Computer vision-bibliotheken gebruiken om de kwantificering van kernen te stroomlijnen

Summary

Dit artikel beschrijft stapsgewijze methoden om de kwantificering van beeldkernen te automatiseren met behulp van een open-source uitvoerbaar programma dat is gevalideerd voor een reeks celdichtheden. Dit programma biedt een alternatief dat barrières aanpakt met betrekking tot kosten, toegankelijkheid voor gebruikers met beperkte technologische vaardigheden en applicatiespecifieke validatie die de bruikbaarheid van bestaande technologieën kunnen beperken.

Abstract

Live celtesten en op beelden gebaseerde celanalyses vereisen gegevensnormalisatie voor een nauwkeurige interpretatie. Een veelgebruikte methode is het kleuren en kwantificeren van kernen, gevolgd door gegevensnormalisatie naar het aantal kernen. Dit aantal kernen wordt vaak uitgedrukt als celgetal voor eenkernige cellen. Hoewel handmatige kwantificering omslachtig en tijdrovend kan zijn, hebben de beschikbare geautomatiseerde methoden mogelijk niet de voorkeur van alle gebruikers, ontbreekt het aan validatie voor deze specifieke toepassing of zijn ze onbetaalbaar. Hier geven we stapsgewijze instructies voor het vastleggen van kwantificeerbare beelden van kernen die zijn gekleurd met fluorescerende DNA-vlekken en vervolgens het kwantificeren van de kernen met behulp van een geautomatiseerd softwareprogramma voor het tellen van objecten dat is ontwikkeld met behulp van Python-computervisiebibliotheken. We valideren dit programma ook voor een reeks celdichtheden. Hoewel de exacte tijd voor het uitvoeren van het programma varieert op basis van het aantal afbeeldingen en computerhardware, consolideert dit programma uren werk en telt het aantal kernen in seconden voordat het programma kan worden uitgevoerd. Hoewel dit protocol is ontwikkeld met behulp van afbeeldingen van gefixeerde, gekleurde cellen, kunnen afbeeldingen van gekleurde kernen in levende cellen en immunofluorescentietoepassingen ook worden gekwantificeerd met behulp van dit programma. Uiteindelijk biedt dit programma een optie die geen hoge mate van technologische vaardigheid vereist en is het een gevalideerd, open-source alternatief om cel- en moleculair biologen te helpen bij het stroomlijnen van hun workflows, waardoor de vervelende en tijdrovende taak van het kwantificeren van kernen wordt geautomatiseerd.

Introduction

Functionele en op afbeeldingen gebaseerde experimenten zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de effecten van experimentele behandelingen op de biochemie en fysiologie van de hele cel. Een geldige interpretatie van gegevens uit celbiologische experimenten hangt af van de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van het experimentele protocol, inclusief gegevensnormalisatie. Analyses van het zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuringssnelheid in levende cellen bij aanvang en na behandeling met specifieke geneesmiddelen maken het bijvoorbeeld mogelijk om verschillende aspecten van het energiemetabolisme te beoordelen

Protocol

OPMERKING: Aanvullende bestanden zijn te vinden op de volgende link https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. Afbeeldingen vastleggen en opslaan met behulp van fluorescentiemicroscopie

1. Bereid cel- of weefselmonsters voor die in beeld moeten worden gebracht, inclusief kleuring met de gewenste DNA-kleurstof. Om de hier gebruikte afbeeldingen te verkrijgen, werden C2C12-myoblasten (CRL-1772, American Type Culture Collection) gekweekt in platen met 6 putjes gedurende 48-72 uur onder standaard kweekomstandigheden (5% CO₂, 37 °C, bevochtigd), met o....

Results

Elke batch-image produceert: 1) een set afbeeldingsbestanden met toegepaste contouren die de contouren van geïdentificeerde kernen tonen (Figuur 5), en 2) een .csv-bestand (spreadsheet) waarin de bestandsnamen van afbeeldingen en de bijbehorende tellingen worden gekoppeld. Door de contouren te bekijken, kan de gebruiker de kwaliteit van de telling visueel beoordelen. In het bijzonder moeten afbeeldingen die zijn verkregen vol.......

Discussion

Ons programma voor het kwantificeren van kernen heeft verschillende voordelen ten opzichte van bestaande opties: het vereist slechts minimale technologische vaardigheden, is gevalideerd voor de specifieke taak van het kwantificeren van kernen en is open-source; Dit laatste overwint kostengerelateerde barrières. Uiteindelijk biedt dit programma cel- en moleculair biologen een extra optie om snel en nauwkeurig kernen te kwantificeren in beelden die zijn vastgelegd met behulp van fluorescen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer with access to results file from method 2 or 3	-	-	See step 2.6 (for Method 2) or step 3.3.9 or 3.4.9 (for Method 3)
Computer with internet access, modern browser	-	-	e.g., Google Chrome
Computer with internet access, modern browser, and Windows OS	Varies	Varies	For Mac, Linux, or other OS, use Method 3
Computer with software for image capture	Zeiss	AxioVision	Other software is acceptable; must be compatible with the fluorescence microscope
File location for output (results spreadsheet and image contours)	-	-	Can be a new, empty folder
Fluorescence microscope	Zeiss	Axiovert 200M	Other fluorescence microscopes are acceptable; must be equipped with appropriate filter cubes, desired objective, and camera
Folder containing all images to be quantified	-	-	See step 1.12
Python version 3.10 or higher	Python	-	Available for free download and installation at https://www.python.org/downloads/
Samples to be imaged	-	-	Fixed or live, stained or counterstained with fluorescent DNA dyes
Spreadsheet software	Microsoft	Excel	Similar spreadsheet software is also acceptable