Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Computer vision-bibliotheken gebruiken om de kwantificering van kernen te stroomlijnen

907 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67945

⸱

6 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Metabolic Health & Muscle Physiology Laboratory, Department of Kinesiology and Sport Management, Texas Tech University, 2Applied Exercise Physiology Laboratory, Department of Kinesiology and Sport Management, Texas Tech University

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft stapsgewijze methoden om de kwantificering van beeldkernen te automatiseren met behulp van een open-source uitvoerbaar programma dat is gevalideerd voor een reeks celdichtheden. Dit programma biedt een alternatief dat barrières aanpakt met betrekking tot kosten, toegankelijkheid voor gebruikers met beperkte technologische vaardigheden en applicatiespecifieke validatie die de bruikbaarheid van bestaande technologieën kunnen beperken.

Samenvatting

Live celtesten en op beelden gebaseerde celanalyses vereisen gegevensnormalisatie voor een nauwkeurige interpretatie. Een veelgebruikte methode is het kleuren en kwantificeren van kernen, gevolgd door gegevensnormalisatie naar het aantal kernen. Dit aantal kernen wordt vaak uitgedrukt als celgetal voor eenkernige cellen. Hoewel handmatige kwantificering omslachtig en tijdrovend kan zijn, hebben de beschikbare geautomatiseerde methoden mogelijk niet de voorkeur van alle gebruikers, ontbreekt het aan validatie voor deze specifieke toepassing of zijn ze onbetaalbaar. Hier geven we stapsgewijze instructies voor het vastleggen van kwantificeerbare beelden van kernen die zijn gekleurd met fluorescerende DNA-vlekken en vervolgens het kwantificeren van de kernen met behulp van een geautomatiseerd softwareprogramma voor het tellen van objecten dat is ontwikkeld met behulp van Python-computervisiebibliotheken. We valideren dit programma ook voor een reeks celdichtheden. Hoewel de exacte tijd voor het uitvoeren van het programma varieert op basis van het aantal afbeeldingen en computerhardware, consolideert dit programma uren werk en telt het aantal kernen in seconden voordat het programma kan worden uitgevoerd. Hoewel dit protocol is ontwikkeld met behulp van afbeeldingen van gefixeerde, gekleurde cellen, kunnen afbeeldingen van gekleurde kernen in levende cellen en immunofluorescentietoepassingen ook worden gekwantificeerd met behulp van dit programma. Uiteindelijk biedt dit programma een optie die geen hoge mate van technologische vaardigheid vereist en is het een gevalideerd, open-source alternatief om cel- en moleculair biologen te helpen bij het stroomlijnen van hun workflows, waardoor de vervelende en tijdrovende taak van het kwantificeren van kernen wordt geautomatiseerd.

Inleiding

Functionele en op afbeeldingen gebaseerde experimenten zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de effecten van experimentele behandelingen op de biochemie en fysiologie van de hele cel. Een geldige interpretatie van gegevens uit celbiologische experimenten hangt af van de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van het experimentele protocol, inclusief gegevensnormalisatie. Analyses van het zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuringssnelheid in levende cellen bij aanvang en na behandeling met specifieke geneesmiddelen maken het bijvoorbeeld mogelijk om verschillende aspecten van het energiemetabolisme te beoordelen 1,2. Het meten van de activiteit van enzymen zoals lactaatdehydrogenase in het supernatans van celculturen kan helpen bij het kwantificeren van de integriteit van het celmembraan3. Het kleuren van gekweekte cellen met annexine V en propidiumjodide vóór fixatie maakt de beoordeling van apoptotische en necrotische cellen mogelijk4. Verschillen in celdichtheid tussen putten beïnvloeden echter de resultaten van elk van deze testen. Alleen vertrouwen op de zaaidichtheid kan misleidende resultaten opleveren als gevolg van fouten bij het tellen van cellen voor zaaien, variaties in celdichtheid in media tijdens het plateren, of verschillende snelheden van celgroei tussen monsters of behandelingen tijdens experimenten. Daarom is normalisatie van experimentele resultaten vereist.

