Hier presenteren we een protocol dat een chirurgisch model voor nierverkrijging beschrijft in een preklinisch varkensmodel voor daaropvolgende machineperfusie of transplantatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Nierverkrijging in een preklinisch groot diermodel
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Machineperfusie is geëvolueerd als een levensvatbare strategie voor ex vivo orgaanbeoordeling, monitoring, behandeling, optimalisatie en om de bewaartijden te verlengen. Grote diermodellen zijn van het grootste belang geweest voor de ontwikkeling en optimalisatie van deze technologieën. Om de kwaliteit van het transplantaat en de reproduceerbaarheid van de gegevens te waarborgen, moeten echter gestandaardiseerde en klinisch vertaalbare chirurgische technieken voor het verkrijgen van organen en weefsels worden gevolgd. Daarom beschrijven we hier een geoptimaliseerd protocol voor nierverkrijging in een preklinisch varkensmodel. Nierherstel wordt uitgevoerd met behulp van varkens van gemengd ras (Yorkshire cross/mix). In het kort, na steriele desinfectie en drapering van het operatieveld, wordt een volledige incisie in de middellijn uitgevoerd om optimale toegang tot beide nieren te krijgen. De urineleider, de nierader en de slagader worden ontleed tot hun oorsprong uit respectievelijk de inferieure vena cava en de aorta. Na volledige nierdissectie wordt de urineleider vastgebonden en distaal doorgesneden. Het donordier wordt vervolgens volledig gehepariniseerd met 100 IE per kg/lichaamsgewicht. Vervolgens wordt de nierslagader dicht bij de aorta vastgeklemd en wordt de nierader dicht bij de vena cava vastgeklemd met behulp van een Satinsky-vaatklem. Het niertransplantaat wordt vervolgens verwijderd en de nierslagader wordt onmiddellijk gecannuleerd. De nier wordt vervolgens gespoeld met een ijskoude conserveringsoplossing en op ijs bewaard tot machineperfusie of transplantatie. Ten slotte wordt de stomp van de nierslagader afgebonden met een 2-0 zijden ligatuur en wordt de vena cava gesloten met een 6-0 polypropyleen hechtdraad. Deze techniek herstelt nieren en simuleert een levende (enkele nier) of overleden (dubbele nier) donorinstelling. Het enkelvoudige nierherstel biedt het voordeel om een volgende autotransplantatie uit te voeren. In het model van de overleden donor kan bloed worden verzameld voorafgaand aan euthanasie door bloedzaknaalden rechtstreeks in de aorta te steken, waardoor het dier wordt verbloedd en bloed wordt geleverd voor ex vivo machineperfusie.
Inleiding
Niertransplantatie is de optimale behandeling voor nierziekte in het eindstadium (ESRD), die een betere kwaliteit van leven en langetermijnresultaten oplevert in vergelijking met dialyse1. Ondanks de vooruitgang op het gebied van orgaanbehoud, sterven elke dag tientallen mensen aan ESRD terwijl ze op de wachtlijst staan voor een niertransplantatie2. Machineperfusie is een groeiend veld dat de conserveringstijden verlengt, waardoor uitgebreide donornetwerken en efficiëntere orgaantoewijzing mogelijk worden. Deze technologie maakt ook ex vivo orgaanmonitoring en -optimalisatie mogelijk, waardoor de effecten van ischemie-reperfusieschade (IRI) worden geminimaliseerd. In vergelijking met statische koude opslag (SCS) is aangetoond dat machineperfusie de incidentie van vertraagde transplantaatfunctie aanzienlijk vermindert 3,4. Machineperfusie heeft ook revitalisering van marginale transplantaten aangetoond, die anders niet zouden hebben voldaan aan de criteria voor transplantatie5. Ondanks de technologische vooruitgang blijft de meest voorkomende conserveringstechniek SCS op ijs. Verdere preklinische experimenten en gegevens kunnen helpen om van machineperfusie een steunpilaar van nierbehoud te maken.
