Een efficiënt protocol om ERK-activiteitsmodulatie te beoordelen in vroege zebravismodellen van het Noonan-syndroom via live FRET-microscopie en immunofluorescentie

Samenvatting

RASopathieën zijn multisysteem-genetische syndromen die worden veroorzaakt door hyperactivering van de RAS-MAPK-route. Potentieel pathogene varianten die wachten op validatie duiken continu op, terwijl slecht preklinisch bewijs de therapie beperkt. Hier beschrijven we ons in vivo protocol voor het testen en kruisvalideren van RASopathie-geassocieerde ERK-activeringsniveaus en de farmacologische modulatie ervan tijdens de embryogenese door middel van live FRET-beeldvorming in Teen-reporter zebravissen.

Samenvatting

RASopathieën zijn genetische syndromen die worden veroorzaakt door ERK-hyperactivering en resulteren in multisystemische ziekten die ook kunnen leiden tot aanleg voor kanker. Ondanks een brede genetische heterogeniteit liggen mutaties in de kiembaan met functiewinst in de belangrijkste regulatoren van de RAS-MAPK-route aan de basis van de meerderheid van de gevallen, en dankzij geavanceerde sequencingtechnieken worden potentieel pathogene varianten die de RAS-MAPK-signaalweg beïnvloeden nog steeds geïdentificeerd. Functionele validatie van de pathogeniteit van deze varianten, essentieel voor een nauwkeurige diagnose, vereist snelle en betrouwbare protocollen, bij voorkeur in vivo. Gezien de schaarste aan effectieve behandelingen in de vroege kinderjaren, kunnen dergelijke protocollen, vooral als ze schaalbaar zijn in kosteneffectieve diermodellen, een belangrijke rol spelen bij het bieden van een preklinische basis voor herpositionering/herbestemming van geneesmiddelen.

Hier beschrijven we stap voor stap het protocol voor het snel genereren van transiënte RASopathie modellen in zebravisembryo's en directe inspectie van levende ziekte-geassocieerde ERK activiteit veranderingen die al optreden tijdens gastrulatie door middel van real-time multispectrale Förster resonantie energieoverdracht (FRET) beeldvorming. Het protocol maakt gebruik van een transgene ERK-reporter die onlangs is opgericht en geïntegreerd met de hardware van commerciële microscopen. We bieden een voorbeeldtoepassing voor zebravismodellen van het Noonan-syndroom (NS) die zijn verkregen door expressie van de Shp2^D61G. We beschrijven een eenvoudige methode die het mogelijk maakt om ERK-signaalverandering in het NS-vismodel te registreren voor en na farmacologische signaalmodulatie door beschikbare laaggedoseerde MEK-remmers. We beschrijven hoe ratiometrische FRET-signalen van multispectrale acquisities voor en na de behandeling kunnen worden gegenereerd, opgehaald en beoordeeld en hoe de resultaten in een vroeg stadium kunnen worden gevalideerd via klassieke immunofluorescentie op hele embryo's. Vervolgens beschrijven we hoe, door het onderzoeken van standaard morfometrische parameters, late veranderingen in embryovorm kunnen worden opgevraagd, die wijzen op een resulterende verslechtering van de gastrulatie, in dezelfde embryo's waarvan de ERK-activiteit 6 uur na de bevruchting wordt beoordeeld door levende FRET.

Inleiding

RASopathieën zijn genetische syndromen die de normale ontwikkeling belemmeren en verschillende organen en weefsels aantasten. Deze aandoeningen worden vaak veroorzaakt door kiembaangain-of-function (GoF)-mutaties in de sleutelgenen en spelers die betrokken zijn bij RAS/MAK-signalering, wat resulteert in een hyperactivatie (verhoogde fosforylering) van het extracellulaire signaalgereguleerde kinase (ERK). ERK reguleert enkele fundamentele processen die belangrijk zijn tijdens de ontwikkeling - weefselgroei - door te transloceren naar de kern ^1,2. Somatische mutaties in genen die betrokken zijn bij de RAS-MAPK-route zijn de meest voorkomende gebeurtenissen die leiden tot kanker³. Het is dus niet verrassend dat aanleg voor kanker ook wordt waargenomen bij RASopathieën. Syndroom van Noonan (NS), gekenmerkt door ontwikkelingsachterstand, kleine gestalte, cognitieve stoornissen met variabele ernst, en cardiomyopathie, is de meest voorkomende vorm van RASopathie². In de meeste gevallen wordt de ziekte veroorzaakt door GoF-mutaties in PTPN11, het eerste gen voor RASopathie dat begin 2000 werd ontdekt⁴ en codeert voor het eiwit tyrosinefosfatase SHP2, dat fungeert als een positieve regulator van de route.

Sindsdien, dankzij het exponentiële gebruik van exoomsequencing-benaderingen bij niet-gediagnosticeerde patiënten, worden potentieel pathogene varianten die van invloed zijn op factoren die betrokken zijn bij de RAS-MAPK, en waarschijnlijk gekoppeld aan verschillende vormen van RASopathieën, nog steeds ontdekt en wachten ze op functionele karakterisering voor efficiënte stratificatie van patiënten². Om dit doel te bereiken, zijn experimentele protocollen nodig die een snelle en informatieve functionele validatie op organismaal niveau garanderen. Het gebruik van klassieke en gestandaardiseerde zoogdiermodellen om varianten met onbekende betekenis te testen, zou kostbaar en extreem tijdrovend zijn en invasieve methoden vereisen bij niet-transparante grote dieren. Een dergelijke strategie is duidelijk niet verenigbaar met de eis van snelle tests, gezien de maatschappelijke last die wordt vertegenwoordigd door arme of niet-gediagnosticeerde RASopathiepatiënten, die momenteel geen behandeling of behandeling hebben. Protocollen voor kwantitatieve beoordeling van de belangrijkste fenotypische eigenschappen en moleculaire correlaten in hele organismen zouden ook dienen om de mogelijke klinische vertaling van geneesmiddelen die mogelijk beschikbaar zijn voor RASopathiepatiënten te versnellen door herbestemming/herpositionering.

Zebravis is een ideaal model voor gewervelde dieren om ziekten te bestuderen die de vroege ontwikkeling beïnvloeden. Om te beginnen delen zebravissen een hoog niveau van genetische homologie met mensen. De hoge vruchtbaarheid van volwassen vissen resulteert in een grote productie van embryo's die klein zijn en zich snel ontwikkelen. Embryo's zijn in een vroeg stadium transparant, zodat belangrijke ontwikkelingsprocessen - epibolie, gastrulatie, assen en vorming van lichaamsplannen - moeiteloos kunnen worden gevisualiseerd met behulp van standaardmicroscopie. Bovendien is de beschikbaarheid van transgene lijnen die kunnen worden gebruikt om specifiek cellulair gedrag en dynamische moleculaire gebeurtenissen in ruimte en tijd tijdens de ontwikkeling te volgen, in combinatie met geavanceerde technieken om genetische modellen te genereren, onverslaanbaar. Bovendien kunnen fenotypische uitlezingen op meerdere niveaus worden beoordeeld in zebravissen (van organismale tot cellulaire defecten), en zijn er al speciale tests opgezet voor verschillende ziekten, waaronder RASopathieën⁵. Bovendien maken relatief eenvoudige onderdompelingsmethoden in baden voor medicijntoediening tijdens de vroege stadia, althans voor in water oplosbare verbindingen, high-throughput drugsscreening in vivo mogelijk in een formaat met 96 putjes.

Vanuit moleculair oogpunt tonen studies met behulp van standaardbenaderingen, zoals immunohistochemie en immunoblot, de correlatie aan tussen ERK-activering en RASopathie-geassocieerde ontwikkelingsdefecten in visembryo's ^6,7. De recent ontwikkelde EKAR-type FRET biosensor in zebravissen (Tg[ef1a:ERK biosensor-nes], Teen) biedt een betrouwbaar in vivo hulpmiddel om ERK-activering tijdens de embryogenese op een spatiotemporeel opgeloste manier te registreren. Daarom kan het waardevol zijn voor een betere beoordeling van dynamische ERK-veranderingen en farmacologische modulaties in RASopathy-vismodellen.

