Oprichting en evaluatie van een in vitro human-based geavanceerd model van longfibrose

Summary

Er werd een beeldvormingsmethode ontwikkeld om de activering van fibroblasten in menselijke, nauwkeurig gesneden longplakjes te evalueren op basis van fibroblastactiveringseiwit (FAP). Deze methodologie creëert een robuust en reproduceerbaar platform voor het stadiëren van fibrotische progressie, het bevorderen van translationele in vitro modellen voor therapeutische ontwikkeling met behoud van de getrouwheid van de micro-omgeving van het menselijk weefsel.

Abstract

Longfibrose wordt gekenmerkt door onomkeerbare vernietiging van de alveolaire structuur en overmatige afzetting van de extracellulaire matrix. Hoewel diermodellen op grote schaal zijn gebruikt in onderzoek naar longfibrose, is geen van de momenteel beschikbare modellen een volledige samenvatting van de progressieve aard van IPF of het bepalende histologische kenmerk ervan, zoals fibroblastische foci. Geavanceerde in-vitromodellen , waaronder precisiegesneden longplakjes (PCLS), worden vaak beschouwd als het meest fysiologisch relevante longtestsysteem en zijn met succes gebruikt voor het screenen van geneesmiddelen. Desalniettemin heeft het onvermogen om de mate van fibrose in de IPF-long te differentiëren geleid tot verblinding en onzekerheid in de verkregen PCLS. Eerder onderzoek toonde aan dat fibroblastactiveringseiwit (FAP) de pro-fibrotische activiteit van ILD zou kunnen evalueren, wat mogelijk kan bijdragen aan een vroege diagnose en de selectie van geschikte therapeutische vensters. In deze studie zal 600 μm PCLS worden verkregen van gezonde donoren en IPF-patiënten met behulp van een shockslicer en geëvalueerd met behulp van moleculaire sondes gericht op FAP om de mate van fibroblastactiviteit te bepalen op basis van fluorescerende signaalintensiteit. Deze benadering biedt een geavanceerd in vitro model en evaluatietechniek voor onderzoek naar longfibrose, waardoor het beter mogelijk wordt om ziektemechanismen te bestuderen en therapeutische interventies te beoordelen.

Introduction

Longfibrose (PF) is een veel voorkomende vorm met een onbekende etiologie en een bijzonder slechte prognose, met een mediane vijfjaarsoverleving van slechts 25%¹. Het intratracheale toedieningsmodel van bleomycine is momenteel het meest gebruikte diermodel voor preklinische studies². Fibrose geïnduceerd door bleomycine is echter van voorbijgaande aard en verdwijnt na verloop van tijd, wat in schril contrast staat met de onomkeerbare aard van IPF³. Bovendien brengt het intratracheale bleomycinemodel aanzienlijke uitdagingen met zich mee vanwege de heterogene ernst van fibrose als gevolg van endotracheale toediening, zowel chirurgisch als niet-chirurgisch. Deze beperkingen van de huidige diermodellen dragen bij aan het hoge faalpercentage van klinische onderzoeken gericht op IPF⁴.

Precisiegesneden longplakjes (PCLS) zijn bij verschillende ziekten gebruikt omdat ze ziektespecifieke cellulaire overspraaknetwerken en de micro-omgeving getrouw behouden ^5,6,7. Bij longfibrose behoudt PCLS uit IPF-longen de natuurlijke weefselarchitectuur en cellulaire heterogeniteit, waardoor observatie van verschillende celtypen en cel-extracellulaire matrixinteracties mogelijk is ^8,9, waardoor ze een representatief ex vivo model worden voor het onderzoeken van pulmonale pathofysiologie. Omdat longfibrose echter wordt gekenmerkt door heterogene fibrotische laesies in de longen, is PCLS-bemonstering inherent blind. Het is niet mogelijk om visueel te onderscheiden of de verkregen secties fibrotische gebieden in de rustfase, actieve fase of normaal longweefsel vertegenwoordigen. Deze beperking onderstreept de noodzaak van visuele beoordelings- en screeningsinstrumenten. Eerder onderzoek wees uit dat fibroblastactiveringseiwit (FAP) sterk en specifiek tot expressie kwam in het longweefsel van IPF-patiënten, wat aangeeft dat FAP de pro-fibrotische activiteit van ILD¹⁰ kon evalueren.