Huidige normalisatiemethoden voor functionele en op afbeeldingen gebaseerde celgegevens omvatten eiwitconcentratie5 of kernen of celtelling6. Om gegevens te normaliseren naar eiwitconcentratie, moeten cellen worden geëxtraheerd in gelijke hoeveelheden lysisbuffer met proteaseremmer nadat de test is uitgevoerd, en moet een aanvullende test (bijv. bicinchoninezuurtest, Bradford-assay, enz.) worden uitgevoerd voor eiwitkwantificering. De nauwkeurigheid van deze methode is afhankelijk van volledige celextractie; Het achterlaten van eiwitten draagt bij aan fouten in de kwantificering. Het tellen van kernen of cellen biedt een alternatief waarbij er geen cellen hoeven te worden verwijderd van het oppervlak waarop ze zijn gegroeid. In plaats daarvan worden levende of gefixeerde cellen gekleurd of tegengekleurd met behulp van colorimetrische of fluorescerende kleuringen, en tellen kan worden uitgevoerd op basis van afbeeldingen van hele cellen of alleen kernen. Het kwantificeren van kernen heeft de voorkeur boven hele cellen voor fluorescentiemicroscopietoepassingen en om gegevens in gefuseerde cellen (bijv. myotubes) of weefsels te normaliseren. Voor kwantificering van kernen met behulp van een fluorescentiebenadering worden fluorescerende DNA-kleurstoffen (bijv. 4′,6-diamidino-2-fenylindatichloride (DAPI), Hoechst 33342, Hoechst 33358, DRAQ5, enz.) aangebracht op levende of gefixeerde cellen en in beeld gebracht met behulp van fluorescentiemicroscopie. DAPI, Hoechst en DRAQ5 binden bij voorkeur aan adenine-thyminerijke DNA-gebieden 7,8,9 en bieden een middel om kernen te detecteren. Optimalisatie van de kleurstofconcentratie voorkomt off-target binding (d.w.z. aan mitochondriaal DNA, waardoor puntvormige cytosolische fluorescentie ontstaat)10. Het optimalisatieproces kan worden gestroomlijnd door gebruik te maken van in de handel verkrijgbare montagemedia die DAPI bevatten voor vaste cellen (bijv. VECTASHIELD Antifade Mounting Medium met DAPI) en gepubliceerde concentraties van kleurstoffen voor levende cellen (bijv. Hoechst)6,11,12. Eenmaal gekleurd, worden kernen in levende of gefixeerde cellen gevisualiseerd met behulp van het juiste excitatiefilter (bijv. ultraviolet [DAPI en Hoechst] of verrood [DRAQ5]). Excitatiemaxima voor DAPI, Hoechst en DRAQ5 bevinden zich aan beide uiteinden van het spectrum voor fluorescentiemicroscopie. Deze eigenschap, plus de DNA-specificiteit van deze kleurstoffen en hun gebruik in optimale concentraties, minimaliseert off-target fluorescentie. De resulterende afbeeldingen tonen heldere kernen tegen een zwarte achtergrond, en deze kernen worden gekwantificeerd als een maat voor het aantal cellen voor eenkernige cellen. Hoewel er andere nauwkeurige, op kleuring gebaseerde methoden voor het kwantificeren van kernen bestaan met behulp van histologische kleuringen en helderveldmicroscopie13, is automatisering moeilijker, zij het mogelijk, met behulp van die benaderingen.

Hoewel het de gouden standaard blijft, is handmatige kwantificering van kernen arbeidsintensief, tijdrovend en vatbaar voor mogelijke menselijke fouten bij langdurig tellen. Hoewel er geautomatiseerde programma's voor het tellen van cellen bestaan, hebben ze niet de voorkeur van alle gebruikers, kunnen ze onbetaalbaar zijn en kan de validatie voor specifieke toepassingen minimaal zijn. Python is de afgelopen jaren een waardevolle en toegankelijke bron geworden voor biologen. Python computer vision-bibliotheken zijn met name handig voor beeldanalyse14. Hier geven we stapsgewijze instructies voor het gebruik van ons uitvoerbare programma dat is ontwikkeld met behulp van Python-code om kernen te kwantificeren die zijn gekleurd met fluorescerende kleurstoffen en zijn afgebeeld met behulp van fluorescentiemicroscopie. Codeervaardigheden zijn niet nodig om het hier beschreven programma te gebruiken. Deze workflow is specifiek voor cellen of weefsels waarop fluorescerende DNA-kleurstoffen zijn toegepast. Het is niet bedoeld voor gebruik met helderveldafbeeldingen. In deel 1 wordt beschreven hoe u afbeeldingen die zijn verzameld met behulp van fluorescentiemicroscopie kunt vastleggen en opslaan op een manier die compatibel is met deze workflow. Sectie 2 geeft instructies voor het uitvoeren van het kernkwantificeringsprogramma als een uitvoerbaar bestand en het ophalen van uitvoer. Het uitvoerbare programma kan rechtstreeks vanuit het meegeleverde .exe-bestand worden uitgevoerd en vereist geen aanpassingen om kernen in kwaliteitsafbeeldingen te kwantificeren. Voor dit uitvoerbare bestand is een Windows-pc vereist. Sectie 3 geeft instructies voor het uitvoeren van het programma als een Python-script in plaats van een uitvoerbaar bestand (vereist voor Mac- of Linux-gebaseerde systemen, optioneel voor Windows-gebaseerde systemen) en maakt het mogelijk om de code desgewenst af te stemmen. In deel 4 wordt beschreven hoe de resultaten kunnen worden gebruikt voor normalisatie. Deze protocollen worden gevolgd door representatieve resultaten, waaronder validatiegegevens uit ons laboratorium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Aanvullende bestanden zijn te vinden op de volgende link https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. Afbeeldingen vastleggen en opslaan met behulp van fluorescentiemicroscopie

  1. Bereid cel- of weefselmonsters voor die in beeld moeten worden gebracht, inclusief kleuring met de gewenste DNA-kleurstof. Om de hier gebruikte afbeeldingen te verkrijgen, werden C2C12-myoblasten (CRL-1772, American Type Culture Collection) gekweekt in platen met 6 putjes gedurende 48-72 uur onder standaard kweekomstandigheden (5% CO2, 37 °C, bevochtigd), met of zonder 50 mM EtOH6, en gefixeerd in ijskoude methanol zoals eerder beschreven13. Vaste cellen werden gemonteerd met behulp van een DAPI-bevattend montagemedium15 en gedroogd in het donker voordat ze werden afgebeeld.
  2. Schakel alle onderdelen van de fluorescentiemicroscoop en computer in volgens de vastgestelde standaardwerkwijzen. Open de software die aan de microscoop is gekoppeld.
  3. Stel de microscoop in om monsters door het oculair te visualiseren. Controleer het doel. Draai indien nodig het neusstuk naar het gewenste doel. Zorg ervoor dat het softwareprogramma het gewenste doel heeft geselecteerd voor een nauwkeurige indicatie van het beeldgebied. Hier werden beelden gemaakt met behulp van een 10x objectief.
  4. Met de lichten uit, plaats je het monster (dia, bord of schaal) op het podium. Schakel live beeldvorming in met het juiste filter en stel de belichtingstijd in op een vooraf bepaalde duur of op automatische belichting. Hier werd een DAPI-filter en een belichtingstijd van 61-62 ms gebruikt. Zie de tabel voor probleemoplossing voor hulp bij het instellen van de belichtingstijd, vooral voor afbeeldingen met een hoge celdichtheid.
  5. Pas met behulp van het oculair langzaam de scherpstelling aan met behulp van de bruto-instelknop totdat gekleurde kernen zichtbaar zijn, en gebruik vervolgens de fijnafstellingsknop om de scherpstelling langzaam aan te passen totdat de kernen helder en scherp lijken.
    OPMERKING: Voorbeelden van geschikte afbeeldingen worden getoond in Figuur 1.
    1. Als er overmatige achtergrondkleuring optreedt of als de kernen erg zwak lijken, pas dan de belichtingstijd handmatig aan. In een enkel beeld kunnen er zichtbare verschillen in signaalintensiteit zijn voor sommige kernen; De ronde vorm moet echter zichtbaar zijn voor alle kernen met minimale signaalinterferentie.
      OPMERKING: Het programma dat in downstream-toepassingen wordt gebruikt, is robuust voor verschillende intensiteiten. Ruwe afbeeldingen die worden gebruikt voor de ontwikkeling en validatie van het kernkwantificeringsprogramma omvatten afbeeldingen met een reeks signaalintensiteiten en zijn beschikbaar via de Open Science Framework-repository (zie bovengenoemde link).

