Methodenartikel

Geautomatiseerde en high-throughput microbiële monoklonale teelt en plukken met behulp van het eencellige Microliter-druppel Culture Omics-systeem

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67925

⸱

14 maart 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biobreeding Center, Wuxi Research Institute of Applied Technologies, Tsinghua University, 5Center for Synthetic and Systems Biology, Tsinghua University, 6Institute of Biomedical Health Technology and Engineering, Shenzhen Bay laboratory, 7Institute of Biopharmaceutical and Health Engineering, Shenzhen International Graduate School, Tsinghua University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe het Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS-cel) kan worden gebruikt om microbiële monoklonale isolatie, teelt en pluk uit te voeren. De MISS-cel bereikt een geïntegreerde workflow op basis van microfluïdische druppeltechnologie, die een uitstekende monodispersie van druppels, hoge parallelle teelt en detectie van biomassa met hoge doorvoer biedt.

Samenvatting

Pure bacterieculturen zijn essentieel voor de studie van microbiële culturomics. Traditionele methoden op basis van massieve platen, putplaten en microreactoren worden gehinderd door omslachtige procedures en een lage doorvoer, waardoor de snelle voortgang van het microbiële culturomics-onderzoek wordt belemmerd. Om deze uitdagingen aan te gaan, hadden we met succes het Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS-cel) ontwikkeld, een geautomatiseerd high-throughput-platform dat gebruikmaakt van druppelmicrofluïdische technologie voor microbiële monoklonale isolatie, teelt en screening. Dit systeem kan in korte tijd een groot aantal eencellige druppeltjes genereren en monoklonale kolonies kweken, screenen en verzamelen, waardoor een geïntegreerd proces van microbiële isolatie tot plukken mogelijk wordt. In dit protocol hebben we de toepassing ervan gedemonstreerd met de isolatie en kweek van de menselijke darmmicrobiota als voorbeeld en hebben we de microbiële isolatie-efficiëntie, monoklonale cultuurprestaties en screeningsdoorvoer vergeleken met behulp van de vaste-plaatcultuurmethode. De experimentele workflow was eenvoudig en het reagensverbruik was erg laag. Vergeleken met vaste-plaatkweekmethoden zou de MISS-cel een grotere diversiteit aan darmmicrobiota-soorten kunnen cultiveren, wat een aanzienlijk potentieel en waarde biedt voor microbieel culturomics-onderzoek.

Inleiding

Microbiële culturomics hebben brede toepassingen bij het onderzoeken van nuttige microben in de voedingsindustrie, de diversiteit van microben in het milieu, screening op nieuwe antimicrobiële verbindingen en het menselijk microbioom in relatie tot ziekte 1,2,3,4. Traditionele methoden, voornamelijk gebaseerd op massieve platen, putplaten of microreactoren om monoklonale kolonies te verkrijgen en te kiezen, zijn eenvoudig te bedienen, maar hebben last van een lage doorvoer vanwege hun meerdere stappen. Deze beperking belemmert toepassingen zoals microbiële mutagenesescreening, microbiële culturomics-studies en hoogproductieve kolonieselectie, die allemaal uitgebreide monoklonale screening vereisen.

Onlangs zijn verschillende detectie- en doseerapparaten met één cel ontworpen om de verwerkingssnelheid van microbiële monsters aanzienlijk te verbeteren, terwijl de arbeid wordt verminderd en fouten door handmatige hantering worden geminimaliseerd5. Deze instrumenten richten zich echter doorgaans alleen op specifieke stappen binnen traditionele methoden, die vaak een uitgebreide integratie van apparatuur vereisen, veel ruimte in beslag nemen en hoge kosten met zich meebrengen. Daarom was er een dringende behoefte aan de ontwikkeling van een goedkoop, universeel toepasbaar microbieel kweek- en screeningsplatform om de bovengenoemde tekortkomingen te compenseren.

In ons eerdere werk hebben we met succes een geautomatiseerd screeningplatform met hoge doorvoer ontwikkeld, bekend als het Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS-cel, hierna "het Omics-systeem" genoemd)6. Dit platform maakt gebruik van druppelmicrofluïdische technologie, die veelbelovend is voor het bereiken van automatisering en integratie in microbiële isolatie, teelt en plukken 7,8,9,10. Het Omics-systeem bestaat uit verschillende belangrijke modules, waaronder een bemonsteringsmodule, een microfluïdische chip, een druppeldetectie- en verzamelingssysteem, waardoor efficiënte isolatie van afzonderlijke cellen, teelt, monoklonale screening en verzameling in microbiologisch onderzoek mogelijk zijn. We hebben het Omics-systeem al gebruikt om high-throughput mutagenesescreening van Corynebacterium glutamicum6 te bereiken.

