Methodenartikel

Voorspellen en valideren van de regulatie van podocytenbeschadiging en behandeling van diabetische nierziekte door Yinhuo Tang

815 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67939

⸱

20 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nephropathy Department, the Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2College of Integrated Chinese and Western Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Met behulp van netwerkfarmacologie en experimentele validatie onthult dit protocol het werkingsmechanisme van Yinhuo Tang (YHT) bij de behandeling van diabetische nierziekte (DKD) en hoe YHT podocytenschade bij DKD-muizen vermindert door de remming van de PI3K/AKT/NF-κB-signaleringsroute.

Samenvatting

Diabetische nierziekte (DKD) is een chronische nierziekte die wordt gekenmerkt door massale proteïnurie en verminderde glomerulaire filtratiesnelheid. Het belangrijkste pathologische kenmerk van DKD is renale microangiopathie en ~40% van de diabetespatiënten zal DKD ontwikkelen. De podocyt-geassocieerde eiwitten CD2AP en WT-1 spelen een cruciale rol bij het behoud van de normale functie van podocyten en de integriteit van de glomerulaire filtratiebarrière. Wanneer de structuur of functie van podocyten wordt verstoord - als gevolg van ontsteking, oxidatieve stress of andere pathologische beschadigingen - worden het spleetdiafragma en het actine-cytoskelet beschadigd, wat leidt tot een verhoogde permeabiliteit van de glomerulaire filtratiebarrière en resulteert in proteïnurie. Yinhuo Tang (YHT) is een recept uit de traditionele Chinese geneeskunde dat de functie heeft om proteïnurie te verminderen en de verslechtering van de nierfunctie te vertragen; het mechanisme van YHT bij de behandeling van DKD is echter niet duidelijk. In dit artikel, gebaseerd op netwerkfarmacologie en dierexperimenten, onderzochten we de bloedglucose, leverfunctie, nierfunctie, bloedlipiden, nierpathologie, expressieniveaus van podocytmarkereiwitten CD2AP en WT-1, evenals de PI3K/AKT/NF-κB-signaleringsroute in db/db-muizen na toediening van YHT gedurende 8 weken. Onze resultaten tonen aan dat YHT de expressieniveaus van ontstekingsfactoren verlaagt door de PI3K/AKT/NF-κB-signaleringsroute te remmen, waardoor schade aan podocyten wordt verminderd om een rol te spelen bij het vertragen van de progressie van DKD.

Inleiding

Diabetische nierziekte (DKD) is een veel voorkomende en ernstige complicatie van diabetes en blijft wereldwijd de belangrijkste oorzaak van nierfalen in het eindstadium1. De ziekte vordert door een reeks complexe pathologische processen, zoals glomerulaire vergroting, mesangiale expansie, tubulo-interstitiële fibrose en overmatige accumulatie van extracellulaire matrixcomponenten 2,3. Ondanks verbeteringen in de diabetesbehandeling, zijn de huidige therapieën voornamelijk gericht op het beheersen van de bloedglucosespiegel en bloeddruk, die de progressie van DKD alleen vertragen in plaats van de onderliggende pathologische veranderingen om te keren. Dit onderstreept de dringende behoefte aan uitgebreidere en effectievere behandelingsopties 4,5.

Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) is naar voren gekomen als een veelbelovende alternatieve therapie voor de behandeling van chronische ziekten zoals DKD 6,7,8. TCM legt de nadruk op een holistische behandelingsbenadering, die het complexe, multi-target karakter van DKD kan aanpakken. Van de verschillende TCM-formuleringen is aangetoond dat Yinhuo Tang (YHT) meerdere fysiologische functies heeft, zoals het voeden van yin (om het bloedvolume aan te vullen), het versterken van de nier (om de nierfunctie te verbeteren), het opruimen van warmte (om ontstekingen te onderdrukken) en het onderdrukken van yang (om de bloeddruk te verlagen)9,10,11. Een uitgebreid begrip van de mechanismen waarmee YHT DKD verlicht, ontbreekt echter nog steeds.

Het podocyt-gerelateerde eiwit CD2AP is een sleuteleiwit in de podocyt, cruciaal voor het behoud van de integriteit van de filtratiebarrière, terwijl WT-1 een cruciale rol speelt bij de ontwikkeling van de nieren en fibrose 12,13,14,15,16. Daarom is de normale functie van deze twee eiwitten van vitaal belang voor de normale glomerulaire filtratiefunctie. Bestaande literatuur suggereert dat deze doelen betrokken zijn bij de progressie van DKD, en we veronderstellen dat de actieve componenten van YHT kunnen interageren met deze doelen om therapeutische effecten uit te oefenen. Deze studie heeft tot doel deze interacties te bevestigen en meer inzicht te geven in hoe YHT de ziekteroutes van DKD moduleert.

In deze studie gebruiken we een combinatie van netwerkfarmacologie en dierproeven om de therapeutische mechanismen van YHT bij DKD te onderzoeken. Netwerkfarmacologie, die bio-informatica-instrumenten integreert om de complexe interacties tussen actieve verbindingen en biologische doelen te analyseren, stelt ons in staat om de multi-target, multi-pathway aard van YHT's actie te onderzoeken 17,18,19. Traditionele methoden voor het ontdekken van geneesmiddelen leggen vaak de nadruk op interventies met één doelwit. Netwerkfarmacologie daarentegen dient als een voorspellend hulpmiddel dat helpt bij het identificeren van potentiële routes en moleculaire doelen, en biedt voorlopige inzichten in de mogelijke werkingsmechanismen van complexe therapieën. Hoewel het niet de rigoureuze experimentele en regelgevende stappen vervangt die nodig zijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, kan netwerkfarmacologie het genereren van hypothesen begeleiden en onderzoek in een vroeg stadium stroomlijnen20.

Uiteindelijk heeft deze studie tot doel de kloof tussen de traditionele en de moderne geneeskunde te overbruggen en wetenschappelijk bewijs te leveren voor de integratie van TCM in de behandeling van DKD. De resultaten van dit onderzoek kunnen helpen bij het ontwikkelen van effectievere en veiligere behandelingsstrategieën voor DKD, die een alternatief bieden voor standaardzorg die vaak wordt beperkt door bijwerkingen. Door de moleculaire mechanismen van YHT op te helderen en het therapeutisch potentieel ervan te valideren, hopen we de brede toepasbaarheid van TCM in de behandeling van DKD aan te tonen.

Protocol

In totaal werden dertig mannelijke 6 weken oude spontane type II diabetische muizen (C57BL/Ksj db/db) en zes mannelijke niet-diabetische controlemuizen (db/m) met dezelfde genetische achtergrond geselecteerd voor deze studie. De muizen werden gedurende 2 weken gehuisvest in een steriele SPF-grade omgeving in het Animal Experiment Center van Changchun University of Traditional Chinese Medicine (licentienummer: SYXK (JI) 2023-0014). Gedurende deze periode kregen ze een regelmatig onderhoudsdieet en steriel water. Nuchtere bloedglucose werd gemeten bij de db/db-muizen aan het begin en einde van de periode van 2 weken, en alleen degenen met resultaten van meer dan 11,1 mmol/L in beide tests werden in het experiment opgenomen. De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Changchun University of Traditional Chinese Medicine (ID-nummer: 2024147).

1. Voorbereiding van geneesmiddelen

  1. Bereiding van YHT (Tabel 1)
    1. Selecteer Rehmannia glutinosa (30 g), Ophiopogon japonicus (10 g), Morindae Officinalis Radix (10 g), Poria cocos (15 g) en Schisandra chinensis (6 g) en spoel de kruiden af met water om onzuiverheden en stof van het oppervlak te verwijderen. Meng vervolgens 71 g van de rauwe kruiden met 710 ml gedestilleerd water en laat 60 minuten weken in keramische potten
    2. Verlaag na het koken bij 100 °C de temperatuur van het afkooksel tot 80 °C gedurende 60 minuten en filtreer vervolgens het bezinksel weg door twee lagen medisch gaas. Bewaar de vloeistof in de koelkast bij 4 °C.
    3. Voeg 710 ml gedestilleerd water toe aan het bovenstaande bezinksel en herhaal het weken vanaf stap 1.1.1 en stap 1.1.2 één keer; bewaar de vloeistof in de koelkast bij 4 °C.
    4. Meng de bovenstaande twee medicinale vloeistoffen uit stap 1.1.2 en 1.1.3 en plaats deze in de materiaalbak van de vacuümvriesdofilis. Start de vacuümpomp om de lucht uit de vriesdroogkamer te verwijderen, stel de temperatuur in op -40 °C en houd deze 6 uur vast om het water in de medicijnoplossing in vaste toestand te bevriezen. Stel vervolgens de temperatuur gedurende 36 uur in op -20 °C om het water als ijskristallen tot gas te sublimeren. Stel ten slotte de temperatuur in op 40 °C, houd deze 24 uur aan om het resterende vocht uit de medicijnoplossing te verwijderen, zet de verwarming en vacuümpomp uit en verwijder het gevriesdroogde poeder (YHT-poeder).
    5. Weeg 0.4615 g, 0.923 g en 1.846 g gevriesdroogd YHT-poeder, suspendeer in 1 ml zoutoplossing en maak de suspensie van YHT met de concentraties van respectievelijk 0.4615 g/ml, 0.923 g/ml en 1.846 g/ml.
  2. Bereiding van Valsartan
    1. Voeg valsartan (10,29 mg) toe aan 50 ml PEG300 en schud goed om volledig op te lossen.
    2. Voeg 50 ml zoutoplossing toe aan de oplossing uit stap 1.2.1 en schud goed om te homogeniseren en een valsartanoplossing te verkrijgen met een concentratie van 10,29 mg/ml.

