Methodenartikel

Multimodaal optisch beeldvormingsplatform voor het bestuderen van cellulair metabolisme

DOI:

10.3791/67906

⸱

6 juni 2025

 ,  ,  , 
1Shu Chien-Gene Lay Department of Bioengineering, University of California San Diego, 2Aiiso Yufeng Li Family Department of Chemical and Nano Engineering, University of California San Diego, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of California San Diego, 4Institute of Engineering in Medicine, University of California San Diego, 5Synthetic Biology Institute, University of California San Diego

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door gebruik te maken van een multimodaal platform dat labelvrije optische beeldvormingsmodaliteiten combineert, hebben we een protocol ontwikkeld voor het visualiseren en kwantificeren van cellulaire dynamiek en metabolisme. Door middel van beeldvorming via multifotonfluorescentie, tweede harmonische generatie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie kunnen we een holistisch overzicht van de cellulaire en moleculaire omgeving genereren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optische beeldvormingstechnologieën zijn van cruciaal belang in biomedische studies vanwege hun vermogen om zowel morfologische als functionele informatie te verkrijgen van biologische monsters met een hoge ruimtelijke resolutie. Deze optische processen maken gebruik van verschillende licht-molecuulinteracties, zoals verstrooiing, absorptie, emissie en harmonische generatie, tussen fotonen en de moleculen in cellen, weefsels of organen. Terwijl conventionele biomedische beeldvorming zich van oudsher richtte op het toepassen van een enkele modaliteit, heeft recent onderzoek aangetoond dat deze diverse technieken complementaire inzichten bieden, en hun gecombineerde output biedt een uitgebreider begrip van moleculaire veranderingen in verouderingsprocessen en ziekteontwikkeling en fundamenten in celbiologie.

In de afgelopen decennia zijn labelvrije optische beeldvormingsmethoden geavanceerd geworden, waardoor gedetailleerde verkenning van cellulaire en subcellulaire omgevingen mogelijk is. Multifotonfluorescentie (MPF) vergemakkelijkt bijvoorbeeld niet alleen gerichte eiwitbeeldvorming, maar kwantificeert ook metabolische activiteit door middel van autofluorescerende co-enzymen, waardoor een hoge penetratiediepte en ruimtelijke resolutie worden bereikt. Second Harmonic Generation (SHG) wordt gebruikt om structuren zoals collageen in de extracellulaire matrix in beeld te brengen, terwijl Stimulated Raman Scattering (SRS) chemische bindingen en moleculaire samenstelling in situ in kaart brengt met subcellulaire resolutie.

We hebben een multimodaal beeldvormingsplatform ontwikkeld dat MPF-, SHG- en SRS-modaliteiten combineert. De integratie van deze modaliteiten in één enkel platform maakt het mogelijk om veelzijdige informatie te verkrijgen uit dezelfde lokalisatie in cellen, weefsels, organen of zelfs lichamen, waardoor een meer gedetailleerde verkenning van de ingewikkelde relaties tussen cellulair metabolisme, extracellulaire matrixstructuur en moleculaire samenstelling mogelijk wordt. Dit multimodale systeem biedt subcellulaire resolutie, diepe weefselpenetratie, in situ beeldvorming van levende cellen/weefsels, evenals labelvrije detectie en onmiddellijke coregistratie zonder de noodzaak van positieaanpassingen, wisseling van apparaat of uitlijning na de analyse. Hier presenteren we een protocol voor labelvrije beeldvorming met dit multimodale platform en demonstreren we de toepassing ervan bij het karakteriseren van cellulair metabolisme en moleculaire heterogeniteit in cellen en weefsels voor het bestuderen van veroudering en ziekten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optische biomedische beeldvorming is van cruciaal belang geweest bij het bevorderen van ons begrip van biologische structuur en functie. De beelden worden gegenereerd door excitatielicht te moduleren en signalen van licht-weefselinteracties te detecteren. De eerste samengestelde microscoop, ontwikkeld door Hans en Zacharias Janssen rond 1590, maakte gebruik van twee bolle lenzen in een buis, die een vergroting tot 30x1 opleverden. Moderne optische microscopen, na eeuwen van vooruitgang, kunnen nu resoluties bereiken die zo fijn zijn als 1-3 nm 2,3. Geavanceerde beeldvormingssystemen bieden niet alleen een hoge resolutie, maar zorgen nu ook voor diepere weefselpenetratie, grotere efficiëntie en minimale schade aan het monster, waardoor ze bijzonder geschikt zijn voor beeldvorming van levende cellen en weefsels. Labelvrije beeldvorming is bijzonder voordelig omdat het informatie vastlegt zonder intracellulaire processen te verstoren of de integriteit van het monster in gevaar te brengen.