figure-protocol-1
Figuur 1: Voorbeeldbeelden van met DAPI gekleurde kernen. Deze afbeeldingen tonen kernen met (A) lage, (B) gemiddelde of (C) hoge celdichtheden met een minimale achtergrond. Let op de variërende signaalintensiteit van kernen in afbeelding C; Dit had geen invloed op de kwantificering. Schaalbalk (C) geeft 100 μm aan; Schaalbalken moeten worden weggelaten uit afbeeldingen die worden gebruikt voor het kwantificeren van kernen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Zodra de kernen door het oculair scherp zijn, schakelt u de detectiemodus over naar de camera. Stem de scherpstelling af met behulp van de fijnafstellingsknop.
  2. Pas de belichtingstijd indien nodig aan. Noteer de uiteindelijke belichtingstijd voor gebruik met volgende voorbeelden en afbeeldingen.
    OPMERKING: Hoewel het ideaal is om voor alle afbeeldingen dezelfde belichtingstijd te gebruiken, zijn variaties in belichtingstijd acceptabel voor deze toepassing omdat de fluorescentie-intensiteit niet wordt gekwantificeerd of vergeleken tussen monsters.
  3. Leg de afbeelding vast met de juiste knop voor het vastleggen van afbeeldingen in de software. Als er meerdere vlekken op monsters zijn aangebracht, schakelt u het filter over (bijvoorbeeld naar FITC, TRITC of Cy5) en bedient u hetzelfde gebied voor samenvoegingsdoeleinden.
  4. Pas de sluiter toe om de blootstelling aan licht van het monster te minimaliseren. Zonder in een schaalbalk te branden, slaat u de afbeelding op in een universele bestandsindeling voor cijfers (.tif, .png of .jpg) in een speciale map. Zorg ervoor dat de bestandsnaam van elke afbeelding de juiste beschrijving bevat of dat de codering die voor bestandsnamen wordt gebruikt, de juiste gekoppelde documentatie bevat.
    OPMERKING: Dit wordt de Image Directory voor het kwantificeringsprogramma. Als meerkleurige beeldvorming is gebruikt, kopieer dan alleen afbeeldingen van kernen naar een aparte, speciale map. Dit kan ook aan het einde van de beeldvormingssessie. Afbeeldingen die worden geëxporteerd met behulp van de standaardexportinstellingen op de meeste beeldbewerkingssoftware hebben doorgaans een voldoende resolutie voor gebruik met dit programma, op voorwaarde dat er kwaliteitsafbeeldingen zijn gemaakt. De afbeeldingen moeten echter na de export visueel worden gecontroleerd om er zeker van te zijn dat de morfologie van de kernen duidelijk is. Als afbeeldingen in .jpg formaat worden opgeslagen, moet ervoor worden gezorgd dat afbeeldingen niet overmatig worden gecomprimeerd en dat de kwaliteit behouden blijft.
  5. Open de sluiter, keer terug naar live beeldvorming en scan het monster naar een andere locatie voor beeldvorming. Herhaal stap 1.8-1.9 indien nodig. Voor afbeeldingen van cellen die zijn gezaaid in platen met 6 putjes die zijn vastgelegd met een vergroting van 10x, legt u 10-15 afbeeldingen per putje vast (afhankelijk van de consistentie van de celdichtheid in het monstergebied).
  6. Nadat alle afbeeldingen voor één monster zijn verkregen, voert u een van de volgende opties uit.
    1. Ga verder met het volgende voorbeeld en herhaal stap 1.4-1.10.
    2. Pauzeer het protocol en kom op een ander tijdstip terug. Monsters moeten beschermd blijven tegen licht. Deze optie wordt niet aanbevolen als u met actieve cellen werkt.
  7. Zodra de beeldvorming is voltooid, zorgt u ervoor dat alle monsters tegen licht zijn beschermd voordat u de kamerverlichting inschakelt. Als de map met afbeeldingen lokaal wordt opgeslagen, brengt u bestanden over naar een USB-stick, cloudopslaglocatie of een ander netwerkstation dat toegankelijk is voor de computer waarop het kwantificeringsprogramma wordt uitgevoerd. Sla op in een speciale map.
  8. Schakel alle onderdelen van de microscoop en computer uit volgens de vastgestelde standaardwerkprocedures.
  9. De beeldvorming is nu voltooid. Analyseer de bestanden met behulp van het geautomatiseerde kwantificeringsprogramma zoals beschreven in Sectie 2 of, als alternatief, door het programma uit te voeren als een Python-script zoals beschreven in Sectie 3.