2. Medicamenteuze behandelingen

OPMERKING: Het experiment werd verdeeld in zes groepen: de normale controlegroep (CON), de modelgroep (MOD), de valsartan-positieve controlegroep (POS), de lage-dosisgroep van de YHT (YH-L), de middelste dosisgroep van de YHT (YH-M) en de hoge-dosisgroep van de YHT (YH-H). Volwassen mensen hebben 71 g YHT per dag nodig. Volgens de omrekeningsformule van de experimentele dosis van muizen en menselijke geneesmiddelen was de dagelijkse dosis voor muizen ~9,23 g/kg:

Equivalente experimentele dosis voor muizen (g/kg) = dosis voor de mens (g)/lichaamsgewicht (70 kg) × 9.1

  1. Pak de achterkant van de muizen stevig vast met de niet-dominante hand zodat hun hoofd, nek en lichaam in een rechte lijn staan (om worstelen te voorkomen) en plaats de gavagenaald van 1 ml op de juiste manier in een hoek die vergelijkbaar is met de fysiologische kromming van de slokdarm van de muizen. Duw de sondenaald door de mondhoek van de muizen, druk hem op de tong, druk hem tegen het gehemelte en duw hem voorzichtig naar binnen in de maag.
  2. Duw het medicijn langzaam naar binnen met de wijsvinger van de dominante hand en trek de naald verticaal terug om de maagsonde te voltooien.
    OPMERKING: De dosis van het medicijn was 10 ml/kg gedurende in totaal 4 weken.
    1. Dien 10 ml∙kg-1∙day-1 zoutoplossing via een maagsonde toe aan CON- en MOD-muizen.
    2. Dien 10,29 mg∙kg-1∙day-1 valsartan suspensie via een maagsonde toe aan de muizen uit de POS-groep.
    3. Dien de volgende doses van de YHT via een maagsonde toe aan deze groepen: 4.615 g∙kg-1∙day-1 aan de YH-L-groep; 9,23 g∙kg-1∙dag-1 voor de YH-M groep; 18,46 g∙kg-1∙dag-1 voor de YH-H groep.

