Methodenartikel

Vertalen van extracellulaire elektronenoverdrachtsactiviteiten met organische elektrochemische transistors

DOI:

10.3791/67928

⸱

31 januari 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1McKetta Department of Chemical Engineering, University of Texas at Austin, 2Department of Electrical and Computer Engineering, The University of Texas at Austin, 3Microelectronics Research Center, The University of Texas at Austin, 4Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 5Simpson Querrey Institute, Northwestern University, 6Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco, 7Department of Biology, Stanford University, 8Department of Chemistry, University of Texas at Austin

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van organische elektrochemische transistors (OECT's) om extracellulaire elektronenoverdracht (EET) activiteit in Shewanella oneidensis te vertalen in elektrische signalen. Het hybride OECT-systeem biedt verbeterde robuustheid, gevoeligheid en potentieel voor snelle tests met hoge doorvoer, waardoor het een effectief hulpmiddel is voor EET-metingen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire elektronenoverdracht (EET) is een proces waarbij bepaalde micro-organismen elektronen door hun celmembranen kunnen overbrengen naar externe elektronenacceptoren, waardoor het cellulaire metabolisme wordt gekoppeld aan hun omgeving. Hoewel Geobacter en Shewanella de primaire modellen zijn geweest voor EET-onderzoek, tonen opkomende studies aan dat EET-actieve soorten ook geassocieerd zijn met fermentatie en het menselijke darmmicrobioom. Door gebruik te maken van het vermogen van EET om biologische en elektronische systemen te overbruggen, presenteren we een protocol voor het gebruik van organische elektrochemische transistors (OECT's) om microbiële EET-activiteit te vertalen in gemakkelijk detecteerbare elektrische signalen. Dit systeem maakt het mogelijk om cellulaire reacties op externe stimuli te gebruiken voor biosensing- en biocomputingtoepassingen. Concreet hebben we aangetoond dat de dedoping van het p-type poly (3,4-ethyleendioxythiofeen): poly (styreensulfonaat) (PEDOT: PSS) kanaal in het OECT wordt aangedreven door cellulaire EET van Shewanella oneidensis. Door de EET-flux transcriptioneel te controleren via genetische circuits, stellen we het biosensing-vermogen van dit hybride OECT-systeem vast om chemische stimuli, zoals inducermoleculen, te detecteren. Bovendien introduceren we op plasmide gebaseerde Booleaanse logische poorten in de cellen, waardoor ze omgevingssignalen kunnen verwerken en stroomveranderingen in de OECT's kunnen aansturen, waardoor het biocomputingpotentieel van deze apparaten verder wordt aangetoond. Deze methode biedt een nieuwe interface tussen biologische systemen en elektronica, waardoor toekomstige high-throughput screening-, biosensing- en biocomputing-toepassingen mogelijk worden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apparaten die biologische en chemische activiteiten kunnen omzetten en versterken in elektrische signalen zijn cruciaal op verschillende gebieden, zoals detectie 1,2, neuromorfisch computergebruik 3,4 en draagbare elektronica5. Hiervan zijn organische elektrochemische transistors (OECT's) naar voren gekomen als uitzonderlijke interfaces tussen biologische systemen en elektronische uitlezingen vanwege hun compatibiliteit met waterige omgevingen en lage bedrijfsspanningen 6,7. OECT's verschillen van conventionele elektronica door ionen in een elektrolyt te gebruiken om de geleidbaarheid van een organisch kanaal te moduleren, dat ionisch en elektronisch transport koppelt om uitzonderlijke transconductantie te bereiken8. Deze kenmerken maken OECT's ideaal voor het koppelen van biologische systemen aan elektronica, omdat ze zwakke biologische signalen kunnen versterken en deze kunnen vertalen in elektrische uitlezingen.

OECT's werken door de dopingtoestand van een gemengd ionisch-elektronisch geleidend kanaal te veranderen door middel van ionische diffusie, meestal gecontroleerd door een spanning op de poortelektrode aan te leggen. Biologische of redoxreacties kunnen echter ook de geleidbaarheid van het kanaal veranderen, waardoor OECT's kunnen reageren op een verscheidenheid aan chemische en biologische stimuli. Door OECT's te functionaliseren met lipidedubbellagen, ionkanalen of biomoleculen kunnen ze specifieke analyten detecteren, waardoor ze nuttig zijn voor detectietoepassingen 9,10. OECT's zijn bijvoorbeeld geïntegreerd met redox-actieve enzymen zoals glucose-oxidase om elektronen rechtstreeks naar het kanaal over te brengen, waardoor de geleidbaarheid wordt afgestemd op de glucoseconcentratie11. Hoewel dergelijke configuraties effectief zijn voor biosensing, zijn ze beperkt in hun rekencapaciteit vanwege het relatief eenvoudige gedrag van individuele enzymen of eiwitten.