Multifotonfluorescentiemicroscopie (MPF), met name twee-fotonfluorescentiemicroscopie, is op grote schaal gebruikt voor beeldvorming zonder labels. In tegenstelling tot conventionele fluorescentiemicroscopie, die berust op lineaire absorptie en emissie van enkelvoudige fotonen, omvat MPF-excitatie de gelijktijdige absorptie van meerdere fotonen, waarvan de gecombineerde energie een enkel fluorofoormolecuul exciteert 4,5. Deze fotonen, meestal in het infraroodspectrum, bezitten de helft of minder van de energie die nodig is voor excitatie met één foton. De langere golflengten en gelokaliseerde excitatie in het brandpunt in dit niet-lineaire proces resulteren in een lagere verstrooiing, diepere weefselpenetratie en verminderde fototoxiciteit.

Cellulaire metabole informatie kan worden vastgelegd door middel van labelvrije MPF-microscopie door de detectie van autofluorescentiesignalen van endogene metabole substraten, zoals gereduceerd nicotinamide-adenine-dinucleotide (NADH) en flavine-adenine-dinucleotide (FAD). Deze co-enzymen vertonen verschillende excitatie- en emissiespectra, en hun fluorescentie-intensiteitsverhouding, bekend als de redoxverhouding (NADH/FAD), weerspiegelt de oxidatieve toestand van de cel. Sinds Britton Chance in 1979 voor het eerst het concept van de redoxverhouding introduceerde, zijn er aanvullende verhoudingen voorgesteld, waaronder NAD(P)H/FAD, NAD(P)H/(FAD + NAD(P)H) en FAD/(FAD + NAD(P)H), 6,7,8,9. Het kwantificeren van deze optische redoxverhoudingen via MPF-beeldvorming levert waardevol inzicht op in de metabole dynamiek. MPF-beeldvorming kan bijvoorbeeld kankercellen onderscheiden van normale cellen op basis van hun veranderde metabolisme, wat het potentieel voor de diagnose van kanker aantoont 10,11,12. Op MPF gebaseerde autofluorescentiedetectie heeft echter beperkingen. Andere intrinsieke fluoroforen, zoals keratine, kunnen bijdragen aan de fluorescentie-intensiteit, wat leidt tot spectrale overspraak en onnauwkeurige signaalinterpretatie13. Bovendien weerspiegelt de redoxverhouding alleen de algehele veranderingen in cellulaire oxidatiereductie en maakt geen onderscheid tussen NADH uit verschillende bronnen (bijv. cytoplasmatisch of mitochondriaal) of tussen NADH en NAD(P)H, aangezien beide vergelijkbare spectrale pieken vertonen bij 450 nm, wat resulteert in signalen met gemengde intensiteit14.

Second Harmonic Generation (SHG), een niet-lineair optisch proces dat voor het eerst werd gedemonstreerd in de biomedische wereld in de jaren 1980, is op grote schaal gebruikt voor labelvrije beeldvorming van cellulaire structuren15,16. Net als bij MPF gaat het bij SHG om de gelijktijdige absorptie van twee fotonen met dezelfde energie van een ultrasnelle gepulseerde laser. Deze fotonen worden gerecombineerd om een nieuw foton uit te zenden dat tweemaal zo vaak voorkomt als het invallende licht, wat resulteert in de detectie van het seconde-harmonische signaal. Deze niet-lineaire optische interactie vindt uitsluitend plaats in niet-centrosymmetrische materialen die een niet-nul tweede-orde gevoeligheid vertonen om een polarisatie te induceren voor het genereren van het tweede harmonische signaal17,18. Dit maakt SHG bijzonder effectief voor het afbeelden van de filamenteuze eiwitten en fibrillaire structuren, zoals collageen, myosine en tubuline, zonder dat exogene fluorescentiekleurstoffen 15,17,19,20 nodig zijn. De afwijking in overvloed, stijfheid, uitlijning en structuur van fibrose en collageen komen veel voor bij veel aandoeningen, zoals ontsteking en kanker, waardoor SHG een veelbelovend hulpmiddel is voor efficiënte en niet-invasieve detectie van bepaalde ziekteaandoeningen 21,22,23. De wijdverbreide toepassing van SHG-beeldvorming in oncologisch onderzoek, waaronder studies naar borst-, eierstok- en huidkanker, heeft de cruciale rol ervan in zowel fundamenteel onderzoek als mogelijke klinische toepassingen benadrukt 24,25,26,27.