Het varkensmodel voor niertransplantatie is goed ingeburgerd en is een integraal onderdeel geweest van de ontwikkeling van nierconserveringstechnologie, met name machineperfusie. In tegenstelling tot de nieren van unilobulaire knaagdieren, zijn de nieren van varkens en mensen beide multilobulair, vergelijkbaar in grootte en delen ze analoge arteriële, veneuze en urinaire anatomie 6,7. Daarom vergemakkelijkt de varkensnier een directe vertaling naar de klinische setting, vooral op het gebied van medische hulpmiddelen en medicamenteuze therapieën. Bovendien vertonen varkensnieren een vergelijkbare pathofysiologie van IRI als menselijke nieren8, waardoor ze ideaal zijn voor onderzoeken naar nierbehoud.
Om de kwaliteit van het transplantaat en de reproduceerbaarheid van de gegevens te waarborgen, moeten gestandaardiseerde en klinisch vertaalbare chirurgische technieken voor het verkrijgen van organen en weefsels worden gevolgd. Daarom beschrijven we hier een geoptimaliseerd protocol voor nierverkrijging in een preklinisch varkensmodel. Dit protocol maakt het herstel van nieren mogelijk en simuleert een levende (enkele nier) of overleden (dubbele nier) donorinstelling. Het enkelvoudige nierherstel biedt het voordeel van het uitvoeren van een volgende autotransplantatie. In het model voor dubbel nierherstel is bloedafname voorafgaand aan euthanasie mogelijk door bloedzaknaalden rechtstreeks in de aorta in te brengen, waardoor het dier wordt verbloedd en bloed wordt geleverd voor ex vivo machineperfusie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle beschreven procedures zijn goedgekeurd door het Institutional Care and Use Committee van de Johns Hopkins University, een vergunning van het Amerikaanse ministerie van landbouw (USDA), een Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW)-geaccrediteerde instelling en de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC)-geaccrediteerde instelling. Dieren werden gehouden in overeenstemming met de Animal Welfare Act van het Amerikaanse ministerie van landbouw, de National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en het beleid van de Amerikaanse volksgezondheidsdienst inzake humane zorg en gebruik van proefdieren.
1. Dieren en huisvesting
- Gebruik voor dit protocol klinisch gezonde Yorkshire-varkens van 3-6 maanden oud (Sus scrofa domesticus), of vergelijkbaar, van 20-40 kg.
- Huisvesting van de dieren in hekwerken met kettingschakels en roostervloeren.
2. Preoperatieve procedure en anesthesie
- Vast het dier ten minste 12 uur voor de sedatietijd.
- Dien orale simethicon (20 mg/kg) ten minste 12 uur voor de operatie toe en herhaal de dosering ten minste 1 uur voorafgaand aan de sedatie om darmverwijding te verminderen.
- Dien ketamine (20-30 mg/kg) en xylazine (2-3 mg/kg) intramusculair toe in een enkele spuit om meerdere injecties te voorkomen.
- Breng het varken over naar de preoperatieve staging-ruimte. Plaats een intraveneuze katheter in een marginale oorader. Dien gedurende de hele procedure 3-10 mg/kg/h 0,9% zoutoplossing of Ringer-lactaatoplossing toe.
- Zodra het varken voldoende verdoofd is, plaatst u een endotracheale tube (6,0-6,5 mm omhulde endotracheale tube voor dieren van 20-30 kg; 6,5-7,0 mm met manchet voor 30-40 kg) voor het toedienen van gasanesthesie en mechanische beademing. Indien nodig vergemakkelijken met een dosis propofol (0,8-1,66 mg/kg) intraveneus, toegediend om effect te bereiken.
- Verwijder het haar op en rond de operatieplaats met behulp van een tondeuse, evenals een vuile schrobbeurt van de operatieplaats, voordat u het dier naar de operatiekamer verplaatst.