Levende cellen, met name bacteriën, bieden daarentegen een veelzijdig platform dat in staat is om complexe en robuuste berekeningen uit te voeren 4,12,13,14,15. Elektroactieve bacteriën zoals Shewanella oneidensis en Geobacter sulfurreducens hebben het unieke vermogen om elektronen over hun celmembranen over te brengen in een proces dat bekend staat als extracellulaire elektronenoverdracht (EET). Onder anaërobe omstandigheden koppelen deze bacteriën hun metabolische processen aan de reductie of oxidatie van externe elektronenacceptoren, waaronder metalen, metaaloxiden en synthetische materialen zoals geleidende polymeren16 en nanodeeltjes17 (Figuur 1A). Deze mogelijkheid is benut in microbiële brandstofcellen voor energieopwekking en biedt het potentieel voor meer geavanceerde bio-elektronische toepassingen18,19. Bovendien heeft de vooruitgang in de synthetische biologie nauwkeurige genetische manipulatie van elektroactieve bacteriën mogelijk gemaakt om EET-routes te beheersen. Door genetische circuits te ontwerpen die de expressie van EET-gerelateerde genen reguleren, kunnen onderzoekers de elektronenflux moduleren als reactie op specifieke omgevingssignalen of computationele logische bewerkingen20,21. Deze genetische controle over EET opent wegen voor het creëren van bio-hybride systemen waarbij bacteriële berekeningen rechtstreeks worden gekoppeld aan elektronische apparaten zoals OECT's. Bacteriële genetische circuits kunnen bijvoorbeeld worden ontworpen om te reageren op combinaties van chemische inputs, waardoor EET-routes worden in- of uitgeschakeld en daardoor de geleidbaarheid van een OECT-kanaal wordt gemoduleerd. Dit zou directe elektrische uitlezingen van bacteriële berekeningen mogelijk maken, waardoor de noodzaak van fluorescerende of andere traditionele biologische reporters wordt omzeild.

Recente ontwikkelingen hebben het potentieel aangetoond van het koppelen van OECT's aan elektroactieve bacteriën. Bijvoorbeeld, Méhes et al. gebruikte S. oneidensis om real-time EET-activiteit te volgen met een p-type OECT, wat illustreert hoe het bacteriële metabolisme elektrisch kan worden gevolgd22. Hoewel dit werk de mogelijkheid benadrukt om OECT's te gebruiken om bacteriële activiteit te detecteren, blijft het potentieel voor het hybride systeem voor biosensing en biocomputing onderbelicht. Om dit aan te pakken, hebben we onlangs hybride transistors ontwikkeld waarin genetisch gemanipuleerde S. oneidensis is opgenomen in p-type OECT's23. De resultaten toonden aan dat het OECT-kanaal kon worden gededoteerd door bacteriële EET-activiteiten (Figuur 1B). Om de biosensorische capaciteiten verder te verbeteren en mechanistische inzichten te verwerven in het dedopingproces, hebben we S. oneidensis-stammen gemanipuleerd met genetische circuits die de EET-flux reguleren. Dit resulteert in voorspelbare OECT-outputveranderingen als reactie op omgevingssignalen zoals inducermoleculen. Door Booleaanse logica in deze genetische circuits te integreren, maakten we bovendien directe elektrische uitlezingen van complexe bacteriële berekeningen mogelijk.

Hier presenteren we het uitgebreide protocol voor de werking van de hybride transistor, dat de fabricage van het apparaat, de voorbereiding van de celcultuur, meetprocedures en gegevensanalyse omvat. Daarnaast gaan we in op belangrijke overwegingen zoals het opschonen van apparaten, herbruikbaarheid en het potentieel voor automatisering bij testen met hoge doorvoer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Alle chemicaliën werden gebruikt zoals ze werden ontvangen zonder verdere zuivering. Indien niet gespecificeerd, werden chemicaliën van analytische kwaliteit gebruikt.

1. Fabricage van OECT-apparaten

OPMERKING: De OECT's worden vervaardigd op objectglaasjes van kwartsmicroscoop met behulp van standaard microfabricagetechnieken die zijn aangepast aan eerder werk24. Zoals te zien is in figuur 2A, zijn acht OECT-apparaten gerangschikt op een enkele standaarddia. Voorgesneden polydimethylsiloxaan (PDMS)-platen worden op de dia geplaatst om OECT-kamers en toegangspoorten te vormen. Het p-type geleidende polymeer poly (3,4-ethyleendioxythiofeen): poly(styreensulfonaat) (PEDOT: PSS) wordt gebruikt voor het OECT-kanaal en de poortelektrode, met afmetingen van 150 μm x 10 μm voor het kanaal en 500 μm x 500 μm voor de poorttip ( Figuur 2B). Een samenvatting van het fabricage- en assemblageproces van OECT-kanalen wordt gegeven in figuur 2C.