3. Evaluatie van de werkzaamheid van YHT

  1. Detectie van biochemische indexen van bloed en urine
    1. Na 8 weken continue toediening van het geneesmiddel, verzamelt u 24 uur urine van muizen met behulp van een metabolische kooi, centrifugeert u de verzamelde urine gedurende 10 minuten bij 7.992 × g , verwijdert u het supernatant en meet u het urine-eiwitgehalte met behulp van de urine-eiwittestkit.
    2. Pak de achterkant van de muis vast met de niet-dominante hand om de muis vast te zetten en gebruik de pink en ringvinger van dezelfde niet-dominante hand om de staart van de muis vast te zetten. Steriliseer het puntje van de staart van de muis met wattenbolletjes jodiumdamp. Houd met de dominante hand een bloedafnamenaald vast om snel het puntje van de staart van de muis te doorboren, knijp van de wortel van de staart van de muis naar het puntje van de staart en laat het bloed op het bloedglucosetestpapier vallen.
    3. Pak met de niet-dominante hand de staart van de muis vast, terwijl u het scapulier met duim en wijsvinger vastzet, zodat de buik van de muis naar boven wijst. Houd met de dominante hand een spuit van 1 ml gevuld met fenobarbitalnatrium vast. Steek de naald (3-5 mm diep) in de buikholte in een hoek van 30-45°, gericht op het gebied tussen de navel en de achterpoten, met de naald naar het hoofd gericht. Trek de zuiger van de spuit langzaam terug om te controleren of er bloed is; Als er bloed wordt opgezogen, verplaats de naald dan dienovereenkomstig.
    4. Injecteer de pentobarbital-natriumoplossing langzaam om een gelijkmatige toediening te garanderen en trek de spuit terug nadat de injectie is voltooid. Wacht 10 minuten en knijp dan met een tang in de dominante hand voorzichtig in de tenen van de achterpoot van de muis om te controleren of er een reactie is. Als er nog steeds een respons wordt waargenomen, dien dan indien nodig een kleine extra dosis (10 mg/kg) toe.
      OPMERKING: Ervan uitgaande dat een muis 60 g weegt en de fenobarbitaloplossing 1% g/v is, is 0,06 ml de extra dosis die moet worden toegediend in geval van een respons.
    5. Gebruik een schaar om de snorharen en het haar rond de ogen van de muizen bij te knippen, gebruik de niet-dominante hand om de huid rond de ogen te drukken waaruit de oogbollen moeten worden verwijderd zodat de oogbollen uitsteken. Steriliseer de huid rond de oogbollen met ethanol, gebruik een pincet om de oogbollen snel te verwijderen zodat het bloed in de microcentrifugebuisjes druppelt (1,5-2 ml), incubeer de buisjes 10 minuten bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, centrifugeer de buisjes 10 minuten bij 7.992 × g en extraheer de bovenstaande oplossing.
    6. Meet de expressieniveaus van serumcreatinine (Scr), bloedureumstikstof (BUN), albumine (ALB), alanineaminotransferase (ALAT), aspartaataminotransferase (AST), triglyceriden (TG) en totaal cholesterol (TC) in serum volgens de instructies van de kit.
  2. Scheiding van nierweefsels
    1. Fixeer na het afnemen van het bloed de muizen op de operatieplaat in rugligging, knip het haar van het voorste thoracale gebied van de muizen, steriliseer het voorste thoracale gebied met ethanol, knip de buikhuid af met een schaar en duw de dunne en dikke darm opzij om de nieren bloot te leggen.
    2. Verwijder het nierweefsel van de muis, gebruik een hemostatische tang om het botvlies botweg te scheiden en plaats de linkernier in een vriezer van -80 °C voor opslag en de rechternier in een tube van 20 ml met 4% paraformaldehyde-oplossing om de nier te fixeren.
    3. Verwijder de rechter nieren uit het formaldehyde na 24 uur, spoel kort met gedestilleerd water gedurende 5 minuten, dehydrateer met een gradiënt van watervrije ethanol (100% → 95% → 85% → 75%, elk 5 minuten), transparant met gradiëntxyleen (2 x 10 min), ingebed in paraffinewas en laat de wasblokken stollen bij kamertemperatuur21. Zet het vervolgens een nacht in de vriezer van -20 °C.
    4. Verwijder het wasblok, snijd het in plakjes op een dikte van 3 μm, plaats het in water om het uit te vouwen, vis het er vervolgens met een schuif uit en plaats het in een oven met constante temperatuur op 40 °C om 30 minuten te bakken en bewaar het vervolgens voor latere analyse
  3. Renale histopathologische analyse
    1. Verwijder de rechternier, voer gradiënt xyleenontwaxing en watervrije ethanoldehydratie uit zoals hierboven (stap 3.2.3) en was met gedestilleerd water.
    2. Voer de kleuring uit volgens de instructies van de hematoxyline- en eosinekleuringskits (H&E), Periodieke Zuur-Schiff-kleuring (PAS) en Masson-kleuringskits.
    3. Voer de gradiënt watervrije ethanoldehydratie en xyleentransparantie opnieuw uit zoals in stap 3.2.3.
    4. Monteer na droging bij kamertemperatuur de weefselsecties op de objectglaasjes met een dekglaasje met neutrale gom als montagemedium. Bekijk de dia's en bekijk ze onder een lichtmicroscoop met een vergroting van 400x.
  4. Immunohistochemische analyse van nierweefsel
    1. Verwijder de rechternier, ontvoer en dehydrateer de secties zoals beschreven in stap 3.2.3, plaats ze in 10 mM natriumcitraatbufferoplossing (pH 6.0) en verwarm (125 °C, 103 kPa) gedurende 5 minuten voor antigeenreparatie. Verwijder na 10 minuten de secties, laat afkoelen tot kamertemperatuur en was ze 3 x 5 minuten in 1x PBS.
    2. Plaats de secties gedurende 10 minuten in een 3% waterstofperoxideoplossing om endogene peroxidase te blokkeren en was 3 x 5 minuten in PBS.
    3. Voeg druppelsgewijs 10% geitenserum toe aan de secties en zorg ervoor dat het geitenserum de hele sectie gelijkmatig bedekt. Plaats de secties in een natte doos, incubeer 30 minuten bij 37 °C en was 3 x 5 minuten met PBS.
    4. Voeg primaire antilichamen COI-I (1:200), α-SMA (1:200), WT-1 (1:200), CD2AP (1:200) druppelsgewijs toe (zie materiaaltabel) en incubeer een nacht in een natte doos bij 4 °C in de koelkast.
    5. Verwijder de sectie, was 3 x 5 minuten met PBS, voeg druppelsgewijs secundair antilichaam (1:3.000) toe, incubeer 60 minuten bij 37 °C en was 3 x 5 minuten met PBS.
    6. Voeg 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kleurontwikkelingsoplossing toe gedurende 10 min, spoel de kleurontwikkelingsoplossing af met gedestilleerd water, incubeer met 100 μL hematoxyline gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en spoel af met gedestilleerd water gedurende 5 min.
    7. Dehydrateer, transparant en sluit af zoals beschreven in stap 3.2.3 en verzamel de beelden met behulp van een optische microscoop.
  5. Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR) assay-analyse
    1. Neem ~100 mg bevroren nierweefsel in een homogenisatorbuis van 10 ml, maal het grondig met een stamper totdat er geen duidelijke weefselmassa meer is en voeg vervolgens 1 ml RNA-extractiereagens toe voor homogenisatie.
    2. Voeg 250 μL chloroform toe, schud in een vortexmixer gedurende 10 s, incubeer het 5 minuten op ijs, centrifugeer het 10 minuten bij 15.984 g × g bij 4 °C en pipetteer de bovenste waterige fase uit in een nieuwe buis.
    3. Voeg 500 μL isopropanol toe aan de waterige fase, meng grondig met een vortexmixer gedurende 10 s en incubeer het mengsel gedurende 5 minuten op ijs. Hierna centrifugeren bij 15.984 × g gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant en was de RNA-pellet met 1 ml 75% ethanol. Centrifugeer na een korte vortex opnieuw bij 15.984 × g gedurende 10 minuten. Gooi de ethanol weg en laat de RNA-pellet bij kamertemperatuur aan de lucht drogen.
    4. Voeg 30 μL diethylpyrocarbonaatwater toe om het RNA op te lossen en meet de absorptie van de RNA-oplossing bij 260 nm en 280 nm met behulp van een spectrofotometer om de RNA-concentratie te berekenen.
      OPMERKING: De RNA-zuiverheid wordt beoordeeld aan de hand van de A260/A280-verhouding . Een ideale A260/A280-verhouding zou tussen 1,8 en 2,0 moeten liggen, wat wijst op een goede RNA-zuiverheid. Als de verhouding lager is dan 1,8, kan dit wijzen op de aanwezigheid van eiwit- of fenolverontreiniging en is verdere zuivering vereist, zoals het uitvoeren van een extra fenol-chloroform-extractie of ethanolprecipitatie om verontreinigingen te verwijderen.
    5. Meng 3 μg totaal RNA, 4 μL 4 gDNA Wiper Mix en RNase-vrije ddH2O tot een eindvolume van 16 μL, centrifugeer bij 1.250 × g gedurende 10 s en incubeer bij 42 °C gedurende 2 min. Voeg 4 μL 5x reverse transcriptase toe aan 16 μL van de bovenstaande oplossing, centrifugeer bij 1.250 × g gedurende 10 s. Voer het reverse transcriptieprogramma uit bij 50 °C (15 min) → 85 °C (5 s) → 4 °C (10 min). Bewaar het gesynthetiseerde cDNA bij -20 °C.
    6. Haal de cDNA-oplossing uit de vriezer en voer de voordenaturatie uit bij 90 °C (10 min), gevolgd door 40 cycli van 94 °C (30 s) → 60 °C (30 s) → 72 °C (24 s), en ten slotte lyseren in de orde van grootte van 95 °C (15 s) → 60 °C (60 s) → 95 °C (350 s, 60 °C geleidelijk oplopend tot 95 °C met een snelheid van 0,1 °C/s).
    7. Bereken de relatieve expressie van WT-1, CD2AP, PI3K, AKT, NF-κB en IL-1β met behulp van de 2-ΔΔCt-methode op basis van de Ct-waarde van elk monster met Gapdh als interne referentie (ΔΔCt = Ct-waarde van het doelgen - Ct-waarde van het interne referentiegen) (zie tabel 2).
  6. Western blot (WB) analyse
    1. Neem ~100 mg bevroren nierweefsel in een homogenisatorbuis van 10 ml, gevolgd door 500 μl lysisoplossing (proteaseremmer: fosfataseremmer: RIPA= 1:1:100), en maal het voldoende met een stamper totdat er geen duidelijke weefselmassa meer is.
    2. Incubeer de buis gedurende 30 minuten op ijs, centrifugeer gedurende 10 minuten bij 15.984 × g en zuig het supernatant op.
    3. Bepaal de eiwitconcentratie van elk monster met behulp van de BCA-test. Pipetteer op basis van de gemeten concentraties gelijke hoeveelheden totaal eiwit (bijv. 30 μg) van elke groep in nieuwe buisjes en pas het uiteindelijke volume aan met behulp van PBS om consistentie te garanderen. Voeg vervolgens 5x eiwitlaadbuffer toe, kook 10 minuten op 100 °C, verwijder en laat afkoelen tot kamertemperatuur.
    4. Gebruik 12,5% SDS-PAGE gelelektroforese om de eiwitten te scheiden. Gebruik eerst 80 V om het monster langzaam door de concentratiegel te laten gaan, pas vervolgens de spanning aan op 120 V totdat het monster naar de bodem van de scheidingsgel loopt en schakel het apparaat uit.
    5. Week het filterpapier in de membraanoverdrachtsbuffer, gebruik een pincet om een hoek van het PVDF-membraan vast te houden en dompel het onder in methanol om het te activeren. Verwijder de gel, gebruik een plastic plaat om de geconcentreerde gel en de bodem van de scheidingsgel af te snijden, en vervolgens, volgens de sandwichstructuur van het filterpapier/gel/PVDF-membraan/filterpapier om het membraanoverdrachtsapparaat op te zetten (gel als de negatieve pool, het PVDF-membraan als de positieve pool), plaats de opstelling in een membraanoverdrachtstank gevuld met voorgekoelde overdrachtsbuffer, omring het met ijsblokjes om een lage temperatuur te behouden en voer de overdracht uit met een constante stroom van 200 mA.
      OPMERKING: Bepaal de overdrachtstijd op basis van het molecuulgewicht van het eiwit (hoe groter het molecuulgewicht, hoe langer de overdrachtstijd).
    6. Plaats het PVDF-membraan in de blokkeerbuffer, schud de blokkeerbuffer 90 minuten op kamertemperatuur en was met TBST (50 ml 20x TBS en 0,5 ml Tween-20 per L TBST) gedurende 3 x 5 min.
    7. Met behulp van primair antilichaamverdunningsmiddel verdund primair antilichaam: WT-1 (1:1.000), CD2AP (1:1.000), P-PI3K (1:1.000), P-AKT (1:1.000), P-NF-κB (1:1.000) en IL-1β (1:1.000), voeg primair antilichaam toe op het PVDF-membraan en incubeer in een natte doos in een koelkast van 4 °C gedurende een nacht (zie materiaaltabel).
    8. Verwijder het PVDF-membraan uit de koelkast van 4 °C, was 3 x 5 minuten met TBST, Gebruik secundair antilichaamverdunningsmiddel verdund secundair antilichaam (1:10000), voeg secundair antilichaamincubeer 60 minuten bij kamertemperatuur toe, was 3 x 5 minuten met TBST, plaats het PVDF-membraan in de chemiluminescentie-imager en voeg gelijkmatig ECL-luminescente vloeistof druppelsgewijs toe (A: B = 1:1).