Verschillende moleculen vertonen verschillende trillingsenergieniveaus, die verschillende gradaties van inelastische verstrooiing veroorzaken wanneer ze worden geëxciteerd door invallend licht - een fenomeen dat voor het eerst werd gekarakteriseerd door C. V. Raman in 192828. Het Raman-effect is sindsdien op grote schaal gebruikt in optische microscopie voor de detectie van moleculaire en weefselsamenstellingen zonder exogene labeling. Zowel Stimulated Raman Scattering (SRS) als coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) wekken moleculaire trillingen coherent op en maken gebruik van de niet-lineaire interactie van licht om een sterker signaal te produceren in vergelijking met conventionele spontane Raman-spectroscopie. Het SRS-fenomeen werd voor het eerst gemeld in 196229. In 2008 werd dit mechanisme geïntegreerd in driedimensionale multifotonbeeldvorming, waardoor selectieve detectie van chemicaliën mogelijk is op basis van intensiteitsveranderingen in de Pump- en Stokes-bundels als gevolg van moleculaire trillingsovergangen30. Deze methode minimaliseert niet-resonante achtergrondinterferentie en genereert een helder intensiteitssignaal dat dat van CARS overtreft. SRS-beeldvorming blinkt uit in het leveren van gemultiplexte en hyperspectrale beeldvorming, waardoor gelijktijdige detectie van meerdere chemische bindingen mogelijk is en visualisatie met hoge resolutie van de moleculaire samenstelling in monsters met een aanzienlijke penetratiediepte mogelijk is. Hoewel het een relatief nieuwe techniek is, is SRS-beeldvorming effectief gebleken in zowel klinische diagnostiek als metabool onderzoek, in vivo en in vitro 30,31,32,33,34,35,36. SRS kan bijvoorbeeld door hersentumoren geïnfiltreerde weefsels onderscheiden van de cortex en witte stof door de lipide-eiwitverhouding te kwantificeren, waardoor tumormarges op een labelvrije, niet-invasieve manier kunnen worden afgebakend37,38. Bovendien kunnen metabole veranderingen, die vaak worden beschouwd als kenmerken van verouderingsgerelateerde en kankergerelateerde ziekten, kwantitatief worden beoordeeld met behulp van SRS die wordt bereikt door koolstof-deuteriumbindingen te detecteren in monsters die zijn behandeld met zwaar water (D2O), waardoor kwantitatieve meting van eiwitsynthese, lipogenese en andere macromoleculaire metabolische processen mogelijk is 31,33,34,35,36. Het vermogen om metabolieten met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie te volgen, positioneert SRS als een veelbelovend hulpmiddel voor ziekteonderzoek en -diagnose, met potentieel voor bredere klinische toepassingen.

Multimodale beeldvorming is naar voren gekomen als een krachtige benadering in biomedisch onderzoek, waarbij twee of meer beeldvormingsmodaliteiten worden geïntegreerd om een beter begrip te krijgen van complexe biologische systemen binnen hetzelfde monster. In 2018 werd een labelvrije autofluorescentie-multiharmonische (SLAM) microscopietechniek geïntroduceerd, waarbij twee-fotonfluorescentie (2PF), drie-fotonfluorescentie (3PF), SHG en derde harmonische generatie (THG)39 worden geïntegreerd. Deze benadering vergemakkelijkt de gelijktijdige visualisatie van cellulaire interacties, dynamische processen en individuele componenten binnen de micro-omgeving van de tumor. SLAM-microscopie biedt minimale verstoring en verminderde laservermogensvereisten voor het monster, waardoor diepe weefselprofilering mogelijk is en een veiligere methode wordt geboden voor intravitale monitoring40. Een andere multimodale modaliteit, een combinatie van intrinsieke fluorescentiespectroscopie, diffuse reflectiespectroscopie en Raman-spectroscopie, is ontwikkeld voor in situ opsporing van kanker tijdens chirurgische ingrepen41. Bovendien heeft een recent ontworpen multimodaal niet-lineair endoscopiesysteem, dat CARS, SHG en twee-fotonfluorescentie (TPF) integreert, aangetoond dat het in staat is om biologische monsters af te beelden met een submicron- en subcellulaire ruimtelijke resolutie42. Gecombineerde 2PF- en SRS-microscopie is op dezelfde manier gebruikt voor in-vivo beeldvorming met hoge resolutie van weefsels, cellen en organellen 42,43,44,45. Deze opkomende multimodale beeldvormingstechnieken maken gebruik van de sterke punten van individuele modaliteiten, wat leidt tot een betere resolutie, penetratiediepte en efficiëntie van beeldacquisitie, waardoor een aanzienlijk potentieel voor klinische en chirurgische toepassingen wordt aangetoond.