Vanwege de automatisering en high-throughput screeningmogelijkheden van het Omics-systeem, wordt verwacht dat het toepassen ervan op microbiële culturomics snel een grote hoeveelheid microbiële gegevens zal opleveren. In dit protocol hebben we de gedetailleerde operationele procedure van de MISS-cel geïntroduceerd, met de isolatie en kweek van de menselijke darmmicrobiota als voorbeeld om het proces van microbiële isolatie, kweek, monoklonale detectie en screening te demonstreren. De werking van het Omics-systeem is eenvoudig en onderzoekers hoeven alleen de softwarerichting te volgen voor de sequentiële installatie van microslangen en druppelgenererende microfluïdische chip, parameterinstellingen en monstervoorbereiding.

In de software-interface is het Omics-systeem onderverdeeld in drie hoofdfuncties: isolatie, teelt en screening. Onderzoekers kunnen verschillende stadia selecteren op basis van het experiment. Bovendien kunnen onderzoekers tijdens de screeningsfase van de druppels kiezen uit twee detectiemodi: fluorescerend signaal of optische dichtheid. De software biedt real-time visualisatie van het druppelscreeningsproces. Ten slotte hebben onderzoekers de flexibiliteit om parameters zoals kweekomstandigheden, gedetecteerde golflengte en het aantal verzamelputten te configureren op basis van hun specifieke experimentele eisen, en ze kunnen het instrument op elk moment pauzeren om andere bewerkingen uit te voeren. De MISS-cel is een microbe-vriendelijk, high-throughput monoklonaal screeningsplatform met eenvoudige bediening en minimaal reagensverbruik.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle onderzoeksprocedures voldoen aan alle relevante ethische voorschriften. De procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie voor wetenschap en technologie van de Tsinghua University. Voor het bestuderen van de menselijke darmmicrobiota werden ontlastingsmonsters verzameld van een gezonde volwassene zonder significante medische aandoeningen, die schriftelijke geïnformeerde toestemming gaf.

1. Installatie van instrumenten

  1. Plaats het Omics-systeeminstrument in een schone of steriele omgeving (zoals een steriele ruimte of anaërobe bank). Het instrument is een precisie-apparaat en houd bij het plaatsen ervan in de faciliteit rekening met het volgende:
    1. Houd het instrument onder normale druk en temperatuur.
    2. Houd het instrument uit de buurt van sterke elektrische velden, magnetische velden en warmtestralingsbronnen.
    3. Zorg ervoor dat het plaatsingsgebied van het instrument groter is dan 2.500 mm (D) x 1.500 mm (B) x 2.000 mm (H).
    4. Houd de omgevingsvochtigheid van het instrument onder de 60%.