4. Netwerkfarmacologische analyse van YHT voor DKD-behandeling

  1. Screening van actieve ingrediënten en doelen van YHT
    1. Bepaal de actieve bestanddelen van Radix Rehmanniae Praeparata, Morindae Officinalis Radix, Priria en Schisandra Chinensis met behulp van de TCMSP-database (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) en van Maitake uit de BATMAN-TCM-database (http://bionet.ncpsb.org/batmantcm). Stel orale biologische beschikbaarheid (OB) ≥ 30% en geneesmiddelgelijkenis (DL) ≥ 0,18 in als screeningcriteria om de actieve ingrediënten te identificeren.
    2. Zoek in de TCMSP-database (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) naar de werkingsdoelen van de actieve ingrediënten uit de bovenstaande TCM's.
    3. Leg minder nadruk op de doelen van de bovenstaande actieve ingrediënten en integreer ze in een lijst voor verdere analyse. Standaardiseer de namen van de doelen met behulp van de Uniprot-eiwitdatabase (https://www.uniprot.org).
  2. Opbouw van het doelnetwerk van de actieve ingrediënten van YHT
    1. Importeer de actieve ingrediënten en de bijbehorende doelen in de software: Bouw het "actieve ingrediënt-doel"-netwerk op door Bestand | Invoer | Netwerk en het laden van de relevante gegevens.
    2. Voer een analyse van de netwerktopologie uit door naar Extra | Netwerk Analyse | Analyseer het netwerk om de relaties tussen medicijnen, actieve ingrediënten, doelen en ziekten te visualiseren. In de netwerkvisualisatie vertegenwoordigen de knooppunten de actieve ingrediënten en de randen de interacties tussen actieve ingrediënten en doelen.
  3. Screening van DKD-gerelateerde doelstellingen
    1. Gebruik diabetische nierziekte als zoekterm en stel de soort in als menselijk, screen DKD-gerelateerde doelen uit de volgende databases: GeneCards-database (https://www.genecards.org); OMIM-databank (http://www.omim.org); TTD-databank (https://www.ttd.cn); Databank van DrugBank (http://www.drugbank.ca); Databank DisGeNET (http://www.disgenet.org).
    2. Nadat u de resultaten van de vijf databases hebt verkregen, voegt u ze samen in een spreadsheet en verwijdert u duplicaten met behulp van de functie Duplicaten verwijderen onder het menu Gegevens , zodat alleen de unieke namen van DKD-gerelateerde doelen behouden blijven.
  4. Opbouw van PPI (eiwit-eiwit interactie) en screening van kerndoelen
    1. Gebruik spreadsheetsoftware om de snijdoelen van YHT en DKD te identificeren door de lijst met YHT-doelen in de ene kolom in te voeren en in de andere de lijst met DKD-doelen. Pas voorwaardelijke opmaak toe om gemeenschappelijke vermeldingen in beide kolommen te markeren, waardoor de snijdoelen worden geïdentificeerd.
    2. Open de website van de String-database (https://cn.string-db.org/), selecteer Invoer | Plak/upload om de gegevens in batches te importeren en stel de drempel in op graad 1 ≥ om vrije doelen (doelen zonder interacties) in het netwerk uit te filteren.
    3. Selecteer bestand | Invoer | Netwerk en importeer de gefilterde snijpuntdoelen in de software om de uiteindelijke visualisatie te maken.
    4. Navigeer naar Netwerkanalyse | Analyseer het netwerk en filter de kerndoelen van YHT-DKD uit op basis van de graadwaarde.
  5. Genontologie (GO) functionele analyse en Kyoto encyclopedie van genen en genomen (KEGG) routeverrijkingsanalyse
    1. Open het Metascape-platform door naar http://metascape.org/gp/index.html te gaan, selecteer Analyse starten om te beginnen, plak de lijst met doelen voor YHT en DKD in het invoervak in de sectie Aangepaste analyse , stel de soort in op Homo sapiens in het vervolgkeuzemenu, kies Aangepaste analyse en stel de drempelwaarde voor de P-waarde in op <0,01 en klik op Verzenden om de analyse uit te voeren.
    2. Nadat de resultaten zijn geretourneerd vanuit Metascape, gaat u naar http://www.bioinformatics.com.cn/, selecteert u Extra | verrijking GO-term, plakt u de GO-termen uit de resultaten en klikt u op Verzenden om bellendiagrammen te genereren. Visualiseer de top 10 GO-termen door ze te sorteren op basis van P-waarde.
    3. Sorteer de KEGG-routes op basis van de P-waarde uit de Metascape-analyseresultaten. Ga naar dezelfde Microbiologie-website (http://www.bioinformatics.com.cn/), selecteer go kegg-routeverrijking, plak de geselecteerde top 10 KEGG-routes en klik op Verzenden om de KEGG-bubbeldiagrammen te visualiseren.

5. Statistische analyse

  1. Als de gegevens een normale verdeling volgen en de varianties homogeen zijn, gebruik dan eenrichtings-ANOVA. Als de varianties niet homogeen zijn, gebruik dan de T3-test van Dunnett of een onafhankelijke steekproef t-test.
  2. Voor gegevens die geen normale verdeling volgen, gebruikt u de rank-sum-test uit niet-parametrische methoden.
  3. Beschouw P < 0,05 als statistisch significant.

Resultaten

Verbetering van de bloedglucose, lever- en nierfunctie en stoornissen in het lipidenmetabolisme bij DKD-muizen
Na 8 weken toediening verlaagden verschillende doses YHT de niveaus van willekeurige bloedglucose aanzienlijk, 24 uur UTP, Scr en BUN, verbeterde de nierfunctie (Figuur 1A-D); verhoogde het niveau van ALB; verlaagde de niveaus van ALAT en ASAT; verbeterde leverfunctie (Figuur 1E-G); verminderde de niveaus van TC en TG; en verbeterde de regulatie van het lipidenmetabolisme (Figuur 1H,I). De bovenstaande resultaten gaven aan dat YHT beschermende effecten had op de bloedglucose, lever- en nierfunctie en lipidenregulatie.

Verbetering van histopathologische beschadiging van de nieren bij DKD-muizen
Om te testen of YHT nierbeschadiging bij DKD-muizen kon verbeteren, werd de mate van pathologisch letsel in nierweefsels onderzocht met behulp van H&E-, PAS- en Masson-kleuring, evenals IHC. H&E en PAS-kleuring toonden glomerulaire atrofie, verbreding van het tunica albuguinea-gebied, zwelling en loslating van tubulaire epitheelcellen, interstitiële inflammatoire celinfiltratie en duidelijke glomerulaire glycogeenafzetting in de MOD-groep (Figuur 2A,B). Masson-kleuring toonde een significante toename van blauwe collageenvezels in de nieren van de MOD-groep in vergelijking met de CON-groep (Figuur 2C,D). IHC toonde aan dat de percentages gebieden die positief waren voor COI-I en α-SMA significant hoger waren in de MOD-groep dan in de CON-groep (Figuur 2E-G). Daarentegen, na het gebruik van YHT en POS, glomerulaire atrofie, verbreding van de gebonden zone, zwelling en afstoting van buisvormige epitheelcellen, de mate van interstitiële infiltratie van ontstekingscellen en glomerulaire glycogeenafzetting werden significant verlicht; het gebied van blauwe collageenvezels was aanzienlijk verminderd; en de percentages gebieden die positief waren voor COI-I en α-SMA waren significant afgenomen. De bovenstaande resultaten gaven aan dat YHT nierpathologische beschadiging en nierfibrose bij DKD-muizen zou kunnen verminderen.

Verzwakking van podocytenbeschadiging bij DKD-muizen
De voetcelbeschadiging bij DKD-muizen werd waargenomen door IHC, PCR en WB. De IHC-resultaten toonden aan dat de expressieniveaus van functionele markereiwitten in voetcellen, CD2AP en WT-1, significant waren verlaagd in de MOD-groep in vergelijking met de CON-groep, wat aangeeft dat de niervoetcellen beschadigd waren. YHT-behandeling verhoogde de expressieniveaus van CD2AP en WT-1 en verminderde de schade aan de voetcellen (Figuur 3A-C). PCR- en WB-resultaten toonden aan dat de relatieve mRNA- en eiwitexpressieniveaus van functionele markereiwitten van voetcellen, CD2AP en WT-1, significant waren verlaagd in de MOD-groep in vergelijking met de CON-groep, en de relatieve mRNA- en eiwitexpressieniveaus van CD2AP en WT-1 waren significant verhoogd na YHT-behandeling (Figuur 3D-H). De bovenstaande resultaten gaven aan dat YHT podocytschade bij DKD-muizen zou kunnen verminderen.

