Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Snelle uitputting van niermacrofagen met behulp van menselijke CD59/Intermedilysin Cell Ablation Tool

894 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67957

⸱

9 mei 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Comparative Pathology, Tulane National Primate Research Center, 2Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt een protocol gerapporteerd voor de selectieve ablatie van renale macrofagen om hun regeneratie te bestuderen met behulp van de menselijke CD59/intermedialysine-celablatietool. Deze methode is ook toepasbaar voor het bestuderen van de functie en regeneratie van de andere celpopulaties in de nieren, lever en vetweefsel.

Samenvatting

Renale macrofagen (RM's) zijn essentieel voor de gezondheid van de nieren, het orkestreren van immuunbewaking, weefselhomeostase en reacties op letsel. Eerder rapporteerden we het gebruik van een humaan CD59 (hCD59)/intermedialysine (ILY) celablatie-instrument om het specifieke lot, de dynamiek en de niches van RM's van beenmerg of embryonale oorsprong te bestuderen. RM's zijn afkomstig van van dooierzakjes, foetale levermonocyten en van beenmerg afgeleide monocyten en worden op volwassen leeftijd in stand gehouden door lokale proliferatie en rekrutering van circulerende monocyten. Hier rapporteren we een gedetailleerd protocol voor de selectieve ablatie van RM's om hun regeneratie te bestuderen, inclusief 1) generatie en karakterisering van de Cre-induceerbare expressie van hCD59 in RM's bij muizen, 2) zuivering van ILY en karakterisering van ILY activiteit, 3) inductie van hCD59-expressie op RM's in samengestelde muizen, en 4) karakterisering van regeneratie na ILY-gemedieerde RM-ablatie. ILY put specifiek en snel RM's uit in samengestelde muizen, met efficiënte macrofaagablatie binnen 1 dag na toediening van ILY De regeneratie van renale macrofagen begon op dag 3 na de ablatie, met ~88% herstel op dag 7. Dit model biedt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de biologie van macrofagen en kan worden gebruikt voor het selectief ableren van andere celpopulaties in de nieren, lever en vetweefsels om hun functie en regeneratie te onderzoeken.

Inleiding

Renale macrofagen (RM's) zijn essentiële immuuncellen die de nierhomeostase behouden, immuunresponsen reguleren en weefselherstel na letsel bevorderen. Ze vervullen een verscheidenheid aan functies, waaronder fagocytose, antigeenpresentatie en de orkestratie van zowel inflammatoire als ontstekingsremmende reacties 1,2,3. Afhankelijk van de lokale omgeving kunnen RM's polariseren in pro-inflammatoire (M1) of ontstekingsremmende (M2) fenotypes, waardoor letsel verergert of genezing wordt vergemakkelijkt 4,5,6. Ontregeling van RM's is betrokken bij het ontstaan en de progressie van acuut nierletsel (AKI) en chronische nierziekte (CKD), waardoor ze cruciale spelers zijn op het gebied van niergezondheid en pathologie 7,8. RM's komen voort uit verschillende bronnen, waaronder van dooierzakjes afgeleide macrofagen tijdens de embryogenese, foetale levermonocyten en van beenmerg afgeleide monocyten op volwassen leeftijd. RM's breiden zich uit en rijpen parallel aan de niergroei postnataal, voornamelijk afkomstig van foetale levermonocyten vóór de geboorte, met zelfbehoud tot in de volwassenheid aangevuld met perifere monocyten9. Bij volwassenen worden circulerende monocyten naar de nier gerekruteerd door homeostatische of verwondingssignalen, waarbij ze onder lokale micro-omgevingsinvloeden differentiëren tot macrofagen. Het onderhoud van RM wordt in stand gehouden door lokale proliferatie en periodieke aanvulling van circulerende monocyten 9,10,11,12.