2. Voorbereidingen

  1. Schakel achtereenvolgens de stroom in voor het Omics-systeem, de computer en de besturingssoftware van het Omics-systeem.
  2. Installatie van microfluïdische chips voor het genereren van MISS-cellen en druppels:
    1. Open de deur van de druppelgeneratie- en kweekkamer (Figuur 1A) en verwijder verticaal de beschermkap voor de microslangen en de druppelgenererende microfluïdische chip. Gebruik een wegwerpspuit om 10 ml steriel gedestilleerd water toe te voegen aan de luchtbevochtiger in de druppelkweekkamer (Figuur 1C) en plaats de beschermkap voor de microslangen en de druppelgenererende microfluïdische chip terug.
    2. Open de steriele verpakking van de microslangen en druppelgenererende microfluïdische chip en plaats deze verticaal direct boven de kweekkamer (Figuur 1C).
    3. Klik op de software-interface op Installatie (Afbeelding 2A). Op dit punt verschijnt er een pop-upvenster met de prompt: Bevestig de vervanging van microslangen en druppelgenererende microfluïdische chip? Klik op Ja om de installatie te starten.
    4. Haal de luchtbellenverwijderaar eruit en bevestig deze ondersteboven op de plaatsing van de luchtbellenverwijderaar in de druppelgeneratie- en kweekkamer. Zorg ervoor dat u niet op de druppelinlaat- en uitlaatbuizen van de luchtbellenverwijderaar drukt (Figuur 1E).
    5. Bevestig de druppeluitlaatbuis van de luchtbellenverwijderaar aan het klemventiel eronder en laat het door het gat gaan, dat naar de druppeldetectie- en verzamelkamer is geleid (Afbeelding 1B).
    6. Open de deur van de druppeldetectie- en verzamelkamer, steek de detectiebuis, die al is aangesloten op de druppeluitlaatbuis, verticaal in de detectiebus en zorg ervoor dat de detectiebuis volledig is ingebracht (Afbeelding 1D).
      NOTITIE: Wanneer u de detectiebuis plaatst, plaatst u deze verticaal zonder bochten op de buis.
    7. Draai de schroef waarmee de detectiebuis is bevestigd met de klok mee vast. Nadat u hebt gecontroleerd of de detectiebuis volledig is ingebracht en vastgezet, sluit u de deur van de druppeldetectie- en verzamelkamer.
    8. Van de microslangen en druppelgenererende microfluïdische chip zijn er 10 siliconenbuizen, elk gelabeld met een nummer (L01-L10). Sluit elke gelabelde buis aan op de overeenkomstige genummerde klemklep (01-10) (Figuur 1C).
    9. Sluit de snelkoppeling van de microslang en druppelgenererende microfluïdische chip aan op de overeenkomstige poort op het Omics-systeem: C1 naar O1, C2 naar O2, C4 naar O4 en CF naar OF.
      OPMERKING: De installatie van de microslangen en de microfluïdische chip voor het genereren van druppels is voltooid. C3 hoeft niet op O3 te worden aangesloten.
    10. Nadat de installatie van de microfluïdische chip voor het genereren van microslangen en druppels is voltooid, verschijnt er een pop-upvenster waarin wordt gevraagd of de klemklep voor druppelslangen wordt geopend. Klik op OK wanneer de installatie van de microslangen en de druppelgenererende microfluïdische chip is voltooid. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat alle siliconenslangen van de microslang en de druppelgenererende microfluïdische chip zijn bevestigd aan de bijbehorende klemklep, klikt u op OK.
  3. Initialisatie van instrumenten
    1. Voordat u de initialisatie uitvoert, klikt u op de instellingeninterface (Afbeelding 2B) om de relevante parameters te configureren: detectiemodus (detectie op basis van OD of op basis van fluorescentie; OD hier), incubatietemperatuur (37 °C) en tijd (30 dagen = 720 uur), snelheid van het roerwerk (20 rpm), de golflengte van OD-detectie (600 nm) en de excitatie- en emissiegolflengte van fluorescentiedetectie.
      OPMERKING: Parameters die in dit protocol worden gebruikt voor de isolatie en cultivatie van de menselijke darmmicrobiota worden tussen haakjes gegeven. Bij het instellen van de parameters moet de teelttemperatuur tussen 5 °C en 50 °C liggen. Bij het selecteren van de detectiemodus moet de optische vezel worden vervangen als de vezel op de druppeldetectiemodule niet hetzelfde is (zie stap 2.3.2). Bij het configureren van parameters wordt de referentiewaarde van de oliefase (basisspectraal) automatisch door de software geïdentificeerd, waardoor handmatige aanpassingen niet nodig zijn.
    2. De vervanging van de gedetecteerde optische vezel
      1. Verwijder de gedetecteerde vezel uit de vezelhouder (schroef tegen de klok in) en draai de vezelbevestigingsschroef op de druppelmodule los (Afbeelding 1D).
      2. Als de optische vezel niet wordt gebruikt, verwijdert u deze uit de module, plaatst u deze in de vezelhouder en draait u deze vast. Steek de gedetecteerde vezel in de detectiepoort en draai de vezelbevestigingsschroef op de module vast. De vervanging van de glasvezel is klaar.
    3. Ga naar de startinterface en klik op Initialiseren om het Omics-systeem een zelfcontrole van zijn componenten te laten uitvoeren, waaronder de injectiepomp, temperatuurinstellingen, testen op de afvoer van afvalvloeistof, de screeningmodule en de druppeldetectiemodule.
      1. Voer tijdens de initialisatie een test uit met de afvoer van afvalvloeistof vanuit de druppeldetectiemodule door 1 ml 75% alcohol in de afvalvloeistofpoort te injecteren en te observeren of de vloeistof normaal naar buiten stroomt.
      2. Plaats voor de screeningsmoduletest een plaat met 96 putjes op de plaatsing van de plaat en observeer of de plaatbeweging normaal is.