- Breng het dier over naar de operatietafel. Dien cefazoline (20-22 mg/kg) intraveneus toe 10 minuten voor aanvang van de operatie en opnieuw elke 90 minuten intraoperatief. Dien pantoprazol (0,5-1 mg/kg) intraveneus toe aan het begin van de operatie.
- Dien een lokaal blok subcutaan toe met lidocaïne (tot 2 mg/kg) om toegevoegde analgesie voorafgaand aan de incisie te vergemakkelijken.
- Bereid de operatieplaats aseptisch voor, afwisselend chloorhexidine of betadine en 70% ethanol of zoutoplossing, minstens drie keer.
- Bewaak continu het vloeistofvolume, de hartslag, de bloeddruk, de pulsoximetrie, de capnografie, de elektrocardiografie en de rectale temperatuur. Noteer deze waarden elke 10-15 minuten. Gebruik een verwarmd onderlichaam en een warmeluchtdeken om onderkoeling te voorkomen.
- Bevestig voorafgaand aan de start van de operatie dat het dier zich binnen het juiste vlak van chirurgische anesthesie bevindt door gebruik te maken van een combinatie van kaaktonus, ooglidreflex en parameters die in de vorige stap zijn vermeld.
3. Procedure voor het oogsten van de nieren
- Bereid het dier voor op de operatie volgens de stappen beschreven in sectie 2.
- Voer na steriele desinfectie en drapering van het operatieveld een mediane laparotomie (25-30 cm) uit om optimale toegang tot beide nieren te krijgen. Plaats een standaard buikretractor.
- Bedek de dikke darm en de dunne darm met handdoeken gedrenkt in warme zoutoplossing. Trek de darmen terug naar de rechterkant voor toegang tot de linkernier of naar de linkerkant voor toegang tot de rechternier.
- Open het buikvlies dat over de nier ligt en ontleed rond de nier om eventuele verklevingen te verwijderen. Ontleed de urineleider tot 10-12 cm lengte is verkregen.
- Ontleed de nierader en slagader tot hun oorsprong uit respectievelijk de inferieure vena cava en de aorta.
- Bind na volledige nierdissectie de urineleider distaal vast met 2-0 zijden ligatuur en snijd proximaal van de stropdas. Laat het uiteinde van de proximale urineleider open om urineafvoer mogelijk te maken.
- Hepariniseer het dier met intraveneuze heparine (100 IE/kg) en wacht 2 minuten om een adequate heparinisatie van de nier te garanderen. Deze stap moet worden herhaald voorafgaand aan de resectie van elke nier.
- Klem de nierslagader en de nierader dicht bij respectievelijk de aorta en de inferieure vena cava vast met twee Satinsky-vaatklemmen. Verwijder het niertransplantaat door de nierslagader en -ader dicht bij de klemmen door te snijden.
- Cannuleer de nierslagader onmiddellijk met een perfusiecanule met stompe punt van 3 mm. Spoel de nier met ijskoude oplossing van de Universiteit van Wisconsin (UW) of Custodiol histidine-tryptofaan-ketoglutaraat (HTK) conserveringsoplossing.
- Verwijder de perfusiecanule na het spoelen met UW of HTK en plaats de nier in een steriele orgaanzak gevuld met dezelfde ijskoude conserveringsoplossing die werd gebruikt voor het spoelen van de nier. Plaats deze zak in een tweede steriele orgaanzak. Sla vervolgens het orgaan op of start machineperfusie.
- Ligate de stomp van de nierslagader met een 2-0 zijden ligatuur. Sluit de nieraderstomp af met een tweelaagse lopende hechtdraad met 6-0 polypropyleen.
4. Procedure voor bloedafname
- Als de procedure terminaal is en alle andere chirurgische ingrepen zijn uitgevoerd, ga dan verder met het oogsten van bloed voor machineperfusie en euthanasie door verbloeding.