2. Het geautomatiseerde kernkwantificeringsprogramma uitvoeren als een uitvoerbaar bestand

OPMERKING: Deze methode, waarbij het programma als een uitvoerbaar bestand wordt uitgevoerd, is compatibel met Windows-pc's en is de aanbevolen methode voor gebruikers van Windows OS. Mac OS of andere niet-Windows-gebruikers moeten het programma uitvoeren als een Python-script (zie Sectie 3).

  1. Zorg ervoor dat Python op de computer is geïnstalleerd. Installeer indien nodig Python vanuit python.org/downloads (bij voorkeur) of met behulp van Anaconda of Miniconda. Op de datum van publicatie is dit programma getest met Python versies 3.10-3.12.
  2. Open de browser en navigeer naar https://github.com/rbudnar/nuclei_counter/releases. Download de nieuwste versie van het bestand met de naam count_nuclei.zip.
  3. Klik in de map Downloads met de rechtermuisknop op het zipbestand en pak alle bestanden uit naar de gewenste locatie op de lokale computer (zie afbeelding 2A). Houd deze bestandslocatie open; dit bestandspad wordt gebruikt in stap 2.5 (zie afbeelding 2B).
    OPMERKING: Count_nuclei zou nu als een aanvraagbestand moeten verschijnen. Dit is het uitvoerbare bestand.
  4. Open een opdrachtprompt door te zoeken naar CMD of Opdrachtprompt in de zoekbalk. Gebruik de cd-opdracht om de map te wijzigen in het bestandspad voor het uitvoerbare bestand (zie afbeelding 2C) en druk op Enter. Voorbeeld van een opdrachtregel: C:\Users\janedoe>cd [spatie na cd, dan kopieer/plak het bestandspad]
  5. Typ op de volgende opdrachtregel het volgende en druk op Enter.
    count_nuclei.exe --img_dir "pad/naar/afbeeldingen" --output_dir "pad/naar/uitvoer" --save_images --output_count_filename "results.csv"
    waarbij pad/naar/afbeeldingen het bestandspad is naar de map met afbeeldingen die moeten worden geanalyseerd (zie stap 1.14); Path/To/Output is het bestandspad naar de map waar het .csv bestand moet worden opgeslagen (standaard naar de huidige werkmap als deze niet is opgegeven); En results.csv is de bestandsnaam waarin de resulterende tellingen worden opgeslagen (indien niet opgegeven, is de uitvoerbestandsnaam standaard ingesteld op count_results.csv).
    OPMERKING: Aanhalingstekens zijn nodig in de opdrachtregel. Zorg ervoor dat er geen spaties achter aanhalingstekens voor het bestandspad staan (zie afbeelding 2C).
  6. Wanneer de volgende opdrachtregel verschijnt, is de verwerking voltooid. De contouren en de resultatenspreadsheet zijn nu beschikbaar op de locatie die is opgegeven als de uitvoermap in stap 2.5 (d.w.z. pad/naar/uitvoer; zie afbeelding 2C).
  7. Inspecteer de contouren visueel om de kwaliteit van de telling te controleren. De resultaten kunnen nu worden gebruikt om gegevens te normaliseren zoals beschreven in sectie 4.
    OPMERKING: Als contouren kernen lijken te hebben gemist (bijv. kernen lijken te zwak) of groepen kernen in een enkel item lijken te clusteren (bijv. overbelicht beeld, te veel achtergrond, artefacten), moet de gebruiker de tabel voor probleemoplossing raadplegen en mogelijk terugkeren naar sectie 1 om de beeldacquisitie te optimaliseren voordat hij verder gaat met sectie 4.

figure-protocol-2
Afbeelding 2: Voorbeelden van belangrijke onderdelen van de workflow voor sectie 2. (A) Pak bestanden uit de map Downloads en zorg ervoor dat u op de juiste map klikt, zoals aangegeven door de pijl om extractie mogelijk te maken (B) naar de gewenste bestemming in stap 2.3. (C) Voorbeelden van opdrachten voor stap 2.4 en 2.5 en de volgende opdrachtregel die de voltooiing in stap 2.6 aangeeft. Houd er rekening mee dat het bestandspad in stap 2.4 (C) overeenkomt met de locatie voor extractie in stap 2.3 (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Het geautomatiseerde kernkwantificeringsprogramma uitvoeren als Python-script