Deze multimodale benadering heeft steeds meer de voorkeur boven beeldvorming met één modaliteit, omdat het een breder scala aan metingen biedt en tegelijkertijd de beperkingen van individuele technieken verzacht. Zoals eerder besproken, meet MPF endogene fluorescentie om metabole veranderingen weer te geven, SHG kan niet-centrosymmetrische structuren zoals collageen in biologische monsters in beeld brengen, en SRS detecteert voornamelijk eiwitten en lipiden vanwege de hoge dichtheid van chemische bindingen die onderscheidende Raman-signalen genereren op basis van hun trillingsmodi. Gezien hun coherente eigenschappen en het gedeelde principe van niet-lineaire optische eigenschappen, kunnen deze beeldvormingsmodaliteiten worden geïntegreerd in een enkele microscoopopstelling met behulp van ultrakorte gepulseerde lasers, waardoor verschillende biomarkers in gelokaliseerde regio's kunnen worden verkregen om een completer beeld te krijgen van biologische processen44,45. Dit document schetst een protocol voor de implementatie van een multimodaal beeldvormingsplatform dat MPF, SHG en SRS integreert voor biomedische onderzoekstoepassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Labelvrije multimodale beeldvormingsexperimenten

OPMERKING: Dit protocol richt zich op de opzet- en acquisitieprocedure van de labelvrije multimodale beeldvorming.

  1. Opstelling van de multimodale microscoop (Figuur 1A) en systeemkalibratie
    1. Warm de laser op en wacht ongeveer 15-20 minuten.
    2. Schakel de besturingseenheden en monitoren in de volgende volgorde in: Schakelkast | Controller met aanraakscherm | AC-adapter voor hoofdlaser, afstandsbediening, AC-adapter voor sublaser-afstandsbediening.
    3. Schakel de Si-fotodiodedetector en lock-in in amplifier.
    4. Configureer de laserstralen van de pomp en de Stokes-straal. Stel het lasersysteem in met een pompstraal die instelbaar is van 780 nm tot 990 nm, een pulsbreedte van 5 - 6 ps en een herhalingsfrequentie van 80 MHz. De Stokes-laserstraal heeft een vaste golflengte van 1.031 nm met een puls van 6 ps en een herhalingsfrequentie van 80 MHz . Zorg ervoor dat zowel de pomp als de Stokes-balken een laag vermogen hebben (minimaal 20 mW) om zichtbaar te zijn op de uitlijnplaat.
    5. Plaats één uitlijnplaat in het optische pad (direct na de laserbox) om de ruimtelijke overlapping van de pompen en Stokes-stralen te controleren en pas de spiegel aan totdat beide vlekken elkaar overlappen in het midden van de uitlijnplaat.
      OPMERKING: Hoewel de pompen en Stokes-stralen elkaar ongeveer overlappen, kan het optimale SRS-signaal worden bereikt door de ruimtelijke overlapping van twee laserstralen nauwkeurig af te stemmen.
    6. Na ruimtelijke overlapping finetunen met de PSD (Position Sensitive Detector) door eerst op de OPO-besturingssoftware te klikken. Gebruik de inbussleutel om de optische spiegel 1 (OM1) zorgvuldig af te stellen en kijk hoe het PSD-display voor de X-Y-positieverandering is om te streven naar een minimale afwijking van het midden. Gebruik vervolgens de inbussleutel op de optische spiegel 2 (OM2) om nauwkeurigere aanpassingen te maken totdat de positie-indicator gecentreerd is op het PSD-display.
      OPMERKING: OM1 en OM2 zijn twee spiegels in de OPO-kop om de laseruitlijning aan te passen.
    7. Centreer ten slotte de condensor door aan de twee condensorcentreerschroeven te draaien om het irisdiafragmabeeld naar het midden van het gezichtsveld te verplaatsen.
