RASopathieën zijn multisysteem-genetische syndromen die worden veroorzaakt door hyperactivering van de RAS-MAPK-route. Potentieel pathogene varianten die wachten op validatie duiken continu op, terwijl slecht preklinisch bewijs de therapie beperkt. Hier beschrijven we ons in vivo protocol voor het testen en kruisvalideren van RASopathie-geassocieerde ERK-activeringsniveaus en de farmacologische modulatie ervan tijdens de embryogenese door middel van live FRET-beeldvorming in Teen-reporter zebravissen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een efficiënt protocol om ERK-activiteitsmodulatie te beoordelen in vroege zebravismodellen van het Noonan-syndroom via live FRET-microscopie en immunofluorescentie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
RASopathieën zijn genetische syndromen die worden veroorzaakt door ERK-hyperactivering en resulteren in multisystemische ziekten die ook kunnen leiden tot aanleg voor kanker. Ondanks een brede genetische heterogeniteit liggen mutaties in de kiembaan met functiewinst in de belangrijkste regulatoren van de RAS-MAPK-route aan de basis van de meerderheid van de gevallen, en dankzij geavanceerde sequencingtechnieken worden potentieel pathogene varianten die de RAS-MAPK-signaalweg beïnvloeden nog steeds geïdentificeerd. Functionele validatie van de pathogeniteit van deze varianten, essentieel voor een nauwkeurige diagnose, vereist snelle en betrouwbare protocollen, bij voorkeur in vivo. Gezien de schaarste aan effectieve behandelingen in de vroege kinderjaren, kunnen dergelijke protocollen, vooral als ze schaalbaar zijn in kosteneffectieve diermodellen, een belangrijke rol spelen bij het bieden van een preklinische basis voor herpositionering/herbestemming van geneesmiddelen.
Hier beschrijven we stap voor stap het protocol voor het snel genereren van transiënte RASopathie modellen in zebravisembryo's en directe inspectie van levende ziekte-geassocieerde ERK activiteit veranderingen die al optreden tijdens gastrulatie door middel van real-time multispectrale Förster resonantie energieoverdracht (FRET) beeldvorming. Het protocol maakt gebruik van een transgene ERK-reporter die onlangs is opgericht en geïntegreerd met de hardware van commerciële microscopen. We bieden een voorbeeldtoepassing voor zebravismodellen van het Noonan-syndroom (NS) die zijn verkregen door expressie van de Shp2D61G. We beschrijven een eenvoudige methode die het mogelijk maakt om ERK-signaalverandering in het NS-vismodel te registreren voor en na farmacologische signaalmodulatie door beschikbare laaggedoseerde MEK-remmers. We beschrijven hoe ratiometrische FRET-signalen van multispectrale acquisities voor en na de behandeling kunnen worden gegenereerd, opgehaald en beoordeeld en hoe de resultaten in een vroeg stadium kunnen worden gevalideerd via klassieke immunofluorescentie op hele embryo's. Vervolgens beschrijven we hoe, door het onderzoeken van standaard morfometrische parameters, late veranderingen in embryovorm kunnen worden opgevraagd, die wijzen op een resulterende verslechtering van de gastrulatie, in dezelfde embryo's waarvan de ERK-activiteit 6 uur na de bevruchting wordt beoordeeld door levende FRET.
Inleiding
RASopathieën zijn genetische syndromen die de normale ontwikkeling belemmeren en verschillende organen en weefsels aantasten. Deze aandoeningen worden vaak veroorzaakt door kiembaangain-of-function (GoF)-mutaties in de sleutelgenen en spelers die betrokken zijn bij RAS/MAK-signalering, wat resulteert in een hyperactivatie (verhoogde fosforylering) van het extracellulaire signaalgereguleerde kinase (ERK). ERK reguleert enkele fundamentele processen die belangrijk zijn tijdens de ontwikkeling - weefselgroei - door te transloceren naar de kern 1,2. Somatische mutaties in....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimentele procedures met betrekking tot de huisvesting en het fokken van dieren werden uitgevoerd volgens de ARRIVE-richtlijnen voor het gebruik van zebravissen in dierproeven en geautoriseerd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (Direzione Generale della Sanità Animale e dei Farmaci veterinari - DGSAF). Alle DNA/RNA-reacties en beeldvormingssessies kunnen naar wens worden op- of afgeschaald, afhankelijk van het uiteindelijke benodigde materiaal of het aantal geteste genen en varianten.