In de Teen-sensor wordt een specifiek ERK-substraat in de reporter gefosforyleerd bij ERK-activering, waardoor een conformatieverandering ontstaat die de fluorescerende CFP-donor (D) en de fluorescerende Ypet (verbeterde YFP) acceptor (A) in de buurt brengt. Als het D-emissiespectrum aanzienlijk overlapt met het absorptiespectrum van de A, kan FRET optreden (energieabsorptie van D naar A). Dit is evenredig met de afstand tussen D en A en dus in Teen met de ERK-activeringsstatus. Verschillende beeldvormingsprotocollen kunnen worden ingesteld met behulp van zowel standaard als geavanceerde beeldvormingsmodules van standaard of confocale microscopen in zowel live als vaste monsters. Bij D-excitatie is het verkrijgen van multispectrale scans langs een gedefinieerd spectrum van emissie (λ) van CFP tot YFP, gevolgd door spectrale "unmixing"-algoritmen, een van de meest betrouwbare methoden om FRET-gegevens te registreren en te kwantificeren⁸. Het kan ook worden toegepast op levende zebravisexemplaren om in vivo weefseldynamiek vast te leggen.

In navolging van eerdere rapporten ^6,9 en onze recente toepassing⁷, beschrijven we hier de stapsgewijze workflow met behulp van tienervissen om ERK-activering in cellen aan de rand van de dierpool van NS-modellen aan het begin van gastrulatie te beoordelen en deze te correleren met karakteristieke defecten van de lichaamsassen die pas later in de ontwikkeling zichtbaar zijn. We laten zien hoe kwantitatieve FRET-gegevens van levende NS-gastrulae voor en na behandeling met een beschikbare MEKi kunnen worden verkregen en onderzocht en hoe de resultaten via standaard immunohistochemie kunnen worden gevalideerd tegen gefosforyleerde (actieve) ERK of hoe correlatieve morfometrische analyse van embryo-rekdefecten kan worden uitgevoerd.

De workflow kan worden toegepast om de functionele test van opkomende varianten en ziektegenen die vermoedelijk geassocieerd zijn met RASopathieën te stimuleren en om inzicht te krijgen in de correlatie van ERK-activeringsdynamiek ruimtelijk en temporeel tijdens de ontwikkeling van gewervelde dieren en de morfologische defecten in embryo's. We laten zien dat dit protocol ook kan worden gebruikt om de werkzaamheid te testen van kandidaat-geneesmiddelen die de ERK-activering moduleren.

Protocol

Alle experimentele procedures met betrekking tot de huisvesting en het fokken van dieren werden uitgevoerd volgens de ARRIVE-richtlijnen voor het gebruik van zebravissen in dierproeven en geautoriseerd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (Direzione Generale della Sanità Animale e dei Farmaci veterinari - DGSAF). Alle DNA/RNA-reacties en beeldvormingssessies kunnen naar wens worden op- of afgeschaald, afhankelijk van het uiteindelijke benodigde materiaal of het aantal geteste genen en varianten.

1. Generatie en medicamenteuze behandeling van transiënte zebravis RASopathie modellen

OPMERKING: Om de expressie van RASopathie-geassocieerde varianten te volgen, kunnen specifieke constructies worden gebruikt die de gewenste coderende sequentie (cds) van het betreffende eiwit herbergen in frame met de cds van kleine niet-fluorescerende tags (zoals myc of iets dergelijks). Op deze manier kunnen de expressieniveaus van het mutante eiwit worden beoordeeld door middel van standaard western blot tegen het label. Als er antilichamen tegen het specifieke eiwit van belang beschikbaar zijn, kunnen tags worden vermeden. Immunofluorescentie kan ook worden gebruikt om eiwitexpressie in embryoweefsel te beoordelen volgens standaardprotocollen. Dit type controle-experiment kan nuttig zijn om de expressie van mutante eiwitten te correleren met geïnduceerde ERK-activeringsniveaus. Het gebruik van fluorescerende tags is niet aan te raden in combinatie met FRET-beeldvorming, gezien de mogelijke fluorescentie-emissie overspraak tijdens microscopie.