- Trek de darmen terug naar de rechterkant en identificeer de infrarenale abdominale aorta. Maak alle grote verklevingen of weefsel dat het vat bedekt vrij.
- Steek de naald van de bloedafnamezak rechtstreeks in de aorta. Hang de zak onder het dier om het vullen te vergemakkelijken. Zodra de zak vol is (ongeveer 450 ml bloed), verwijdert u de naald uit de aorta en houdt u druk op de prikplaats.
- Steek voor een tweede bloedzak de nieuwe naald 1-2 cm proximaal in op de vorige prikplaats. Herhaal dit met meerdere bloedzakken indien nodig, waarbij u met elke naald 1-2 cm proximaal beweegt.
- Nadat al het benodigde bloed is verzameld, wordt een hartstilstand geïnduceerd met intraveneuze injectie van pentobarbitalnatrium/fenytoïnenatrium in een dosis van ten minste 78 mg/kg van de pentobarbitalcomponent. Als er bezorgdheid bestaat dat pentobarbital de daaropvolgende tests van de nier zal verstoren, gebruik dan kaliumchloride (KCl) (75-100 mg/kg IV) als alternatieve chemische euthanasiemethode als het onder narcose aan varkens wordt toegediend. Controleer de dood door gebrek aan hartslag, afwezigheid van hoornvliesreflex en een significante daling van de lichaamstemperatuur.
LET OP: De overige organen en weefsels van het geofferde varken kunnen worden gebruikt voor andere onderzoeks- of onderwijsdoeleinden in overeenstemming met de 3V-principes.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Onze onderzoeksgroep heeft een brede ervaring van bijna 15 jaar met varkensmodellen van zowel solide orgaantransplantatie als gevasculariseerde composiet allotransplantatie 9,10,11,12,13,14,15,16,17
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het varkensmodel voor niertransplantatie is van vitaal belang geweest voor de ontwikkeling en optimalisatie van machineperfusietechnologie. Gezien de anatomische, immunologische en pathofysiologische overeenkomsten met menselijke nieren 6,7,8, bieden varkensnieren een vereenvoudigde vertaling naar klinische tests en praktijk.
Het model van...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de vele veterinaire technici van de Johns Hopkins University School of Medicine bedanken voor hun technische hulp. We willen ook onze dankbaarheid betuigen aan Drs. Jessica Izzi en Amanda Maxwell, en de talrijke veterinaire bewoners, waaronder Drs. Mallory Brown, Jessica Plunkard en Alexis Roach voor het bieden van uitstekende klinische zorg en veterinair toezicht aan onze dieren. Ten slotte willen we alle leden van het Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Laboratory van de Johns Hopkins School of Medicine erkennen die in welke hoedanigheid dan ook hebben geholpen bij het verkrijgen van nieren of andere orgaanverkrijgingsprocedures die in ons laboratorium zijn uitgevoerd. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) subsidie R44DK136396.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 70% Ethanol Solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Adson Tissue ForceA2:D30ps, 4.75", 1 x 2 Teeth | Wexler Surgical | FL0081.1 | |
| Bair Hugger Animal Health Overbody Blanket | 3M | 53777 | |
| Bair Hugger Warming Unit | 3M | 77500 | |
| Balfour Abdominal Retractor w/ Fixed Side Blades, 4" Deep, 10" Maximum Spread | MPM Medical Supply | 124-7017 | |
| Betadine Solution (5% Providone-iodine) | MWI Animal Health | NDC-67618-155-01 | |
| Cefazolin for Injection, USP | MWI Animal Health | NDC-63323-237-10 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Animal Health | NDC-30798-624-31 | |