1. Generatie en medicamenteuze behandeling van transiënte zebravis RASopathie modellen
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol toont een eenvoudige workflow om snel voorbijgaande RASopathiemodellen in zebravisembryo's te genereren en ERK-fluctuaties in vroege mutanten te beoordelen met een standaard live FRET-beeldvormingsmethode toegepast op een recent gevestigde ERK-zebravissensor 6,9. Zoals onlangs aangetoond 6,7 binnen dezelfde experimentele workflow, kunnen FRET-resultaten worde.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Ondanks tientallen jaren van onderzoek en talloze mutaties die leiden tot zeer heterogene vormen van RASopathieën die nu in kaart zijn gebracht, blijven genetische varianten met onbekende betekenis voortkomen uit sequentie-inspanningen op niet-gediagnosticeerde patiënten. In veel gevallen kan diagnose uitsluitend op basis van klinische kenmerken een uitdaging zijn en functionele genomische benaderingen om sequentieresultaten te valideren blijven cruciaal. Bovendien, ondanks het feit dat .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Wij danken Dr. Jeroen den Hertog (Hubrecht Instituut, Utrecht, Nederland) voor het ter beschikking stellen van pCS2+_eGFP-2a-Shp2a waaruit de shp2 CDS van volledige lengte werd geëxtraheerd om het plasmidesjabloon te genererendat we gebruikten 7. We danken het Nara Institute of Science and Technology (Takaaki Matsui), het National Institute of Genetics (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami) voor het leveren van de transgene tienerverslaggeverslijn. Dit werk werd ondersteund door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid - Current Research Funds 2021 en Current Research Funds 2024 en Ricerca Finali....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Plasticwares | |||
| 1.7 L Breeding Tank - Beach style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
| Capillaries GC100F-10 | Harvard apparatus | 30-0019 | One-cell stage embryo microinjection |
| Cell and Tissue Culture Plates - 12 well | BIOFIL | TCP011012 | Embryo collection and treatment |
| Cell and Tissue Culture Plates - 6 well | BIOFIL | TCP011006 | Embryo collection and treatment |
| Cell Culture Dish | SPL Life Sciences | 20100 | Embryo collection |
| Nunc Glass Dishes 12mm | Thermo Fisher | 150680 | Embryo FRET spectral imaging |
| Pipette Pasteur | Corning | 357524 | Embryo transfer |
| Protein Lobind Tubes 2ml | Eppendorf | 30108450 | IHC assay |
| Reagents and others | |||
| Caviar 500-800 µm | Rettenmaier Italia | BE2269 (500-800) | Dry fish food |
| Great Salt Lake Blue Artemia Cysts | Sanders | 00004727 | Live fish food |
| Instant Ocean salt | Tecniplast | XPSIO25R | Dehydrated sea salt for live food preparation |
| Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Teen) | Contacts for ordering*: National BioResource Project Zebrafish, Support Unit for Animal Resources Development, RRD, RIKEN Center for Brain Science, Japan. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *upon MTA signature. | - | Supplier of ERK Reporter zebrafish line. Fish embryos can be obtained upon MTA signature from National BioResource Project of Japan for Zebrafish (RIKEN, Japan). The zebrafish line is deposited by Nara Institute of Science and Technology (Takaaki Matsui) and the National Institute of Genetics (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami, patent for Tol2 system) (Wong et al., 2018, Urasaki et al., 2006, Okamoto and Ishioka, 2010). |
| 6x loading dye | Cell Signaling | B7024S | Gel Elecrophoresis |
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231S | Gel Elecrophoresis |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 1,01,236 | Gel Elecrophoresis |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Embryo mounting for FRET spectral imaging and IHC assay |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A8022 | IHC assay |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 223506 | E3 medium component |
| Calcium nitrate | Sigma-Aldrich | 237124 | Danieau stock solution component |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | IHC assay |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | TBE buffer component for gel preparation |
| Ethanol 99%+ | Fisher Scientific | 10048291 | In vitro RNA purification |
| Formaldeide 16% | Thermo Fisher | 28908 | Embryo fixation |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Gel Elecrophoresis |
| Gel Loading Buffer II (Denaturing PAGE) | Thermo Fisher | AM8546G | In vitro RNA transcription |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092 | TBE buffer component for gel preparation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | IHC assay |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | IHC assay |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 633 | Thermo Fisher | A21070 | IHC assay |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Danieau stock solution component |
| KpnI - HF (Enzyme + rCutSmart Buffer) | NEB | R3142 | Plasmid linearization |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | E3 medium component/Danieau stock solution component |
| Millennium RNA Markers | Thermo Fisher | AM7150 | Gel Elecrophoresis |
| Monarch Genomic DNA purification Kit | NEB | T3010L | Plasmid linearization |
| Mouse monoclonal p44/42 MAPK | Cell Signaling | 4696S | IHC assay |
| mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1340 | In vitro RNA transcription |
| Normal Goat serum (NGS) | Sigma-Aldrich | G9023 | IHC assay |
| Nuclease-free water Ambion | Thermo Fisher | AM9937 | In vitro RNA transcription |
| PD0325901 | Sigma-Aldrich | PZ0162 | MEK inhibitor |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | Microinjection mix component |
| Poly A Tailing Kit | Thermo Fisher | AM1350 | In vitro RNA transcription |
| Potassium chloride bioxtra | Sigma-Aldrich | P9333 | E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | PBS stock solution component |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | IHC assay |
| Rabbit polyclonal phospho-p44/42 MAPK | Cell Signaling | 4695S | IHC assay |
| SYBR safe DNA gel staining | Thermo Fisher | S33102 | Gel Elecrophoresis |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 31434-M | E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71643 | PBS stock solution component |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | TBE buffer component for gel preparation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | PBSTr buffer component |
| Equipment | |||
| Alliance Mini HD9 | Uvitec | - | Imaging system |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000205 | Microcentrifuge |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | - | Embryo mounting |
| FemtoJet 4x | Eppendorf | - | Microinjection system |
| Infinite M Plex | Tecan | - | Multimode plate reader |
| Leica M205FA | Leica Microsystems | - | Fluorescence stereo microscope |
| Leica TCS-SP8X equipped with incubator (OkoLab) | Le |
Referenties
- Iroegbu, J. D., Ijomone, O. K., Femi-Akinlosotu, O. M., Ijomone, O. M. ERK/MAPK signalling in the developing brain: Perturbations and consequences. Neurosci Biobehav Rev. 131, 792-805 (2021).
- Tartaglia, M., Aoki, Y., Gelb, B. D.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