1. Plasmidelinearisatie (dag 1-2) (Figuur 1A)
   OPMERKING: Bij het genereren van een voorbijgaand ziektemodel in zebravissen (RAsopathie hier) veroorzaakt door een GoF-mutatie die een specifiek gen aantast, is een snelle aanpak het voorbereiden van het mRNA dat codeert voor het wildtype (WT) en het mutante eiwit van belang, dat vervolgens moet worden geïnjecteerd in zebravisembryo's volgens de onderstaande stappen. Het plasmide dat als sjabloon wordt gebruikt om het mRNA te transcriberen, moet de gewenste CDS (coderende sequentie) van volledige lengte bevatten voor het gen van belang dat stroomafwaarts is gekloond een T7-, Sp6- of T3-polymerasepromotor en stroomopwaarts van het polyadenyleringssignaal (polyA). Als het niet beschikbaar is, is de eerste stap om het te produceren door de zebravis of door de mens gewenste CDS te klonen in een geschikte vector¹⁰ en te valideren door SANGER-sequencing. Houd voor het klonen rekening met extra tijd (gemiddeld 1 week inclusief klonen, screeningkolonies en het isoleren en uitbreiden van de juiste klonen).
   1. Lineariseer het plasmide met geschikte restrictie-enzymen en knip slechts één keer stroomafwaarts van het polyA-signaal (hier KpnI). Om een efficiënte plasmidelinearisatie te bereiken, mengt u 3 γ (μg/μL) plasmide-DNA, 2 μL restrictie-enzym (20.000 Unit/ml) en 10 μL 10x reactiebuffer in een eindvolume van 100 μL in nucleasevrij water. Meng de componenten grondig door een paar keer te pipetteren en incubeer het reactiemengsel gedurende 2-4 uur bij 37 °C.
   2. Controleer het resultaat van de linearisatie door elektroforese op een agarosegel van 1,5%.
      1. Verdun 10x stockoplossing van TBE (48,5 g Tris, 11,4 ml ijsazijn, 20 ml 0,5 M EDTA [pH 8,0]) met nucleasevrij water.
      2. Bereid de agarosegel voor door in de magnetron 1,5 g agarose op te lossen in een eindvolume van 100 ml 1x TBE-oplossing. Voeg vervolgens 3,5 μL kleurstofgelvlek toe.
      3. Giet de gel door de agaroseoplossing in kamers van geschikte grootte te gieten, afhankelijk van het aantal aandoeningen/plasmiden. Stel de kammen in en wacht ongeveer 1 uur tot de gel gestold is; Verwijder vervolgens de kammen en plaats de gepolymeriseerde gel in de daarvoor bestemde gellade voor de elektroforese.
      4. Meng een paar μL van het verteerde plasmide ("cut") en 1,5 μL 6x laadbuffer (met een kleurstof om de elektroforese te controleren) in een eindvolume van 10 μL nucleasevrij water. Bereid op dezelfde manier ook een afzonderlijk controlemonster met het onverteerde plasmide ("ongesneden"). Laad de monsters in de agarosebanen en laad in de eerste baan een DNA-ladder van 1 Kb. Voer de DNA-elektroforese uit op 100 V gedurende 30 minuten.
      5. Visualiseer en documenteer de DNA-banden die het resultaat zijn van de run op een standaard UV-transilluminator. Controleer de efficiëntie van plasmidelinearisatie door het patroon van DNA-banden te inspecteren waarbij "geknipt" en "ongesneden" worden vergeleken.
         OPMERKING: Voldoende gelineariseerde plasmiden zouden sneller moeten lopen als één scherpe band. Zorg ervoor dat de DNA-splitsing volledig is, want het initiëren van de transcriptiereactie is een belangrijke beperkende stap die kan worden belemmerd door de aanwezigheid van cirkelvormige plasmidevormen, wat resulteert in een slechte mRNA-opbrengst.
   3. Ga verder met het zuiveren van het gelineariseerde plasmide met behulp van in de handel verkrijgbare DNA-zuiveringskits op basis van spinkolommen en bewaar het gezuiverde DNA-preparaat bij -20 °C totdat het nodig is.
      OPMERKING: In plaats van linearisatie is het mogelijk om een PCR-product te gebruiken als sjabloon voor mRNA-transcriptie, op voorwaarde dat het de polymerasepromotorsequentie stroomopwaarts en de polyA-signaalsequentie stroomafwaarts van het stopcodon bevat. PCR-producten moeten ook worden gezuiverd en geïnspecteerd op een agarosegel voordat u verder gaat.
2. In vitro mRNA-transcriptie, zuivering en kwaliteitscontrole (dag 2-3) (Figuur 1A)
   OPMERKING: reinig het werkgebied en de pipetten zorgvuldig met RNAse-ontsmettingsoplossingen. Gebruik nucleasevrije materialen en reagentia; Draag handschoenen. Dit minimaliseert RNase-besmetting en zorgt voor een betere opbrengst van mRNA over de volledige lengte.
   Transcribeer afgetopte en gepolyadenyleerde mRNA's die coderen voor WT en mutante eiwitten uit gelineariseerde plasmiden met behulp van standaardkits voor in vitro mRNA-transcriptie en volgens de instructies van de fabrikant.
   1. Centrifugeer het gezuiverde gelineariseerde plasmide gedurende enkele seconden bij 17.949 × g om ervoor te zorgen dat vuil op de bodem van de buis wordt verzameld en niet wordt overgebracht naar de transcriptiereactie.
   2. Ontdooi alle componenten bij kamertemperatuur (RT) behalve het mengsel van NTP- en CAP-analogen, die op ijs worden bewaard. Houd het polymerase tot gebruik op -20 °C.
   3. Centrifugeer alle reagentia voor gebruik kort met 17.949 × g om reagensverlies of onbedoelde contaminatie te voorkomen en draai de 10-voudige reactiebuffer en het gebruiksklare NTP/CAP-analoge mengsel kort voort totdat ze volledig in oplossing zijn. Houd de 10x reactiebuffer op RT.
   4. Bereid de transcriptiereactie bij RT voor door 600-800 ng van het gelineariseerde en gezuiverde plasmide toe te voegen aan een oplossing die 10 μL 2x NTP/CAP analoog mengsel, 2 μL 10x reactiebuffer, 2 μL SP6, T7 of T3 enzym bevat (afhankelijk van de specifieke promotor stroomopwaarts van de CDS in het plasmide) in een eindvolume van 20 μL aangevuld met nucleasevrij water. Meng grondig door een paar keer op en neer te pipetteren.
   5. Incubeer de transcriptiereactie bij 37 °C in een thermocycler. Zorg ervoor dat u ook de temperatuur van het deksel instelt op 37 °C en laat de reactie 2 uur draaien.
   6. Om het resterende plasmide te verwijderen dat tijdens de reactie niet is getranscribeerd, voegt u 1 μL standaard DNAse-oplossing (2 eenheden/μL) toe. Meng de reactie grondig door een paar keer te pipetteren en incubeer nog 30 minuten bij 37 °C.
   7. Voordat u verder gaat, controleert u de kwaliteit en integriteit van in vitro gesynthetiseerd mRNA door middel van TBE/formamide agarose-elektroforese. Los 1,0 g agarose op in 50 ml 1x TBE-oplossing, voeg 5,5 ml 37% formamide en 3,5 μl kleurstofgelvlek toe, meng en giet de gel zoals hierboven uitgelegd.
      LET OP: Draag bij het hanteren van formamide persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en gebruik een chemische kap.
   8. Meng 1 μL van het getranscribeerde mRNA met 2,5 μL 2x Formamide Dye Loading Buffer in nucleasevrij water in een totaal volume van 5 μL. Meng de componenten grondig door een paar keer te pipetteren en laad de monsters in de gelbanen. Laat de gel 10-15 minuten op 100 mV draaien in voorgekoelde 1x TBE-buffer. Voer ook een 1 kb DNA- en/of RNA-ladder uit.
   9. Optioneel: Denatureer de ladder en het mRNA bij 70 °C gedurende 10 min.
   10. Visualiseer en documenteer de resulterende mRNA-banden op een standaard UV-transilluminator.
       OPMERKING: Lange runs en hoge temperaturen vergroten de kans op RNA-degradatie.
   11. Als de integriteit en grootte van het gesynthetiseerde afgetopte RNA optimaal zijn, ga dan verder met polyadenylering van het C-terminal door aan de reactie toe te voegen: 36 μL nucleasevrij water, 20 μL 5x denaturerende laadbuffer, 10 μL 25 mM MnCl₂, 10 μL 10 mM ATP en 4 μL polyadenyleringsenzym (zoals gezuiverd E. coli Poly(A) Polymerase). Meng de reactie grondig door een paar keer te pipetteren en incubeer de 100 μL van de eindreactie bij 37 °C nog 1 uur.
       OPMERKING: Het is niet raadzaam om de RNA-kwaliteit te controleren via gelelektroforese na een polyA-reactie, omdat het RNA besmeurd lijkt door de polyA-staarten.
   12. Precipiteer en herstel het gesynthetiseerde, afgedekte en gepolyadenyleerde mRNA met behulp van geschikte zouten zoals LiCl. Meng kort gelijke hoeveelheden nucleasevrij water en standaard 2,5 M LiCl-oplossing (30 μl) en incubeer gedurende >30 minuten bij -20 °C.
       OPMERKING: Efficiënte neerslag kan na 2 uur worden verkregen, maar nachtelijke incubatie verhoogt doorgaans de uiteindelijke opbrengst van mRNA.
   13. Om het gezuiverde mRNA te pelleteren, centrifugeert u de reactie gedurende 30 minuten bij 4 °C bij 17.949 × g en verwijdert u het supernatant. Was nu de pellet met ~1 ml 70% ethanol (EtOH) en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 17.949 × g om verontreinigingen en resterende nucleotiden uit de reactie te verwijderen.
   14. Laat de pellet aan de lucht drogen en suspendeer hem vervolgens opnieuw in 20 μL nucleasevrij water. Los het RNA goed op door voorzichtig en herhaaldelijk te pipetteren op RT en incubeer na 10 minuten.
       OPMERKING: Controleer de pellet elke 5 minuten om er zeker van te zijn dat de pellet verdampt. Bij het opnieuw suspenderen, gezien de plakkerigheid van het RNA, pipetteer het totdat het goed is opgelost in water.
   15. Beoordeel de concentratie en zuiverheid van het bereide mRNA door de extinctie bij 260 nm en 280 nm (verhouding 260/280) te meten in een spectrofotometer. Meet verschillende scalaire verdunningen van het RNA-preparaat om een correcte schatting van de concentratie te garanderen.
       OPMERKING: Normaal gesproken varieert de concentratie van het gesynthetiseerde RNA van 1 tot 2 μg/ml, maar de uiteindelijke hoeveelheid kan verschillen afhankelijk van de CDS-lengte en de hoeveelheid uitgangsmateriaal.
   16. Houd tijdens het beoordelen van de kwaliteit de mRNA-voorraad in ijs, verdeel het vervolgens in aliquots van 5 μL en bewaar het bij -80 °C totdat het nodig is voor injectie.