  1. Fabricage van gouden elektroden
    1. Reinig de kwartsdia's door ze af te spoelen met aceton, isopropylalcohol (IPA) en gedeïoniseerd (DI) water. Föhn droog met N2 gas.
    2. Voer O2 plasmareiniging uit met 50 sccm bij 150 W gedurende 120 s.
    3. Spin-coat AZ5209e photoresist (PR) met 2 fasen: eerste bij 500 tpm, 100 tpm/s acceleratie gedurende 5 s, en de tweede bij 2000 tpm, 1000 tpm/s acceleratie gedurende 45 s.
    4. Hard bakken op 90 °C gedurende 150 s.
    5. Schakel de maskeruitlijner (Suss MA6) in en selecteer i-line (365 nm) als UV-bron, stel de parameters in: belichtingstijd als 3,5 s (13 W), uitlijningsafstand op 15 μm, WEC-type naar Contact. en blootstelling type aan Hard.
    6. Laad het lithografiemasker en het glaasje in de aligner, lijn het glaasje uit met het masker en voer vervolgens de eerste belichting uit.
    7. Omgekeerd bakken op 110 °C voor 180s.
    8. Verwijder het lithografiemasker en voer de blootstelling aan overstromingen uit met de volgende parameters: belichtingstijd als 25 s (13 W), belichtingstype als overstroming E.
    9. Ontwikkel de PR met de AZ 400K 1:4 ontwikkelaar, vooraf verdund door de fabrikant. Giet de juiste hoeveelheid van de ontwikkelaar in een kristalliserende schaal om het objectglaasje onder te dompelen en schud de schaal constant met cirkelvormige bewegingen gedurende 45 s. Verwijder vervolgens onmiddellijk de dia en week deze 45 s in gedemineraliseerd water, spoel af met gedemineraliseerd water en föhn droog met N2.
      OPMERKING: Het proces kan hier worden gepauzeerd.
    10. Verplaats de dia's in de e-beam verdamper. Pomp tot 2,7 x 10-4 Pa (2 x 10-6 T) of lager.
    11. Breng de Ti-lijmlaag (10 nm) en Au (100 nm) achtereenvolgens aan. De depositiesnelheid kan variëren, afhankelijk van de specifieke verdamper die wordt gebruikt. Een depositiesnelheid van 0,1 nm/s wordt aanbevolen om een goede balans tussen depositiekwaliteit en verwerkingstijd te bereiken.
    12. Verwijder het overtollige metaal door de objectglaasjes een nacht in aceton te laten weken. Gebruik na het weken een pipet om acetonstromen op het glijoppervlak te spuiten om eventueel achtergebleven overtollig metaal los te maken. De kwartglaasjes die na de bovenstaande stappen worden verkregen, worden OECT-elektrodeglaasjes genoemd.
      OPMERKING: U kunt ook sonicatie gebruiken om te helpen bij het losmaken van het overtollige metaal.
  2. PEDOT: Fabricage van PSS-kanalen
    1. Reinig de OECT-elektrodeglaasjes door ze af te spoelen met aceton, IPA en DI-water. Föhn droog met N2 gas.
    2. Bak de glacantes minimaal 5 minuten op 160 °C. Laat de dia's afkoelen voordat u gaat centrifugeren.
    3. Spin-coat AZ5209e PR met 2 fasen: eerst bij 500 tpm, 100 tpm/s acceleratie gedurende 5 s gevolgd door 2000 tpm, 1000 tpm/s acceleratie bij 45 s.
    4. Hard bakken op 90 °C gedurende 150 s.
    5. Begin de eerste belichting met i-line in de hard-contactmodus gedurende 3,5 s bij 13 W.
    6. Bak 180 s omgekeerd op 110 °C.
    7. Blootstelling aan overstromingen gedurende 25 s bij 13 W.
    8. Ontwikkel met de AZ 400K 1:4 ontwikkelaar gedurende 45 s met constant circulair schudden van de schotel. Week de dia's vervolgens 45 s in DI-water, spoel ze af met DI-water en föhn ze droog met N2.
      OPMERKING: Het proces kan hier worden gepauzeerd.
    9. Sonificeer de PEDOT: PSS-dispersie gedurende 5 minuten door de fles op een DI-waterbad te laten drijven dat gevuld is met de vullijn van de sonicator. Filter de PEDOT: PSS-dispersie met een filter van 0,22 μm om klonten te verwijderen.
    10. Spin-coat PEDOT: PSS bij 3500 tpm met acceleratie bij 3500 tpm/s gedurende 60 s. Droog 15 minuten bij 90 °C.
    11. Verwijder overtollige PEDOT:PSS-film door de objectglaasjes 12 minuten in aceton te weken, gevolgd door 1 minuut sonicatie.
    12. Spoel de objectglaasjes af met aceton en vervolgens IPA en föhn ze droog met N2.
    13. Voer een behandeling met ethyleenglycol (EG) uit door de dia's op 90 °C over de kookplaat te plaatsen en laat vervolgens voldoende EG vallen om alle PEDOT: PSS gedurende 5 minuten te bedekken. Spoel af met gedemineraliseerd water en föhn droog met N2. De kwartglaasjes die na de bovenstaande stappen worden verkregen, worden OECT-dia's genoemd.
  3. Fabricage van PDMS-apparaatkamer
    1. Maak PDMS-vellen door de basis en het uithardingsmiddel te mengen in een verhouding van 10:1. Giet de oplossing in de mal om een dikte van 3 mm te bereiken en ontgas gedurende 1 uur in een 2-kwart ontgassingskamer die is aangesloten op een vacuümpomp.
    2. Hard het mengsel uit door de vorm 48 uur bij kamertemperatuur op een genivelleerde bank te plaatsen om gladde PDMS-oppervlakken te garanderen. Bedek de vorm om besmetting door vuil in de lucht te voorkomen.
    3. Snijd het PDMS uit met scheermesjes en maak de apparaatkamers en vloeistofuitwisselingspoorten met ronde perforatoren met een diameter van respectievelijk 5 mm en 1,5 mm. Zorg ervoor dat de hoogte van het PDMS 3 mm is, zoals gecontroleerd tijdens het gieten van de matrijs (stap 1.3.1)

2. Voorbereiding van de media

  1. Autoclaaf 500 ml ultrapuur water, vier roestvrijstalen doseernaalden, twee rubberen kolfdoppen (voor de 250 ml kolven met ronde bodem), twee kolven met ronde bodem van 250 ml en één glazen mediafles van 500 ml. Bewaar het steriele ultrazuivere water bij 4 °C voor toekomstig gebruik.
  2. Bereid het 2x Shewanella basaal medium (SBM) gemodificeerd met 2x Wolfe's Trace Mineral Mix 0,1% casaminozuren volgens tabel 1. Filter steriliseer het medium in de steriele glazen mediabodem (verkregen in stap 2.1) met een flessenfilter. Dit medium wordt aangeduid als 2x SBM++, waarbij elke + de toevoeging van Trace Mineral Mix en casaminozuren aangeeft. Bewaren bij 4 °C voor toekomstig gebruik.
  3. Filter steriel (0,22 μm filter) elk van de volgende chemicaliën afzonderlijk: 50 ml 1 M natriumfumaraat in een steriele centrifugebuis van 50 ml; 1 ml 2,5 mg/ml kanamycine (KAN), aangeduid als 100x KAN in een steriele microcentrifugebuis. Wijs 1 ml 60% w/w steriel natriumlactaat (gebruikt zoals ontvangen) toe aan een microcentrifugebuis. Bewaar alle bereide oplossingen bij 4 °C.
  4. Bereid afzonderlijk 1 ml van de volgende chemicaliën in steriele microcentrifugebuisjes: 100 mM isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), ook wel 100x IPTG genoemd; 10 mM 3-oxohexanoyl-homoserinelacton (OC6), aangeduid als 100x OC6; 1 mM anhydrotetracyclinehydrochloride (aTc), aangeduid als 100x aTc. Bewaren bij 4 °C voor toekomstig gebruik.
  5. Gebruik de gesteriliseerde kolven, rubberen doppen en naalden die in stap 2.1 zijn voorbereid en verwijder de middelgrote voorraad. Verdeel 200 ml steriel 2X SBM++ en ultrapuur water in afzonderlijke kolven met ronde bodem van 250 ml. Sluit de kolven af met rubberen doppen en plaats steriele doseernaalden om een gaswasopstelling te creëren (luchtinlaatnaald ondergedompeld in de vloeistof; gasuitlaatnaald boven het vloeistofoppervlak). Spoel met N2 gedurende 15 min.
  6. Breng het gezuiverde 2x SBM++ en ultrapuur water, lactaat, 1 M natriumfumaraat, 100x KAN, 100x IPTG, 100x OC6 en 100x aTc over in het dashboardkastje voor verder gebruik met de OECT.