      OPMERKING: Het veldirisdiafragma kan de diameter van de lichtstraal die het objectief binnenkomt beperken en zo vreemd licht uitsluiten, waardoor het beeldcontrast wordt verbeterd.
  2. Stappen voor het verwerven van multimodale beeldvorming zonder etiketten
    1. Breng olie aan op de oliecondensor met hoge numerieke apertuur (1,4 NA) en monteer het microscoopglaasje op de geoliede condensor. Plaats ten slotte een grote waterdruppel op het microscoopglaasje voor het 25x waterobjectief. Zorg ervoor dat de microscoop stevig gemonteerd en onbeweeglijk is en pas vervolgens de z-fase aan om de focus af te stemmen totdat het helderveldbeeld van het biologische monster te zien is onder het 25x waterobjectief.
    2. Begin het beeldvormingsproces in de juiste volgorde: MPF, SHG en SRS om fotobleken te voorkomen, wat van invloed is op de beeldkwaliteit en nauwkeurige analyse van MPF. Om snel te schakelen tussen MPF en SHG, schakelt u over van de pompbalk naar de vaste Stokes-balk.
      OPMERKING: Het afstemmen van de pomplaser van 800 nm (NADH en FAD autofluorescentie) naar 791.3 nm (CH3 Raman-verschuiving) kan 1-2 minuten duren.
    3. Selecteer de beeldresolutie (512 x 512 pixels) en de geschikte verblijftijd voor elke modaliteit. Gebruik 8 μs/pixel voor de MPF en SHG met een gemiddeld frame boven de 3. Gebruik 40 μs/pixel met gemiddeld frame 2 voor de SRS-modaliteit.
      OPMERKING: Het gemiddelde frame betekent het aantal afbeeldingen dat moet worden gemiddeld voordat u ze opslaat.
    4. Om autofluorescentie met MPF te verkrijgen, schakelt u de Stokes-laserstraal uit en stemt u de pomplaser af op 800 nm voor opwindende NADH en flavin. Installeer de FVOPT-filterkubus in het lichtpad met respectievelijk 460 ± 10 nm en 515 ± 10 nm voor de NADH en flavin. Het vermogen op het monster is dus ongeveer 15 mW.
    5. Verkrijg het collageenvezelsignaal met behulp van SHG. Schakel de laserstraal van de pomp uit, gebruik alleen de stokes-laserstraal en stel het vermogen in op 500 mW. Verkrijg alleen het kanaal dat betrekking heeft op het 515 nm-filter.
    6. Verkrijg de ruimtelijke verdeling van eiwitten en lipiden met behulp van SRS. Houd beide laserstralen aan en pas de frequentie van de laserstraal aan de specifieke trillingsmodus voor elk molecuul aan.
      OPMERKING: Doorgaans wordt 791,3 nm gebruikt voor CH3, 797 nm wordt gebruikt voor CH2, 787 nm is voor onverzadigde lipiden en 794,6 is voor verzadigde lipiden. Het vermogen op het monster is dus ongeveer 40 mW.
    7. Om de SRS-hyperspectrale beelddatasets te verkrijgen, opent u de OPO-besturingssoftware om sweep te selecteren, stelt u het golflengtebereik in van 780 nm tot 806,5 nm en kiest u een stapelnummer van ten minste 60. Leg vervolgens de hyperspectrale beeldstapel vast.
      OPMERKING: De resulterende dataset bevat 60 afbeeldingen, die elk de ruimtelijke verdeling weergeven bij een specifieke Raman-verschuiving (van 2.700 cm-1 tot 3.150 cm-1). De tijd voor hyperspectrale acquisitie is afhankelijk van het gezichtsveld (FOV) van het beeld en de scantijd, maar zal ongeveer tussen 5 minuten en 8 minuten liggen voor een beeld van 512 x 512. Voor grotere afbeeldingen moet ervoor worden gezorgd dat de duur onder de laser tot een minimum wordt beperkt om fotoschade te voorkomen, die na 2 uur kan optreden (afhankelijk van de dikte van het monster en de FOV-grootte).
    8. Sla alle afbeeldingen van dezelfde interessegebieden (ROI's) op in dezelfde map. Het afbeeldingsformaat is een Olympus .oir-bestand.