3. Druppel generatie

  1. Verzameling en verwerking van monsters van de menselijke darmmicrobiota
    1. Bereid een kamerpot en ontlastingscontainers voor, was de handen en draag handschoenen om verse ontlastingsmonsters te verzamelen.
      OPMERKING: Vermijd bij het verzamelen van ontlastingsmonsters zoveel mogelijk urinebesmetting. Het is beter om van tevoren te plassen en de ontlasting in een schone, droge container te plaatsen.
    2. Verzamel aseptisch de juiste hoeveelheid ontlasting in het middensegment en sluit deze af in gesteriliseerde cryovials (ongeveer 3-5 g per injectieflacon). Plaats de injectieflacons onmiddellijk op ijs om ze vervolgens te verdelen en te etiketteren.
      OPMERKING: Als het ontlastingsmonster groot is of niet onmiddellijk kan worden verzameld, moet het binnen maximaal 2 uur worden verzameld.
    3. Gebruik in de anaërobe bank een steriel wattenstaafje of ontlastingsbemonsteringsinstrument om een monster in het middensegment te verzamelen.
      OPMERKING: De oppervlaktelaag van de ontlasting bevat afgestoten darmslijmvliescellen en is vatbaar voor externe besmetting; na blootstelling aan lucht begint een deel van het microbiële DNA af te breken.
    4. Breng de verzamelde ontlastingsmonsters over in steriele microcentrifugebuisjes van 2 ml of steriele cryovials, waarbij elke buis 0,5-2,0 g ontlasting bevat. Bereid per monster twee aliquots voor om in te vriezen.
    5. Resuspendeer het verse ontlastingsmonster in een steriele fysiologische zoutoplossing, waarbij elke 100 mg van de ontlasting wordt verdund in 1 ml oplossing. Meng de ontlasting grondig totdat er geen grote deeltjes meer zichtbaar zijn.
    6. Na natuurlijke sedimentatie gedurende 10 minuten wordt het bovenstaande achtereenvolgens gefilterd door steriele gaasfilters met poriegroottes van 200 mazen (0,075 mm), 400 mazen (0,038 mm) en 800 mazen (0,018 mm) om onverteerd voedsel en kleinere fijnstof te verwijderen. Vang ten slotte het filtraat op in steriele centrifugebuisjes.
    7. Neem 10 μL van de gefilterde fecale suspensie en bepaal de microbiële concentratie met behulp van een hemocytometer en een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.
      OPMERKING: Na het filteren van het fecale monster supernatans door verschillende maaswijdten, blijven er enkele kleinere fecale deeltjes over. Daarom worden bij het bepalen van de microbiële concentratie actieve deeltjes die onder de microscoop worden waargenomen, beschouwd als micro-organismen, wat slechts een benaderende berekening van de microbiële concentratie mogelijk maakt.
    8. Breng de fecale suspensie over in een steriele centrifugebuis van 1,5 ml en label deze met de datum, microbiële concentratie en monsternaam. Bewaar een deel voor latere experimenten en bewaar de rest bij 4 °C voor toekomstig gebruik.
      OPMERKING: Noteer onmiddellijk monsterinformatie (monsternaam, verzameltijd) om ervoor te zorgen dat monsters tegelijkertijd worden verzameld (rekening houdend met veranderingen in het microbiële temporele ritme van de darm van zoogdieren). De volledige monsterverzameling en -verwerking moet worden uitgevoerd in een anaërobe omgeving.
  2. Voorbereiding op de eerste fecale suspensie
    1. Bereid Brain Heart Broth (BHI) medium volgens het protocol van de fabrikant en steriliseer het door te autoclaveren op 121 °C gedurende 15 min.
    2. Neem de fecale suspensie uit stap 3.1.8 en voer seriële verdunningen uit met BHI-medium om een concentratie van ~50 cellen/ml te bereiken.
      OPMERKING: Om de monsterfles te vullen, bereidt u ten minste 40 ml fecale suspensie voor.
    3. Zorg ervoor dat er een kleine magnetische roerstaaf op de bodem ligt en giet de verdunde fecale suspensie in de monsterfles tot aan de positie voor het toevoegen van het monster. Draai de dop vast en draai deze vast. Steek vervolgens de snelkoppeling A in snelkoppeling B om het laadproces van het monster te voltooien (Afbeelding 3A).
    4. Plaats de monsterfles in de daarvoor bestemde positie en scheid de snelkoppelingen A en B van de monsterfles. Sluit de snelkoppeling A van de monsterfles aan op de O3-poort op het Omics-systeem en de C3-connector op de microslang en de druppelgenererende microfluïdische chip worden aangesloten op de snelkoppeling B. Sluit de deur van druppelgeneratie en kweekkamer (Afbeelding 3B).
  3. Druppel generatie
    1. Selecteer het gewenste aantal druppelslangen dat moet worden gegenereerd op de startinterface van de software (Afbeelding 2A).
      OPMERKING: Elke run kan tot 10 druppelslangen produceren, waarbij elke buis ongeveer 5.000 druppels genereert.
    2. Klik op Produceren in de startinterface van de software om het genereren van druppels met één cel te starten.
      NOTITIE: Controleer of de pomp voor het afvoeren van afvalvloeistof werkt of niet. Tijdens het genereren van druppels heeft elke druppel een volume van 2,0 μL. Zie het discussiegedeelte voor een beschrijving van het genereren van druppels.
    3. Wacht tot het pieperalarm aangeeft dat het genereren van druppels is voltooid. Sluit de clamp op de C3-connector (Figuur 1E) en verwijder de monsterfles.