3. Monitoring van cellulaire EET met OECT-apparaten

OPMERKING: Om de aeroliciteit te garanderen, wordt het OECT-experiment uitgevoerd in een dashboardkastje zonder vochtigheidsregeling bij kamertemperatuur.

  1. Dag 1
    1. Sterilisatie en bereiding van het apparaat
      1. Autoclaaf de OECT-dia's, PDMS-vellen en Ag/AgCl-referentie-elektrode (RE) in afzonderlijke containers. Droog door te bakken op 80 °C. Breng de geautoclaveerde OECT-dia's en Ag/AgCl RE in het dashboardkastje.
      2. Desorbeer de ingesloten zuurstof in de PDMS-vellen door deze gedurende 4 uur aan het vacuüm in de voorkamer van het dashboardkastje bloot te stellen. Zet het OECT-apparaat in elkaar door de PDMS-vellen over de OECT-dia's in het dashboardkastje te leggen.
      3. Injecteer 45 μl geschikt SBM-medium in elke OECT-kamer. Gebruik voor de meeste experimenten 1x SBM++ aangevuld met 20 mM lactaat. Bereid bijvoorbeeld 1 ml 1x SBM++ voor door 500 μl 2x SBM++, 497 μl steriel ultrapuur water en 2,85 μl 60% w/w natriumlactaat te mengen.
      4. Bedek de OECT-kamerpoorten met PDMS-vellen om gemiddelde verdamping en vervuiling te voorkomen.
      5. Bewaak de OECT-kanaalstroom IDS onder een constante kanaalspanning VDS van -0.05 V en poortspanning VGS van 0.2 V totdat de stroom stabiliseert. De voltage selectie kan variëren, afhankelijk van het OECT-apparaat of biologische monsters. Gebruik gedurende de hele meting dezelfde continue biasspanningen voor de poort en het kanaal. Stabilisatie kan uren tot enkele dagen duren, afhankelijk van het vacuümniveau en de desorptieduur in de voorkamer.
    2. Celculturen
      1. Streep celvoorraden (bewaard bij -80 °C) op agarplaten die LB bevatten (voor stammen die geen plasmide herbergen) of LB met 25 μg/ml kanamycine (voor plasmidehoudende stammen) en groei 's nachts aëroob bij 30 °C20,23.
  2. Dag 2
    1. Celpreparaat (aërobe culturen)
      1. Pak willekeurig enkelvoudige volken uit de LB agarplaten (verkregen in stap 3.1.2.1) in 2 ml 1x SBM++ aangevuld met 20 mM lactaat in 15 ml kweekbuisjes. Houd de cellen een nacht bij 30 °C en 250 tpm schudden. Bereid 6 ml groeimedium zonder cel voor als abiotische controle die later zal worden gebruikt bij het wassen van de cellen.
    2. Celbereiding (anaërobe cultuur)
      1. Breng de LB-agarplaten met de te testen stammen over in het dashboardkastje.
      2. Kies willekeurig enkele kolonies van LB-agarplaten in 1 ml geschikt SBM aangevuld met 20 mM lactaat en 40 mM fumaraat in kweekbuisjes van 15 ml. Bereid bijvoorbeeld 1 ml medium voor IPTG-induceerbare stam die 1 mM IPTG en 25 μg/ml KAN vereist door 500 μl 2x SBM++, 437 μl steriel ultrapuur water, 2,85 μl 60% w/w natriumlactaat, 40 mM 1 M natriumfumaraat, 10 μl 100 mM IPTG en 10 μl 2,5 mg/ml KAN te mengen.
      3. Houd de cellen 18 - 24 uur op 30 °C zonder te schudden. Om de vergelijkbaarheid van experimentbatches te garanderen, moet u consistente groeitijden aanhouden.
  3. Dag 3
    1. Eerste elektrochemische OECT-meting
      OPMERKING: Het type OECT-karakteriseringen varieert van statische typen, zoals constante spanningsbias, tot dynamische typen, zoals poortpulsen. Hier gebruiken we de poortspanningsstaptest om zowel dynamische als statische eigenschappen te verkrijgen. Het opnieuw configureren van de elektrische verbinding tussen OECT's en het instrument (in dit geval een meerkanaals potentiostaat) wordt ondersteund door op maat gemaakte handmatige multiplex (MUX) printplaten. Geautomatiseerde MUX-borden kunnen worden ontwikkeld voor metingen met een hoge doorvoer.
      1. Meet de OECT-kanaalstroom IDS die overeenkomt met de gate-spanningsstap van 0 V tot 0,2 V met de hieronder beschreven instellingen (exacte namen kunnen variëren afhankelijk van het instrument).
      2. Instrumentkanaal 1 meet de OECT-kanaalstroom IDS. Stel hiervoor de naam van de techniek in: Snelle amperometrie; Evenwichtstijd: 1 s; Evenwichtsspanning: - 0,05 V; Biasspanning: -0,05 V; Looptijd: 14 s; Voorbeeldinterval: 0,5 ms.
      3. Instrumentenkanaal 2 regelt de OECT-poortspanning VGS. Stel hiervoor de naam van de techniek in: Gemengde modus; Conditie tijd: 1 s; Conditie spanning: 0 V; Fase 1-modus: Constante E; Fase 1 biasspanning: 0 V; Looptijd fase 1: 4 s; Fase 2-modus: Constante E; Fase 2 biasspanning: 0,2 V; Looptijd fase 2: 10 s; Voorbeeldinterval: 0,5 ms.
      4. Herhaal de stappentest van de poortspanning (stappen 3.3.1.1 tot 3.3.1.3) voor alle OECT's. Deze stap kan worden geautomatiseerd voor testen met een hoge doorvoer.
      5. Pas een constante kanaalspanning VDS van -0.05 V en poortspanning VGS van 0.2 V toe op alle OECT's tot inoculatie. Zorg ervoor dat de bias voltages zijn hetzelfde als die gebruikt tijdens de stabilisatie van het apparaat (stap 3.1.1.5).
    2. Inoculum preparaat (aërobe culturen)