  1. Zorg ervoor dat Python op de computer is geïnstalleerd. Installeer indien nodig Python vanuit python.org/downloads (bij voorkeur) of met behulp van Anaconda of Miniconda. Op de datum van publicatie is dit programma getest met Python versies 3.10-3.12.
  2. Open de browser en navigeer naar https://github.com/rbudnar/nuclei_counter. Klik op de knop Groene Code en klik vervolgens op ZIP downloaden om de coderepository te downloaden (zie afbeelding 3A).
  3. Gebruik de volgende instructies voor Windows OS. Zie stap 3.4 voor Mac OS-machines.
    1. Klik met de rechtermuisknop in de map Downloads op het bestand en selecteer Alles uitpakken om de bestanden uit te pakken naar een lokale computer (zie afbeelding 3B-C).
    2. Open op de uitgepakte bestandslocatie de map met de naam nuclei_counter-main. Dit is de repository voor code.
      OPMERKING: Dit hoeft alleen te worden gedownload de eerste keer dat dit programma wordt gebruikt; Verplaats de uitgepakte bestanden eenvoudig naar een toegankelijke netwerklocatie en noteer die locatie.
    3. Open een opdrachtprompt door te zoeken naar CMD of Opdrachtprompt in de zoekbalk. Als Python is geïnstalleerd door Anaconda of Miniconda, opent u de Anaconda-prompt in plaats van een standaardopdrachtprompt. Dit is te vinden door Anaconda Prompt in de zoekbalk te typen.
    4. Gebruik de opdracht cd om de map naar de coderepository te wijzigen en druk op Enter. Zie de onderstaande coderegel, die hoofdlettergevoelig is. Zorg ervoor dat de map met de naam nuclei_counter-main is geopend wanneer u het bestandspad kopieert; het bestand met de naam pyproject of pyproject.toml moet zichtbaar zijn (zie Figuur 3D). Voorbeeld van een opdrachtregel: C:\Users\janedoe>cd [spatie na cd, dan kopieer/plak het bestandspad]
    5. Typ op de volgende opdrachtregel het volgende, inclusief de spatie en punt (zie afbeelding 3D:
      pip installeren -e .
      OPMERKING: Stappen 3.3.5 en 3.3.6 hoeven alleen te worden voltooid wanneer dit programma voor het eerst op een computer wordt uitgevoerd. Als dit al is voltooid, gaat u verder met stap 3.3.7. Het kan even duren voordat het installatieproces is geïnitialiseerd.
    6. Druk op Enter. Door deze opdracht uit te voeren, worden de vereiste bibliotheken geïnstalleerd om dit script uit te voeren en wordt de repository in een bewerkbare modus geïnstalleerd voor het geval er code-aanpassingen nodig zijn (zie Afbeelding 3D).
    7. Typ het volgende in de volgende opdrachtregel om de map te wijzigen in de hoofdbroncodemap (zie Afbeelding 3E):
      CD "nuclei_counter"
    8. Typ op de volgende opdrachtregel het volgende en druk op Enter (zie afbeelding 3E):
      Python count_nuclei.py --img_dir "pad/naar/afbeeldingen" --output_dir "pad/naar/uitvoer" --save_images --output_count_filename "results.csv"
      Waarbij pad/naar/afbeeldingen het bestandspad is naar de map met afbeeldingen die moeten worden geanalyseerd (stap 1.14); Path/To/Output is het bestandspad naar de map waar het .csv bestand moet worden opgeslagen (standaard naar de huidige werkmap als deze niet is opgegeven); En results.csv is de bestandsnaam waarin de resulterende tellingen worden opgeslagen (indien niet opgegeven, is de uitvoerbestandsnaam standaard ingesteld op count_results.csv).
      OPMERKING: Aanhalingstekens zijn nodig in de opdrachtregel. Zorg ervoor dat er geen spaties na aanhalingstekens voor het bestandspad staan. Het python-script leest de bestanden in het opgegeven bestandspad en voert het programma voor het tellen van kernen uit voor alle afbeeldingen in de map (zie Figuur 3E). De resulterende tellingen worden opgeslagen in de resultaten .csv bestand op de opgegeven locatie.
    9. Wanneer de volgende opdrachtregel verschijnt, is de verwerking voltooid (zie afbeelding 3E). De contouren en het werkblad met resultaten zijn nu beschikbaar op de locatie die is opgegeven als de uitvoermap in stap 3.3.8 (d.w.z. pad/naar/uitvoer).