2. Beeldanalyse

  1. Gebruik beeldverwerkingssoftware om alle opgeslagen onbewerkte afbeeldingen te openen om de kleur toe te wijzen en de schaalbalk voor de beeldweergave toe te voegen. Gebruik het ook om het binaire masker van NADH en verzadigingsvetzuren (SFA's, 2.880 cm-1) beelden te genereren voor optische redoxverhouding en analyse van lipidenonverzadiging.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de intensiteit van het masker alleen 0 en 1 heeft.
  2. Gebruik het zelfgebouwde python-script om downstream-analyses uit te voeren (de code is beschikbaar op https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis).
    OPMERKING: Dit script is ontworpen om meerdere interessegebieden (ROI's) te verwerken van zowel controle- als kankermonsters. De hoofdfunctie van het script vereist slechts twee invoer: de bestandspaden voor de mappen Control en Cancer Image.
    1. Herhaal de mappen en match afbeeldingen met dezelfde basisnaam (bijv. "roi_1_flavin.tif", "roi_1_nadh.tif", "roi1_mask.tif").
    2. Laat het script voor elke set overeenkomende afbeeldingen ratiometrische analyses uitvoeren en nieuwe ratiometrische afbeeldingen genereren op basis van deze berekeningen.
      De optische redoxverhouding wordt berekend als flavine / (NADH + flavine).
      Lipide-onverzadiging wordt berekend als: USFA's / (SFA's + USFA's) waarbij USFA's onverzadigde vetzuren vertegenwoordigen.
    3. Alle ratiometrische waarden van de afbeeldingen worden vervolgens opgeslagen in een pandas DataFrame voor eenvoudige manipulatie. Voer eenrichtings-ANOVA uit en gebruik matplotlib met styple "ggplot" of seaborn om de barplot of boxplot te doen voor kwantificering.
    4. Gebruik de afbeeldingen van 2.930 cm-1 (3l) en 2.850 cm-1 (2l) om een afgetrokken (3l -2l) afbeelding te genereren. Meng vervolgens een afbeelding van CH2 CH3 - CH2 in de RGB-kleurruimte met een aangepaste LUT die H&E-kleuring nabootst om de digitale histologieafbeelding46 te genereren.
  3. Na het verkrijgen van hyperspectrale SRS-beelden, gebruikt u het zelfgebouwde python-script om de k-means clustering uit te voeren om de afbeeldingen te segmenteren op basis van spectrale overeenkomsten (de code is beschikbaar op https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis).
    1. Laad de .tiff afbeeldingstacks met het tifffile-pakket. Verander de vorm van de SRS-hyperspectrale beeldstapel (x, y, spectra) in een 2D-array (pixels, spectra).
    2. Gebruik het scikit-learn-pakket om het k-means-algoritme te implementeren in deze 2D-array, met het gedefinieerde aantal clusters.
    3. Wijzig de vorm van de resulterende clusterlabels terug naar de oorspronkelijke afbeeldingsafmetingen, waardoor een segmentatietoewijzing ontstaat.
    4. Wijs unieke kleuren toe aan elk cluster en genereer een afbeelding met valse kleuren die verschillende biochemische samenstellingen in het weefsel vertegenwoordigt.
    5. Gebruik matplotlib om de spectra van elke cluster uit te zetten met gemiddelde waarde (ononderbroken lijn) en standaarddeviatie (schaduwgebied)
    6. Volg het protocol van het bestrafte reference matching SRS (PRM-SRS)-protocol met behulp van MATLAB om de ruimtelijke labelvrije lipide-subtypedetectie te creëren met SRS hyperspectrale beelddatasets47.
    7. Organiseer de afbeeldingen en sla ze op in een .tif formaat van 300 dpi.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De afbeeldingen in figuur 2 zijn representatief voor de resultaten die zijn verkregen door het protocol voor het verkrijgen van autofluorescentie van FAD en NADH te volgen, evenals de vier SRS-kanalen voor eiwit, totale lipiden, onverzadigde lipiden en verzadigde lipiden. Hier genereren we ook een pseudo-histologisch beeld zoals beschreven in het protocol door middel van RGB-kleurmenging. De acquisitie van de MPF- en SRS-kanalen levert de beeldbestanden op d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit multimodale systeem is een krachtig beeldvormingsplatform voor het vastleggen van een holistische visualisatie van de moleculaire omgeving van monsters over een breed scala van biologische oorsprong en pathologische aandoeningen. Het voordeel van het gebruik van verschillende labelvrije modaliteiten ligt in het vermogen om aanvullende informatie te verkrijgen en zich te richten op specifieke analyten die anders moeilijk of onmogelijk zouden zijn in een enkele labelvrije beeldvormings...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Dr. Gloria Pryhuber en haar HuBMAP-teamleden voor het verstrekken van plakjes menselijk longweefsel. We danken Dr. Kun Zhang voor het verstrekken van menselijk hersenweefsel. We danken ook Dr. Gen-Sheng Feng voor het verstrekken van levermonsters van muizen. We erkennen de steun van NIHU54DK134301, NIH R01GM149976, NIH U01AI167892, NIH R01HL170107, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIH U54CA132378, UCSD Startup funds, Sloan Research Fellow Award en CZI DAF2023-328667 Award.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
460 nm Filter CubeOlympusOCT-ET 460/50M32
Bandpass FilterKR ElectronicsKR27248 MHz
BNC 50 Ohm TerminatorMini CircuitsSTRM-50
DC power supplyTopWard6302D
Dichroic MountThorlabsKM100CL
FIJI ImageJImageJ
High NA oil condenserOlympus6-U130
High O.D. shortpass filterThorlabs950 nm
Inverted Laser Scanning MicroscopeOlympusFV1200MPE
Lock-in AmplifierZurich Instruments
picoEmerald Laser SystemApplied Physics & Electronics, Inc. Gesynchroniseerde gepulseerde pompstraal (afstembare 720–990 nm golflengte, 5–6 ps pulsbreedte en 80 MHz herhalingsfrequentie) en Stokes (golflengte bij 1032 nm, 6 ps pulsbreedte en 80 MHz herhalingsfrequentie)
SI Photodiode DetectorHome Built
Touch Panel ControllerOlympus
VF-300 Compresstome Precisionary