      1. Spoel de cellen driemaal door ze gedurende 4 minuten te centrifugeren bij 1503 x g en opnieuw te suspenderen in 1 ml vers medium dat wordt gebruikt voor de celgroei (stap 3.2.1.1). Na de laatste (3e) centrifuge worden de cellen geresuspendeerd in 0,5 ml (of de helft van het oorspronkelijke kweekvolume) om geconcentreerde celsuspensie te verkrijgen bij OD600 van 1 - 3,5. Pas het uiteindelijke ophangingsvolume dienovereenkomstig aan.
      2. Breng de celsuspensie over in het dashboardkastje.
      3. Om het entmateriaal te verkrijgen, verdunt u de cellen tot een beoogde OD600 van 0,1 (of 10x de inoculatie OD600). Het waanmedium heeft dezelfde samenstelling als het groeimedium, maar bereid het vers in het dashboardkastje met gezuiverde mediavoorraden. Als cellen bijvoorbeeld aëroob zijn gekweekt in SBM++ aangevuld met lactaat, bereid dan verse SBM++ aangevuld met lactaat in het dashboardkastje voor de inoculumverdunning.
      4. Stop de potentiostaat. Injecteer 5 μl van het inoculum in de OECT-kamer (die 45 μl geschikt SBM bevat) om een uiteindelijke OD600 van 0,01 in de OECT te bereiken. Bedek de OECT-kamerpoorten met PDMS-vellen om gemiddelde verdamping en vervuiling te voorkomen.
    3. Inoculumpreparaat (anaërobe culturen)
      1. Om het inoculum te verkrijgen, verdunt u de celculturen 10-voudig. Gebruik een waanmedium dat dezelfde samenstelling heeft als het groeimedium, maar het fumaraat mist. Als cellen bijvoorbeeld anaeroob zijn gekweekt in SBM++ aangevuld met lactaat, fumaraat, KAN en IPTG, bereid dan vers SBM++ aangevuld met lactaat, KAN en IPTG in het dashboardkastje voor de inoculumverdunning.
      2. Stop de potentiostaat. Injecteer 5 μl van het entmateriaal in de OECT-kamer (met 45 μl van de juiste SBM). Bedek de OECT-kamerpoorten met PDMS-vellen om gemiddelde verdamping en vervuiling te voorkomen.
    4. Continue meting en tijdstippen
      1. Pas gedurende het hele experiment constante biasspanningen toe op de OECT-kanalen (VDS = -0,05 V) en de poort (VGS = 0,2 V), behalve tijdens timepointmetingen wanneer de potentiostaat is aangesloten op individuele OECT's voor karakterisering.
      2. Voer het experiment 24 uur na inoculatie uit. Beschouw de meting vóór inoculatie (zie stap 3.3.1) als het tijdstip van 0 uur.
      3. Significante veranderingen in de dopingtoestand van het OECT-kanaal treden doorgaans op tijdens de eerste 8 uur. Selecteer 5-7 tijdstippen voor metingen tijdens deze periode, gevolgd door één meting tussen 12 uur en 16 uur en het laatste tijdstip op 24 uur. Voorbeelden van tijdstippen zijn direct na inoculatie en op tijdstippen van 1 uur, 2 uur, 3 uur, 4,5 uur, 6 uur, 8 uur, 18 uur en 24 uur na inoculatie.
      4. Om metingen 's avonds laat te voorkomen, begint u vroeg op de dag met de inoculatie (zie stap 3.3.2 of 3.3.3) om de frequente metingen op het tijdstip gedurende de eerste 8 uur mogelijk te maken.
      5. Herhaal de stap in 3.3.1 voor elke timepointmeting.
  4. Dag 4
    1. Meting van de overdrachtscurve op het laatste tijdstip (24 uur)
      1. Plaats de Ag/AgCl RE in de OECT-kamer door de RE voorzichtig te draaien en door de vloeistofuitwisselingspoort te duwen.
      2. Meet de overdrachtscurves van de OECT door de gate-spanning te vegen van -0,1 V naar 0,6 V terwijl de kanaalstroom IDS met constante bias VDS bij -0,05 V wordt bewaakt. Meet de nauwkeurige gate- en bronelektrodepotentialen ten opzichte van de Ag/AgCl RE.
      3. Configureer het instrument zoals hieronder beschreven (exacte namen kunnen variëren afhankelijk van het instrument).
      4. Instrumentkanaal 1 meet de OECT-kanaalstroom IDS, gebruik de volgende instelling: Technieknaam: Chronoamperometrie (CA), Evenwichtstijd: 5 s, Evenwichtsspanning: - 0,05 V, Biasspanning: -0,05 V, Looptijd: 35 s, Sample-interval: 0,09915 s.
      5. Instrumentkanaal 2 regelt de OECT-poortspanning VGS, gebruik de volgende instelling: Technieknaam: Linear Sweep Voltammetry (LSV), Evenwichtstijd: 5 s, Evenwichtsspanning: - 0,1 V, Startspanning: -0,1 V, Eindspanning: 0,6 V, Spanningsstap: 0,002 V, Scansnelheid: 0,02 V/s.
      6. Instrumentkanaal 3 meet OECT-bronpotentiaal VS tegen Ag/AgCl RE, gebruik de volgende instelling: Technieknaam: Open Circuit Potentiometry (OCP), Looptijd: 40 s, Sample-interval: 0,09915 s.
      7. Instrumentkanaal 4 meet OECT-poortpotentiaal VG tegen Ag/AgCl RE, gebruik de volgende instelling: Technieknaam: Open Circuit Potentiometry (OCP), Looptijd: 40 s, Sample-interval: 0,09915 s.
      8. Herhaal de meting van de overdrachtscurve voor alle OECT's. Spoel na elke meting de Ag/AgCl-referentie-elektrode (RE) af met 70% ethanol en veeg deze af met een nieuwe pluisarme handdoek. De Ag/AgCl RE kan worden hergebruikt binnen dezelfde steekproefgroep voor de drievouden, maar mag niet opnieuw worden gebruikt tussen verschillende steekproefgroepen.