In deze studie werd een enkelvoudig ketenantilichaam tegen FAP gelabeld met indocyaninegroen (ICG) om een gerichte moleculaire beeldvormingssonde te ontwikkelen met verbeterde weefselpenetratie. De 600 μm PCLS verkregen van gezonde donoren en IPF-patiënten werden in beeld gebracht met behulp van deze sonde en de fibroblastactiviteit werd beoordeeld op basis van de intensiteit van het fluorescerende signaal. Deze beeldvormingsmodaliteit presteert beter dan conventionele fibrosebeoordelingstechnieken (Western blotting, qPCR, trichrome kleuring van Masson of immunofluorescentie) door de eenvoud van de bediening, het behoud van de cytoarchitecturale integriteit en levensvatbaarheid en tegelijkertijd longitudinale tracking van pathogene progressie mogelijk te maken. Wat nog belangrijker is, het is eenvoudig te bedienen en vereist slechts 90 minuten. Dit biedt een geavanceerd screeningsinstrument voor het PCLS in vitro model, dat onderzoek naar longfibrose faciliteert.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het eerste ziekenhuis van de Guangzhou Medical University (2021G-29). IPF werd gediagnosticeerd op basis van lichamelijk onderzoek en bevindingen van computertomografie met hoge resolutie van de borstkas, volgens de diagnostische criteria die zijn vastgesteld door ATS/ERS/JRS/ALAT (2022). Alle monsters van IPF-patiënten werden verkregen door middel van longtransplantatie of longbiopsie. Gezonde longweefselmonsters werden verkregen van orgaandonoren bij wie hersendood was vastgesteld10. Voorafgaand aan de afname werd schriftelijke toestemming verkregen voor weefselafname van elke patiënt of de familie van de patiënt. Raadpleeg de materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, oplossingen en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.

1. Bereiding van menselijke PCLS

OPMERKING: Patiënten worden routinematig gescreend op virussen zoals HIV, HCV of syfilis voorafgaand aan longtransplantatie of biopsie, en moeten negatief testen voordat ze doorgaan met volgende experimenten om de veiligheid van het laboratoriumpersoneel op het werk te waarborgen.

1. Oplossingen voorbereiding
   1. Bereid de fosfaatgebufferde oplossing (1× PBS) en koel voor bij 4 °C.
   2. Bereid 2% agarose-oplossing. Weeg 2 g agarose af en doe deze in een erlenmeyer. Voeg 100 ml PBS toe, meng grondig en verwarm in een magnetron tot het mengsel krachtig kookt (≥95 °C), waardoor het volledig helder, homogeen en vrij van zichtbare deeltjes of strepen wordt. Draai de kolf af en toe tijdens het verwarmen om overmatig koken te voorkomen. Plaats de oplossing tot gebruik in een waterbad van 37 °C.
2. Nauwkeurig gesneden longschijfjes
   1. Was het uitwendige oppervlak van het longweefsel met PBS om overtollige onzuiverheden en bloed te verwijderen.
   2. Gebruik een spuit van 20 ml (naald van 1,2 mm) om een geschikte hoeveelheid agarose op te zuigen en breng deze in de luchtpijp in. Injecteer agarose langzaam in de longkwabben totdat deze volledig is opgeblazen. Stop de injectie bij duidelijke weerstand om lekkage van agarose te voorkomen.
      OPMERKING: Ongeveer 10 ml agarose is nodig voor elk weefselblok van 5 × 2 × 1 cm, om overloop te voorkomen. Gebruik voor kleinere stukjes weefsel een spuit van 5 ml en inbeddingsvormpjes (bijv. siliconen vormpjes, plastic bakjes of centrifugebuisjes op maat gesneden) om het inbedden te vergemakkelijken. Giet een 1-2 mm dikke basislaag agarose in de vorm en laat deze half stollen. Plaats het longweefsel voorzichtig op de halfvaste agarose en giet dan langzaam extra agarose om het weefsel volledig te bedekken, waarbij luchtbellen worden vermeden. Laat de agarose volledig stollen.
   3. Plaats de longen ongeveer 30 minuten op ijs om agarosepolymerisatie mogelijk te maken. Controleer het borstvlies op hardheid en koelte om polymerisatie te bevestigen; Blijf indien nodig afkoelen.
   4. Snijd het longweefsel met een scherp mes in plakken van 1-2 cm.
   5. Centreer de ijsbadschaal op de snijbank en vul deze van tevoren met ijsblokjes om voor te koelen.
   6. Zet de aan/uit-schakelaar aan en houd de UP-knop ingedrukt om de sampletrap naar een geschikte positie te brengen.
   7. Plaats het mes voorzichtig op de meshouder.
      OPMERKING: Behandel het mes voorzichtig om letsel te voorkomen. Gooi gebruikte messen weg in de daarvoor bestemde naaldencontainers.
   8. Knip een stuk tape af van ongeveer 3 cm lang en 1 cm breed. Bevestig de plakkerige kant aan de bak en smeer de niet-plakkerige kant gelijkmatig in met cyanoacrylaatlijm.
   9. Pak een stuk longweefsel op met een tang. Dep het oppervlak droog met absorberend papier en plaats het op de met lijm beklede tape. Druk zachtjes om een stevige hechting te garanderen.
   10. Nadat de lijm is uitgehard, laadt u de bak op de ijsbadbak. Vul met voorgekoelde PBS totdat het weefselblok is ondergedompeld.
   11. Stel de trillingsfrequentie in op "10" en de snijsnelheid op "2". Druk op de FWD-knop om te beginnen met snijden. Nadat de eerste plak volledig is gesneden, drukt u op de STP-knop om te stoppen en drukt u vervolgens op de RVE-knop om het mes in te trekken. Gooi het eerste plakje weg.
   12. Draai de draaitafel 6 keer handmatig om de sectiedikte in te stellen op 600 μm. Druk op de FWD-knop om het snijden te hervatten en druk op de STP-knop nadat het gedeelte is gesneden. Druk op RVE om het mes in te trekken en haal het longplakje op met een pincet. Plaats het plakje in PBS met 1% penicilline/streptomycine (P/S) en bewaar het op ijs.
   13. Herhaal de bovenstaande snijstappen om extra PCLS te verkrijgen, elk ongeveer 600 μm dik.
   14. Wanneer het huidige weefselblok bijna uitgeput is, vervangt u het door een nieuw weefselblok en herhaalt u de stappen 1.2.4 tot 1.2.13.