Opheldering van de potentiële doelwitten en signaalroutes die verband houden met de effecten van YHT op DKD via netwerkfarmacologie
De actieve ingrediënten van YHT (291) werden gescreend via TCMSP- en BATMAN-TCM-databases, waarvan 39 actieve ingrediënten voldeden aan de criteria van OB ≥ 30% en DL ≥ 0,18. De actieve ingrediënten werden in de database gezocht om hun doelen te identificeren, en na het samenvoegen en verwijderen van dubbele waarden werden in totaal 303 doelen verkregen (Figuur 4A). Na het samenvoegen van de resultaten van vijf databases, waaronder GeneCards, OMIM, TTD, Drugbank en DisGeNET, en het verwijderen van dubbele waarden, werden uiteindelijk 1.867 DKD-gerelateerde doelen verkregen. Vervolgens werd http://www.bioinformatics.com.cn/ gebruikt om de gescreende YHT-actieve ingrediënten te kruisen met DKD-doelen, wat resulteerde in 84 kruisende doelen (Figuur 4B). Deze 84 doelen werden geïmporteerd in Cytoscape-software om een PPI-netwerkdiagram te tekenen, en potentiële belangrijke doelen voor YHT-behandeling van DKD werden geïdentificeerd, waaronder AKT, IL-1 β, CASP3, APOE en JUN (Figuur 4C). De functionele verrijkingsanalyse van GO leverde in totaal 1.246 items op, wat aangeeft dat YHT therapeutische effecten op DKD kan hebben door biologische processen te reguleren, zoals respons op hormonen en moleculaire functies, waaronder eiwithomodimerisatie-activiteit en oxidoreductase-activiteit, evenals cellulaire componenten zoals membraanvlotten en membraanmicrodomeinen (Figuur 4D). Er werden in totaal 263 KEGG-verrijkingsresultaten verkregen, voornamelijk met betrekking tot de AGE-RAGE-signaleringsroute in diabetische complexen, alcoholische leverziekte, lipiden- en atheroscleroseroute. Op basis van de P-waarde werden de top 10 resultaten geselecteerd om een KEGG-visualisatiebellendiagram te tekenen (Figuur 4E). De AGE-RAGE-signaleringsroute is sterk verrijkt in diabetische complexen en meerdere kerndoelen in de PPI, zoals PI3K, AKT en IL-1β, zijn verrijkt in deze route. Daarom werd deze signaalroute geselecteerd voor latere validatie.

Verzwakking van podocytbeschadiging door remming van de PI3K/AKT/NF-κB-signaleringsroute
De expressieniveaus van genen en eiwitten die verband houden met de PI3K/AKT/NF-κB-signaleringsroute werden verder onderzocht door PCR en WB. De PCR-resultaten toonden aan dat de relatieve mRNA-expressieniveaus van Pi3k, Akt, Nf-κb en Il-1β in de MOD-groep significant verhoogd waren in vergelijking met de CON-groep en significant waren afgenomen na toediening van YHT (Figuur 5A-D). WB-resultaten toonden aan dat de relatieve eiwitniveaus van P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB en IL-1β ook significant verhoogd waren in de MOD-groep in vergelijking met de CON-groep, terwijl ze significant waren verlaagd na de toediening van YHT (Figuur 5E-I). Deze resultaten suggereerden verder dat YHT de PI3K/AKT/NF-κB-signaleringsroute zou kunnen remmen door podocytbeschadiging bij DKD-muizen te verzwakken.

figure-results-1
Figuur 1: Verbetering van de bloedglucose, lever- en nierfuncties en stoornissen in het lipidenmetabolisme bij DKD-muizen. Effecten van YHT op (A) willekeurige bloedglucose; (B-D) nierfunctie, inclusief 24 uur urine-eiwit, bloedcreatinine en ureumstikstof; (E-G) leverfunctie, waaronder serumalbumine, alanineaminotransferase en aspartaataminotransferase; en (H,I) regulering van het lipidenmetabolisme, inclusief totaal cholesterol en triglyceriden. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelden ± standaarddeviaties van zes onafhankelijke steekproeven, vergeleken met de lege groep, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, en vergeleken met de modelgroep, #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, worden deze statistische notaties consequent gebruikt in alle figuren. Afkortingen: YHT = yinhuo Tang; DKD = diabetische nierziekte; ALB = albumine; ALAT = alanineaminotransferase; ASAT = aspartaataminotransferase; TC = totaal cholesterol; TG = triglyceriden; CON = controlegroep; MOD = modelgroep; POS = valsartan Positieve controlegroep; YH-L = groep met lage dosis van de YHT; YH-M = middelste dosisgroep van de YHT; YH-H = groep met hoge dosis van de YHT. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Verbetering van de histopathologische schade van de nieren bij DKD-muizen. (A,B) Renale histologie door H&E en PAS-kleuring (schaalbalk = 20 μm); (C) Masson-kleuring om de mate van nierfibrose waar te nemen en (D) semi-kwantitatieve analyse met behulp van ImageJ-software; (E-G) Semikwantitatieve analyse van de relatieve expressieniveaus van COI-I en α-SMA in nierweefsels met behulp van IHC- en ImageJ-software (schaalbalk = 20 μm). Afkortingen: YHT = yinhuo Tang; DKD = diabetische nierziekte; H&E = Hematoxyline- en eosinekleuring; PAS = Periodieke zuur-Schiff-kleuring; COI-I = Collageen type I; α-SMA = actine van de α-gladde spier; CON = controlegroep; MOD = modelgroep; POS = valsartan Positieve controlegroep; YH-L = groep met lage dosis van de YHT; YH-M = middelste dosisgroep van de YHT; YH-H = groep met hoge dosis van de YHT. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Verzwakking van podocytbeschadiging bij DKD-muizen. (A-C) IHC detecteerde de relatieve expressieniveaus van CD2AP en WT-1 in nierweefsels (schaalbalk = 20 μm); (D,E) PCR detecteerde de relatieve mRNA-expressie van CD2AP en WT-1 in nierweefsels en semi-kwantitatieve analyse werd uitgevoerd met behulp van Image J-software; (F-H) WB detecteerde de relatieve eiwitexpressieniveaus van CD2AP en WT-1 in nierweefsels en semikwantitatieve analyse werd uitgevoerd met behulp van ImageJ-software. kwantitatieve analyse met behulp van Image J-software. Afkortingen: YHT = yinhuo Tang; DKD = diabetische nierziekte; IHC = immunohistochemie; WB = Western blotting; CD2AP = CD2-geassocieerd eiwit; WT-1 = Wilms-tumor 1; CON = controlegroep; MOD = modelgroep; POS = valsartan Positieve controlegroep; YH-L = groep met lage dosis van de YHT; YH-M = middelste dosisgroep van de YHT; YH-H = groep met hoge dosis van de YHT. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Farmacologische netwerkanalyse van YHT voor de behandeling van DKD. (A) Doelplot van YHT voor de behandeling van DKD. (B) Venn-diagram van kruisende doelen van YHT en DKD. De oranje kleur staat voor het aantal relevante doelen voor DKD; groene kleur vertegenwoordigt het aantal therapeutische doelen van YHT-actieve ingrediënten; en het kruisende deel vertegenwoordigt het aantal kruisende doelen (het aantal doelen van YHT voor DKD). (C) PPI-netwerkdiagram van de kruisende doelen van YHT en DKD. (D) GO-verrijkingsanalyse van de 10 belangrijkste doelen van YHT voor de behandeling van DKD. (E) KEGG-verrijkingsanalyse van de 10 belangrijkste doelen voor YHT-behandeling van DKD. Afkortingen: YHT = yinhuo Tang; DKD = diabetische nierziekte; PPI = eiwit-eiwit interactie; GO = Gen-ontologie; KEGG = Kyoto Encyclopedie van Genen en Genomen; CON = controlegroep; MOD = modelgroep; POS = valsartan Positieve controlegroep; YH-L = groep met lage dosis van de YHT; YH-M = middelste dosisgroep van de YHT; YH-H = groep met hoge dosis van de YHT. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Verzwakking van podocytbeschadiging door remming van de PI3K/AKT/NF-κB-signaleringsroute. (A-D) PCR om de relatieve mRNA-expressie van Pi3k, Akt, Nf-κb en Il-1β in nierweefsels te detecteren. (E-I) WB om de relatieve eiwitexpressieniveaus van P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB en IL-1β in nierweefsels te detecteren, en semi-kwantitatieve analyse werd uitgevoerd met behulp van ImageJ-software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Samenstelling van Yinhuo Tang. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Details van qRT-PCR-primers. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Een van de cruciale stappen in dit protocol is het gebruik van netwerkfarmacologie om de actieve componenten van YHT te identificeren en hun interacties met DKD-gerelateerde doelen te voorspellen. Deze stap omvat het analyseren van grootschalige biologische gegevens met behulp van bio-informaticatools zoals databases (bijv. TCMSP, DrugBank en GeneCards) om de moleculaire routes en potentiële biologische netwerken die door YHT worden beïnvloed in kaart te brengen. Deze voorspelling werd gevolgd door experimentele validatie door middel van diermodellen van DKD, waarbij de veronderstelde effecten van YHT op deze routes werden getest. De integratie van computationele voorspellingen met gegevens is een cruciaal aspect van onze aanpak, omdat het de betrouwbaarheid van onze bevindingen vergroot en de kloof tussen theoretische voorspellingen en praktische resultaten overbrugt. Bovendien is het gebruik van diermodellen een andere cruciale stap in het valideren van de therapeutische effecten van YHT. DKD bij dieren bootst de progressie van ziekten bij de mens nauwkeurig na, waardoor een effectieve evaluatie van de impact van YHT op zowel glomerulaire schade als nierfibrose mogelijk is. De nauwgezette monitoring van nierfunctiemarkers zoals Scr, BALL en proteïnurie, naast histopathologische beoordelingen, is essentieel om de therapeutische werkzaamheid van YHT te beoordelen.