4. Gegevensanalyse

  1. Extractie van gegevens
    1. Gebruik aangepaste MATLAB-code voor gegevensverwerking om de extractie en logging van gegevens uit de native software van het instrument te automatiseren, waardoor de verwerkingstijd aanzienlijk wordt verkort. MATLAB-scripts zijn beschikbaar in de Texas Data Repository (https://doi.org/10.18738/T8/MNKO8D).
  2. Gegevensverwerking
    1. Pas de OECT-kanaalstroom IDS-gegevens aan om de snelheidsconstanten k te verkrijgen voor verdere analyse en vergelijking (Figuur 3). Voor EET-compatibele celmonsters vinden we het enkele exponentiële model dat het beste past. Daarom hebben we het eenfasige exponentiële vervalmodel in analysesoftware gebruikt om de I DS-tijdreeksgegevens aan te passen en de fitted rate-constante k te verkrijgen. Deze I DS-tijdreeksgegevens kunnen de ruwe waarde zijn of genormaliseerd naar het 0-uurstijdstip, aangezien de snelheidsconstante k de veranderingssnelheid weerspiegelt in plaats van de absolute waarden.
    2. Verkrijg de genormaliseerde IDS door de IDS-waarden te delen door de 0 h-timepointwaarde (IDS0), ook wel IDS/IDS0 genoemd.
  3. Bepaling van de snelheidsconstante k
    1. Open de analysesoftware (Prism 10, GraphPad) en maak een nieuw project door te klikken op Bestand > Nieuw > Nieuw projectbestand. Kies op het tabblad Maken de optie XY. Stel in de sectie Opties X in op Getallen en Y op Enter en teken een enkele Y-waarde voor elk punt.
    2. Importeer de OECT-kanaalstroom IDS-gegevens naar de tabel. Pas de IDS-gegevens aan op het eenfasige exponentiële vervalmodel door op Analyseren te klikken op het tabblad Analyse. Zoek de niet-lineaire regressiemethode (curve fit) in XY-analyses. Zorg ervoor dat u Alle gegevenssets die moeten worden gemonteerd aan de rechterkant selecteert en klik vervolgens op OK.
    3. Selecteer in het nieuwe venster Parameters de optie Model voor eenfaseverval in de groep Exponentieel en klik vervolgens op OK. De modelvergelijking is als volgt:
      Y=(Y0 - Plateau)*e-k*X + Plateau
      Waar: Y is de stroom van het OECT-kanaal IDS, T is tijd, k is de snelheidsconstante.
    4. Zodra de k-waarden zijn verkregen, controleert u de pasvormkwaliteit door de R-kwadraatwaarde voor elke pasvorm te controleren. Een goede fitting moet een R2 hoger dan 0,95 hebben.
  4. Ongepaarde tweezijdige Student's t-test
    1. Om de statistische significantie tussen steekproefgroepen te beoordelen, voert u ongepaarde tweezijdige t-tests van studenten uit.
    2. Open de analysesoftware en maak een nieuw project door te klikken op Bestand > Nieuw > Nieuw projectbestand. Kies op het tabblad Maken de optie XY. Stel in de sectie Opties X in op Getallen en Y op Voer 3 repliceerwaarden in subkolommen naast elkaar in.
    3. Importeer de waarden voor de constante k van de fitted rate in de tabel. Voer de t-toets uit door op Analyseren te klikken op het tabblad Analyse. Vind de t-toets (en niet-parametrische tests) methode in Kolomanalyses. Zorg ervoor dat u elke keer twee gegevenssets selecteert en klik vervolgens op OK.
    4. Selecteer in de handleiding Experimenteel ontwerpen de optie Ontkoppeld, Ja. Gebruik parametrische test en ongepaarde t-test. Stel dat beide populaties dezelfde SD-opties hebben. De p-waarden worden voor elke vergelijking gegenereerd. In figuren worden p-waarden als volgt weergegeven: n.s.: p > 0,05 (niet significant), *: p ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001, ****: p ≤ 0,0001.
    5. Herhaal stap 4.4.3 -4.4.4 voor alle relevante gegevenssets.