3. Bereiding van standaardoplossingen en materialen voor embryo-injectie en medicamenteuze behandeling (dag 2-3, figuur 1B)
   1. Trek aan micro-injectienaalden voor zebravisembryo's met behulp van steriele haarvaten (standaard capillaire afmetingen: 1,0 OD x 0,58 ID x 100 L mm). Gebruik een in de handel verkrijgbaar trekapparaat en pas de gewenste instellingen toe op het gebied van uitgangsspanning, trekmodus (één stap of twee stappen) en trekkracht om een variabele puntlengte, diameter en naaldvorm te verkrijgen. Voor veelgebruikte naaldkenmerken voor zebravissen, zie Abdelrahman en collega's¹¹.
      OPMERKING: Optimale instellingen kunnen per laboratorium verschillen, omdat omgevingsomstandigheden (zoals vochtigheid of kamertemperatuur) de resultaten van het naaldtrekken kunnen beïnvloeden. Instellingen moeten regelmatig opnieuw worden getest en gekalibreerd. Getrokken naalden kunnen bij RT enkele maanden in schone containers worden bewaard.
   2. Bereid de 30x "Danieau" stockoplossing bij pH 7,6 door 101,7 g NaCl, 1,56 g KCl, 2,96 g MgSO₄ x 7H₂O, 4,25 g Ca(NO₃)₂ en 35,75 g HEPES op te lossen in 1 l dubbel gedestilleerd (DD) water voor de bereiding van de micro-injectieoplossing. Bereid ook een stockoplossing van fenolrood bij 5% in DD-water voor gebruik als zichtbare tracer van het injectiemengsel.
   3. Bereid E3-mediumoplossing voor embryogroei door 4 ml NaCl (5 M), 680 μl KCl (1 M), 1,32 ml CaCl₂ x 2H₂O (1 M) en 1,32 ml MgSO₄ (1 M) te verdunnen in een eindvolume van 4 l water met omgekeerde osmose.
   4. Bereid voorraadoplossingen van de gewenste geneesmiddelen (in dit voorbeeld: de MEKi-remmer [MEKi] PD032590) als voorraadoplossingen volgens de productgegevenssheet en oplosbaarheid (10 mM van de MEKi naar keuze door 5 mg op te lossen in 1,036 ml DMSO). Meng grondig en genereer kleine hoeveelheden om tot gebruik bij -80 °C te bewaren.
      OPMERKING: DMSO is een veelgebruikt oplosmiddel dat wordt gebruikt om zowel polaire als niet-polaire verbindingen op te lossen en vertoont oplosbaarheid in een breed scala aan organische oplosmiddelen en water.
   5. Bereid een levende artemia-suspensie door de Artemia salina-cysten gedurende ten minste 18 uur in broedoplossing te laten uitkomen (2 g/l Artemia salina-cysten in 30 g/l oceaanzout dat eerder is opgelost in water met omgekeerde osmose) bij 28-30 °C, waarbij een constante beluchting wordt verzorgd.
      OPMERKING: De kweekomstandigheden en de broedtijd kunnen worden beïnvloed door de omgevingsomstandigheden van de faciliteit en de partijen cysten en moeten regelmatig opnieuw worden getest en indien nodig opnieuw worden ingesteld.
4. Kweekparen voorbereiden op Tg[ef1α:ERK biosensor-nes] (Tiener) vissen (Dag 3)
   1. Voer de volwassen paren op de dag van de paring regelmatig volgens het goedgekeurde protocol van de dierenfaciliteit.
      1. Reinig de cultuur met uitgekomen artemia door de niet-uitgekomen of lege cysten eruit te filteren met twee zeefjes van verschillende filtergroottes (filterstap I: 180 μm, filterstap II: 112 μm).
      2. Verzamel en was de gefilterde artemia's in 200 ml water met omgekeerde osmose om 10-15 volwassen vissen te voeden met ongeveer ongeveer 5-10 ml van de artemia-oplossing.
         OPMERKING: Controleer de kwaliteit van de uitgekomen artemia-oplossing en kijk naar hun vitaliteit, beweeglijkheid, grootte en kleur en zorg ervoor dat u niet-uitgekomen of lege cysten verwijdert, die onverteerbaar zijn voor vissen en schade kunnen toebrengen aan het maagdarmkanaal van vissen. Voor kweekparen verdient het de voorkeur om de laatste maaltijd van de dag ten minste 3 uur voor het isoleren van paren in de kweekbak te geven om de voedselvertering mogelijk te maken en een hoog waterkwaliteitsniveau te behouden.
   2. Selecteer visparen die in (minstens) de afgelopen 2 weken niet zijn gekoppeld om te paren, om ongemak te minimaliseren en de ontwikkeling van gameten mogelijk te maken. Acclimatiseer de geselecteerde volwassen tienervisparen (normaal gesproken met deze samenstelling: 1 ♂ : 2 ♀ ) in geschikte kweekbakken. Scheid vrouwtjes van mannetjes door een tankverdeler te gebruiken tot de volgende ochtend. Zorg voor een standaard licht/donker-cyclus van 14/10 uur.
      OPMERKING: Groepskruisen kunnen ook worden geregeld. In dit geval kan het paaien echter op verschillende tijdstippen plaatsvinden en wordt het moeilijker om embryo's in hetzelfde stadium uit gemengde legsels te selecteren. De overgang van donker naar licht is van cruciaal belang voor een succesvolle paring.
5. Embryoverzameling en micro-injectie van WT en mutante mRNA's (dag 4)
   1. Zodra het licht in de faciliteit wordt ingeschakeld, verwijdert u de tankverdeler die de mannetjes en vrouwtjes scheidt en, indien nodig, ververs u ongeveer 20% van het aquariumwater met vers water uit het recirculerende aquacultuursysteem om de waterkwaliteit hoog te houden zonder de hormonen die door de vissen vrijkomen overmatig te verdunnen.
   2. Laat de vissen met rust en controleer regelmatig op het leggen van eieren (meestal in de eerste 30 minuten tot 1 uur daglicht). De eieren (2-3 mm) worden gelegd en vallen op de bodem van de bak, gescheiden door een rooster zodat volwassenen ze niet kunnen eten. Isoleer de volwassenen die met succes hebben gefokt en zeef het aquariumwater met de eieren door een standaardzeef (zoals een theezeef) om de eieren vast te houden.
      OPMERKING: Het is mogelijk om dezelfde vis terug in het kweekaquarium te zetten voor een nieuwe paringsronde of de vis terug te brengen naar de originele behuizingsbakken, waarbij het paringspaar, de datum en de prestaties worden geregistreerd.
   3. Was de verzamelde embryo's met vers E3-medium en verwijder onbevruchte, gedegenereerde eieren, uitwerpselen en andere soorten vuil van de paren met behulp van een pasteurpipet.
      OPMERKING: Verzamel ~n = 100 bevruchte tienereieren in een petrischaaltje met een diameter van 90 mm om overbevolking van embryo's te voorkomen.
   4. Schik en lijn bevruchte tienereieren uit in een op maat gemaakte micro-injectieplaat die is verkregen door 2% agarose in E3-medium te vormen om de juiste rijstroken te genereren die de eieren tijdens micro-injectie moeten bevatten en beperken.
      OPMERKING: Hiervoor kunnen op maat gemaakte of commerciële mallen worden gebruikt.
   5. Bereid een vers micro-injectiemengsel voor om mutante embryo's als volgt te genereren: 30-60 pg afgetopt en gepolyadenyleerd mRNA (hier shp2) opgelost in 0,3x Danieau-oplossing (verdund uit standaardoplossing) voor een eindvolume van 20 μL. Voeg 0,2 μL (0,05%) fenolrode stockoplossing toe als micro-injectietracer.
   6. Vul de naald terug met 2 μL injectiemateriaal met behulp van een microloaderpipet. Injecteer de oplossing in het eencellige stadium van tienerzebravisembryo's met behulp van een in de handel verkrijgbaar micro-injectieapparaat onder druk, waarbij u de druk- en tijdinstellingen handmatig aanpast om elke injectie te kalibreren op basis van de naald en de embryokwaliteit. Raadpleeg de standaard micro-injectieprotocollen voor zebravissen die beschikbaar zijn in de literatuur^11,12.
   7. Kweek microgeïnjecteerde tienerembryo's op onder gecontroleerde houderijomstandigheden (temperatuur: 28 °C, vochtigheid: 70%, licht-donkercyclus: 14/10 uur) voor een optimale ontwikkeling en verwijder alle eieren die er troebel of gedegenereerd uitzien in de volgende 3 uur na afzet.
   8. Screen de embryo's ~4 uur na de bevruchting (hpf) op fluorescentie (reporterexpressie) met behulp van een standaard fluorescentie-stereomicroscoop met de juiste lamp- en filterinstellingen (465-500 nm). Gebruik tiener-positieve vissen voor FRET-beeldvorming en negatieve broers en zussen voor immunohistochemische (IHC) beoordelingen (zie hieronder).
      OPMERKING: Gezien de bekende variabiliteit in de expressie van op Tol2 gebaseerde transgenen¹³, kunnen embryo's variabele niveaus van tienerfluorescentie vertonen. Het wordt aanbevolen om niet-geïnjecteerde broers en zussen te inspecteren om te controleren op interindividuele variabiliteit in fluorescentie binnen een batch en, rekening houdend met het lage dynamische bereik van FRET-beeldvorming, embryo's met extreem lage niveaus van basale fluorescentie weg te gooien.
6. Behandeling van zebravisembryo's met de MEK-remmer (MEKi) (dag 4)
   1. Bereid een tussenoplossing van MEKi-PD0325901 (1 mM) door 1 μl 10 mM stockoplossing te verdunnen met 9 μl met E3-medium. Gebruik de tussenoplossing om de uiteindelijke oplossingen met een lage dosis te verkrijgen. Bereid een lage dosis (0,25 μM) van de MEKi-PD0325901 in een totaal volume van 3 ml door 0,75 μl van de 1 mM tussenoplossing te mengen met 2,25 μl E3-medium. Verdun 0,75 μl 10% DMSO met 2,25 ml E3-medium om de controleoplossing (Ctrl) te verkrijgen.
   2. Plaats embryopools van gelijke aantallen in verschillende putjes van een plaat met 6 putjes en begin de behandeling met onderdompeling in een bad: vervang voor elk putje het E3-medium door E3-medium dat mediumcontrole (0,0025% DMSO) of verdunde geneesmiddelen bevat in de gewenste concentratie (0,25 μM, 0,0025% DMSO) zoals eerder vermeld. Gebruik 3 ml medicijnoplossing per putje.
      OPMERKING: Om eventuele effecten veroorzaakt door variërende concentraties van de drager (DMSO) te elimineren, is het belangrijk ervoor te zorgen dat zowel de controle- als de behandelingsoplossingen dezelfde uiteindelijke DMSO-concentratie hebben.
   3. Bewaar de behandelde embryo's bij 28 °C voordat u ze verzamelt tot het gewenste ontwikkelingsstadium voor vervolgtesten (hier: morfometrische analyse en IHC-validatie).