| Custodial HTK Organ Preservation Solution | Essential Pharmaceuticals | 25767073545 | |
| DeBakey Tissue Forceps, 7.75", 2 mm Tips | Wexler Surgical | FL0789.1 | |
| EUTHASOL (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) | Virbac | NDC-051311-050-01 | |
| Heparin Sodium Injection, USP | MWI Animal Health | NDC-71288-402-10 | |
| Hot Dog Temperature Management Controller | Augustine Surgical Inc. | WC71V | |
| Hot Dog Veterinary Underbody Warming Mattress | Augustine Surgical Inc. | V106 | |
| Invisishield Isolation Bag, 20" x 20" | Medline | DYNJSD1003 | |
| Jacobson Micro Needle Holder, Straight Jaws, Round Handle, 7.25" | Wexler Surgical | NL0729.11 | |
| Ketamine Hydrochloride Injectable Solution | NexGen Pharmaceuticals | NC-0256 | |
| Lap Sponges 18" x 18" | Medline | MDS231318LF | |
| Metzenbaum Dissection Scissors, 7" Curved | Wexler Surgical | SL5011.1S | |
| Non-Conductive Suction Tubing with Scalloped Connectors, 1/4" x 10' | Medline | DYND50251 | |
| Pantoprazole Sodium for Injection | MWI Animal Health | NDC-55150-202-00 | |
| Perfusion Cannula, Free-Flow, 3 mm Blunt Tip | MED Alliance Solutions | PER-3003S | |
| Rigid Bulb Tip Yankauer | Medline | DYND50130 | |
| Satinsky Clamp, 30 mm Angled DeBakey Atraumatic Jaws, Curved Shanks, 10" | Wexler Surgical | AL2150.1 | |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Servator B UW (University of Wisconsin) | Global Transplant Solutions | JFISERB10A r2 | |
| Single Collection Unit Prefilled CPDA-1, 450 mL | Jorgensen Laboratories | JO520 | |
| Sofsilk Suture Tie, 2-0, Black, 18" | Covidien | S-195 | |
| Surgical Scalpel Blade No. 10 | World Precision Instruments | 500239 | |
| Surgipro II Suture, 6-0, Blue, 30", Double Armed, CV-22 Needle | Covidien | VP-733-X | |
| Three-Quarter Surgical Drape | Medline | DYNJP2414 | |
| Valleylab Electrosurgical Pencil with Stainless Steel Electrodes | Covidien | CVNE2516H | |
| Valleylab Force FXc Electrosurgical Generator | Covidien | MFI-MDT-FORCE-FXC | |
| Valleylab Polyhesive Adult Patient Return Electrode | Covidien | E7507-SD | |
| Xylazine Hydrochloride Injectable Solution | NexGen Pharmaceuticals | NC-0334 |
Referenties
- Merion, R. M., et al. Deceased-donor characteristics and the survival benefit of kidney transplantation. JAMA. 294 (21), 2726-2733 (2005).
- Lentine, K. L., et al. OPTN/SRTR 2022 annual data report: Kidney. Am J Transplant. 24 (2S1), S19-S118 (2024).
- Hosgood, S. A., et al. Normothermic machine perfusion versus static cold storage in donation after circulatory death kidney transplantation: a randomized controlled trial. Nat Med. 29 (6), 1511-1519 (2023).
- Malinoski, D., et al. Hypothermia or machine perfusion in kidney donors. N Engl J Med. 388 (5), 418-426 (2023).
- Hamar, M., Selzner, M. Ex vivo machine perfusion for kidney preservation. Curr Opin Organ Transplant. 23 (3), 369-374 (2018).
- Pereira-Sampaio, M. A., Favorito, L. A., Sampaio, F. J. Pig kidney: anatomical relationships between the intrarenal arteries and the kidney collecting system. Applied study for urological research and surgical training. J Urol. 172 (5 Pt 1), 2077-2081 (2004).
- Bagetti Filho, H. J., Pereira-Sampaio, M. A., Favorito, L. A., Sampaio, F. J. Pig kidney: anatomical relationships between the renal venous arrangement and the kidney collecting system. J Urol. 179 (4), 1627-1630 (2008).
- Giraud, S., et al. Contribution of large pig for renal ischemia-reperfusion and transplantation studies: the preclinical model. J Biomed Biotechnol. 2011 (21), 532127(2011).
