Methodenartikel

De isolatie en karakterisering van neutrofielen met een lage en normale dichtheid uit volbloed

DOI:

10.3791/67805

⸱

7 februari 2025

 ,  , 
1TB Immunology Group, Department of Clinical Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, St James's Hospital, Trinity College Dublin, The University of Dublin

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier bieden we een betrouwbare benadering voor het isoleren van neutrofielen met een lage en normale dichtheid uit volbloed met behulp van magnetische isolatie (negatieve selectie) en een discontinu dichtheidsgradiëntmedium. Het zorgt voor ongerepte isolatie van cellen met een hoge zuiverheid (≥93%), waardoor een nauwkeurige stroomafwaartse analyse van neutrofielensubpopulaties mogelijk is, cruciaal voor het begrijpen van hun rol in gezondheid en ziekte.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opkomend onderzoek toont aan dat de circulerende neutrofielenpopulatie bij mensen bestaat uit verschillende subtypes en niet als een enkele populatie moet worden bestudeerd, zoals in het verleden is gedaan. In het bijzonder is aangetoond dat neutrofielen met een lage dichtheid en een normale dichtheid (LDN's, NDN's) functioneel en metabolisch verschillende profielen hebben, een factor waarmee rekening moet worden gehouden bij het publiceren van neutrofielenonderzoek. Hier presenteren we een aangepaste methode voor de ongerepte isolatie en scheiding van LDN's en NDN's uit volbloed.

Het dichtheidsgradiëntmedium (1,135 g/ml) wordt gecombineerd op 9:10 met 10x PBS. Specifieke dichtheidsgradiënten van 55%, 70% en 81% worden vervolgens gemaakt door het 100% dichtheidsgradiëntmedium te combineren met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Neutrofielen geïsoleerd uit 12 ml perifeer volbloed verkregen van goedgekeurde donoren met behulp van een op negatieve selectie gebaseerde magnetische isolatiekit worden opnieuw gesuspendeerd in de 55%-fractie. Een volume van 3 ml van de 81% en 70% fracties wordt gelaagd in een buis van 15 ml, gevolgd door de 55% fractie die het totale aantal neutrofielen bevat. De dichtheidsgradiënten worden vervolgens gedurende 30 minuten gecentrifugeerd bij 720 x g . Er worden twee verschillende banden verkregen op de 55%/70% interface (LDN's) en 70%/81% interface (NDN's). De cellen worden zorgvuldig in afzonderlijke buisjes gepipetteerd en gewassen met behulp van PBS. De zuiverheid van de geïsoleerde fracties wordt bepaald met behulp van flowcytometrie. Zowel LDN's als NDN's werden gedefinieerd als CD14lo, CD15+ SSChi door flowcytometrie. De isolatiezuiverheid werd berekend op ≥93% van de levensvatbare cellen voor beide typen.

Deze methode biedt een betrouwbare en efficiënte aanpak voor het scheiden van LDN en NDN's van perifeer bloed, waardoor een hoge zuiverheid en levensvatbaarheid van de geïsoleerde cellen wordt gegarandeerd. Het verbeteren van de precisie van neutrofielenisolatie maakt nauwkeurigere stroomafwaartse analyses van deze verschillende neutrofielensubpopulaties mogelijk. Deze zijn van cruciaal belang voor het vergroten van ons begrip van neutrofiele heterogeniteit en de implicaties ervan in verschillende fysiologische en pathologische contexten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofielen zijn korrelige immuuncellen en de meest voorkomende leukocyten in perifeer bloed, die gemiddeld ongeveer 50%-70% van de leukocyten uitmaken. Ze ontwikkelen zich in het beenmerg uit granulocyt-monocytprecursoren (GMP's), die zich op hun beurt ontwikkelen uit hematopoëtische voorlopercellen (HPC's) in aanwezigheid van granulocytkoloniestimulerende factor (G-CSF). Bij homeostase hebben ze een levensduur van ~24 uur, maar studies hebben aangetoond dat hun levensduur kan worden verlengd onder specifieke fysiologische omstandigheden en de bijbehorende micro-omgevingen zoals chronische immuunactivering1, ontsteking1 en zelfs weefselresidentie in stabiele toestand2. Neutrofielen worden al lang beschouwd als de eerste verdedigingslinie tegen ziekteverwekkers en wekken hun antimicrobiële effecten op door middel van 3 belangrijke effectorfuncties: degranulatie, fagocytose en activering en afgifte van neutrofiele extracellulaire val (NET) (NETosis).

