabolomische en lipidomische profilering van GELABELDE morulae, NIET-GELABELDE morulae, NIET-GELABELDE eicellen, .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het beschreven protocol maakt de identificatie mogelijk van metabolieten die tijdens de bevruchting van sperma naar eicellen worden overgedragen door gebruik te maken van stabiele isotopenlabeling van mannelijke muizen met 2H2O of U13C glucose gevolgd door metabolomische analyse. Isotopisch gelabelde metabolieten die in morulae worden aangetroffen, zijn van vaderlijke oorsprong.
Hoewel waterstof en deuterium isotopen zijn, zijn.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2H2O gefilterd, 99,8 atoom % 2H | Sigma Aldrich | 756822 | |
| Aceton | Sigma Aldrich | 179124 | |
| Agilent SIL-8 | Agilent (Santa Clara, CA, U.S.A.) | ||
| C16-Ceramide-13C3-15N | LGC standard | TRC-C342770-25MG | |
| dichloormethaan | Sigma Aldrich | 34856 | |
| Diethylether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| ethanol | Sigma Aldrich | 1,11,727 | |
| HCG (Human chorionic gonadotropin, | Sigma Aldrich | CG5-1VL | |
| L-Lysine-ε-15N hydrochloride | Sigma Aldrich | 608971 | |
| Mannelijke en vrouwelijke C57BL/6JOlaHsd muizen | Inotiv | C57BL/6JOlaHsd | |
| methyl tert-butylether (MTBE) | Sigma Aldrich | 306975 | |
| MetOH | Sigma Aldrich | 1,06,035 | |
| N,O-Bis(trimethylsilyl(TMS) trifluoraceetamide (BSTFA) | Supelco | 15238 | |
| PBS | Applichem | A0965-9010 | |
| PMSG (Pregnant mare’s serum) | Lee Biosolutions | 493-10 | |
| pyridine | Sigma Aldrich | 360570 | |
| Shimadzu GCMS 2010plus | Shimadzu | ||
| Sitostanol-5,6,22,23-d4 | Sigma Aldrich | 680028 | |
| natriumtrifluoracetaat | Sigma Aldrich | 1615138 | |
| SolariX XR 7T | Bruker Daltonics | ||
| TimsTOF Pro Q-TOF | Bruker Daltonics | ||
| U13C glucose | Sigma Aldrich | 389374 | |
| Ultimate RS3000 UHPLC | Thermo Fisher Scientific | ||
| VanGuard CSHTM precolumn (5.0 × 2.1 mm; 1.7 μm, 130 Å) | Waters |
Referenties
- Wang, Y., Liu, H., Sun, Z. Lamarck rises from his grave: Parental environment-induced epigenetic inheritance in model organisms and humans. Biol Rev. 92 (4), 2084-2111 (2017).
- Champroux, A., Cocquet, J., Henry-Berger, J., Drevet, J. R., Kocer, A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