Hoewel ons protocol krachtige computationele en experimentele methoden combineert, zijn er verschillende beperkingen. Ten eerste is de benadering van netwerkfarmacologie sterk afhankelijk van beschikbare gegevens in openbare databases, en kunnen er vertekeningen of ontbrekende informatie zijn met betrekking tot bepaalde componenten van YHT- of DKD-gerelateerde routes. Hoewel we meerdere databases hebben vergeleken om dit probleem op te lossen, kunnen sommige relevante interacties nog steeds over het hoofd worden gezien. Ten tweede onderzocht deze studie alleen het mechanisme van YHT bij het verminderen van podocytschade op proefdierniveau, en cellulaire experimenten en klinische studies met grote steekproeven zijn nodig om de experimentele resultaten te valideren. Ten slotte toonde netwerkfarmacologie aan dat de behandeling van DKD met YHT ook geassocieerd was met alcoholische leverziekte, lipidenmetabolisme en atherosclerose, en regulatie van lipolyse in adipocyten. Deze studie verifieerde alleen of modulatie van de PI3K/AKT/NF-κB-signaleringsroute door YHT de progressie van DKD zou kunnen vertragen; De resultaten moeten verder worden onderzocht.

De PI3K/AKT/NF-κB-signaleringsroute is een belangrijke intracellulaire signaalroute die betrokken is bij de regulatie van een verscheidenheid aan biologische processen zoals celgroei, proliferatie, overleving en ontstekingsreacties22. Studies hebben aangetoond dat het een belangrijke rol speelt bij de progressie van letsel aan pediculocyten23,24. NF-KB is een belangrijke stroomafwaartse component van de PI3K/Akt-route en neemt deel aan de overdracht van een verscheidenheid aan intracellulaire signalen en de expressie van meerdere genen. Remming van de PI3K/AKT-signaleringsroute leidt tot de afbraak van het NF-KB-remmende eiwit IκB, wat op zijn beurt leidt tot de fosforylering van NF-KB en het binnendringen ervan in de kern, en tot de productie van een verscheidenheid aan chemokinen en ontstekingsfactoren, wat leidt tot podocytbeschadiging en renale interstitiële fibrose25. Sommige studies hebben aangetoond dat remming van de activering van de PI3K/AKT/NF-κB-signaleringsroute ontstekingsreacties en nierfibrose effectief kan onderdrukken, waardoor de progressie van DKD26 wordt vertraagd.

Studies hebben aangetoond dat stoornissen in het lipidenmetabolisme een belangrijke rol spelen bij het ontstaan en de progressie van DKD27,28. DKD-patiënten vertonen vaak een abnormaal lipidenmetabolisme, waaronder verhoogde niveaus van LDL-, TG- en vetzuuraccumulatie. Deze afwijkingen hangen nauw samen met pathologische veranderingen zoals glomerulosclerose en tubulo-interstitiële fibrose29,30. Onderzoek wijst uit dat stoornissen in het lipidenmetabolisme DKD-progressie kunnen bevorderen via meerdere signaalroutes31,32. Ten eerste is de mTOR-signaleringsroute een belangrijke route in de regulatie van het lipidenmetabolisme; De overactivering ervan leidt tot beschadiging van podocyten en proteïnurie33,34. Een vetrijke omgeving kan de accumulatie van lipiden bevorderen via de PI3K/AKT/mTOR-as, waardoor podocytapoptose wordt geïnduceerd en uiteindelijk de verslechtering van de nierfunctie verergert 35,36,37. Ten tweede beschermt AMP-geactiveerde proteïnekinase (AMPK), een kritische regulator van het cellulaire energiemetabolisme, de nier tegen metabole stoornissen door vetzuuroxidatie te bevorderen, de lipidensynthese te remmen en lipotoxiciteit te verminderen 38,39,40. AMPK-inactivatie wordt beschouwd als een belangrijk mechanisme bij de progressie van DKD. AMPK-activatoren, zoals metformine, hebben significante renoprotectieve effecten laten zien en vormen een veelbelovend therapeutisch doelwit voor DKD41.

Ten slotte hebben studies aangetoond dat peroxisoomproliferator-geactiveerde receptoren α/γ (PPARα/γ) een essentiële rol spelen bij het reguleren van het lipidenmetabolisme en DKD42,43. PPARα-activering bevordert de oxidatie van vetzuren en vermindert de ophoping van lipiden in de nier, terwijl PPARγ de insulinegevoeligheid verbetert en ontstekingsremmende effecten heeft44,45. PPAR-agonisten, zoals fibraten, hebben potentiële klinische voordelen aangetoond bij het verminderen van proteïnurie bij DKD-patiënten46. Concluderend beïnvloeden stoornissen in het lipidenmetabolisme de pathologische progressie van DKD via meerdere signaalroutes. De interacties tussen deze routes vormen een complex pathologisch netwerk. Het aanpakken van het lipidenmetabolisme zou nieuwe therapeutische strategieën voor DKD kunnen opleveren.

De caspase (CASP) familie, een familie van cysteïne-specifieke proteasen, is een groep proteasen die veel worden aangetroffen in cellen en voornamelijk betrokken zijn bij de regulatie van apoptose en ontstekingsreacties 47,48. Leden van de CASP-familie delen structurele overeenkomsten en bestaan meestal als zymogens, die worden geactiveerd door een cascade van reacties, waardoor apoptose, pyroptose en andere geprogrammeerde celdoodprocessen worden geactiveerd49. Onder hen is CASP3, een lid van de caspase (CASP)-familie met een geconserveerde structuur die doorgaans aanwezig is als een zymogeen, een belangrijk protease in de uitvoeringsfase van apoptose dat de splitsing van specifieke cellulaire eiwitten katalyseert, waardoor het een cruciale rol speelt bij het reguleren van normale celgroei en het handhaven van interne homeostase50,51. Caspase-8 fungeert als een initiator van apoptotische cascades en neemt deel aan de modulatie van ontstekingsreacties door de activering van NPK, wat een sleutelfactor is bij de regulatie van cellulaire groei. Caspase-8 fungeert als een initiator van de apoptotische cascade en neemt ook deel aan de regulatie van de ontstekingsreactie door ontstekingsblaasjes zoals NLRP1 en NLRP3 te activeren, waardoor cellulaire pyroptose52 wordt geactiveerd. Op basis van de belangrijke rol van de CASP-signaleringsroute bij het mediëren van apoptose en pyroptose in gesteelde cellen, is verder diepgaand onderzoek naar de relatie tussen YHT, CASP3/8, gesteelde cellen en DKD in de toekomst gerechtvaardigd.