We hebben eerder het gebruik van het menselijke CD59 (hCD59)/intermedialysine (ILY) celablatiesysteem gedemonstreerd als een hulpmiddel13,14 om de verschillende lotgevallen, dynamiek en micro-omgevingsniches van RM's afgeleid van beenmerg of embryonale oorsprong te onderzoeken9. ILY lyseert menselijke cellen selectief binnen enkele seconden door poriën te vormen in gerichte celmembranen15. Deze specificiteit vloeit voort uit de exclusieve bindingsaffiniteit van ILY voor humaan CD59 (hCD59), zonder interactie of lytisch effect op cellen van andere soorten die deze receptor missen15. Op basis van dit concept hebben we een tool ontwikkeld die de snelle, voorwaardelijke en gerichte ablatie van menselijke cellen die CD59 tot expressie brengen in transgene muismodellen mogelijk maakt door de toepassing van intermedialysine (ILY)14. Om het gebruik van deze tool te vergemakkelijken, hebben we een model ontwikkeld voor voorwaardelijke en gerichte celablatie door het genereren van gefloxte STOP-CD59 knockin-muizen (ihCD59), waarbij expressie van humaan CD59 alleen optreedt na Cre-gemedieerde recombinatie13. Eerder werd het CX3CR1cre-EFP-gen gevonden dat uitsluitend tot expressie kwam op CD11bintF480hi, gedefinieerd als renale macrofagen9. Daarom gebruikten we CX3CR1CreER2+/+ lijnen om te kruisen met ihCD59-muizen om hCD59 tot expressie te brengen op renale macrofagen. We hebben met succes samengestelde muizen gegenereerd met het genotype ihCD59+/-/CX3CR1CreER+/-9 (+/-, +/+ en -/- geven respectievelijk de homozygote, hemizygote en niet-dragende transgene muizen aan). Toediening van tamoxifen bij ihCD59+/-/CX3CR1CreER+/- samengestelde muizen voorwaardelijk gelabeld en gemarkeerd met RM's door hCD59-expressie9. Na de uitputting van de RM-niche door ILY-behandeling, differentieerden perifere monocyten onmiddellijk in van beenmerg afgeleide RM's, waardoor de niche effectief werd herbevolkt zoals eerder beschreven in9. Deze regeneratie was kritisch afhankelijk van de CX3CR1/CX3CL1-signaleringsas, wat de essentiële rol ervan in zowel het onderhoud als het herstel van deRM-populatie 9 onderstreept. We tonen ook aan dat RM's van embryonale oorsprong vanwege hun verschillende glycolytische capaciteiten een hoger vermogen hebben om immuuncomplexen op te ruimen en gevoeliger zijn voor immuunuitdagingen dan van beenmerg afgeleide RM's9.

We presenteren een gedetailleerd protocol voor de selectieve ablatie van RM's om hun regeneratie te onderzoeken met behulp van Cre-induceerbare hCD59 (ihCD59)-gemedieerde snelle celablatie na toediening van ILY. Injectie van ILY veroorzaakte de gerichte ablatie van RM's die voorwaardelijk en specifiek hCD59 tot expressie brengen in CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/- samengestelde muizen. Na ablatie volgden we de dynamische veranderingen van macrofagen met behulp van flowcytometrie en vonden we een snelle uitputting van macrofagen gevolgd door de regeneratie van RM's. Recombinant ILY werd tot expressie gebracht in E. coli BL21(DE3)-cellen en gezuiverd met behulp van nikkel-NTA-affiniteitschromatografie. De zuiverheid en functionaliteit van het recombinante ILY werden bevestigd door SDS-PAGE, spectrofotometrie en een hemolysetest, waarbij de karakteristieke cholesterolafhankelijke cytolysine-activiteit werd aangetoond. We gebruikten ILY om de RM's in de muizen uit te putten, waardoor een efficiënte macrofaagablatie werd bereikt binnen 1 dag na toediening van ILY De regeneratie van renale macrofagen begon op dag 3 na de ablatie, met ~85% herstel op dag 7. De gegevens suggereren dat regeneratie voornamelijk wordt aangedreven door de rekrutering van monocyten. Dit model biedt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de biologie van macrofagen en heeft therapeutisch potentieel voor de gerichte manipulatie van macrofaagpopulaties bij nierziekten. De ihCD59/ILY celablatietool kan worden gebruikt om de celfunctie en regeneratie in de nier, lever, vetweefsel en andere organen te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De protocollen voor dieronderzoek zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Tulane University, School of Medicine (protocolnummer 1482). De experimentele muizen, Cx3cr1CreER+/+ en ihCD59+/+, in de leeftijd van 10-12 weken en met een gewicht van 25-30 g, werden gehuisvest onder specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden in de dierenfaciliteit van de universiteit. Alle procedures met nierisolatie werden uitgevoerd in een steriele omgeving, waarbij onderzoekers handschoenen en gezichtsmaskers droegen om besmetting te voorkomen. Details over de reagentia en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, zijn te vinden in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van dieren

  1. Verkrijg CX3CR1CreER+/+muizen van The Jackson Laboratory. Huisvesting van de muizen aan de Tulane University School of Medicine (SOM) in een specifieke pathogeenvrije (SPF) faciliteit. Houd de dieren in een licht/donker-cyclus van 12 uur met gecontroleerde omgevingsomstandigheden.
  2. Gebruik voor de fokkerij eerder gegenereerde ihCD59+/+ muizen met een C57BL/6 genetische achtergrond. Kruis homozygote CX3CR1CreER+/+ muizen (deficiënt in CX3CR1-expressie) met ihCD59+/- muizen om de volgende nakomelingengenotypen te produceren: CX3CR1CreER+/-/ihCD59-/-en CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/-.
  3. Zorg ervoor dat heterozygote CX3CR1CreER+ -muizen functionele CX3CR1-expressie behouden, terwijl homozygote CX3CR1CreER+/+ -muizen CX3CR1-deficiëntie hebben door flowcytometrieanalyse met anti-CX3CR1-antilichaam9.