De meeste onderzoeken naar de functie en biologie van neutrofielen onderzoeken de resultaten voor de totale neutrofielenpopulatie. Echter, uit studies in kankersettings die N1 (anti-tumor) / N2 (pro-tumor) subtypes afbakenen tot de classificatie van neutrofielen op basis van volwassenheid, ziekte en fysiologische toestand, en zelfs cellulaire dichtheid (neutrofielen met lage dichtheid en normale dichtheid), is het steeds duidelijker geworden dat de menselijke neutrofielenpopulatie fenotypisch diverse subtypes vormt. Of het bestaan van deze neutrofielensubtypes nu kan worden toegeschreven aan het feit dat ze volledig verschillende celtypen zijn of vanwege de complexe aard van plasticiteit, er bestaat een groeiende hoeveelheid literatuur over atypische neutrofielen en biedt een overtuigende mogelijkheid om neutrofielen met een lage dichtheid te bestuderen, gescheiden van neutrofielen met een normale dichtheid3.

Voor het eerst beschreven bij SLE-patiënten als een pro-inflammatoire neutrofielensubgroep4, zijn LDN's sindsdien geïdentificeerd bij chronische ziekten, zwangerschap en zelfs bij een gezonde bloedsomloop, zowel bij pro-inflammatoire als bij onderdrukkende capaciteiten 5,6,7,8. LDN's worden gelijktijdig aangetroffen met perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) wanneer volbloed wordt gecentrifugeerd over media met dichtheidsgradiënt. Hun specifieke dichtheid komt overeen met ongeveer 1,077 g/ml, vergeleken met NDN's bij 1,083 g/ml9. Hoewel er nog steeds veel discussie is over dit onderwerp, bestaat er speculatie dat LDN's lijken op een meer onrijp granulocytenfenotype (vergelijkbaar met promyelocyten en myelocyten, met een dichtheid van minder dan 1.080 g/ml)9,10. Anderen speculeren nog steeds dat er zowel volwassen als onrijpe LDN-fenotypes zijn, afhankelijk van de aan- of afwezigheid van ziekte 11,12,13. Desalniettemin zijn LDN's ook gedetecteerd bij gezonde personen; hun opname in sommige onderzoeken is echter beperkt vanwege de moeilijkheid om ze in voldoende aantallen te isoleren5.

Deze studie had tot doel deze twee populaties te isoleren in hoeveelheden die ons in staat zouden stellen om stroomafwaarts in situ metabole experimenten uit te voeren (minimaal 0,5 × 106 cellen/ml). Daarbij werd een bestaand protocol5 geoptimaliseerd met vaak gerapporteerde fenotypische markers13,14 die de beste uitkomst bieden voor het isoleren en karakteriseren van LDN's en NDN's uit volbloed (Figuur 1A).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bloedmonsters werden verzameld met geïnformeerde toestemming van gezonde deelnemers. De studie kreeg goedkeuring van de Research Ethics Committee van zowel het St. James's Hospital als het Tallaght University Hospital.