Vergeleken met conventionele benaderingen voor het ontdekken van geneesmiddelen die doorgaans de nadruk leggen op goed gedefinieerde single-target-mechanismen voor duidelijkheid en voorspelbaarheid van de regelgeving, maakt onze op netwerkfarmacologie gebaseerde strategie een systematische verkenning mogelijk van de multi-target interacties die inherent zijn aan TCM-formuleringen zoals YHT. Hoewel deze complexiteit de holistische aard van TCM en de potentiële therapeutische breedte ervan weerspiegelt, onderstreept het ook de uitdaging van onbedoelde off-target effecten, die zorgvuldige validatie en interpretatie vereisen. Door rekening te houden met het multi-target en multi-pathway karakter van de werking van YHT, bieden we een meer holistisch begrip van de therapeutische effecten bij de behandeling van DKD. Bovendien maakt netwerkfarmacologie het mogelijk om mogelijke geneesmiddelinteracties en bijwerkingen te voorspellen, wat cruciaal is voor het waarborgen van de veiligheid en werkzaamheid van therapieën met meerdere componenten. De huidige DKD-behandelingen zijn grotendeels gericht op het beheersen van symptomen of het vertragen van de progressie in plaats van op het aanpakken van de onderliggende ziektemechanismen. Door moderne bio-informaticatools te integreren met experimentele validatie, onderstreept deze studie het belang van systeembiologie bij het verbeteren van de werkzaamheid van TCM, met name bij chronische ziekten zoals DKD.

Vooruitkijkend is deze techniek veelbelovend voor het uitbreiden van de reikwijdte van netwerkfarmacologie in TCM-onderzoek, met name bij de behandeling van complexe ziekten zoals DKD. Onze aanpak kan worden toegepast om andere TCM-formules of individuele kruiden te onderzoeken op hun therapeutisch potentieel bij de behandeling van nierziekten, hart- en vaatziekten en stofwisselingsstoornissen. Bovendien zou deze methodologie kunnen worden uitgebreid om de herbestemming van geneesmiddelen te onderzoeken door nieuwe toepassingen voor bestaande medicijnen bij de behandeling van DKD te identificeren. Een andere mogelijke toepassing van onze aanpak ligt in gepersonaliseerde geneeskunde. Door patiëntspecifieke gegevens op te nemen, kan netwerkfarmacologie worden gebruikt om TCM-behandelingsstrategieën op maat te maken op basis van individuele moleculaire profielen, waardoor de werkzaamheid van de behandeling wordt verbeterd en bijwerkingen worden geminimaliseerd.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Jilin Provincial Natural Science Foundation (nr. 20210101201JC).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anhydrous ethanolChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10009218
Animal Experiment CenterChangchun University of Traditional Chinese MedicineSYXK (JI) 2023-0014
BATMAN-TCM databasehttp://bionet.ncpsb.org/batmantcm--
BCA Protein Assay KitSolarbioPC0020
Blocking BufferBeyotimeP0023B
Ceramic potsMideaMD-DG30E103
Chemiluminescence imaging systemHangzhou Shenhua Technology Co., LtdSH-523
ChloroformChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10006818
Cytoscape 3.8.0 software----
DAB reagent kitServicebioG1212-200T
db/db miceNanjing Junke Biological limited companySCXK (Su) 2020-009
ECL substrate solutionaffinityKF8003
Electric constant temperature water bath potFisaff Instrument (Hebei) Co., LtdDK-20000-IIIL
Electrophoresis instrument power supplyBeijing Longfang Technology Co., LtdLF-600S
Glass HomogenizerSolarbioYA0852
Glass slideNantong Meiweide Life Science Co., LtdPC2-301
Goat Anti-Rabbit IgG HRP(secondary antibody)AffinityS00011:3000 voor IHC, 1:10000 voor WB
HematoxylinWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG1140
High speed refrigerated centrifuge Hunan Kecheng Instrument Equipment Co., LtdH1-16KR
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)VAZYMER223-01
Horizontal shakerJiangsu Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., LtdTS-1
Imaging systemNikonNikon DS-U3
Intelligent digital magnetic heating stirrerHangzhou Miou Instrument Co., LtdTP-350E+
IsopropanolChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd80109218
marker(20-120KD)GenScriptM00521
Masson staining kitBASOBA4079B
Medical gauzeJianerkang Medical--
Metascape platformhttp://metascape.org/gp/index.html--
MethanolThermo67-56-1
Microbiology websitehttp://www.bioinformatics.com.cn/--
microscopeNikonECLIPSE Ci
microwave ovenGalanz Microwave Oven Electrical Appliance Co., LtdP70D20TL-P4
Multi sample tissue grinderShanghai Jingxin Industrial Development Co., LtdTissuelyser-24L
Multifunctional analytical electronic balanceChangzhou Lucky Electronic Equipment Game CompanyFA1204
Neutral resinWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG8590
Normal Goat SerumSolarbioSL038
ovenShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co., LtdDHG-9140A
Palm centrifugeWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdD1008E
PAS staining kitBASOBA4114B
Pathological slicerShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
PBSSolarbioP1020
PCR instrumentHangzhou Miou Instrument Co., LtdPR-96
Pipette gunDragonKE0003087/KA0056573
Primary Antibody Dilution BufferBeyotimeP0023A
Protein phosphatase inhibitor complexMeilunbioMB12707-1
PVDF membrane (0.22 μm)SolarbioISEQ00010
Quick primary/secondary antibody diluentSolarbioA1811
Rabbit anti-CD2APAffinityDF22981:200 voor IHC, 1:1000 voor WB
Rabbit anti-COI-IAffinityDF121491:200 voor IHC, 1:1000 voor WB
Rabbit anti-IL-1βAffinityAF51031:1000 voor WB
Rabbit anti-P-AKTAffinityAF00161:1000 voor WB
Rabbit anti-P-NF-ΚbAffinityAF32191:1000 voor WB
Rabbit anti-P-PI3KAffinityAF32421:1000 voor WB
Rabbit anti-WT-1AffinityDF63311:200 voor IHC, 1:1000 voor WB
Rabbit anti-α-SMAAffinityAF10321:200 voor IHC, 1:1000 voor WB
Rabbit anti-β-ActinAffinityAF70181:1000 voor WB
Real-Time PCR SystemABIQuantStudio 6
RIPA Lysis BufferMeilunbioMA0151
RNase-free ddH2OSolarbioR1600
Secondary Antibody Dilution BufferBeyotimeP0023D
Slide and cover glassJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd10212432C
SPSS 26.0 software----
String database website https://cn.string-db.org/--
Super pure water instrumentZhiang Instrument (Shanghai) Co., LtdClever-S15
Taq Plus DNA PolymeraseTIANGENET105-02
TCMSP database https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php--
Tissue grinderBeautiful WallMB-96
TrizolAmbion15596-026
Tween 20China National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd30189328
Ultra micro UV visible spectrophotometerHangzhou Miou Instrument Co., LtdND-100
Uniprot protein databasehttps://www.uniprot.