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wollman, A. J. M., Nudd, R., Hedlund, E. G., Leake, M. C. From Animaculum to single molecules: 300 years of the light microscope. Open Biol. 5 (4), 150019(2015).
  2. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nat Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  3. Weber, M., et al. MINSTED fluorescence localization and nanoscopy. Nat Photonics. 15 (5), 361-366 (2021).
  4. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. , (1990).
  5. Hell, S. W., et al. Three-photon excitation in fluorescence microscopy. J Biomed Optics. 1 (1), 71-74 (1996).
  6. Alhallak, K., Rebello, L. G., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N. Optical redox ratio identifies metastatic potential-dependent changes in breast cancer cell metabolism. Biomed Opt Express. 7 (11), 4364-4374 (2016).
  7. Pena, A. -M., et al. Multiphoton FLIM imaging of NADH and FAD to analyze cellular metabolic activity of reconstructed human skin in response to UVA light. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XIX. 10882, 23-33 (2019).
  8. Hu, L., Wang, N., Cardona, E., Walsh, A. J. Fluorescence intensity and lifetime redox ratios detect metabolic perturbations in T cells. Biomed Opt Express. 11 (10), 5674-5688 (2020).
  9. Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. J Biol Chem. 254 (11), 4764-4771 (1979).
  10. Ostrander, J. H., et al. Optical redox ratio differentiates breast cancer cell lines based on estrogen receptor status. Cancer Res. 70 (11), (2010).
  11. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of NADH and FAD redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (49), 19494-19499 (2007).
  12. Varone, A., et al. Endogenous two-photon fluorescence imaging elucidates metabolic changes related to enhanced glycolysis and glutamine consumption in precancerous epithelial tissues. Cancer Res. 74 (11), 3067-3075 (2014).
  13. Malak, M., James, J., Grantham, J., Ericson, M. B. Contribution of autofluorescence from intracellular proteins in multiphoton fluorescence lifetime imaging. Sci Rep. 12, 16584(2022).
  14. Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).
  15. Roth, S., Freund, I. Second harmonic generation in collagen. J Chem Phys. 70 (4), 1637-1643 (1979).
  16. Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11 (2), 94(1986).
  17. Boyd, R. W., Gaeta, A. L., Giese, E. Nonlinear optics. Springer Handbook of Atomic, Molecular, and Optical Physics. Drake, G. W. F. , Springer. 1097-1110 (2023).
  18. Aghigh, A., et al. Second harmonic generation microscopy: a powerful tool for bio-imaging. Biophys Rev. 15 (1), 43-70 (2023).
  19. Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
  20. Cox, G. Biological applications of second harmonic imaging. Biophys Rev. 3 (3), 131(2011).
  21. Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat Med. 9 (6), 796-800 (2003).
  22. Keikhosravi, A., Bredfeldt, J. S., Sagar, A. K., Eliceiri, K. W. Chapter 28 - Second-harmonic generation imaging of cancer. Methods Cell Bio. 123, 531-546 (2014).
  23. Hui Mingalone, C. K., et al. Bioluminescence and second harmonic generation imaging reveal dynamic changes in the inflammatory and collagen landscape in early osteoarthritis. Lab Invest. 98 (5), 656-669 (2018).
  24. Tsafas, V., et al. Polarization-dependent second-harmonic generation for collagen-based differentiation of breast cancer samples. J Biophotonics. 13 (10), e202000180(2020).
  25. Nadiarnykh, O., LaComb, R. B., Brewer, M. A., Campagnola, P. J. Alterations of the extracellular matrix in ovarian cancer studied by Second Harmonic Generation imaging microscopy. BMC Cancer. 10, 94(2010).
  26. Xiong, S. Y., Yang, J. G., Zhuang, J. Nonlinear spectral imaging of human normal skin, basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma based on two-photon excited fluorescence and second-harmonic generation. Laser Phys. 21 (10), 1844-1849 (2011).
  27. Tilbury, K., Campagnola, P. J. Applications of second-harmonic generation imaging microscopy in ovarian and breast cancer. Perspect Medicin Chem. 7, 21-32 (2015).
  28. Raman, C. V., Krishnan, K. S. A New type of secondary radiation. Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).
  29. Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Phys Rev Lett. 9 (11), 455-457 (1962).
  30. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  31. Li, Y., et al. Microglial lipid droplet accumulation in tauopathy brain is regulated by neuronal AMPK. Cell Metab. 36 (6), 1351-1370.e8 (2024).
  32. Lu, F. -K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. Cancer Res. 76 (12), 3451-3462 (2016).
  33. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nat Commun. 9 (1), 2995(2018).
  34. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nat Biomed Eng. 3 (5), 402-413 (2019).
  35. Li, Y., et al. Bioorthogonal stimulated Raman scattering imaging uncovers lipid metabolic dynamics in Drosophila brain during aging. GEN Biotechnol. 2 (3), 247-261 (2023).