1. Bereiding van dichtheidsgradiëntmedium, isotone werkoplossingen, fracties en celscheidingsbuffer

  1. Bereiding van isotone werkoplossingen uit dichtheidsgradiëntmedium
    1. Bereiding van isotone 100% werkoplossing (~1,123 g/ml)
      1. Om de isotone 100% werkoplossing te bereiden, combineert u 27 ml dichtheidsgradiëntmedium met 3 ml 10x PBS. Dit resulteert in een isotone oplossing die geschikt is voor verdere verdunningen.
    2. Bereiding van isotone 81% werkoplossing (~1,0996 g/ml)
      1. Bereid de isotone 81% werkoplossing door 8,1 ml van de isotone 100% werkoplossing (bereid in stap 1.1.1) te mengen met 1,9 ml 1x PBS. Meng grondig om homogeniteit te garanderen.
    3. Bereiding van isotone 70% werkoplossing (~1,0861 g/ml)
      1. Om de isotone 70% werkoplossing te bereiden, combineert u 7 ml van de isotone 100% werkoplossing met 3 ml 1x PBS. Zorg ervoor dat de oplossing goed gemengd is.
    4. Bereiding van isotone 55% werkoplossing (1,0676 g/ml)
      1. Maak de isotone 55% werkoplossing door 5,5 ml van de isotone 100% werkoplossing te mengen met 4,5 ml 1x PBS. Meng.
  2. Gelaagdheid van gradiëntbreuken
    1. Gelaagdheid van gradiëntbreuk
      1. Gebruik een conische buis van 15 ml om voorzichtig 3 ml van de isotone 81% werkoplossing op de bodem aan te brengen. Leg vervolgens langzaam en voorzichtig 3 ml van de isotone 70% werkoplossing erop, vermijd het mengen van de lagen. Deze gradiënt wordt gebruikt voor celscheiding.
  3. Voorbereiding van de celscheidingsbuffer
    1. Bereiding van 500 ml celscheidingsbuffer
      1. Om de celscheidingsbuffer voor te bereiden, combineert u 2% foetaal runderserum (FBS) en 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) met 1x PBS tot een totaal volume van 500 ml. Gebruik deze buffer om cellen te wassen en opnieuw te suspenderen tijdens het isolatieproces.
        OPMERKING: Zorg ervoor dat de lagen goed gescheiden en ongestoord zijn. In dit protocol worden de isotone werkoplossingen aangeduid als "100%", "81%", "70%" en "55%" op basis van de bereidingswijze, in overeenstemming met eerdere studies5. Het is echter belangrijk om te verduidelijken dat deze labels niet de werkelijke eindconcentraties van de werkoplossingen vertegenwoordigen. Het "100%" dichtheidsgradiëntmedium wordt bijvoorbeeld bereid door 27 ml zuiver dichtheidsgradiëntmedium te mengen met 3 ml 10x PBS, wat resulteert in een uiteindelijke concentratie van 90% isotone werkoplossing. De daaropvolgende verdunningen (bv. "81%", "70%" en "55%") weerspiegelen op dezelfde manier de preparaatratio's in plaats van de werkelijke procentuele concentraties. Deze nomenclatuur werd behouden om consistent te blijven met de terminologie die in eerdere literatuur over dit onderwerp werd gebruikt.