Referenties

  1. Naaman, S. C., Bakris, G. L. Diabetic nephropathy: Update on pillars of therapy slowing progression. Diabetes Care. 46 (9), 1574-1586 (2023).
  2. Glastras, S. J., Pollock, C. A. Targeted identification of risk and treatment of diabetic kidney disease. Nat Rev Nephrol. 20 (2), 75-76 (2024).
  3. Gregory, G. A., et al. Global incidence, prevalence, and mortality of type 1 diabetes in 2021 with projection to 2040: a modelling study. Lancet Diabetes Endocrinol. 10 (10), 741-760 (2022).
  4. Rao, B. V., Tan, S. H., Candasamy, M., Bhattamisra, S. K. Diabetic nephropathy: An update on pathogenesis and drug development. Diabetes Metab Syndr. 13 (1), 754-762 (2019).
  5. Guo, M., He, F., Zhang, C. Molecular therapeutics for diabetic kidney disease: An update. Int J Mol Sci. 25 (18), 10051(2024).
  6. Shen, S., et al. Advances in traditional Chinese medicine research in diabetic kidney disease treatment. Pharm Biol. 62 (1), 222-232 (2024).
  7. Han, C., et al. Yi-Shen-Hua-Shi granule ameliorates diabetic kidney disease by the "gut-kidney axis". J Ethnopharmacol. 10 (307), 116257(2023).
  8. Ma, X., et al. Advances in oxidative stress in pathogenesis of diabetic kidney disease and efficacy of TCM intervention. Ren Fail. 45 (1), 2146512(2023).
  9. Liu, M., et al. A systematic review on polysaccharides from Morinda officinalis How: Advances in the preparation, structural characterization and pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 28 (328), 118090(2024).
  10. Zhang, X., et al. Network pharmacology-based identification of key pPharmacological mechanism of Shen-qi-di-huang decoction acting on uremia. Altern Ther Health Med. 30 (1), 44-50 (2024).
  11. Linlin, Z., et al. A multi-target and multi-channel mechanism of action for Jiawei Yinhuo Tang in the treatment of social communication disorders in autism: Network pharmacology and molecular docking studies. Evid Based Complement Alternat Med. 8 (2022), 4093138(2022).
  12. Husain, S. Role of podocyte in kidney disease. Front Biosci (Landmark Ed). 29 (7), 250(2024).
  13. Pavenstädt, H., Kriz, W., Kretzler, M. Cell biology of the glomerular podocyte. Physiol Rev. 83 (1), 253-307 (2003).
  14. Torban, E., et al. From podocyte biology to novel cures for glomerular disease. Kidney Int. 96 (4), 850-861 (2019).
  15. Yue, J. I., et al. Acupuncture improve proteinuria in diabetic kidney disease rats by inhibiting ferroptosis and epithelial-mesenchymal transition. Heliyon. 10 (13), e33675(2024).
  16. Liu, X. Q., et al. Wogonin protects glomerular podocytes by targeting Bcl-2-mediated autophagy and apoptosis in diabetic kidney disease. Acta Pharmacol Sin. 43 (1), 96-110 (2022).
  17. Nogales, C., et al. Network pharmacology: curing causal mechanisms instead of treating symptoms. Trends Pharmacol Sci. 43 (2), 136-150 (2022).
  18. Zhang, P., et al. Network pharmacology: towards the artificial intelligence-based precision traditional Chinese medicine. Brief Bioinform. 25 (1), bbad518(2023).
  19. Zhao, L., et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 12 (309), 116306(2023).
  20. Meek, R. L., et al. Glomerular cell death and inflammation with high-protein diet and diabetes. Nephrol Dial Transplant. 28 (7), 1711-1720 (2013).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
  22. Yusuf, J. A., et al. Molecular mechanism underlying stress response and adaptation. Prog Brain Res. 291, 81-108 (2025).
  23. Yu, M., et al. Baicalein increases cisplatin sensitivity of A549 lung adenocarcinoma cells via PI3K/Akt/NF-κB pathway. Biomed Pharmacother. 12 (90), 677-685 (2017).
  24. Chen, H., et al. The PI3K/AKT pathway in the pathogenesis of prostate cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 21 (5), 1084-1091 (2016).
  25. Wang, J., et al. Critical roles of PI3K/Akt/NF-κB survival axis in angiotensin II-induced podocyte injury. Mol Med Rep. 20 (6), 5134-5144 (2019).
  26. Zhang, S. J., et al. Integrated network pharmacology analysis and experimental validation to elucidate the mechanism of acteoside in treating diabetic kidney disease. Drug Des Devel Ther. 12 (18), 1439-1457 (2024).
  27. Rong, J., et al. Mechanisms of hepatic and renal injury in lipid metabolism disorders in metabolic syndrome. Int J Biol Sci. 20 (12), 4783-4798 (2024).
  28. Bi, Z., et al. Development of a clinical prediction model for diabetic kidney disease with glucose and lipid metabolism disorders based on machine learning and bioinformatics technology. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 28 (3), 863-878 (2024).
  29. Wei, L., Gao, J., Wang, L., Tao, Q., Tu, C. Multi-omics analysis reveals the potential pathogenesis and therapeutic targets of diabetic kidney disease. Hum Mol Genet. 33 (2), 122-137 (2024).
  30. Vartak, T., Godson, C., Brennan, E. Therapeutic potential of pro-resolving mediators in diabetic kidney disease. Adv Drug Deliv Rev. 178 (4), 113965(2021).
  31. Liu, S., et al. Renal tubule ectopic lipid deposition in diabetic kidney disease rat model and in vitro mechanism of leptin intervention. J Physiol Biochem. 78 (2), 389-399 (2022).
  32. Tang, C., et al. Fenofibrate attenuates renal tubular cell apoptosis by up-regulating MCAD in diabetic kidney disease. Drug Des Devel Ther. 17 (2), 1503-1514 (2023).
  33. Lu, H. T., et al. Unraveling DDIT4 in the VDR-mTOR pathway: a novel target for drug discovery in diabetic kidney disease. Front Pharmacol. 15 (10), 1344113(2024).
  34. Tang, G., et al. Clinical efficacies, underlying mechanisms and molecular targets of Chinese medicines for diabetic nephropathy treatment and management. Acta Pharm Sin B. 11 (9), 2749-2767 (2021).
  35. Zhang, P., et al. Huaiqihuang (HQH) protects podocytes from high glucose-induced apoptosis and inflammation response by regulating PI3K/AKT/mTOR pathway. Arch Physiol Biochem. 11 (27), 1-8 (2024).
  36. Zhaoan, G., et al. Qizhi Jiangtang capsule activates podocyte autophagy in diabetic kidney disease by inhibiting phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin pathways. J Tradit Chin Med. 43 (4), 667-675 (2023).
  37. Jin, D., et al. Jiedu Tongluo Baoshen formula enhances podocyte autophagy and reduces proteinuria in diabetic kidney disease by inhibiting PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. J Ethnopharmacol. 293 (3), 115246(2022).
  38. Zhou, Y., et al. Metrnl alleviates lipid accumulation by modulating mitochondrial homeostasis in diabetic nephropathy. Diabetes. 72 (5), 611-626 (2023).
  39. Shao, M., et al. Canagliflozin regulates metabolic reprogramming in diabetic kidney disease by inducing fasting-like and aestivation-like metabolic patterns. Diabetologia. 67 (4), 738-754 (2024).
  40. Tian, S., et al. GLP-1 receptor agonists alleviate diabetic kidney injury via β-klotho-mediated ferroptosis inhibition. Adv Sci (Weinh). 12 (4), e2409781(2024).
  41. Song, Y., et al. Identification of circular RNAs and functional competing endogenous RNA networks in human proximal tubular epithelial cells treated with sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor dapagliflozin in diabetic kidney disease. Bioengineered. 13 (2), 3911-3929 (2022).
  42. Fan, Y., et al. Identification of potential key lipid metabolism-related genes involved in tubular injury in diabetic kidney disease by bioinformatics analysis. Acta Diabetol. 61 (8), 1053-1068 (2024).
  43. Pan, S., et al. A comprehensive weighted gene co-expression network analysis uncovers potential targets in diabetic kidney disease. J Transl Int Med. 10 (4), 359-368 (2023).
  44. Chen, Y., et al. Curcumin targets CXCL16-mediated podocyte injury and lipid accumulation in diabetic kidney disease treatment. Arch Pharm Res. 47 (12), 924-939 (2024).
  45. Liu, K., et al. Design, synthesis, and biological evaluation of a novel dual peroxisome proliferator-activated receptor alpha/delta agonist for the treatment of diabetic kidney disease through anti-inflammatory mechanisms. Eur J Med Chem. 218 (5), 113388(2021).
  46. Kitada, M., Kanasaki, K., Koya, D. Clinical therapeutic strategies for early stage of diabetic kidney disease. World J Diabetes. 5 (3), 342-356 (2014).
  47. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Caspase-3 and prostaglandins signal for tumor regrowth in cancer therapy. Oncogene. 31 (23), 2805-2808 (2012).
  48. Li, L., Wang, S., Zhou, W. Balance cell spoptosis and pyroptosis of caspase-3-activating chemotherapy for better antitumor therapy. Cancers (Basel). 15 (1), 26(2022).
  49. Fan, T. J., et al. Caspase family proteases and apoptosis. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (11), 719-727 (2005).
  50. Asadi, M., et al. Caspase-3: Structure, function, and biotechnological aspects. Biotechnol Appl Biochem. 69 (4), 1633-1645 (2022).
  51. Eskandari, E., Eaves, C. J. Paradoxical roles of caspase-3 in regulating cell survival, proliferation, and tumorigenesis. J Cell Biol. 221 (6), e202201159(2022).
  52. Pang, J., Vince, J. E. The role of caspase-8 in inflammatory signalling and pyroptotic cell death. Semin Immunol. 42 (70), 101832(2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Reductie van prote nurieglomerulaire filtratiepodocytenmarkerprote nenCD2AP expressieWT 1 expressiePI3K AKT NF Brenale microangiopathie
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen