Dit protocol beschrijft een methode voor het induceren van unilaterale ureterobstructie (UUO) bij muizen om de progressie van weefselfibrose bij obstructieve nefropathie te bestuderen. Het omvat chirurgische ingrepen, postoperatieve zorg en methoden voor de beoordeling van fibrose.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Unilateraal ureterobstructiemodel voor het onderzoeken van interstitiële fibrose van de nier
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Nierfibrose is de uiteindelijke pathologische uitkomst van progressieve chronische nierziekte (CKD). Het unilaterale ureterobstructiemodel (UUO) wordt veel gebruikt om de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan interstitiële fibrose van de nier op te helderen en om potentiële therapeutische doelen te identificeren. Dit model wordt bij muizen vastgesteld door chirurgische ligatie van een unilaterale urineleider, een procedure die relatief eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren is. Het is echter bekend dat het UUO-muismodel aanzienlijke variabiliteit en inconsistentie vertoont, beïnvloed door factoren zoals muizenstam, leeftijd, geslacht, anesthesietype, duur van de operatie, lichaamstemperatuur tijdens de procedure, de chirurgische vaardigheden van de operator, voedingsomstandigheden en de algehele gezondheidstoestand van de muizen. Variaties in chirurgische technieken, plaatsing van hechtingen en de duur van de obstructie dragen bij aan de variabiliteit in resultaten. Bovendien verhoogt inconsistente bemonstering van verstopte nieren de variabiliteit in de beoordeling van nierfibrose verder. Deze studie schetst het proces van het ontwikkelen van het UUO-muismodel en het evalueren van interstitiële fibrose, bespreekt de technische uitdagingen die bijdragen aan de onvoorspelbaarheid van het model en stelt mogelijke oplossingen voor. Deze inzichten zijn bedoeld om een meer gestandaardiseerde en universeel toepasbare aanpak voor het onderzoeken van nierfibrose tot stand te brengen.
Inleiding
Chronische nierziekte (CKD) treft meer dan 10% van de wereldbevolking en de prevalentie ervan neemt toe1. Verschillende aandoeningen van de urinewegen, waaronder aangeboren anatomische afwijkingen, nefrolithiasis, prostaathyperplasie en blaastumoren, kunnen leiden tot obstructie van de ureter². Als gevolg hiervan is het muismodel voor unilaterale ureterobstructie (UUO) een belangrijk hulpmiddel voor het identificeren van nieuwe mechanismen van interstitiële fibrose van de nier, het begrijpen van ziekteprogressie en het evalueren van mogelijke behandelingsstrategieën. Het is op grote schaal gebruikt om de oorsprong van myofibroblasten, (myo)fibroblastsubclusters, tubulair celmetabolisme en celcyclusstop, gedeeltelijke epitheel-mesenchymale overgang en andere gerelateerde processen te onderzoeken 3,4,5,6,7,8.
Naast UUO-geïnduceerde interstitiële fibrose van de nier, omvatten andere veelgebruikte knaagdiermodellen van interstitiële fibrose van de nier toxine-geïnduceerde modellen, zoals modellen die aristolochinezuur, foliumzuur en adenine gebruiken, evenals chirurgisch geïnduceerde modellen zoals 5/6 nefrectomie en ischemie-reperfusieschade (IRI). Het UUO-model biedt verschillende voordelen ten opzichte van alternatieve nierfibrosemodellen. Door toxine geïnduceerde nierfibrose vereist bijvoorbeeld een relatief lange modelleringsperiode (ongeveer 1-2 maanden) en de toxische bijwerkingen op andere organen kunnen het onderzoek naar fibrosemechanismen bemoeilijken 9,10,11. Chirurgisch geïnduceerde modellen, zoals 5/6 nefrectomie, kunnen leiden tot aanzienlijke nierbloedingen en infecties, waardoor het risico op postoperatieve mortaliteit toeneemt. Bovendien is de mate van geïnduceerde interstitiële fibrose direct gecorreleerd met het volume van gereseceerd nierweefsel, waardoor het een uitdaging is om consequent dezelfde mate van fibrose te reproduceren in elke muis12.
Het renale IRI-model is een primaire methode voor het induceren van acuut nierletsel aan CNZ en heeft een aanzienlijke klinische relevantie. De ernst van fibrose kan worden gemoduleerd door de ischemische tijd en lichaamstemperatuur aan te passen; in vergelijking met het UUO-model is het echter chirurgisch complexer en vereist de inductie van interstitiële fibrose een langere duur13. In vergelijking met deze modellen heeft het UUO-model verschillende voordelen, waaronder een korte modelleringsduur, minimale variabiliteit, herhaalbaarheid en een relatief eenvoudige chirurgische ingreep. Het UUO-muismodel, waarbij geen toxines betrokken zijn, wordt gemaakt door één urineleider af te binden, wat binnen twee weken leidt tot obstructieve nefropathie. Dit resulteert in hydronefrose, tubulaire dilatatie en interstitiële fibrose, die sterk lijken op het pathologische proces dat bij mensen wordt waargenomen14. De ernst van fibrose - mild, matig of ernstig - kan worden gecontroleerd door de duur van het experiment aan te passen.
Hoewel het UUO-muismodel eenvoudiger uit te voeren is dan andere door belediging geïnduceerde modellen voor het onderzoeken van CKD, kunnen verschillende factoren de stabiliteit ervan aanzienlijk beïnvloeden. Deze factoren omvatten de stam van de muis, de leeftijd, het geslacht, het type anesthesie, de duur van de operatie, de lichaamstemperatuur tijdens de operatie, de chirurgische vaardigheden van de operator en de voedingsomstandigheden en gezondheidstoestand van de muizen15,16.
Het minimaliseren van chirurgische stress en infectie tijdens het uitvoeren van de procedure op een gestage en georganiseerde manier onder narcose is essentieel voor het creëren van een reproduceerbaar UUO-muismodel. Bovendien kan onderzoek naar de mechanismen en potentiële therapeutische doelen van CKD in het gedrang komen door onervaren operators, wat leidt tot meer muizenverlies en een grotere heterogeniteit van het model. Om deze uitdagingen aan te gaan, worden de belangrijkste technische aspecten van het chirurgische proces - voor, tijdens en na de procedure - geschetst, waarbij kritieke kwesties worden benadrukt die aandacht vereisen. Bovendien is de evaluatiemethodologie voor het UUO-muismodel gedetailleerd om onderzoekers een consistente en betrouwbare aanpak te bieden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierprocedures worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het agentschap en goedgekeurd door de Institutional Animal Ethics Committee van de Nanjing Medical University. Om verschillen tussen geslacht en stam te elimineren en de vergelijkbaarheid van de resultaten te garanderen, worden alleen mannelijke CD1-muizen van 8-10 weken en met een gewicht van 22-25 g gebruikt. De details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Voorbereiding van dieren en instrumenten
- Autoclaaf alle chirurgische instrumenten vóór de operatie.
- Weeg en verdoven de muizen (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Sluit het inhalatie-anesthesieapparaat op de juiste manier aan en plaats de muizen in de inductiekamer met 2% isofluraan gemengd met zuurstof van 1-2 l/min. Plaats vervolgens de neus van de muis in de neuskegel met een constante toevoer van anesthesie. Bevestig het juiste niveau van sedatie door het uitblijven van een reactie op een teenbeknelling te beoordelen.
OPMERKING: Controleer regelmatig de ademhalingsfrequentie en beoordeel het anesthesieniveau met behulp van de pedaalreflex van de muizen. Pas het isofluraan zo nodig aan. - Plaats de muis op een elektronisch warmtekussen in rugligging met het hoofd en de nek gestrekt om de luchtweg open te houden. Zet de poten vast met weinig plakband.
- Gebruik een thermometer om de omgevingstemperatuur in de gaten te houden en houd deze op 37-38 °C. Breng een rectale sonde in en houd de kernlichaamstemperatuur van de muizen tijdens de procedure rond de 36,5-37 °C.
- Breng oogzalf aan op de ogen om beschadiging van xerose aan het hoornvlies te voorkomen.
- Scheer het haar over het operatiegebied met ontharingscrème en desinfecteer het drie keer met betadine-oplossing.
2. Chirurgische ingreep
OPMERKING: Zodra de lichaamstemperatuur zich op het instelpunt heeft gestabiliseerd en de teenknijpreflex afwezig is, start u de volgende chirurgische ingrepen.
- Gebruik een chirurgisch mes om een verticale chirurgische incisie te maken van ongeveer 1-1,5 centimeter van de blaas tot de linkeronderrand van de ribben om de buikholte bloot te leggen.
- Verplaats de darm naar de rechterkant van de buikholte met behulp van een wattenstaafje bevochtigd met steriele normale zoutoplossing om de linkernier bloot te leggen, die zich onder de achterkant van de milt en naast de wervelkolom bevindt.
- Gebruik een gebogen iristang om het vet en bindweefsel rond de linker urineleider te verwijderen. Na zachte isolatie, lig de linker urineleider dicht bij de onderpool van de nier met behulp van een 3/0 zijden gevlochten hechtdraad. Voer een tweede ligatie uit van de linker urineleider tussen de eerste ligatie en de blaas.
OPMERKING: Om de variabiliteit tussen de muizen te minimaliseren, moet u ervoor zorgen dat de ligatiepositie bij alle proefpersonen consistent blijft. Gebruik de linker pincet om de hechtdraad in de uiteinden van de rechter pincet te plaatsen en schuif de hechtdraad terug onder de urineleider17. Vermijd het opnemen van overtollig vet en bindweefsel in de ligatie, omdat dit kan leiden tot onvolledige nierobstructie. Bereik dit door de urineleider zachtjes te strelen met droge wattenstaafjes. - Verplaats de darmen voorzichtig in de peritoneale holte. Hecht de spier- en huidlagen afzonderlijk met een 3/0 zijde gevlochten hechtdraad.
OPMERKING: Het aan elkaar hechten van de huid- en spierlagen kan leiden tot het scheuren van de hechtwond en beschadiging van de ingewanden van de buik. - Als u meerdere muizen opereert, reinigt u de chirurgische instrumenten met stromend water en 75% ethanol voordat u doorgaat naar de volgende muis.
3. Postoperatieve zorg en monitoring
- Injecteer 0,5 ml warme normale zoutoplossing intraperitoneaal om uitdroging te voorkomen.
- Plaats de muizen terug in een schone kooi totdat ze weer volledig bij bewustzijn zijn.
- Toediening van buprenorfine (50 μg/kg) via subcutane injectie gedurende 3 dagen. Controleer de muizen dagelijks op tekenen van gebrek aan verzorging, verminderd eten en een abnormale houding.
4. Postoperatieve beoordelingen
- Histologie
- Euthanaseer de muizen met een overdosis isofluraan (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Oogst de verstopte en contralaterale niet-geblokkeerde nieren18 na euthanasie.
- Gebruik de grootste dwarsdoorsnede van de niersectie voor histologisch onderzoek.
- Fixeer nierweefsel in 4% paraformaldehyde en snijd de verkregen monsters in secties van 4 μm.
- Kleuring niersecties met periodieke zuur-Schiff (PAS), Masson's trichrome kleuring (MTS) of Sirius rode kleuring om niertubulaire beschadiging en nierfibrose te detecteren.
- Selecteer tien willekeurige velden van de niersecties onder een lichtmicroscoop met een vergroting van 200×.
- Bereken het aandeel van het collageenpositieve blauwe gebied met behulp van ImageJ-software.
- Westerse vlek
- Extraheer ongeveer 20 mg nierweefsel uit dezelfde pool van UUO-nieren met behulp van radio-immunoprecipitatietest (RIPA) buffer18.
- Kwantificeer de eiwitconcentratie met behulp van een bicinchoninezuurtest19.
- Laad gelijke hoeveelheden eiwitmonsters op 4%-10% Bis-Tris-gels voor elektroforese en breng ze over naar polyvinylideendifluoride (PVDF) membranen.
- Blokkeer de PVDF-membranen met 5% melk in Tris-Buffered Saline Tween (TBST) en incubeer ze 's nachts bij 4 °C met primaire antilichamen.
- Was de PVDF-membranen met TBST en incubeer ze met secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Detecteer eiwitniveaus met behulp van een verbeterde chemiluminescentiemethode (ECL) en analyseer ze met behulp van ImageJ-software, met glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) als belastingscontrole.
- Nierfunctie
- Verdoof de muizen met geïnhaleerd isofluraan (zie stap 1.2).
- Verzamel bloedmonsters retro-orbitaal na anesthesie.
- Centrifugeer bloedmonsters bij 3.000 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Meet serumcreatinine en bloedureumstikstof (BUN) met behulp van een automatische droge chemische analysator om de nierfunctie te controleren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Histologie
Periodieke zuur-Schiff (PAS) kleuring onthulde tubulaire dilatatie, verlies van borstelranden, gipsvorming en tubulaire epitheliale zwelling. De trichrome en Sirius rode kleuring van Masson vertoonde interstitiële fibrose na UUO, in tegenstelling tot de normale compacte buisjes met waarneembare lumen die werden waargenomen in de schijngroep. De mate van renale interstitiële fibrose, aangegeven door blauwe gebieden in de trichrome kleuring van Masson en rode...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er wordt een uitgebreide procedure geboden voor het opstellen van het UUO-model, een veelgebruikte benadering voor het onderzoeken van interstitiële fibrose van de nier. Bovendien worden de identificatie en beoordeling van het model, inclusief evaluaties van de nierfunctie en histologische veranderingen, gedemonstreerd. De variabelen die bijdragen aan de heterogeniteit van het model en de aanpasbare technische factoren worden besproken.
De gevoeligheid voor UU...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door National Science Foundation of China Grants (82370686/2024YFA1107704), Jiangsu Specially-Appointed Professor Grant, Nanjing Science and Technology Innovation Project, Jiangsu Province Hospital High-level Talent Cultivation Program (Fase I) (CZ0121002010037), Natural Science Foundation van de provincie Jiangsu (BK20240055) en Jiangsu Medical Innovation Team naar JR; Jiangsu Province Hospital (het eerste aangesloten ziekenhuis bij de Nanjing Medical University) Clinical Capacity Enhancement Project (JSPH-MA-2023-4), Priority Academic Program Development van Jiangsu Higher Education Institutions (China) en National Natural Science Foundation of China (81970639/82151320) naar HM.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 mL Syringe | Mingankang | / | |
| 4/0 chirurgische hechtdraad | Jinhuan Medical | F401 | |
| 75% Ethanol | Lircon | 6303060031 | |
| Anesthesiegespook | RWD Life Science | R510-29 | |
| Anesthesie-inductiekamers | RWD Life Science | V102-V | |
| Dierhaarschaar | Jinke | / | |
| Betadine-oplossing | Lircon | 6303030036 | |
| Buprenorfine (pijnstiller) | RWD Life Science | / | |
| Gebogen iristang | jinke | / | |
| Elektronische verwarmingspad | Reptizoo | AHM23 | |
| Fijne rechte pincet | Jinke | / | |
| Gasfiltercanister | RWD Life Science | R510-31-6 | |
| Gaaskussentjes | Winner Medical | 601-026576 | |
| Irisschaar | Jinke | / | |
| Isofluraan (anestheticum) | RWD Life Science | R510-22-10 | |
| Meervoudige dieranesthesiemolen | RWD Life Science | R550IE | |
| Naaldhouder | jinke | / | |
| Oftalmische zalf | Dechra NDC | 17033-211-38 | |
| Steriele wattenstaafjes | Winner Medical | 601-015213 | |
| Steriele zoutoplossing | Shimen | H20066533 |
Referenties
- Bello, A. K., et al. An update on the global disparities in kidney disease burden and care across world countries and regions. Lancet Glob Health. 12 (3), e382-e395 (2024).
- Klahr, S. Obstructive nephropathy. Intern Med. 39 (5), 355-361 (2000).
- Lovisa, S., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nat Med. 21 (9), 998-1009 (2015).
- Grande, M. T., et al. Snail1-induced partial epithelial-to-mesenchymal transition drives renal fibrosis in mice and can be targeted to reverse established disease. Nat Med. 21 (9), 989-997 (2015).