2. Zuivering van FAP-antilichamen

OPMERKING: Genereer het FAP-specifieke single-domain antilichaam dat een C-terminal Zijn tag bevat zoals eerder beschreven^11,12.

1. Voer faagweergave uit om high-throughput selectie van FAP-specifieke antilichaamfragmenten (scFv) mogelijk te maken door combinatorische bibliotheken herhaaldelijk te pannen tegen geïmmobiliseerde doelen of doelen in de oplossingsfase. Herstel gebonden fagen door streng wassen en elutie. Versterk fagen door E. coli opnieuw te infecteren en verrijk doelbindmiddelen gedurende 3-4 cycli. Valideer klonen met behulp van faag-ELISA en DNA-sequencing om antilichamen met hoge affiniteit te identificeren¹².
2. Kloneer de DNA-sequentie die codeert voor het anti-FAP single-chain variabele fragment in de pET-28a(+) vector gefuseerd met een His tag voor expressie in E. coli¹³.
3. Transformeer het recombinante plasmide in E. coli BL21 (DE3) cellen. Induceer eiwitexpressie met behulp van isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) in schudkolfculturen die 's nachts bij 20 °C¹⁴ worden geïncubeerd.
4. Zuiver het FAP-antilichaam van het bovenstaande met behulp van nikkel-nitralomazijnzuur (Ni-NTA) kralen. Voer bufferuitwisseling uit met PBS voor downstreamtoepassingen.
5. Beoordeel de zuiverheid van antilichamen door natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE). Een enkele dominante band met het verwachte molecuulgewicht duidt op een hoge zuiverheid.

3. Beoordeling van de affiniteit van FAP-antilichamen

1. Kweek menselijke embryonale nier 293T (HEK 293T) cellen in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine.
2. Voeg lentivirus met overexpressie van humaan fibroblastactiveringseiwit (hFAP) toe aan 293T-cellen met 90% samenvloeiing. Incubeer gedurende 96 uur om een stabiele 293T-hFAP-cellijn te genereren.
3. Verteer zowel 293T- als 293T-hFAP-cellen met 0,25% trypsine-EDTA en verzamel de cellen.
4. Was de cellen met PBS en incubeer met FAP-antilichaam, gevolgd door Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-His IgG.
5. Analyseer de fluorescentie-intensiteit met behulp van een NovoCyte-flowcytometer^15,16.

4. scFv-FAP-ICG molecuul sonde labeling

1. Pas de concentratie van FAP-scFv aan op 2 mg/ml met behulp van PBS.
2. Voeg indocyaninegroene NHS-ester (ICG-NHS) toe om een molaire verhouding van 5:1 (ICG-NHS:FAP-scFv) te bereiken.
3. Meng grondig door vortexen en schudden.
4. Incubeer de reactie in het donker bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
5. Verwijder ongebonden kleurstof met behulp van een ontziltingskolom. Bewaar het uiteindelijke geconjugeerde product bij 4 °C in het donker.

5. scFv-FAP-ICG moleculaire sonde voor het evalueren van de mate van fibroblastactiviteit in PCLS

1. Plaats na het snijden van de PCLS een sectie per putje in een plaat met 12 putjes. Spoel elk goed twee keer met 1 ml PBS om achtergebleven bloed en vuil te verwijderen.
2. Dompel de PCLS onder in 1 ml DMEM zonder FBS. Voeg scFv-FAP-ICG toe in een eindconcentratie van 5 μg/ml. Incubeer op een shaker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met zacht schudden, beschermd tegen licht.
3. Was de monsters drie keer met PBS, elk gedurende 5 minuten.
4. Verkrijg ICG-fluorescentiebeelden van PCLS met behulp van het in vivo beeldvormingssysteem voor dieren met de volgende instellingen: excitatiegolflengte bij 785 nm en emissiegolflengte bij 810 nm.
5. Beoordeel de fibrose-activiteit van PCLS op basis van fluorescentie-intensiteit. Definieer interessegebieden (ROI) met behulp van compatibele software, waarbij fluorescentiestraling wordt uitgedrukt als fotonen/s/cm²/sr.
   1. Klik op de knop ROI selecteren om de software automatisch het pseudo-gekleurde gebied te laten omlijnen. Als de ROI-plaatsing onnauwkeurig is, past u deze handmatig aan. Klik op Berekenen om de signaalsterkte binnen de regio te bepalen. Als er meerdere subregio's zijn geselecteerd, telt u de waarden van alle subregio's op.

Results

De bereidingsprocedure voor PCLS van menselijk longweefsel is weergegeven in figuur 1. Menselijk longweefsel werd ingebed in agarose en vervolgens met een scheermesje in weefselblokken van ongeveer 1 cm³ groot gesneden. Bijgesneden en afgeplatte weefsels werden met behulp van een microtoom op een platform aangebracht om te worden doorgesneden met een dikte van 600 μm (Figuur 1A,B). PCLS werden geïncubeerd in platen me...

Discussion

Door middel van bovenstaande onderzoeksmethoden werden PCLS van gezonde donoren en IPF-patiënten voorbereid. Tegelijkertijd werden zoogdiercellen gebruikt om variabele fragmenten van FAP met één keten tot expressie te brengen, en hun zuiverheid en specificiteit werden geverifieerd. Een moleculaire sonde gericht op FAP en gelabeld met ICG werd gebruikt om FAP-expressieniveaus te detecteren, die de mate van fibroblastactivering weerspiegelden. Deze aanpak biedt een geavanceerde evaluatieme...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 % trypsin-EDTA	Gibco	15050-057
2× Color SYBR Green qPCR Master Mix (ROX2)	EZBioscience	A0012-R2
20 ml spuit	Winner	V532159
293T cell	Beyotime	C6008
502 lijm	Zhuolide	D-40
Agarose, lage geleertemperatuur	Sigma Aldrich	A9414-25G
Anti-Collageen I antilichaam	abcam	ab138492
Anti-Fibronectin antilichaam	abcam	ab2413
Anti-His-tag mAb-Alexa Fluor 488	MBL	D291-A48
BL21	Beyotime	D1009S
Blade	Gillette	7in83a7Q
Color Reverse Transcriptie Kit (met gDNA Remover)	EZBioscience	A0010CGQ
Coomassie Blue Super Snel Kleuringsoplossing	Beyotime	P0017F
DMEM	Gibco	12800017
Erlenmeyer kolf	Sichuan Shunbo	GG-17
FAP Konijn mAb	CST	66562
FBS	Gibco	10099-141
Pincetten	Roboz	RS-5135
ICG-NHS	Ruixibio	R-TE-157
IPTG	MCE	367-93-1
microbalans	Secura	Secura225D-1CN
microgolfoven	Mideo	PM2002
Multi-Mode In Vivo Dier Imaging Systeem	BioLight	AniView600
Ni-NTA	Genscript	L00250
NovoCyte flow cytometer	ACEA Biosciences	Novocyte
PBS	Gibco	10010023
Penicilline-Streptomycine	Gibco	15140122
SDS-PAGE	Beyotime	P00528
Universele RNA-zuivering	EZBioscience	EZB-RN4
Vibratome	DOSAKA	DTK-1000N
β-actine Konijn pAb	Yeasen	30102ES
Primer
β-actine primer-F	iGenebook Biotech		CATGTACGTTGCTATCCAGGC
β-actine primer-R	iGenebook Biotech		CTCCTTAATGTCACGCACGAT
FAP primer-F	iGenebook Biotech		TTGAGTGGATGGGAGGGAT
FAP primer-R	iGenebook Biotech		GCTGTGCTCGTGGATTTGT
Collageen-I primer-F	iGenebook Biotech		GAGGGCCAAGACGAAGACATC
Collageen-I primer-R	iGenebook Biotech		CAGATCACGTCATCGCACAAC
Fibronectin primer-F	iGenebook Biotech		CGGTGGCTGTCAGTCAAAG
Fibronectin primer-R	iGenebook Biotech		AAACCTCGGCTTCCTCCATAA