5. Reiniging en herbruikbaarheid van het OECT-apparaat

  1. Haal na het experiment het apparaat uit elkaar en kook de OECT-dia's gedurende 15 minuten in een sopje (1:10, zeep: DI water).
  2. Verplaats de glaasjes snel in een bekerglas met gedemineraliseerd water op kamertemperatuur en wacht 5 minuten totdat de glaasjes zijn afgekoeld. Spoel de dia's af met DI en föhn ze droog met schone lucht.
  3. Meet de weerstand van het OECT-kanaal met een multimeter. Als de kanaalweerstand binnen 400% van de oorspronkelijke waarde ligt, kan het apparaat na sterilisatie opnieuw worden gebruikt voor het experiment (stap 3.1.1). De OECT-objectglaasjes kunnen ook worden gereinigd met behulp van de volgende stappen en zijn geschikt voor kanaalfabricage met behulp van stap 1.2.
    LET OP: Piranha-oplossing is zeer corrosief en kan aanzienlijke hitte genereren. Gebruik altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas. Ga uiterst voorzichtig te werk en gehoorzaam de veiligheidsrichtlijnen van de instelling.
  4. Bereid de piranha-oplossing voor in een goed geventileerde zuurkast. Voeg voorzichtig en langzaam 30% (w/w) waterstofperoxide toe aan 98% zwavelzuur in een verhouding van 1:4 terwijl u roert door de kristalliserende schaal voorzichtig heen en weer te kantelen.
  5. Plaats de kristalliserende schaal op een hete plaat die op 70 °C is verwarmd. Gebruik een pincet om de glaasjes 1 minuut in piranha-oplossing te brengen en onder te dompelen.
  6. Breng de glaasjes voorzichtig over in een bekerglas met gedemineraliseerd water en laat ze minstens 1 minuut staan. Spoel de dia's grondig af met DI-water en föhn ze droog met lucht.
  7. Gooi de piranha-oplossing weg volgens de richtlijnen voor de verwijdering van chemisch afval van de instelling. Neutraliseer de piranha-oplossing door deze langzaam toe te voegen aan een bekerglas met een ijs-watermengsel, ongeveer 4x het volume van de oplossing. Voeg geleidelijk een neutraliserend middel toe (bijv. 10 M NaOH) terwijl u de pH bewaakt met teststrips tot neutraal.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gemonteerde snelheid constante k
De fitted rate constante k van de OECT-kanaalstroom IDS dient als een betrouwbare maatstaf voor het beoordelen van de EET-activiteit van het monster. Hoewel de constante gate-biasspanningen de snelheidsconstanten zouden beïnvloeden, kiezen we voor 0,2 V om een positieve bias te garanderen om bacteriële elektronenoverdracht aan te moedigen, terwijl snelle dedoping bij hogere gate-spanningen wo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrochemische cel (EC) vergelijking
Een groot voordeel van het aanpassen van de snelheidsconstante van de OECT-kanaalstroom is dat het apparaatvariatie wordt geminimaliseerd door zich te concentreren op de onderliggende dynamiek van IDS-veranderingen in plaats van op de ruwe output. In combinatie met het inherente signaalversterkingsvermogen van OECT's verbetert deze aanpak de robuustheid van hybride OECT-systemen in vergelijking met traditionele elektro...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Basisplasmiden voor het NAND-circuit werden royaal geleverd door het Voigt Lab via Addgene (#49375, #49376, #49377). Dit onderzoek werd financieel ondersteund door de Welch Foundation (Grant F-1929, B.K.K.), de National Institutes of Health onder award nummer R35GM133640 (B.K.K.), een NSF CAREER award (1944334, B.K.K.), en het Air Force Office of Scientific Research onder award nummer FA9550-20-1-0088 (B.K.K.). A.J.G. werd ondersteund door een National Science Foundation Graduate Research Fellowships (Program Award No. DGE-1610403). De auteurs erkennen het gebruik van gedeelde onderzoeksfaciliteiten die gedeeltelijk worden ondersteund door het Texas Materials Institute, het Center for Dynamics and Control of Materials: een NSF MRSEC (DMR-1720595) en de NSF National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (ECCS-1542159). We zijn dankbaar voor het gebruik van de faciliteiten binnen het kernmicroscopielab van het Institute for Cellular and Molecular Biology, University of Texas in Austin.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-oxohexanoyl-homoserine lactone Sigma-Aldrich
anhydrotetracycline hydrochloride VWR
casamino acids VWR
Equipment
Ethylene glycol Sigma-Aldrichwatervrij 99,8%, 
HEPES buffer solution VWR1 M in water, pH = 7.3
isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside Teknova
kanamycin sulfate Growcells
Magnesium(II) sulfate heptahydrate VWR
PEDOT:PSS waterige suspensie Heraeus Epurio LLCClevios PH1000
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich
Potassium phosphate monobasicSigma-Aldrich
Potentiostat PalmSens BVMultiPalmSens4
Kwarts microscoopglazen AdValue FQ-S-003
Kwarts microscoopglazen 
Sodium chloride VWR
Sodium DL-lactaat TCI60% in water
Sodium fumaraat VWR98%
Zwavelzuur Sigma-Aldrich95,0%-98,0%
Tweedelig silikonen elastomeer Electron Microscopy SciencesSylgard184
Wolfe's Trace Mineral Mix ATCC