  36. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by stimulated Raman scattering microscopy. Anal Chem. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  37. Ji, M., et al. Detection of human brain tumor infiltration with quantitative stimulated Raman scattering microscopy. Sci Transl Med. 7 (309), 309ra163(2015).
  38. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Sci Transl Med. 5 (201ra119), 201ra119(2013).
  39. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nat Commun. 9, 2125(2018).
  40. You, S., et al. Label-free deep profiling of the tumor microenvironment. Cancer Res. 81 (9), 2534-2544 (2021).
  41. Jermyn, M., et al. Highly accurate detection of cancer in situ with intraoperative, label-free, multimodal optical spectroscopy. Cancer Res. 77 (14), 3942-3950 (2017).
  42. Pshenay-Severin, E., et al. Multimodal nonlinear endomicroscopic imaging probe using a double-core double-clad fiber and focus-combining micro-optical concept. Light Sci Appl. 10 (1), 207(2021).
  43. Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated Raman scattering microscopy. J Vis Exp. (178), e63411(2021).
  44. Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and stimulated Raman scattering microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. J Am Chem Soc. 139 (47), 17022-17030 (2017).
  45. Li, Z., et al. Multimodal imaging of metabolic activities for distinguishing subtypes of breast cancer. Biomed Opt Express. 14 (11), 5764-5780 (2023).
  46. Fung, A. A., et al. Label-free optical biopsy reveals biomolecular and morphological features of diabetic kidney tissue in 2D and 3D. , (2024).
  47. Zhang, W., et al. Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS microscopy. Nat Commun. 15 (1), 1599(2024).
  48. Xu, F. X., et al. Discrimination of lipid composition and cellular localization in human liver tissues by stimulated Raman scattering microscopy. J Biomed Opt. 29 (1), 016008(2024).
  49. Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
  50. Liaudanskaya, V., et al. Mitochondria dysregulation contributes to secondary neurodegeneration progression post-contusion injury in human 3D in vitro triculture brain tissue model. Cell Death Dis. 14 (8), 1-15 (2023).
  51. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, sub-types and early treatment response in breast cancer. Cancer Res. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  52. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  53. Sun, W., et al. Nonlinear optical microscopy: use of second harmonic generation and two-photon microscopy for automated quantitative liver fibrosis studies. J Biomed Optics. 13 (6), 064010(2008).
  54. Nejim, Z., Navarro, L., Morin, C., Badel, P. Quantitative analysis of second harmonic generated images of collagen fibers: a review. Res Biomed Eng. 39 (1), 273-295 (2023).
  55. Burke, K., Brown, E. The use of second harmonic generation to image the extracellular matrix during tumor progression. Intravital. 3 (3), e984509(2015).
  56. Balasubramanian, P., Prabhakaran, M. P., Sireesha, M., Ramakrishna, S. Collagen in human tissues: Structure, function, and biomedical implications from a tissue engineering perspective. Polymer Composites - Polyolefin Fractionation - Polymeric Peptidomimetics - Collagens. Abe, A., Kausch, H. H., Möller, M., Pasch, H. 251, 173-206 (2012).
  57. Dadsena, S., et al. Lipid unsaturation promotes BAX and BAK pore activity during apoptosis. Nat Commun. 15, 4700(2024).
  58. Barelli, H., Antonny, B. Lipid unsaturation and organelle dynamics. Curr Opin Cell Biol. 41, 25-32 (2016).
  59. Harayama, T., Antonny, B. Beyond fluidity: The role of lipid unsaturation in membrane function. Cold Spring Harb Perspect Biol. 15 (7), a041409(2023).
  60. Yoon, H., Shaw, J. L., Haigis, M. C., Greka, A. Lipid metabolism in sickness and in health: Emerging regulators of lipotoxicity. Mol Cell. 81 (18), 3708-3730 (2021).
  61. Villazon, J., Shi, L. Utilizing K-means clustering on hyperspectral DO-SRS images of the mouse hippocampus. CLEO 2024, Technical Digest Series. , Optica Publishing Group. (2024).
  62. Fu, D., et al. Quantitative chemical imaging with multiplex stimulated Raman scattering microscopy. J Am Chem Soc. 134 (8), 3623-3626 (2012).
  63. Periasamy, A., Diaspro, A. Special section guest editorial: Multiphoton microscopy. J Biomed Optics. 8 (3), 327(2003).
  64. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  65. Blacker, T. S., et al. Separating NADH and NADPH fluorescence in live cells and tissues using FLIM. Nat Commun. 5, 3936(2014).
  66. Xiong, H., et al. Background-free imaging of chemical bonds by a simple and robust frequency-modulated stimulated Raman scattering microscopy. Opt Express. 28 (10), 15663-15677 (2020).
  67. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  68. Alam, S. R., Wallrabe, H., Christopher, K. G., Siller, K. H., Periasamy, A. Characterization of mitochondrial dysfunction due to laser damage by 2-photon FLIM microscopy. Sci Rep. 12 (1), 11938(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Labelvrije beeldvormingmultifotonfluorescentietweede harmonische generatiegestimuleerde Raman verstrooiingmoleculaire samenstellinglipidemetabolismeoptische redoxratiosubcellulaire resolutie

Gerelateerde artikelen