figure-protocol-3
Figuur 3: Voorbeelden van belangrijke onderdelen van de workflow voor sectie 3 met behulp van Windows OS. Om toegang te krijgen tot de code, klikt u op de groene knop met het label Code en (A) downloadt u het zip-bestand (aangegeven met pijlen). (B) Pak uit door met de rechtermuisknop op het zip-bestand te klikken (weergegeven in blauw) en (C) de gewenste bestemming in te stellen. (D) Na het openen van de opdrachtprompt, voorbeelden van opdrachten voor de stappen 3.3.4 en 3.3.5. Merk op dat de opdracht voor stap 3.3.5 allemaal op één regel staat; de tekst die begint met "Bestand verkrijgen" op de volgende regel verschijnt nadat u op enter hebt gedrukt (stap 3.3.6; d.w.z. het uitvoeren van de opdracht). (E) Voorbeelden van opdrachten voor de stappen 3.3.7 en 3.3.8, een voortgangsbalk na uitvoering van stap 3.3.8 en de opdrachtregel die de voltooiing in stap 3.3.9 aangeeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Gebruik de volgende instructies voor Mac OS.
    1. Klik in de map Downloads op het menu Bestand en selecteer Openen om de bestanden uit te pakken naar de lokale computer (zie afbeelding 4A).
    2. Open op de uitgepakte bestandslocatie de map met de naam nuclei_counter-main. Dit is de repository voor code.
      OPMERKING: Dit hoeft alleen te worden gedownload de eerste keer dat dit programma wordt gebruikt; Verplaats de uitgepakte bestanden eenvoudig naar een toegankelijke netwerklocatie en noteer die locatie.
    3. Open een terminal door op command+spatiebalk te drukken die de schijnwerper opent; Zoek vervolgens op "terminal".
    4. Gebruik de opdracht cd om de map naar de coderepository te wijzigen en druk op Enter. Zie de onderstaande coderegel, die hoofdlettergevoelig is. Typ het bestandspad in een tekstdocument en kopieer het naar de terminal. Zorg ervoor dat het bestandspad begint met de tekst die direct aan de cd voorafgaat (bijv. /Users/userid in Figuur 4B). Voorbeeld van een opdrachtregel: /Users/janedoe›cd /Users/janedoe/Desktop/nuclei_counter-main
    5. Op de volgende opdrachtregel verschijnt een dollarteken achter de gebruikers-ID (zie afbeelding 4B). Zorg ervoor dat er een spatie achter het dollarteken staat en typ het volgende, inclusief de spatie en punt aan het einde van de opdracht. Voeg de juiste Python-versie toe direct na pip zonder spatie: pip3 install -e .
      OPMERKING: Stappen 3.4.5 en 3.4.6 hoeven alleen te worden voltooid wanneer dit programma voor het eerst op een computer wordt uitgevoerd. Als dit al is voltooid, gaat u verder met stap 3.4.7. Het kan even duren voordat het installatieproces is geïnitialiseerd.
    6. Druk op Enter. Door deze opdracht uit te voeren, worden de vereiste bibliotheken geïnstalleerd om dit script uit te voeren en wordt de opslagplaats in een bewerkbare modus geïnstalleerd voor het geval er codeaanpassingen nodig zijn.
    7. Zorg er op de volgende opdrachtregel voor dat er een spatie achter het dollarteken staat en typ vervolgens het volgende om de map te wijzigen in de hoofdbroncodemap (zie afbeelding 4C):
      CD "nuclei_counter"
    8. Typ op de volgende opdrachtregel de onderstaande opdrachtregel. Vervang het nummer na Python door het juiste versienummer als u een andere versie dan 3 gebruikt. Druk vervolgens op Enter (zie afbeelding 4C):
      python3 count_nuclei.py --img_dir "pad/naar/afbeeldingen" --output_dir "pad/naar/uitvoer" --save_images --output_count_filename "results.csv"
      waarbij pad/naar/afbeeldingen het bestandspad is naar de map met afbeeldingen die moeten worden geanalyseerd (stap 1.14); Path/To/Output is het bestandspad naar de map waar het .csv bestand moet worden opgeslagen (standaard naar de huidige werkmap als deze niet is opgegeven); En results.csv is de bestandsnaam waarin de resulterende tellingen worden opgeslagen (indien niet opgegeven, is de uitvoerbestandsnaam standaard ingesteld op count_results.csv).
      OPMERKING: Aanhalingstekens zijn nodig in de opdrachtregel. Zorg ervoor dat er geen spaties na aanhalingstekens voor het bestandspad staan. Het Python-script leest de bestanden in het opgegeven bestandspad en voert het programma voor het tellen van kernen uit voor alle afbeeldingen in de map (zie Figuur 4C). De resulterende tellingen worden opgeslagen in de resultaten .csv bestand op de opgegeven locatie.
    9. Wanneer de volgende opdrachtregel verschijnt, is de verwerking voltooid (zie afbeelding 4C). De contouren en de resultatenspreadsheet zijn nu beschikbaar op de locatie die is opgegeven als de uitvoermap in stap 3.4.8 (d.w.z. pad/naar/uitvoer).
  2. Inspecteer de contouren visueel om de kwaliteit van de telling te controleren. De resultaten kunnen nu worden gebruikt om gegevens te normaliseren zoals beschreven in sectie 4.
    OPMERKING: Als contouren kernen lijken te hebben gemist (bijv. kernen lijken te zwak) of groepen kernen in een enkel item lijken te clusteren (bijv. overbelicht beeld, te veel achtergrond, artefacten), moet de gebruiker Tabel 1 raadplegen en mogelijk terugkeren naar Sectie 1 om de beeldacquisitie te optimaliseren voordat hij verder gaat met Sectie 4.

figure-protocol-4
Afbeelding 4: Voorbeelden van belangrijke onderdelen van de workflow voor sectie 3 met behulp van Mac OS. Na het downloaden van de code (zie afbeelding 3A), (A) uitpakken door op het zip-bestand te klikken (weergegeven in blauw) en de gewenste bestemming in te stellen. (B) Na het openen van de terminal, voorbeelden van commando's voor stap 3.4.4 (het wijzigen van de directory naar de coderepository) en 3.4.5 (het installeren van pip). (C) Voorbeelden van opdrachten voor de stappen 3.4.7 en 3.4.8, een voortgangsbalk na uitvoering van stap 3.4.8 en de opdrachtregel die de voltooiing in stap 3.4.9 aangeeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Tellingen gebruiken om experimentele gegevens te normaliseren