2. Live multispectrale FRET-beeldvorming van RASopathy zebravismodellen in het gastrula-stadium en gegevensanalyse

1. Montage van gastrulae voor live beeldvorming (dag 4) (Figuur 2A)
   1. Bereid het montagemedium voor levende embryo's voor door 1,5 g laagsmeltende agarose (LMA) op te lossen in 1x PBS om 1,5% LMA/E3 te maken.
      OPMERKING: Kies de agaroseconcentratie van 0,8 tot 1,5%, afhankelijk van het ontwikkelingsstadium en de specifieke behoefte om de vissen in bedwang te houden. Distribueer vers gemaakte LMA-oplossing in aliquots van het gewenste formaat en bewaar LMA in gepolymeriseerde toestand bij RT (stabiel voor een paar maanden). Dit minimaliseert bacteriële en schimmelbesmetting, maar controleer de kwaliteit van het LMA-aliquot regelmatig voor gebruik.
   2. Smelt vóór de monstermontage het 1,5% LMA-gehalte in een thermomixer of steriel waterbad bij 50 °C. Eenmaal opgelost, verlaagt u de temperatuur van de thermomixer tot ongeveer 30 °C.
   3. Plaats een enkel geïnjecteerd Teen⁺ embryo (hier een gastrula die Shp^D61G tot expressie brengt) in het midden van een glazen bodemschaal met een diameter van 35 mm voor live beeldvorming en oriënteer het met behulp van een dunne haar. Verwijder het overtollige E3-medium en immobiliseer het embryo door er een druppel LMA op te doen en het te laten polymeriseren bij RT.
      OPMERKING: In het begin van het polymerisatieproces kunnen de vissen naar de gewenste positie worden gericht. Het wordt ten strengste aanbevolen om de LMA te gebruiken bij een temperatuur die niet hoger is dan 35 °C om weefselbeschadiging te voorkomen.
2. Microscopieparameters instellen en multispectrale FRET-beeldvorming van gastrulae uitvoeren (dag 4) (Figuur 2B)
   OPMERKING: Het protocol is van toepassing op het gebruik van alle confocale microscopieplatforms die zijn uitgerust met alle benodigde hardware en software om FRET-beeldvorming uit te voeren. Hier gebruikten we een confocale microscoop uitgerust met een argon-ionlaser met de golflengtelijnen van 458-476-488-496-514 nm, een programmeerbare akoestisch-optische bundelsplitser (AOBS) die excitatie- en emissielicht scheidt, twee spectrale hybride (HyD) detectoren en een podiumincubator om stabiele temperatuuromstandigheden (bij 28 °C) en vochtigheid te behouden tijdens live beeldvorming van monsters.
   Het live multispectrale FRET-beeldvormingsprotocol zoals beschreven kan worden toegepast op embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia buiten de vroege gastrulae, zoals aangetoond door Fasano et al.⁷. Een grotere z-stack moet worden overwogen voor latere ontwikkelingsstadia (bijv. 24 hpf), evenals geschikte z- en t-intervalinstellingen om multispectrale detectiestappen mogelijk te maken tijdens spectrale FRET-beeldacquisitie.
   1. Schakel de couveusecontroller ten minste 1 uur voor het begin van de afname in en stel de temperatuur in op 28 °C om zebravisembryo's in een gezonde staat te houden. Zodra de temperatuur van de broedmachine is gestabiliseerd, plaatst u de beeldvormingsschaal met het embryo op de monsterhouder en gebruikt u een 10x/droog objectief (numerieke apertuur van 0,4) om het monster snel te visualiseren.
   2. Schakel in de laserconfiguratie van de software waarnaar wordt verwezen de argon-ionlaser in en gebruik de schuifregelaar om het laservermogen aan te passen aan 50%. Kies in Hardware-instellingen de 8-bits diepteresolutie waarmee de afbeeldingen worden verkregen.
   3. Selecteer de XYλZ-scanmodus voor spectrale detectie in het acquisitiepaneel en stel de volgende acquisitieparameters in: beeldformaat: 512 x 512 px; scansnelheid van 400 Hz; optische zoom van 0,75.
   4. Activeer de 458 nm laserlijn van de argon-ionlaser en stel de intensiteitswaarde in, normaal <10% (hier 8,5%).
   5. Selecteer een HyD-detector en pas de gevoeligheid van de detector (versterking) aan door de gewenste waarde in te voeren (hier 500).
      OPMERKING: Voor live, zwak fluorescerende samples en om minder achtergrondgeluid op te hopen, is het raadzaam om hybride detectoren te gebruiken in plaats van Photomultiplier Tubes (PMT's).
      In de software waarnaar wordt verwezen, moet voor het weergeven van het emissiespectrum van een kleurstof een detector worden geactiveerd.
   6. Activeer om te beginnen de eerste detector (HyD) en selecteer het cyaanfluorescentie-eiwit (CFP) om de emissiecurve weer te geven. Open het dropdown menu van de detectorbalk van de software om de selectielijst voor de CFP-emissiecurve te openen. Activeer nu een tweede detector om de emissiecurve van de tweede kleurstof geel fluorescentie-eiwit (YFP) weer te geven. Om ook de Ypet-emissiecurve weer te geven, activeert u een tweede detector en selecteert u vervolgens de YFP-emissiecurve die in het spectrumbeeld zal verschijnen nadat u de tweede detector hebt uitgeschakeld.
      OPMERKING: Zodra deze stap is voltooid, moet de tweede detector worden gedeactiveerd, aangezien slechts één detector wordt gebruikt in de spectrale acquisitiemodus.
   7. Om live-acquisities te starten, plaatst u de detectiecursor in het bereik van de meest intense signaalemissie (in dit geval die van YFP) om het monster te visualiseren, te beslissen en de begin- en eindposities van de monsterdikte in het z-stack LAS X-venster in te stellen.
   8. Stel voor de eigenschappen van het λ-scanbereik de volgende parameters in: begin (460 nm) en einde (570 nm) van het detectiebereik; Breedte detectieband: 5 nm; λ-scan Stapgrootte: 5 nm. Start met de acquisitie van z-stack.
      OPMERKING: De aangegeven parameters stellen gebruikers in staat om een relatief snelle beeldvorming te verkrijgen met een acceptabele resolutie, maar er kunnen verschillende instellingen worden gebruikt. In de instellingen van de fluorifierschijf kan het automatisch geplaatste NOTCH-filter worden uitgeschakeld om verlies van enkele intensiteit te voorkomen.
   9. Om real-time signaalveranderingen bij blootstelling aan MEKi te beoordelen, monteert u een enkel mutant embryo (hier Shp2^D61G) in een glazen schaal en afbeelding voor en na de medicamenteuze behandeling. Voer voor deze live experimenten direct medicamenteuze behandeling uit door onderdompeling in een bad tijdens de beeldvormingssessie met een maximum van 2 ml van de oplossing die het opgeloste geneesmiddel bevat.
3. Nabewerking van beelden en multispectrale kleurstofscheiding om ratiometrische FRET-beelden te verkrijgen (dag 5) (Figuur 2C)
   1. Om de donor- (CFP) en acceptor- (Ypet)-emissie te scheiden, moet u ervoor zorgen dat de bijdrage van de fluorescentie-emissie van beide moleculen in het FRET-kanaal, spectrale bloeding (SBT) genaamd, wordt geëlimineerd.
      1. Raadpleeg de openbaar beschikbare databases met kleurstof/fluorescerende eiwitten om het .cvs-bestand weer te geven en te downloaden met betrekking tot een standaard CFP-emissiespectrum (excitatie- en emissiespectra).