4. Druppel teelt

  1. Selecteer hetzelfde aantal druppelslangen als tijdens het genereren van druppels op de startinterface van de software, klik op Cultuur, bevestig de teelttijd en temperatuur en begin het proces. Bewaak de voortgangsbalk op de startinterface die de voortgang van de teelt en de resterende tijd weergeeft.
  2. Wacht tot het alarm van de pieper aangeeft dat de druppelteelt is voltooid. Als de teelttijd moet worden verlengd, past u de tijd rechtstreeks op de instellingsinterface aan.

5. Screening van druppels

  1. Druk op de UV-knop op het Omics-systeem om ultraviolet (UV) licht in te schakelen (Figuur 1A), bestraal de druppeldetectie- en verzamelkamer gedurende 30 minuten en schakel vervolgens het UV-licht uit.
    NOTITIE: Voordat u het UV-licht inschakelt, moet u ervoor zorgen dat de deur van de druppeldetectie- en verzamelkamer gesloten is.
  2. Open in een superschone bank alle platen met 96 putjes die worden gebruikt om druppels op te vangen en stapel ze op elkaar zonder deksel, waarbij je ze opeenvolgend van onder naar boven nummert. Zorg ervoor dat de bovenste putplaat is afgedekt met een deksel.
    OPMERKING: Elke run biedt plaats aan maximaal tien platen met 96 putjes en het aantal platen is afhankelijk van het totale aantal druppels.
  3. Open de deur van de druppeldetectie- en verzamelkamer, plaats de putplaten op de daarvoor bestemde posities (Figuur 1D), verwijder het deksel van de bovenste putplaat en sluit de deur van de kamer.
  4. Schakel het UV-licht op het Omics-systeem 30 minuten in om secundaire sterilisatie uit te voeren.
  5. Installatie van de luchtbellenverwijderaar
    1. Haal de luchtbellenverwijderaar uit de standplaats, draai de dop los en verwijder de vlindervormige schroef van de dop (Figuur 3C).
    2. Giet 200 ml olie voor het verwijderen van luchtbellen in de luchtbellenverwijderaar, schroef de fles stevig vast met de dop van de luchtbellenverwijderaar op het Omics-systeem en bevestig de verwijderaar vervolgens ondersteboven op de plaatsing van de luchtbellenverwijderaar. De installatie van de luchtbellenverwijderaar is voltooid.
      NOTITIE: Zorg er bij het bevestigen van de luchtbellenverwijderaar op de plaatsing voor dat er geen olie uit lekt. Als er lekkage optreedt, draai dan het deksel vast.
  6. Selecteer de druppelslang om te sorteren op de startinterface , klik op Sorteren, voer het aantal putplaten in dat moet worden verzameld en start vervolgens het proces. Nadat de druppelscreening is begonnen, observeert u het gebied met procesweergaven, dat real-time metingen van de optische dichtheid (OD) van druppels of fluorescentiewaarden toont.
  7. Analyseer ongeveer 20-30 druppels om de OD-waarde te controleren. Als bijvoorbeeld wordt vastgesteld dat de meerderheid een OD-waarde van ~0,2 heeft, wat overeenkomt met de OD-waarde van lege druppels, op basis van de Poisson-verdeling, stelt u de onderste OD-drempel in op 0,5 en de bovenste OD-drempel op 4,0. De druppels binnen dit bereik worden automatisch opgevangen in platen met 96 putjes (Figuur 4A).
    OPMERKING: Volgens de wet van Beer-Lambert wordt de OD-waarde van lege druppels bepaald door de samenstelling van het kweekmedium in de druppels. Doorgaans wordt de onderste OD-drempel 0,2-0,3 eenheden hoger ingesteld dan de OD-waarde van lege druppels om een duidelijk onderscheid te maken tussen lege druppels en druppeltjes die micro-organismen bevatten.
  8. Wacht tot het alarm van de pieper aangeeft dat het zeven en verzamelen van druppels is voltooid. Open de deur van de druppeldetectie- en verzamelkamer, plaats het deksel van de putplaat op de bovenste putplaat en haal vervolgens alle putplaten samen uit de kamer om de daaropvolgende sequentiebepaling en back-up uit te voeren.

6. Gegevensexport en weergave van heatmaps

  1. Klik op Gegevens exporteren om de verzamelde druppelsignaalgegevens op te slaan (Afbeelding 4A,B).
  2. Klik op Heatmap, selecteer het gegevensbestand voor het verzamelen van druppels en observeer de OD-waarden van druppels die zijn verzameld in de microplaat die door de software wordt weergegeven. Visualiseer deze OD-waarden als een heatmap, waarbij de kleurintensiteit overeenkomt met de OD-verdeling over de putjes, waardoor een duidelijke en intuïtieve weergave ontstaat van de verzamelde monoklonale OD-waarden (Figuur 4A,C).

7. Reiniging van de MISS-cel

  1. Nadat u het experiment hebt voltooid, selecteert u de druppelslang die moet worden gereinigd en klikt u op Reinigen om het instrument te reinigen.

8. Microbiële monoklonale back-up en sequencing monstervoorbereiding

  1. Voorbereiding van sequentiemonsters
    1. Voeg in de anaërobe bank 100 μl BHI-medium toe aan elk putje van de verzamelde druppelplaat, meng goed door te pipetteren en neem vervolgens 10 μl uit elk putje en breng dit alles over in een steriel buisje van 15 ml. Vortex om een gemengde microbiële suspensie te verkrijgen.
    2. Voeg 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing toe aan de gemengde microbiële suspensie, centrifugeer bij 1.000 × g gedurende 10 minuten, verwijder de supernatant en plaats de microbiële pellet in vloeibare stikstof voor snelle bevriezing. De voorbereiding van het sequentiemonster is voltooid.
    3. Gebruik 16S rDNA amplicon sequencingmethoden gericht op het V3- en V4-domein van het 16S rDNA. De specifieke sequencing-primers die worden gebruikt zijn als volgt: 341F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA en 806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT.
  2. Microbiële monoklonale monster cryopreservatie:
    1. Nadat u 10 μl van het monster uit elk putje in de druppelplaten hebt verzameld (uit stap 8.1.1), voegt u 30 μl glycerol toe aan elk putje. Plaats de platen onder -80 °C voor het behoud van microbiële stam.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De menselijke darmmicrobiota, die de overheersende microbiële gemeenschap vormt, herbergt naar schatting ongeveer 4 × 1013 micro-organismen in de darm, wat de enorme aantallen en complexe samenstelling ervan laat zien11. In deze studie wilden we de darmmicrobiota isoleren en kweken en gebruikten we de vaste-plaatmethode als controle om de high-throughput-prestaties van de MISS-cel aan te tonen.