  1. Open het results.csv bestand dat elk beeld koppelt aan de kwantificering van kernen die is bepaald met behulp van het geautomatiseerde programma.
  2. Bepaal de methode van normalisatie: 1) beeld-voor-beeld (bijv. als meerkleurige fluorescentiemicroscopie), 2) normaliseer gegevens als een verhouding van het gemiddelde aantal kernen per monster versus een referentiemonster (of toestand), 3) normaliseer naar het aantal kernen per monster (bijv. extrapoleer het totale aantal kernen naar het monstergebied). Aanbevelingen voor de methode van normalisatie staan in de sectie Discussie.
    1. Als normalisatie per afbeelding wordt uitgevoerd, deelt u eenvoudig de experimentele gegevens voor elk beeld door het aantal kernen voor dat beeld.
    2. Als u gegevens wilt normaliseren als een verhouding, volgt u de onderstaande stappen.
      1. Bereken het gemiddelde aantal kernen per beeld voor monsters waarbij meerdere beelden zijn verzameld voor een enkele replicaat (bijv. 10-15 beelden gemaakt uit een enkele put in een plaat met 6 putjes). Deze kerntellingen worden beschouwd als het aantal cellen, uitgaande van eenkernige cellen of een aantal cellen dat samensmelt in meerkernige cellen (zoals met myotubes).
      2. Selecteer een referentiemonster of een referentievoorwaarde (bijvoorbeeld het gemiddelde aantal van alle monsters van de controlevoorwaarde) en noteer het aantal.
      3. Deel het aantal voor alle monsters door dat aantal referenties, wat resulteert in een normalisatiewaarde. Als er een referentiemonster is gebruikt, gebruikt u de normalisatiewaarde voor het referentiemonster als 1.
        OPMERKING: Als een referentievoorwaarde werd gebruikt, zou de gemiddelde normalisatiewaarde voor de toestand nu 1 zijn. Monsters met minder kernen dan de referentie (d.w.z. minder dicht) zullen normalisatiewaarden hebben die kleiner zijn dan 1, en monsters met meer kernen dan de referentie (d.w.z. dichter) zullen normalisatiewaarden hebben die groter zijn dan 1.
      4. Deel de experimentele gegevens voor elk putje door de bijbehorende berekende normalisatiewaarde.
    3. Volg de onderstaande stappen om gegevens te normaliseren naar het aantal kernen per monster.
      1. Bereken het gemiddelde aantal kernen per beeld voor monsters waarbij meerdere beelden zijn verzameld voor een enkele replicaat (bijv. 10-15 beelden gemaakt uit een enkele put in een plaat met 6 putjes). Deze tellingen worden beschouwd als het aantal cellen, uitgaande van eenkernige cellen, of het aantal cellen dat samengesmolten is in cellen met meerdere kernen (zoals met myotubes).
      2. Bepaal het oppervlak van het objectglaasje (dekglaasje), de put of de schaal waarvan de gegevens zijn afgeleid. Deze informatie is te vinden in de sectie specificaties op productwebsites.
      3. Bepaal het gebied van elke vastgelegde afbeelding. Deze informatie is vaak beschikbaar als metadata in de beeldvormings- of analysesoftware.
      4. Zorg ervoor dat het monsteroppervlak en het beeldgebied in dezelfde eenheden worden uitgedrukt (bijv.mm 2). Als dit niet het geval is, converteert u naar de gewenste eenheid.
      5. Bereken het totale aantal voor elk monster met behulp van de volgende vergelijking:
        TC = WISSELSTROOM • (SA/IA)
        waarbij TC het totale aantal is, AC het gemiddelde aantal, SA het oppervlak en IA het beeldgebied.
      6. Deel experimentele gegevens door de corresponderende TC voor het monster.
  3. Normaliseer experimentele gegevens en gebruik deze indien nodig voor statistische analyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Elke batch-image produceert: 1) een set afbeeldingsbestanden met toegepaste contouren die de contouren van geïdentificeerde kernen tonen (Figuur 5), en 2) een .csv-bestand (spreadsheet) waarin de bestandsnamen van afbeeldingen en de bijbehorende tellingen worden gekoppeld. Door de contouren te bekijken, kan de gebruiker de kwaliteit van de telling visueel beoordelen. In het bijzonder moeten afbeeldingen die zijn verkregen vol...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Ons programma voor het kwantificeren van kernen heeft verschillende voordelen ten opzichte van bestaande opties: het vereist slechts minimale technologische vaardigheden, is gevalideerd voor de specifieke taak van het kwantificeren van kernen en is open-source; Dit laatste overwint kostengerelateerde barrières. Uiteindelijk biedt dit programma cel- en moleculair biologen een extra optie om snel en nauwkeurig kernen te kwantificeren in beelden die zijn vastgelegd met behulp van fluorescen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Financiering voor dit werk werd verstrekt door de National Institutes of Health / National Institute on Aging (R01AG084597; DEL en HYL) en door startfondsen van Texas Tech University (DEL). De auteurs willen de Texas Tech University Undergraduate Research Scholars en TrUE Scholars-programma's bedanken voor het verlenen van financiële steun aan de niet-gegradueerde onderzoekers die aan dit werk hebben bijgedragen (REH, MRD, CJM, AKW). We danken ook Drs. Lauren S. Gollahon en Michael P. Massett voor het genadig delen van hun laboratoriumruimte en apparatuur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Computer met toegang tot resultatenbestand van methode 2 of 3--Zie stap 2.6 (voor Methode 2) of stap 3.3.9 of 3.4.9 (voor Methode 3)
Computer met internettoegang, moderne browser--bijv. Google Chrome
Computer met internettoegang, moderne browser en Windows OSVariesVariesVoor Mac, Linux of andere OS, gebruik Methode 3
Computer met software voor beeldvastleggingZeissAxioVisionAndere software is acceptabel; moet compatibel zijn met de fluorescentiemicroscoop
Locatie van het bestand voor output (resultatenspreadsheet en beeldcontouren)--Kan een nieuwe, lege map zijn
FluorescentiemicroscoopZeissAxiovert 200MAndere fluorescentiemicroscopen zijn acceptabel; moet zijn uitgerust met geschikte filter cubes, gewenste objectief en camera 
Map met alle afbeeldingen die gequantificeerd moeten worden--Zie stap 1.12
Python versie 3.10 of hogerPython-Beschikbaar voor gratis download en installatie op https://www.python.org/downloads/ 
Monsters om te beeldvormen--Gefixeerd of levend, gekleurd of contragekleurd met fluorescente DNA-kleurstof
SpreadsheetsoftwareMicrosoftExcelVergelijkbare spreadsheetsoftware is ook acceptabel