      2. Kies in het deelvenster Gegevens van het cvs-bestand de optie Tekst naar kolommen en splits de gegevens op in kolommen met een komma als scheidingsteken. Het resulterende bestand bevat aanvullende informatie (bijv. CFP-excitatie, CFP 2P) die moet worden verwijderd. Bewaar alleen de kolomgegevens met betrekking tot golflengte en emissie.
      3. Verwijder in de kolom CFP-emissie alle intensiteitsgegevens vanaf 501 nm.
      4. Sla het aangepaste CFP-emissiespectrumbestand op van 460 tot 500 nm in .xls-formaat ("eCFP modified" genoemd in figuur 2C).
      5. Herhaal dezelfde procedure om het YFP-eiwitemissiespectrum te downloaden en te verwerken en bewaar alleen de kolomgegevens met betrekking tot golflengte en emissie. Verwijder alle emissiewaarden tot 524 nm. Sla het aangepaste YFP-emissiespectrumbestand op van 525 tot 650 nm in.xls formaat ("Ypet vanaf 525 nm" genoemd in figuur 2C).
      6. Om uitsluiting van spectrale doorbloeding (SBT) in de kleurstofdatabase die beschikbaar is in het configuratievenster van de software, twee aangepaste referentie-emissiespectra voor CFP en YFP in te voegen en op te slaan.
   2. Selecteer het resulterende spectrale beeldbestand uit de beeldvormingssessie, open het venster Proces en selecteer Spectrale kleurstofscheiding in de tool Kleurstofscheiding. Configureer de instellingen voor de kleurstofscheiding als volgt: selecteer in de vervolgkeuzelijsten aan de linkerkant van het dialoogvenster het nieuwe CFP-emissiespectrum (eCFP gewijzigd) op de eerste positie en het nieuwe YFP-emissiespectrum (Ypet vanaf 525 nm) uit de spectrumdatabase.
   3. Selecteer onder Schaal wijzigen de optie Per kanaal om de kanalen afzonderlijk te schalen en kies vervolgens in de λ-scan van de afbeeldingen het kanaal met de grootste signaalintensiteit (overeenkomend met stap 14 van de spectrale scan op het niveau van de FRET-kanaalemissiepiek, aangegeven door een witte pijl in het paneel met detectiestappen rechts van figuur 2B). Beweeg vervolgens langs de Z-scan van het monster en kies het optische gedeelte dat het interessegebied op de margezone markeert.
   4. Gebruik de ROI-selectiemodus op de randzone van de dierenpaal om het gebied met het beste spectrum te definiëren. Klik op ROICrosshair die bovenaan in het weergavevenster wordt aangegeven om het dradenkruis op te roepen en de grootte van de referentie-ROI aan te passen door de waarde van 40 voxels in te voeren in het gebied Metingen. Definieer nauwkeurig het interessegebied door de ROICrosshair. Kies in het afbeeldingsdiagram gegevensnormalisatie en klik vervolgens op Toepassen om de kleurstofscheiding uit te voeren met de geconfigureerde instellingen.
   5. Open dit nieuw gegenereerde bestand dat is verkregen met de twee kanalen gescheiden en produceer een tweedimensionaal projectiebeeld uit de driedimensionale beeldreeks (projectie met maximale intensiteit) voor gegevensvisualisatie.
   6. Selecteer in het venster Proces de optie Bijsnijden om kanalen te scheiden in twee afzonderlijke bestanden, de kanalen CH1 en CH2 (of FRET).
   7. Selecteer in het venster Proces de optie Afbeeldingen combineren, selecteer het CH2-bestand en voeg het in de eerste optie in, selecteer vervolgens het CH1-bestand en voeg het in de tweede optie in. Stel een herschaal in met factor 5 en kies de Ratio-bewerking. Klik vervolgens op Toepassen om het nieuwe bestand met de ratiometrische afbeelding (YFP/CFP) te genereren. Sla het bestand op voor vervolggegevensanalyse.
4. Kwantitatieve analyse van FRET-signalen en beeldweergave (dag 5-6) (Figuur 2D)
   1. Voor kwantitatieve metingen van FRET-signalen van FRET/CFP-ratiometrische beelden, voert u het experiment uit op N>2-embryo's (replicaten), afhankelijk van een a priori statistische beoordeling op basis van het verwachte effect. Gebruik een beeldverwerkingspakket zoals de open-source software Fiji. Importeer de beeldbestanden die zijn verkregen uit spectrale beeldvorming en kleurstofscheiding in een beeldanalysepakket zoals het open source Fiji.
   2. Voordat u begint met de ROI-selectie op de gastrulae-afbeeldingen, stelt u de parameters in als uitleesmetingen met behulp van de functie Analyseren | Set Metingen | selecteer de parameters die van belang zijn, zoals Gebied, Geïntegreerde dichtheid en Gemiddelde grijswaarde.
   3. Selecteer het interessegebied (in dit specifieke onderzoek: de marge van gastrula) met behulp van het polygoonselectiegereedschap in de werkbalk. Sla de ROI x,y-specificaties op door te klikken op Analyseren | Gereedschap | ROI-manager.
   4. Om metingen uit te voeren in een geselecteerde ROI, klikt u op Analyseren | Meten. Herhaal deze stappen voor elke ROI en afbeelding/voorwaarde.
      OPMERKING: Sla de afbeelding indien nodig op als . TIFF-formaat. Het is mogelijk om alle ROI-metingen die voortkomen uit meerdere afbeeldingen op te slaan als één ROI-bestand. Wijzig de naam van elke meting in de lijst met ROI-managers met de juiste naam ten opzichte van elk voorbeeld/afbeelding.
   5. Extraheer voor elke aandoening (mutant en mutant + behandeling hier) alle waarden van de FRET/CFP-ratio voor elke geselecteerde ROI die wordt verkregen en organiseer ze in een werkblad door bijvoorbeeld experimentele groepen in kolommen en elke ruwe waarde in rijen te organiseren.
   6. Gebruik geschikte software om statistische verschillen van FRET-signalen tussen verschillende experimentele omstandigheden te beoordelen en voor het genereren van grafieken en gegevensvisualisatie.
      OPMERKING: Er is open-source en gelicentieerde software beschikbaar voor gegevensanalyse en grafische oplossingen.
   7. Organiseer een specifiek project voor de statistische beoordeling, waarbij rekening wordt gehouden met alle ruwe metingen en het aantal replicaten voor elke experimentele conditie. Voor de statistische analyse van een enkele biologische replicaat maakt u een kolomtabel met één groeperingsvariabele, waarbij elke groep wordt gedefinieerd door een kolom. Voor de statistische analyse van meer dan één biologische replicaat maakt u gegroepeerde tabellen met ten minste twee groeperingsvariabelen, de ene gedefinieerd door kolommen (bijv. experimentele omstandigheden) en de andere gedefinieerd door rijen (bijv. gemiddelde waarden van duplo's).
   8. Nadat u de experimentele groepen op de juiste manier in het werkblad hebt gerangschikt, beoordeelt u de gegevensdistributie (normaliteitstest, bijv. D'Agostino-Pearson, Anderson-Darling) en kiest u op basis van het resultaat de meest geschikte statistische test.
      1. Voer een One-Way ANOVA uit voor parametrische gegevens (volgens de Gaussiaanse verdeling) en een Kruskal-Wallis-test voor niet-parametrische gegevens. Als er meer factoren aanwezig zijn (genetische en geneesmiddelconcentraties), overweeg dan een tweerichtings-ANOVA. Vergelijk de gemiddelde FRET-waarde voor elke aandoening met elkaar (meerdere vergelijkingen) en corrigeer voor meerdere vergelijkingen met behulp van een post hoc-test (bijv. Tukey's test en Dunn's voor respectievelijk parametrische en niet-parametrische gegevens).