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luo, Y. F., et al. Technology roadmap for flexible sensors. Acs Nano. 17 (6), 5211-5295 (2023).
  2. Din, M. O., Martin, A., Razinkov, I., Csicsery, N., Hasty, J. Interfacing gene circuits with microelectronics through engineered population dynamics. Sci Ad. 6 (21), eaaz8344(2020).
  3. Markovic, D., Mizrahi, A., Querlioz, D., Grollier, J. Physics for neuromorphic computing. Nat Rev Phys. 2 (9), 499-510 (2020).
  4. Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497 (7451), 619-623 (2013).
  5. Ates, H. C., et al. End-to-end design of wearable sensors. Nat Rev Mater. 7 (11), 887-907 (2022).
  6. Rivnay, J., et al. Organic electrochemical transistors. Nat Rev Mater. 3 (2), e17086(2018).
  7. Rashid, R. B., Ji, X. D., Rivnay, J. Organic electrochemical transistors in bioelectronic circuits. Biosens Bioelectron. 190, 113461(2021).
  8. Bernards, D. A., Malliaras, G. G. Steady-state and transient behavior of organic electrochemical transistors. Adv Funct Mater. 17 (17), 3538-3544 (2007).
  9. Lubrano, C., Matrone, G. M., Iaconis, G., Santoro, F. New frontiers for selective biosensing with biomembrane-based organic transistors. Acs Nano. 14 (10), 12271-12280 (2020).
  10. Guo, K., et al. Rapid single-molecule detection of COVID-19 and MERS antigens via nanobody-functionalized organic electrochemical transistors. Nat Biomed Eng. 5 (7), 666-677 (2021).
  11. Pappa, A. M., et al. Direct metabolite detection with an n-type accumulation mode organic electrochemical transistor. Sci Adv. 4 (6), eaat0911(2018).
  12. Siuti, P., Yazbek, J., Lu, T. K. Synthetic circuits integrating logic and memory in living cells. Nat Biotechnol. 31 (5), 448-452 (2013).
  13. Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Meth. 11 (5), 508-520 (2014).
  14. Rubens, J. R., Selvaggio, G., Lu, T. K. Synthetic mixed-signal computation in living cells. Nat Comm. 7, 11658(2016).
  15. Rizik, L., Danial, L., Habib, M., Weiss, R., Daniel, R. Synthetic neuromorphic computing in living cells. Nat Comm. 13 (1), 5602(2022).
  16. Tseng, C. P., et al. Solution-deposited and patternable conductive polymer thin-film electrodes for icmrobial bioelectronics. Adv Mater. 34 (13), 2109442(2022).
  17. Dundas, C. M., Graham, A. J., Romanovicz, D. K., Keitz, B. K. Extracellular electron transfer by Shewanella oneidensis controls palladium nanoparticle phenotype. Acs Synth Biol. 7 (12), 2726-2736 (2018).
  18. Catania, C., Karbelkar, A. A., Furst, A. L. Engineering the interface between electroactive bacteria and electrodes. Joule. 5 (4), 743-747 (2021).
  19. Logan, B. E., Rossi, R., Ragab, A., Saikaly, P. E. Electroactive microorganisms in bioelectrochemical systems. Na Rev Microbiol. 17 (5), 307-319 (2019).
  20. Graham, A. J., et al. Transcriptional regulation of living materials via extracellular electron transfer. Nat Chem Biol. 20 (10), 1329-1340 (2024).
  21. Cao, Y. X., et al. A synthetic plasmid toolkit for Shewanella oneidensis MR-1. Front Microbiol. 10, 410(2019).
  22. Mehes, G., et al. Organic microbial electrochemical transistor monitoring extracellular electron transfer. Adv Sci. 7 (15), 2000641(2020).
  23. Gao, Y., et al. A hybrid transistor with transcriptionally controlled computation and plasticity. Nat Commun. 15 (1), 1598(2024).
  24. Yoo, B., Dodabalapur, A., Lee, D. C., Hanrath, T., Korgel, B. A. Germanium nanowire transistors with ethylene glycol treated poly(3,4-ethylenedioxythiophene): poly(styrene sulfonate) contacts. Appl Phys Lett. 90 (7), 072106(2007).
  25. Tahernia, M., et al. A 96-well high-throughput, rapid-screening platform of extracellular electron transfer in microbial fuel cells. Biosens Bioelectron. 162, 112259(2020).
  26. Ainla, A., et al. Open-source potentiostat for wireless electrochemical detection with smartphones. Anal Chem. 90 (10), 6240-6246 (2018).
  27. Rowe, A. A., et al. CheapStat: an open-source, "do-it-yourself" for analytical and educational applications. PLoS One. 6 (9), e23783(2011).
  28. Salyk, O., et al. Organic electrochemical transistor microplate for real-time cell culture monitoring. Appl Scil. 7 (10), 998(2017).
  29. Zhao, F. J., et al. Light-induced patterning of electroactive bacterial biofilms. Acs Synth Biol. 11 (7), 2327-2338 (2022).
  30. Tan, S. T. M., et al. Operation mechanism of organic electrochemical transistors as redox chemical transducers. J Mater Chem. 9 (36), 12148-12158 (2021).
  31. White, S. P., Dorfman, K. D., Frisbie, C. D. Operating and sensing mechanism of electrolyte-gated transistors with floating gates: Building a platform for amplified biodetection. J Phys Chem. 120 (1), 108-117 (2016).
  32. Huang, B., Gao, S., Xu, Z., He, H., Pan, X. The functional mechanisms and application of electron shuttles in extracellular electron transfer. Curr Microbiol. 75 (1), 99-106 (2018).
  33. Light, S. H., et al. A flavin-based extracellular electron transfer mechanism in diverse Gram-positive bacteria. Nature. 562 (7725), 140-144 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Shewanella oneidensisgenetische circuitsbiosensing toepassingenbiocomputing apparatenmeting van kanaalstroomredoxmonitoringBooleaanse logische poortenmicrobi le elektronentransfer

Gerelateerde artikelen