2. Isolatie van neutrofielen uit volbloed met behulp van negatieve selectie

  1. Bereiding van magnetische kralen
    1. Draai de magnetische kralen gedurende 30 s grondig om ervoor te zorgen dat ze volledig opnieuw zijn gesuspendeerd voor gebruik.
  2. Bereiding van bloed
    1. Doseer voor elke donor 4 ml volbloed in drie afzonderlijke buisjes van 14 ml met ronde bodem.
  3. Toevoeging van neutrofielenisolatiecocktail en magnetische kralen
    1. Voeg 50 μL neutrofielenisolatiecocktail en 50 μL magnetische kralen per ml bloed toe aan elk buisje. Voeg voor 4 ml bloed 200 μL van elk reagens toe.
    2. Resuspendeer het mengsel goed door voorzichtig te pipetteren en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) zodat de reagentia zich kunnen binden aan ongewenste cellen.
  4. Wassen en magnetische scheiding - eerste ronde
    1. Vul elke buis bij tot 12 ml met behulp van een celscheidingsbuffer en meng grondig.
    2. Plaats de buisjes zonder deksel op een magneet en laat ze 10 minuten bij RT incuberen om de magnetische kralen die aan ongewenste cellen zijn gebonden naar de buiswand te trekken.
  5. Verzameling van niet-afhankelijke cellen
    1. Breng de clear cell-suspensie met neutrofielen voorzichtig over van elk buisje in een nieuwe, schone buis met behulp van een transferpipet. Verwijder de originele buis van de magneet.
  6. Magnetische kralen opnieuw aanbrengen en incubatie - tweede ronde
    1. Draai de magnetische kralen opnieuw gedurende 30 s. Voeg hetzelfde volume magnetische kralen toe aan de nieuw overgebrachte celsuspensie als in stap 2.3. Resuspendeer grondig en incubeer nog 5 minuten bij RT.
  7. Definitieve magnetische scheiding en verzameling
    1. Plaats de buisjes terug op de magneet zonder deksel en incubeer nog 10 minuten bij RT.
    2. Breng de clear cell-suspensie voorzichtig over op een nieuwe buis. Deze laatste suspensie vertegenwoordigt de geïsoleerde totale neutrofielenpopulatie.

3. Scheiding van neutrofielen met lage dichtheid (LDN's) en neutrofielen met normale dichtheid (NDN's) van de totale neutrofielenpopulatie

  1. Pooling en bereiding van celsuspensies
    1. Verzamel voor elke donor de geïsoleerde neutrofiele suspensies in buisjes van 50 ml. Vul elke buis bij tot een totaal volume van 50 ml met behulp van de celscheidingsbuffer.
  2. Centrifugeren
    1. Centrifugeer de buizen op 400 x g gedurende 5 minuten op RT met de rem erop.
  3. Suspensie en celtelling
    1. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de neutrofielenkorrel in 1 ml celscheidingsbuffer. Voer een celtelling uit om het totale aantal neutrofielen te bepalen.
  4. Voorbereiding van het dichtheidsgradiëntmedium
    1. Centrifugeer de buizen opnieuw op 400 x g gedurende 5 minuten bij RT met de rem erop. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de neutrofielenkorrel in 3 ml van het 55% dichtheidsgradiëntmedium. Gebruik voor een optimale resolutie 3 ml 55% dichtheidsgradiëntmedium per 5-6 × 106 totale neutrofielen.
    2. Verdeel indien nodig de geresuspendeerde cellen over meerdere vooraf gemaakte buizen met dichtheidsgradiënt, waarbij u ervoor zorgt dat 3 ml van de celsuspensie in elke buis wordt gelaagd.
  5. Gelaagd op buizen met dichtheidsgradiënt
    1. Breng de 3 ml celsuspensie met het 55% dichtheidsgradiëntmedium langzaam aan op de vooraf gemaakte dichtheidsgradiëntbuizen (bereid zoals beschreven in sectie 1). Zorg voor zorgvuldige gelaagdheid om te voorkomen dat het verloop wordt verstoord.
  6. Centrifugatie van de dichtheidsgradiënt
    1. Centrifugeer de buizen op 720 x g gedurende 30 minuten zonder de rem te gebruiken. Behandel de buizen na het centrifugeren voorzichtig om de lagen niet te verstoren.
  7. Isolatie van neutrofiele fracties
    1. Observeer na het centrifugeren hoe de neutrofielen zich scheiden in twee verschillende lagen:
      Neutrofielen met lage dichtheid (LDN's) bevinden zich op het 55%/70%-grensvlak en vormen een bovenste band op ongeveer de 3 ml-markering, en neutrofielen met normale dichtheid (NDN's) bevinden zich op het 70%/81%-grensvlak, die verschijnen als een onderste band rond de 6 ml-markering.
    2. Isoleer met behulp van een transferpipet elke laag zorgvuldig en breng ze over in afzonderlijke buisjes van 15 ml.
  8. Wassen van geïsoleerde fracties
    1. Om eventueel resterend dichtheidsgradiëntmedium af te wassen, voegt u 1x PBS toe aan elke tube van 15 ml tot de markering van 15 ml.
    2. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 5 minuten bij RT met de rem erop. Als de cellen geen stevige korrel vormen en in plaats daarvan blijven hangen, herhaal dan deze wasstap, om de aanwezigheid van het resterende dichtheidsgradiëntmedium aan te geven.
  9. Aantal cellen en downstream-toepassingen
    1. Tel de cellen in elke fractie en ga verder met stroomafwaartse toepassingen zoals metabole experimenten, flowcytometriekleuring, RNA-extractie of eiwitlysis indien nodig.
      OPMERKING: Na het uitplateren van de cellen wordt aanbevolen om de plaat gedurende 1 minuut met 210 × g naar beneden te draaien (remmen).