3. IHC-validatie van de FRET-resultaten en correlatieve morfometrische analyse van gastrulatiedefecten

1. Bereiding van oplossingen en embryofixatie en montage voor IHC tegen tERK en pERK (dag 7) (figuur 3A)
   1. Bereid werkende oplossingen voor die nodig zijn voor IHC.
      1. Bereid een stockoplossing van 10x PBS door 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na₂HPO₄ en 2,4 g KH₂PO₄ op te lossen in 1 L DD-water. Autoclaaf de oplossing om deze steriel te houden.
      2. Bereid een 0,8% PBS-Triton (PBSTr) oplossing door 8 ml 10% Triton X-100 op te lossen in een eindvolume van 100 ml 1x PBS.
      3. Bereid 20%, 50% en 80% glyceroloplossingen door respectievelijk 3 ml, 7,5 ml en 12 ml 100% glycerol te verdunnen in een eindvolume van 15 ml 1x PBS.
   2. Bereid 4% paraformaldehyde (PFA)/0,25% PBSTr (fixatieve oplossing) door 2,5 ml 16% PFA te mengen in 250 μl 10% Triton X-100 eerder opgelost in een eindvolume van 10 ml 1x PBS. Gebruik deze oplossing om embryo's 's nachts bij 6 hpf bij 4 °C te fixeren. Gebruik 2 ml buisjes en maximaal vijf embryo's per buisje voor een efficiënte fixatie en wasbeurten.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om voor elke fixatieronde een nieuw fixatiemiddel te bereiden. LET OP: Draag bij het hanteren van formaldehyde met 16% persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en onder een chemische kap.
   3. Was de embryo's in de buisjes van 2 ml door de buisjes een paar keer te vullen met 1,5 ml 0,8% PBSTr. Breng de embryo's over in nieuwe buisjes van 2 ml en bewaar de embryo's in 1x PBS tot gebruik.
      OPMERKING: Als u niet bekend bent met de behandeling van vroege zebravisembryo's, werk dan onder een stereomicroscoop om embryoverlies tijdens het pipetteren te voorkomen. Gebruik "laagbindend" plastic om mogelijke plakkerigheid van de embryo's aan de buiswand te verminderen.
2. Weefselpermeabilisatie en IHC tegen pERK en tERK (dag 7-9)
   OPMERKING: IHC-resultaten zijn afhankelijk van meerdere variabelen die per laboratorium kunnen verschillen en specifieke optimalisatie van de protocollen kan nodig zijn.
   1. Was de gefixeerde zebravisembryo's in 1 ml 0,8% PBSTr gedurende 3 x 10 minuten bij RT.
   2. Permeabiliseer de monsters met 2 μL proteïnase K verdund in 0,8% PBSTr (1:1.000) gedurende 2 minuten bij RT.
   3. Stop de permeabilisatie van het weefsel door de monsters 3 x 10 minuten te wassen in 1 ml 0,8% PBSTr en fixeer de monsters gedurende 20 minuten in 500 μl 4% PFA/1x PBS bij RT. Was de monsters vervolgens in 1 ml 0,8% PBSTr gedurende 3 x 10 min.
      OPMERKING: De methode en de tijd die wordt gebruikt voor weefselpermeabilisatie zijn cruciale stappen die kunnen worden beïnvloed door het antigeentype, de kwaliteit van de weefselconservering en omgevingsfactoren. Optimaliseer het protocol voordat u het toepast op kostbare monsters.
   4. Incubeer de monsters met 1x blokkeerbuffer (BB) met 5% normaal geitenserum (NGS), 1% runderserumalbumine (BSA), 1% DMSO, als volgt bereid: 75 μl 100% NGS, 150 μl 10% BSA en 15 μl 100% DMSO in een eindvolume van 1,5 ml 0,8% PBSTr. Gebruik 200 μl van de oplossing per buis en incubeer de embryo's gedurende 20-30 minuten bij RT in de oplossing.
   5. Verwijder de 1x BB uit de vorige stap en incubeer de monsters in een oplossing met een mengsel van de gewenste primaire antilichamen (hier: verdunning van 1 μL primair monoklonaal antilichaam p44/42 MAPK bij muizen, totaal ERK, tERK, + 1 μL konijn polyklonaal fosfo-p44/42 MAPK, gefosforyleerd ERK, pERK) in 250 μL vers bereide 1x BB-oplossing. Gebruik 200 μl van de oplossing per buisje en incubeer de embryo's een nacht in de oplossing bij 20 °C.
   6. Om niet-specifieke binding te elimineren, wast u de monsters meerdere keren met 1 ml 0,8% PBSTr (eerst elke 10 minuten en vervolgens elke 30 minuten).
   7. Incubeer de monsters in vers bereide 1x BB gedurende 20 minuten bij RT. Gebruik 200 μL per buisje.
   8. Verwijder de 1x BB uit de vorige stap en incubeer de monsters met een mengsel van de secundaire antilichamen (1 μL fluorescerend 488 geconjugeerd geit anti-muis, + 1 μL fluorescerend geconjugeerd 633 geiten anti-konijn in 600 μL 1x BB oplossing). Laat de embryo's een nacht zachtjes schudden bij 20 °C.
      OPMERKING: We hebben IHC uitgevoerd op negatieve (niet transgene) tienervissen uit dezelfde batch die werd gebruikt voor FRET-beeldvorming. Als alternatief kunnen ook Teen⁺ vissen worden gebruikt, maar in dit geval moeten in plaats daarvan secundaire antilichamen worden gebruikt die zijn geconjugeerd aan fluoroforen die niet overlappen met de emissiespectra van CFP of YFP.
   9. Elimineer niet-specifieke binding zoals hierboven beschreven.
   10. Was de monsters in een gradiënt van glycerol/1x PBS-oplossingen (20%, 50%, 80%) gedurende 15 minuten per elke oplossing bij RT. Bewaar de monsters in 90% glycerol/1x PBS bij 4 °C.
       OPMERKING: Bewaar de monsters in het donker om mogelijk fluorescentieverval tot een minimum te beperken.
3. Confocale microscopie van immunogekleurd weefsel en kwantitatieve analyse (dag 10-11) (Figuur 3B-E)
   1. Monteer de embryo's zoals eerder beschreven.
   2. Stel de confocale microscopie-acquisitieparameters als volgt in: witte laser op 80%, fluorescentie-emissiebereik op 507 - 551 nm voor fluorescerend geconjugeerde geitenanti-muis (in dit geval met het emissiespectrum van 488 nm, gebruikt voor tERK), 644 - 740 nm voor fluorescerend geconjugeerd geitenanti-konijn (in dit geval met het emissiespectrum van 633 nm, gebruikt voor pERK). Selecteer een sequentiële acquisitiemodus , een formaatscanning van 512 x 512 px en een snelheid van 400 Hz. Definieer het begin en einde van de scan met een z-stapgrootte, dikte van 4 - 5 μm en standaard digitale zoom van 1. Gebruik een 25x objectief in water (met een numerieke opening van 0,05) om de hele gastrula met 6 hpf te verkrijgen
      LET OP: Dit protocol omvat de toepassing van lasers die schadelijk kunnen zijn; Daarom vereist het een opleiding van het personeel volgens de specifieke nationale vereisten.
   3. Na confocale beeldacquisitie inspecteert u het onbewerkte afbeeldingsbestand dat is verkregen met behulp van een beeldverwerkingspakket zoals de open-sourcesoftware Fiji.
      1. Gebruik in Fiji het commando Kanalen splitsen uit het menu Afbeelding en submenu Kleur om een afbeelding met één kanaal te verkrijgen (totaal ERK: kanaal = 0, C = 0; pERK: kanaal = 1, C = 1) en genereer een z-projectiebeeld met maximale intensiteit voor beide kanalen door op Afbeelding | Stapels | Z-project.
      2. Herhaal de procedure voor ROI-intensiteitsmetingen zoals eerder beschreven en extraheer de gegevens naar een werkblad.
      3. Om veranderingen in de p-ERK-signaalintensiteit in de gewenste ROI onder experimentele groepen af te leiden, berekent u de p-ERK/t-ERK-verhouding door de ruwe geïntegreerde dichtheidswaarden van p-ERK-kleuring te delen door de ruwe geïntegreerde dichtheid van het t-ERK-signaal. Ga verder met de beoordeling van de statistische significantie zoals in stap 2.4.
         OPMERKING: De instellingen van beeldvormingsparameters kunnen worden gewijzigd op basis van de specifieke behoeften en rekening houdend met de tijdsduur voor elk monster, de gewenste kwaliteit van de beelden en het aantal te verkrijgen vliegtuigen.
4. Metingen van assen in 11 hpf-embryo's (dag 4 voor embryofixatie, dag 12 voor gegevensverzameling en -analyse) (Figuur 4A-D)
   1. Aan het einde van de gastrulatie (11 hpf) fixeer je de embryo's met 4% PFA in 1x PBS gedurende 20 minuten bij RT, was je ze meerdere keren in 1x PBS en bewaar je ze bij 4 °C tot beeldacquisitie.
   2. Oriënteer de embryo's lateraal met behulp van een pasteurpipet in een enkel putje van een plaat met 12 putjes met verse 1x PBS.
   3. Om de aanwezigheid van een ovale vorm (Y/X embryo-assenverhouding > 1), een karakteristiek rasopathiefenotype bij zebravissen en de morfologische redding van embryo-assen als gevolg van de werkzaamheid van de behandeling te evalueren, verkrijgt u beelden van hele embryo's met behulp van een stereomicroscoop met een 3,4x vergrotingsobjectief (0,63x scanobjectief x 8,60 zoomfactor) door eenvoudig beelden vast te leggen in een helderveldmodus.
   4. Importeer het afbeeldingsbestand in een afbeeldingsanalysepakket, zoals het open source Fiji.
      1. Meet de lengte van de assen van de embryo's (x, kleine as; y, grote as) door het rechte gereedschap in de werkbalk te selecteren en op Analyseren | Meten. Nadat u geselecteerde metingen hebt uitgevoerd, voegt u deze toe aan de lijst met ROI-managers en slaat u het ROI-bestand op zoals hierboven uitgelegd voor FRET-beeldvormingsanalyse.
         OPMERKING: Herhaal deze stappen voor elk embryobeeld.
   5. Ga verder met het exporteren van de gegevens in een werkblad en bereken de asverhouding door de lengte van de hoofdas (y) te delen door de lengte van de secundaire as (x). Bereken het gemiddelde, de standaarddeviatie van het gemiddelde of de standaardfout van het gemiddelde van verschillende replicaten.
   6. Ga verder met de analyse van statistische gegevens zoals in stap 2.4.