- Girard, A. O., et al. Hickman catheter use for long-term vascular access in a preclinical swine model. J Vis Exp. (193), e65221(2023).
- Gerling, K. A., et al. A novel sutureless anastomotic device in a swine model: A proof of concept study. J Surg Res. 291, 116-123 (2023).
- Etra, J. W., et al. Latissimus Dorsi myocutaneous flap procedure in a swine model. J Invest Surg. 34 (12), 1289-1296 (2021).
- Etra, J. W., et al. A skin rejection grading system for vascularized composite allotransplantation in a preclinical large animal model. Transplantation. 103 (7), 1385-1391 (2019).
- Al-Rakan, M., et al. Ancillary procedures necessary for translational research in experimental craniomaxillofacial surgery. J Craniofac Surg. 25 (6), 2043-2050 (2014).
- Santiago, G. F., et al. Establishing cephalometric landmarks for the translational study of Le Fort-based facial transplantation in Swine: enhanced applications using computer-assisted surgery and custom cutting guides. Plast Reconstr Surg. 133 (5), 1138-1151 (2014).
- Ibrahim, Z., et al. Cutaneous collateral axonal sprouting re-innervates the skin component and restores sensation of denervated Swine osteomyocutaneous alloflaps. PLoS One. 8 (10), e77646(2013).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. J Vis Exp. (80), e50475(2013).
- Wachtman, G. S., et al. Biologics and donor bone marrow cells for targeted immunomodulation in vascularized composite allotransplantation: a translational trial in swine. Transplant Proc. 43 (9), 3541-3544 (2011).
- Kaths, J. M., et al. Heterotopic renal autotransplantation in a porcine model: A step-by-step protocol. J Vis Exp. 108, e53765(2016).
- Liu, W. J., et al. Orthotopic kidney auto-transplantation in a porcine model using 24 hours organ preservation and continuous telemetry. J Vis Exp. (162), e61591(2020).
- Steinhauser, C., et al. Assessment of hemodynamic and blood parameters that may reflect macroscopic quality of porcine kidneys during normothermic machine perfusion using whole blood. World J Urol. 42 (1), 471(2024).
- Kaths, J. M., et al. Normothermic ex vivo kidney perfusion for graft quality assessment prior to transplantation. Am J Transplant. 18 (3), 580-589 (2018).
- Urcuyo, D., et al. Development of a prolonged warm ex vivo perfusion model for kidneys donated after cardiac death. Int J Artif Organs. 40 (6), 265-271 (2017).
- Vallant, N., et al. A comparison of pulsatile hypothermic and normothermic ex vivo machine perfusion in a porcine kidney model. Transplantation. 105 (8), 1760-1770 (2021).
- Hosgood, S. A., Saeb-Parsy, K., Hamed, M. O., Nicholson, M. L. Successful transplantation of human kidneys deemed untransplantable but resuscitated by ex vivo normothermic machine perfusion. Am J Transplant. 16 (11), 3282-3285 (2016).
- Vallant, N., Wolfhagen, N., Sandhu, B., Hamaoui, K., Papalois, V. Delivery of mesenchymal stem cells during hypothermic machine perfusion in a translational kidney perfusion study. Int J Mol Sci. 25 (9), 5038(2024).
- Uzarsk, J. S., et al. Sustained in vivo perfusion of a re-endothelialized tissue engineered kidney graft in a human-scale animal model. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1184408(2023).
- Anand, R. P., et al. Design and testing of a humanized porcine donor for xenotransplantation. Nature. 622 (7982), 393-401 (2023).
- Pan, W., et al. Cellular dynamics in pig-to-human kidney xenotransplantation. Med. 5 (8), 1016-1029 (2024).
- Golriz, M., et al. Pig kidney transplantation: an up-to- date guideline. Eur Surg Res. 49 (3-4), 121-129 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