4. Fenotypering van geïsoleerd LDN en NDN

  1. Isoleer ~0,5-1 × 106 LDN's en NDN's. Maak een 2x geconcentreerde antilichaammastermix met behulp van CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, Fc-blok en levensvatbaarheidskleuring.
  2. Kleur de geïsoleerde LDN- en NDN-populaties met een equivalent volume van de antilichaammastermix, zodat de uiteindelijke verdunning van de antilichamen die de cellen kleuren respectievelijk 1:100 (CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, Fc-blok) en 1:50 (levensvatbaarheidskleuring) is.
  3. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten in het donker bij RT.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de cellen grondig zijn gemengd met de antilichaammastermix en het Fc-blok.
  4. Was de cellen eenmaal met PBS en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten op 400 × g . Gooi het bovenstaande weg.
  5. Fixeer de cellen in 1% paraformaldehyde (PFA) gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
  6. Was de cellen opnieuw met PBS, centrifugeer gedurende 5 minuten op 400 × g en gooi het bovenstaande weg.
  7. Resuspendeer de cellen in 200 μl PBS of indien nodig voor gebruik en neem de cellen zo snel mogelijk op een flowcytometer op.
    OPMERKING: De gekleurde en gefixeerde cellen kunnen kortstondig bij 4 ◦C in het donker worden bewaard om fotobleken van de fluoroforen te voorkomen. Idealiter zou de fenotyperingsprocedure echter onmiddellijk na kleuring en fixatie moeten worden uitgevoerd om een optimale levensvatbaarheid van de cellen en nauwkeurige resultaten te garanderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De succesvolle gelaagdheid van het totale aantal neutrofielen over het dichtheidsgradiëntmedium kan worden waargenomen in figuur 1B. Er moeten twee verschillende banden worden verkregen. Als vermenging van de gradiënten optreedt, of als het totale aantal gelaagde neutrofielen per buis hoog is (groter dan ongeveer 5-6 × 106), zullen de banden er diffuus uitzien (Figuur 1C) en neemt het risico van vermenging van de twee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode om de totale neutrofielenpopulatie op te splitsen in neutrofielen met een lage dichtheid en neutrofielen met een normale dichtheid, samen met fenotypische karakterisering van elk celtype met behulp van flowcytometrie die is aangepast aan eerdere methoden5.

Dit protocol is gebaseerd op de isolatie van LDN's en NDN's uit volbloed. Een cruciale stap is dat het totale aantal neutrofielen word...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen onthullingen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door de Health Research Board EIA-2024-002 en de Royal City of Dublin Hospital Trust. We willen Dr. Lorraine Thong en Dr. Kevin Brown bedanken voor hun hulp bij het verzamelen van monsters van gezonde donoren voor dit manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube (17 x 100 mm)Corning Science352059
APC anti-human CD14 (63D3)BioLegend367118
Brilliant Violet 421 anti-human CD10 (25 tests)BioLegend312217
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineSigmaD8537-1L
EasyEights EasySep MagnetStemCell Technologies#18103
EasySep Buffer (cell separation buffer)StemCell Technologies#20144
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation KitStemCell Technologies#19666
FcR Blocking Reagent, humanMiltenyi Biotec130-059-901
FITC anti-human CD16 (3G8)BioLegend302005
OneComp eBeads Compensation BeadseBioscience Inc.01-1111-42
PE/Cy7 anti-human CD86 (BU63)BioLegend374209
PE/Dazzle 594 anti-human CD15 (SSEA-1)BioLegend323037
Phosphate-Buffered Saline Tablets Gibco18912-014
Zombie NIR Fixable Viability KitBioLegend423105