Ten eerste gebruikten we dezelf...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol schetst de werking van de MISS-cel voor geautomatiseerde en high-throughput microbiële monoklonale isolatie, teelt, detectie en verzameling. Vergeleken met traditionele methoden waarbij slechts ~20%-30% van de darmmicrobiota kon worden geïsoleerd en gekweekt 2,12, was het aantal monoklonale klonen verkregen met behulp van het Omics-systeem 1.97 keer hoger dan dat verkregen uit massieve platen. Uit deze vergelijking b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door de onderzoeks- en ontwikkelingsprojecten in belangrijke gebieden van de provincie Guangdong (2024B1111130002), onderzoeks- en ontwikkelingsprojecten van de provincie Hebei (22375503D) en het openingsproject van Anhui Engineering Laboratory for Industrial Microbiology Molecular Breeding (Grant ELMB-07).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 mm Petri schotelMerck KGaA, Darmstadt, GermanyP5731-500EAVoor bereiding van vaste plaat
30 mL OntlastingscontainersBoen Healthcare Co., Ltd611101Voor het verzamelen van de ontlastingsmonsters
37 °C constante temperatuur incubatorShanghai Yiheng Technology Co., Ltd.LRH-150Kweek de vaste plaat in de incubator
96-well Clear Flat Bottom Polystyreen TC-behandelde MicroplatesCorning3599Voor detectie van putplaatbeweging en druppelverzameling
AgarBecton, Dickinson and Company214010Voor bereiding van vaste plaat
Luchtbellen verwijderen olieLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-S-olieDe olie in de luchtbellen verwijderen tijdens druppelscreening
Luchtbellen verwijderenLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-SSluit de gasfase tussen druppels uit voordat u druppeldetectie en verzameling uitvoert
Anaerobe werkbankArgon and Nitrogen Space Equipment Business Department, Haiyu Town, Changshu CityVGB-4CM Voor aseptische werking en UV-sterilisatie onder anaërobe omstandigheden
AutoclaafPuhexi Health and Medical Equipment Co., Ltd.MLS-830LVoor autoclaveren van BHI-medium, EP-buis, enzovoort.
Brain Heart Infusion (BHI) BouillonQingdao High-tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., LtdHB8297-1Componenten van het BHI-medium
De ingrediëntenlijst:
38,5 g/L BHI Bouillon in gedestilleerd water
Cell SpreaderMerck KGaA, Darmstadt, GermanyHS8151Inoculateer de microbiële oplossing op de vaste plaat
Centrifugebuis, 15 mLBeijing Xinhengyan Technology Co., LtdHB53397Voor bereiding van microbiële oplossing
ComputerLenovoE450Software-installatie en MISS cell-besturing
CryovialThermo Fisher2,0 mLVoor ontlastingsbehoud
Gedestilleerd waterBeijing Mreda Technology Co., Ltd.M306444-100mlToevoegen aan bevochtiger om de luchtvochtigheid in de druppelkweekkamer te behouden
EP-buisThermo Fisher2,0 mLVoor het verzamelen van de ontlastingsmonsters
Fluorescente geïnverteerde microscoopOlympus Life Science (LS)CKX53Controleer en bereken de microbiële concentratie
GlycerolGENERAL-REAGENTG66258AVoor stambehoud
HemocytometerAcmecAYA0810-1eaBereken de microbiële concentratie
KClAmbeedA442876Componenten van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS-oplossing)De ingrediëntenlijst: 8 g/L NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 in gedestilleerd water
KH2PO4MACKLINP815661Componenten van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS-oplossing)De ingrediëntenlijst: 8 g/L NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 in gedestilleerd water
GaasfilterAnping Jiufeng Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd200 mesh (0,075 mm), 400 mesh (0,038 mm), 800 mesh (0,018 mm) Verwijder onverteerd voedsel en kleinere deeltjes uit de ontlastingsmonsters
Micro-buis en druppelgeneratie microfluïdische chipLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISC-B2Voor druppelgeneratie en druppelkweek
MISS cell olieLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-BOS-BDe oliefase voor druppelmicrofluidica
MISS cell-softwareLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell V3.2.4Voer experimentele bewerkingen uit op het MISS cell-instrument
Na2HPO4SolarbioD7292Componenten van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS-oplossing)De ingrediëntenlijst: 8 g/L NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 in gedestilleerd water
NaClGENERAL-REAGENTG81793JComponenten van de fysiologische zoutoplossing
De ingrediëntenlijst:
9 g/L NaCl in gedestilleerd water
Pipeteppendorf2,5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μLVoor het hanteren van vloeistoffen
Polytetrafluorethyleen buisShenzhen WOER Heat-shrinkable Material Co., Ltd.3401000141Voor druppelkweek. Dit materiaal is al opgenomen in micro-buis en druppelgeneratie microfluïdische chip
Steekproef flesLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-flesBemonstering van microbiële oplossing
Single Cell Microliter-druppel Cultuur Omics Systeem (MISS cell)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-G3fVoer de microbiële monoklonale isolatie, kweek, detectie en verzameling uit
Superspeed CentrifugeThermo FisherSorvall Lynx 4000 Bereid de microbiële oplossing voor op sequencing
SpuitJiangsu Zhiyu Medical Instructment Co., Ltd10 mLTrek het gedestilleerd water en injecteer het in de bevochtiger in de druppelkweekkamer
Ultra lage temperatuur koelkastSANYO Ultra-low MDF-U4086S Voor stambehoud (-80 °C)

Referenties

  1. Hurst, C. J. Isolation and cultivation of bacteria. The structure and function of aquatic microbial communities. , Springer International Publishing. Cham. 313-351 (2019).
  2. Xu, M. Q., Pan, F., Peng, L. H., Yang, Y. S. Advances in the isolation, cultivation, and identification of gut microbes. Mil Med Res. 11 (1), 34(2024).
  3. Lattermann, C., Büchs, J. Microscale and miniscale fermentation and screening. Curr Opin Biotechnol. 35, 1-6 (2015).
  4. Huang, Y., et al. High-throughput microbial culturomics using automation and machine learning. Nat Biotechnol. 41 (10), 1424-1433 (2023).
  5. Brehm-Stecher Byron, F., Johnson Eric, A. Single-cell microbiology: Tools, technologies, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 68 (3), 538-559 (2004).
  6. Jian, X., et al. Single-cell microliter-droplet screening system (miss cell): An integrated platform for automated high-throughput microbial monoclonal cultivation and picking. Biotechnol Bioeng. 120 (3), 778-792 (2023).
  7. Hu, B., et al. One cell at a time: Droplet-based microbial cultivation, screening and sequencing. Mar Life Sci Technol. 3 (2), 169-188 (2021).
  8. Leygeber, M., et al. Analyzing microbial population heterogeneity-expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations. J Mol Biol. 431 (23), 4569-4588 (2019).
  9. He, Z., Wu, H., Yan, X., Liu, W. Recent advances in droplet microfluidics for microbiology. Chinese Chemical Letters. 33 (4), 1729-1742 (2022).
  10. Kaminski, T. S., Garstecki, P. Controlled droplet microfluidic systems for multistep chemical and biological assays. Chem Soc Rev. 46 (20), 6210-6226 (2017).
  11. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are we really vastly outnumbered? Revisiting the ratio of bacterial to host cells in humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
  12. Simrén, M., et al. Intestinal microbiota in functional bowel disorders: A rome foundation report. Gut. 62 (1), 159-176 (2013).
  13. Periyannan Rajeswari, P. K., Joensson, H. N., Andersson-Svahn, H. Droplet size influences division of mammalian cell factories in droplet microfluidic cultivation. Electrophoresis. 38 (2), 305-310 (2017).
  14. Jian, X., et al. Microbial microdroplet culture system (mmc): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnol Bioeng. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  15. Baret, J. -C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  16. Kubie, L. S. The solubility of O2, CO2, and N2 in mineral oil and the transfer of carbon dioxide from oil to air. J Biol Chem. 72 (2), 545-548 (1927).
  17. Poon, C. Measuring the density and viscosity of culture media for optimized computational fluid dynamics analysis of in vitro devices. J Mech Behav Biomed Mater. 126, 105024(2022).
  18. Yao, J., Lin, F., Kim, H. S., Park, J. The effect of oil viscosity on droplet generation rate and droplet size in a t-junction microfluidic droplet generator. Micromachines. 10 (12), 808(2019).
  19. Venkateshwarlu, A., Bharti, R. P. Effects of capillary number and flow rates on the hydrodynamics of droplet generation in two-phase cross-flow microfluidic systems. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 129, 64-79 (2021).
  20. Nekouei, M., Vanapalli, S. A. Volume-of-fluid simulations in microfluidic t-junction devices: Influence of viscosity ratio on droplet size. Physics of Fluids. 29, 032007(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microbi le culturomicsdruppelmicrofluidicamonoklonale isolatiehigh throughput screeningdarmmicrobiotaenkelcel druppelsgeautomatiseerde cultivatiemicrobi le diversiteitvergelijking met vaste platenoptische densiteitsdetectie

Gerelateerde artikelen