Referenties

  1. Chacko, B. K., et al. The bioenergetic health index: A new concept in mitochondrial translational research. Clin Sci. 127 (6), 367-373 (2014).
  2. Desousa, B. R., et al. Calculation of ATP production rates using the Seahorse XF Analyzer. EMBO Rep. 24 (10), e56380(2023).
  3. Rayamajhi, M., Zhang, Y., Miao, E. A. detection of pyroptosis by measuring released lactate dehydrogenase activity. Inflammasome. 1040, 85-90 (2013).
  4. Baskic, D., Popovic, S., Ristic, P., Arsenijevic, N. Analysis of cycloheximide-induced apoptosis in human leukocytes: Fluorescence microscopy using annexin V/propidium iodide versus acridin orange/ethidium bromide. Cell Biol Int. 30 (11), 924-932 (2006).
  5. Duplanty, A. A., Siggins, R. W., Allerton, T., Simon, L., Molina, P. E. Myoblast mitochondrial respiration is decreased in chronic binge alcohol administered simian immunodeficiency virus-infected antiretroviral-treated rhesus macaques. Physiol Reps. 6 (5), e13625(2018).
  6. Levitt, D. E., Bourgeois, B. L., Rodríguez-Graciani, K. M., Molina, P. E., Simon, L. Alcohol impairs bioenergetics and differentiation capacity of myoblasts from Simian immunodeficiency virus-infected female Macaques. Int J Mol Sci. 25 (4), 2448(2024).
  7. Larsen, T. A., Goodsell, D. S., Cascio, D., Grzeskowiak, K., Dickerson, R. E. The structure of DAPI bound to DNA. J Biomol Str Dyn. 7 (3), 477-491 (1989).
  8. Bazhulina, N. P., et al. Binding of Hoechst 33258 and its derivatives to DNA. J Biomol Str Dyn. 26 (6), 701-718 (2009).
  9. Njoh, K. L., et al. Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells. Cytomet A. 69A (8), 805-814 (2006).
  10. Hamada, S., Fujita, S. DAPI staining improved for quantitative cytofluorometry. Histochemistry. 79 (2), 219-226 (1983).
  11. Levitt, D. E., Chalapati, N., Prendergast, M. J., Simon, L., Molina, P. E. Ethanol-impaired myogenic differentiation is associated with decreased myoblast glycolytic function. Alcohol Clin Exp Res. 44 (11), 2166-2176 (2020).
  12. Levitt, D. E., et al. Skeletal muscle bioenergetic health and function in people living with HIV: association with glucose tolerance and alcohol use. Am J Physiol Regul, Integ Comp Physiol. 321 (5), R781-R790 (2021).
  13. Levitt, D. E., Adler, K. A., Simon, L. HEMA 3 staining: A simple alternative for the assessment of myoblast differentiation. Curr Prot Stem Cell Biol. 51 (1), e101(2019).
  14. Solem, J. E. Programming computer vision with Python. , O'Reilly. Sebastopol, CA. (2012).
  15. Delery, E. C., Levitt, D. E., Amedee, A. M., Molina, P. E., Simon, L. High fat, high sucrose diet promotes increased expression of ACE2 receptor in the SIV-infected host: implications for SARS-CoV-2 infection. Front Nutrition. 11, 1458106(2024).
  16. Corrà, M. F., et al. Advantages of an automated method compared with manual methods for the quantification of intraepidermal nerve fiber in skin biopsy. J Neuropathol Exp Neurol. 80 (7), 685-694 (2021).
  17. Neves, K., et al. The reliability of the isotropic fractionator method for counting total cells and neurons. J Neurosci Meth. 326, 108392(2019).
  18. Tiong, K. H., et al. QuickCount: a novel automated software for rapid cell detection and quantification. BioTechniques. 65 (6), 322-330 (2018).
  19. Koo, T. K., Li, M. Y. A guideline of selecting and reporting intraclass correlation coefficients for reliability research. J Chiropractic Med. 15 (2), 155-163 (2016).
  20. Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. P. Normalization of Agilent Seahorse XF Data by in situ. cell counting using a BioTek Cytation 5. , https://www.agilent.com/cs/library/applications/5991-7908EN.pdf 5991-7908 (2017).
  21. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to imageJ: 25 years of image analysis. Nat Meth. 9 (7), 671-675 (2012).
  22. O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. J Vis Exp. (117), e54719(2016).
  23. Grishagin, I. V. Automatic cell counting with ImageJ. Anal Biochem. 473, 63-65 (2015).
  24. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  25. Tollemar, V., et al. Quantitative chromogenic immunohistochemical image analysis in cellprofiler software. Cytometry A. 93 (10), 1051-1059 (2018).
  26. Chazotte, B. Labeling nuclear DNA using DAPI. Cold Spring Harbor. 2011 (1), (2011).
  27. Cole, R. Live-cell imaging. Cell Adhesion Migrat. 8 (5), 452-459 (2014).
  28. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified Annexin V/Propidium Iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. J Vis Exp. (50), e2597(2011).
  29. Hernandez, J. J., Beaty, D. E., Fruhwirth, L. L., Lopes Chaves, A. P., Riordan, N. H. Dodging COVID-19 infection: low expression and localization of ACE2 and TMPRSS2 in multiple donor-derived lines of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells. J Transl Med. 19 (1), 149(2021).
  30. Bourgeois, B. L., et al. Extracellular vesicle miR-206 improves chronic binge alcohol-mediated decreased myoblast differentiation in SIV-infected female macaques. Am J Physiol Cell Physiol. 327 (6), C1626-C1637 (2024).
  31. Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Analysis of cell viability by the lactate dehydrogenase assay. Cold Spring Harbor. 2018 (6), (2018).
  32. Hsu, S., et al. Effects of everolimus on macrophage-derived foam cell behavior. Cardiovasc Revasc Med Including Mol Intervent. 15 (5), 269-277 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Geautomatiseerde objecttellingfluorescente DNA-kleuringenbeeldgebaseerde celanalysedatanormalisatiePython computer visioncelassaysopen-source workflowcel telling
Computer vision-bibliotheken gebruiken om de kwantificering van kernen te stroomlijnen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.