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tracchi, I., et al. Increased neutrophil lifespan in patients with congestive heart failure. Eur J Heart Fail. 11 (4), 378-385 (2009).
  2. Ballesteros, I., et al. Co-option of neutrophil fates by tissue environments. Cell. 183 (5), 1282-1297.e18 (2020).
  3. Mckenna, E., et al. Neutrophils: Need for standardized nomenclature. Front Immunol. 12, 602963(2021).
  4. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis Rheumatol. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  5. Hardisty, G. R., et al. High purity isolation of low density neutrophils casts doubt on their exceptionality in health and disease. Front Immunol. 12, 625922(2021).
  6. Scapini, P., Marini, O., Tecchio, C., Cassatella, M. A. Human neutrophils in the saga of cellular heterogeneity: Insights and open questions. Immunol Rev. 273 (1), 48-60 (2016).
  7. Ssemaganda, A., et al. Characterization of neutrophil subsets in healthy human pregnancies. PLoS One. 9 (2), e85696(2014).
  8. Tay, S. H., Celhar, T., Fairhurst, A. M. Low-density neutrophils in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheumatol. 72 (10), 1587-1595 (2020).
  9. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. J Leukoc Biol. 107 (5), 809-818 (2020).
  10. Cowland, J. B., Borregaard, N. Isolation of neutrophil precursors from bone marrow for biochemical and transcriptional analysis. J Immunol Methods. 232 (1-2), 191-200 (1999).
  11. Blanco-Camarillo, C., Aleman, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Front Immunol. 12, 672520(2021).
  12. Park, J., et al. Low-density granulocytes display immature cells with enhanced NET formation in people living with HIV. Sci Rep. 13 (1), 13282(2023).
  13. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  14. Ui Mhaonaigh, A., et al. Low density granulocytes in anca vasculitis are heterogenous and hypo-responsive to anti-myeloperoxidase antibodies. Front Immunol. 10, 2603(2019).
  15. Mosca, T., Forte, W. C. Comparative efficiency and impact on the activity of blood neutrophils isolated by Percoll, Ficoll and spontaneous sedimentation methods. Immunol Invest. 45 (1), 29-37 (2016).
  16. Ren, Y., et al. Increased apoptotic neutrophils and macrophages and impaired macrophage phagocytic clearance of apoptotic neutrophils in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 48 (10), 2888-2897 (2003).
  17. Connelly, A. N., et al. Optimization of methods for the accurate characterization of whole blood neutrophils. Sci Rep. 12 (1), 3667(2022).
  18. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes in systemic autoimmunity and autoinflammation. Immunol Rev. 314 (1), 313-325 (2023).
  19. Yennemadi, A. S., Keane, J., Leisching, G. Mitochondrial bioenergetic changes in systemic lupus erythematosus immune cell subsets: Contributions to pathogenesis and clinical applications. Lupus. 32 (5), 603-611 (2023).
  20. Futoh, Y., et al. Peripheral low-density granulocytes after colorectal cancer surgery in predicting recurrence. BJS Open. 7 (1), zrac154(2023).
  21. Dwivedi, A., et al. Emergence of dysfunctional neutrophils with a defect in arginase-1 release in severe COVID-19. JCI Insight. 9 (17), e171659(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neutrofielen met lage dichtheidneutrofielsubtypedichtheidsgradi ntscheidingisolatie van neutrofielenflowcytometrieisolatie met magnetische beadsperifeer bloedcelseparatiebufferneutrofielheterogeniteit

Gerelateerde artikelen