- Kang, H. M., et al. Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells has a key role in kidney fibrosis development. Nat Med. 21 (1), 37-46 (2015).
- Lebleu, V. S., et al. Origin and function of myofibroblasts in kidney fibrosis. Nat Med. 19 (8), 1047-1053 (2013).
- Yang, L., Besschetnova, T. Y., Brooks, C. R., Shah, J. V., Bonventre, J. V. Epithelial cell cycle arrest in g2/m mediates kidney fibrosis after injury. Nat Med. 16 (5), 535-543 (2010).
- Kuppe, C., et al. Decoding myofibroblast origins in human kidney fibrosis. Nature. 589 (7841), 281-286 (2021).
- Ren, J., et al. The transcription factor twist1 in the distal nephron but not in macrophages propagates aristolochic acid nephropathy. Kidney Int. 97 (1), 119-129 (2020).
- Perales-Quintana, M. M., et al. Metabolomic and biochemical characterization of a new model of the transition of acute kidney injury to chronic kidney disease induced by folic acid. PeerJ. 7, e7113(2019).
- Kim, K., et al. Skeletal myopathy in CKD: A comparison of adenine-induced nephropathy and 5/6 nephrectomy models in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 321 (1), F106-F119 (2021).
- Tan, R. Z., et al. An optimized 5/6 nephrectomy mouse model based on unilateral kidney ligation and its application in renal fibrosis research. Ren Fail. 41 (1), 555-566 (2019).
- Fu, Y., Xiang, Y., Wei, Q., Ilatovskaya, D., Dong, Z. Rodent models of aki and AKI-CKD transition: An update in 2024. Am J Physiol Renal Physiol. 326 (4), F563-F583 (2024).
- Kramann, R., Menzel, S. Mouse models of kidney fibrosis. Methods Mol Biol. 2299, 323-338 (2021).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Nørregaard, R., Mutsaers, H. aM., Frøkiær, J., Kwon, T. H. Obstructive nephropathy and molecular pathophysiology of renal interstitial fibrosis. Physiol Rev. 103 (4), 2827-2872 (2023).
- Thornhill, B. A., Chevalier, R. L. Variable partial unilateral ureteral obstruction and its release in the neonatal and adult mouse. Methods Mol Biol. 886, 381-392 (2012).
- Ren, J., et al. Twist1 in infiltrating macrophages attenuates kidney fibrosis via matrix metallopeptidase 13-mediated matrix degradation. J Am Soc Nephrol. 30 (9), 1674-1685 (2019).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298 (4), F1024-F1032 (2010).
- Falke, L. L., et al. Age-dependent shifts in renal response to injury relate to altered BMP6/CTGF expression and signaling. Am J Physiol Renal Physiol. 311 (5), F926-F934 (2016).
- Song, L., Shi, S., Jiang, W., Liu, X., He, Y. Protective role of propofol on the kidney during early unilateral ureteral obstruction through inhibition of epithelial-mesenchymal transition. Am J Transl Res. 8 (2), 460-472 (2016).
- Saad, K. M., et al. Reno-protective effect of protocatechuic acid is independent of sex-related differences in murine model of UUO-induced kidney injury. Pharmacol Rep. 76 (1), 98-111 (2024).
- Goorani, S., Khan, A. H., Mishra, A., El-Meanawy, A., Imig, J. D. Kidney injury by unilateral ureteral obstruction in mice lacks sex differences. Kidney Blood Press Res. 49 (1), 69-80 (2024).
- La Russa, D., Barberio, L., Marrone, A., Perri, A., Pellegrino, D. Caloric restriction mitigates kidney fibrosis in an aged and obese rat model. Antioxidants (Basel). 12 (9), 1778(2023).
- Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: Technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1487-F1494 (2012).
- Hammad, F. T. The long-term renal effects of short periods of unilateral ureteral obstruction. Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol. 14 (2), 60-72 (2022).
- Chevalier, R. L., Thornhill, B. A., Wolstenholme, J. T., Kim, A. Unilateral ureteral obstruction in early development alters renal growth: Dependence on the duration of obstruction. J Urol. 161 (1), 309-313 (1999).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