Resultaten

Dit protocol toont een eenvoudige workflow om snel voorbijgaande RASopathiemodellen in zebravisembryo's te genereren en ERK-fluctuaties in vroege mutanten te beoordelen met een standaard live FRET-beeldvormingsmethode toegepast op een recent gevestigde ERK-zebravissensor ^6,9. Zoals onlangs aangetoond ^6,7 binnen dezelfde experimentele workflow, kunnen FRET-resultaten worde...

Discussie

Ondanks tientallen jaren van onderzoek en talloze mutaties die leiden tot zeer heterogene vormen van RASopathieën die nu in kaart zijn gebracht, blijven genetische varianten met onbekende betekenis voortkomen uit sequentie-inspanningen op niet-gediagnosticeerde patiënten. In veel gevallen kan diagnose uitsluitend op basis van klinische kenmerken een uitdaging zijn en functionele genomische benaderingen om sequentieresultaten te valideren blijven cruciaal. Bovendien, ondanks het feit dat ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Plasticwares
1.7 L Breeding Tank - Beach style Design	Tecniplast	1.7L SLOPED	Breeding tank
Capillaries GC100F-10	Harvard apparatus	30-0019	One-cell stage embryo microinjection
Cell and Tissue Culture Plates - 12 well	BIOFIL	TCP011012	Embryo collection and treatment
Cell and Tissue Culture Plates - 6 well	BIOFIL	TCP011006	Embryo collection and treatment
Cell Culture Dish	SPL Life Sciences	20100	Embryo collection
Nunc Glass Dishes 12mm	Thermo Fisher	150680	Embryo FRET spectral imaging
Pipette Pasteur	Corning	357524	Embryo transfer
Protein Lobind Tubes 2ml	Eppendorf	30108450	IHC assay
Reagents and others
Caviar 500-800 µm	Rettenmaier Italia	BE2269 (500-800)	Dry fish food
Great Salt Lake Blue Artemia Cysts	Sanders	00004727	Live fish food
Instant Ocean salt	Tecniplast	XPSIO25R	Dehydrated sea salt for live food preparation
Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Teen)	Contacts for ordering*: National BioResource Project Zebrafish, Support Unit for Animal Resources Development, RRD, RIKEN Center for Brain Science, Japan. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *upon MTA signature.	-	Supplier of ERK Reporter zebrafish line. Fish embryos can be obtained upon MTA signature from National BioResource Project of Japan for Zebrafish (RIKEN, Japan). The zebrafish line is deposited by Nara Institute of Science and Technology (Takaaki Matsui) and the National Institute of Genetics (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami, patent for Tol2 system) (Wong et al., 2018, Urasaki et al., 2006, Okamoto and Ishioka, 2010).
6x loading dye	Cell Signaling	B7024S	Gel Elecrophoresis
100 bp DNA ladder	NEB	N3231S	Gel Elecrophoresis
Agarose	Sigma-Aldrich	1,01,236	Gel Elecrophoresis
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Embryo mounting for FRET spectral imaging and IHC assay
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A8022	IHC assay
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	223506	E3 medium component
Calcium nitrate	Sigma-Aldrich	237124	Danieau stock solution component
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	IHC assay
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	TBE buffer component for gel preparation
Ethanol 99%+	Fisher Scientific	10048291	In vitro RNA purification
Formaldeide 16%	Thermo Fisher	28908	Embryo fixation
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037	Gel Elecrophoresis
Gel Loading Buffer II (Denaturing PAGE)	Thermo Fisher	AM8546G	In vitro RNA transcription
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	695092	TBE buffer component for gel preparation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279-1L	IHC assay
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	IHC assay
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 633	Thermo Fisher	A21070	IHC assay
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Danieau stock solution component
KpnI - HF (Enzyme + rCutSmart Buffer)	NEB	R3142	Plasmid linearization
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	230391	E3 medium component/Danieau stock solution component
Millennium RNA Markers	Thermo Fisher	AM7150	Gel Elecrophoresis
Monarch Genomic DNA purification Kit	NEB	T3010L	Plasmid linearization
Mouse monoclonal p44/42 MAPK	Cell Signaling	4696S	IHC assay
mMACHINE SP6 Transcription Kit	Thermo Fisher	AM1340	In vitro RNA transcription
Normal Goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	IHC assay
Nuclease-free water Ambion	Thermo Fisher	AM9937	In vitro RNA transcription
PD0325901	Sigma-Aldrich	PZ0162	MEK inhibitor
Phenol Red solution	Sigma-Aldrich	P0290	Microinjection mix component
Poly A Tailing Kit	Thermo Fisher	AM1350	In vitro RNA transcription
Potassium chloride bioxtra	Sigma-Aldrich	P9333	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P0662	PBS stock solution component
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308	IHC assay
Rabbit polyclonal phospho-p44/42 MAPK	Cell Signaling	4695S	IHC assay
SYBR safe DNA gel staining	Thermo Fisher	S33102	Gel Elecrophoresis
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	31434-M	E3 medium component/Danieau stock solution component/PBS stock solution component
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71643	PBS stock solution component
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	TBE buffer component for gel preparation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	PBSTr buffer component
Equipment
Alliance Mini HD9	Uvitec	-	Imaging system
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000205	Microcentrifuge
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	-	Embryo mounting
FemtoJet 4x	Eppendorf	-	Microinjection system
Infinite M Plex	Tecan	-	Multimode plate reader
Leica M205FA	Leica Microsystems	-	Fluorescence stereo microscope
Leica TCS-SP8X equipped with incubator (OkoLab)	Le