2. ILY productie (afgeleid van14,15 )

  1. Dag 0
    1. Haal bevroren voorraad op van de ILY bacteriestam BL21-DE3-RIPL met His-gelabelde ILY sequenties in pTrcHis-A plasmide (Aanvullende Figuur 1) bewaard bij -80 °C. Inoculeer 10 μL van de bacterievoorraad in 40 μL Luriabouillon (LB) medium dat ampicilline bevat in een concentratie van 1 μg/ml.
    2. Verdeel het geënte mengsel op een LB-agarplaat aangevuld met ampicilline (1 μg/ml). Incubeer de plaat een nacht bij 37 °C in een bacterie-incubator.
  2. Dag 1
    1. Selecteer zes individuele kolonies uit de LB-agarplaat. Inoculeer elke kolonie in 3,5 ml LB-medium dat ampicilline bevat. Incubeer de culturen een nacht bij 37 °C.
  3. Dag 2
    1. Breng elke startercultuur van 3,5 ml over in 250 ml LB-medium aangevuld met ampicilline. Incubeer de culturen gedurende 3 uur bij 37 °C en schud ze op 230 x g om bacteriegroei mogelijk te maken.
    2. Voeg na 3 uur isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe uit een stockoplossing van 1 M (bewaard bij -20 °C) in een verdunning van 1:1000 om een uiteindelijke concentratie van 1 mM te bereiken. Ga nog 4 uur door met de incubatie om de eiwitexpressie te induceren.
    3. Weeg een lege centrifugefles en noteer het gewicht. Breng ongeveer 250 ml van de geïnduceerde cultuur over in de centrifugefles.
    4. Pellet de cellen door ze 15 minuten bij 4 °C te centrifugeren bij 10.000 x g . Gooi het bovenstaande weg en weeg vervolgens de fles met de pellet. Bereken het gewicht van de pellet door het gewicht van de lege fles af te trekken van het totale gewicht na centrifugeren.
    5. Bewaar de bacteriekorrel bij -20 °C voor latere extractie en zuivering van ILY.
  4. Dag 3 : Extractie en zuivering van ILY
    1. Bereid de lysisbuffer voor door 30 ml Bug Buster Protein Extraction Reagens te combineren met 30 μl benzonasenuclease (1200 Kunitz-eenheden) en 0,9 μl lysozym (10.000 eenheden enzymatische activiteit) in een centrifugebuis van 50 ml.
    2. Meng de oplossing voorzichtig om ervoor te zorgen dat de lysisbuffer homogeen is. Voeg de voorbereide lysisbuffer toe aan de bacteriekorrel (2-5 g). Draai het mengsel grondig gedurende 30-60 s om de bacteriële cellen volledig te suspenderen.
    3. Verdeel de geresuspendeerde oplossing gelijkmatig over twee centrifugebuisjes van 50 ml. Plaats de buizen op ijs en incubeer gedurende 30-90 minuten. Schud tijdens de incubatie de buizen voorzichtig met behulp van een orbitale shaker en vortex kort om de 5-10 minuten gedurende 10-15 s om de cellyse te verbeteren.
    4. Centrifugeer de lysaten na de incubatie bij 4.900 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    5. Was de kolom grondig met kraanwater en gebruik een pipetpunt van 1 ml om eventuele resterende hars van eerder gebruik te verwijderen.
    6. Spoel de kolom af met 70% ethanol om deze te ontsmetten. Was de kolom 2x-3x met koude ddH2O om eventuele resterende ethanol te verwijderen. Plaats de zuil in de houder.
    7. Voeg 6-10 ml koude ddH2O toe om de kolom verder te wassen en in evenwicht te brengen voor zuivering. Voeg ongeveer 3 ml harsparels toe aan de kolom. Sluit de kolom aan op een slangenpomp die is ingesteld op een snelheid van 30.
    8. Voeg 10 ml koude ddH2O toe om de hars volledig te suspenderen en voor te bereiden op eiwitbinding. Was de harskorrels met 15 ml 1x oplaadbuffer om de hars voor te bereiden op eiwitbinding.
    9. Verzamel het bacteriële lysaatsupernatans na centrifugatie in een verse buis en zorg ervoor dat de pellet wordt weggegooid. Filtreer het bovenstaande met behulp van een filter van 0,45 μm met een spuit om eventueel achtergebleven cellulair vuil te verwijderen.
    10. Laat 20-25 ml van het gefilterde bacteriële lysaat in drie afzonderlijke rondes door de kolom lopen. Verzamel na elke doorgang 20 μL van de doorstroom en label deze als PE voor latere meting van de optische dichtheid (OD).
    11. Was de kolom met 20-30 ml bindbuffer om ongebonden eiwitten te verwijderen. Was de kolom met 20-30 ml wasbuffer. Verzamel 20 μL van de wasfractie voor OD-meting.
    12. Elueer het gebonden eiwit door 10-20 ml elutiebuffer toe te voegen. Begin na 3-4 minuten met het verzamelen van de elutie met behulp van microcentrifugebuisjes. Verzamel ongeveer 1 ml per tube en vul 15-17 tubes.
    13. Meet de absorptie van elke elutiefractie bij A280 met behulp van een spectrofotometer. Gebruik de elutiebuffer als blanco tijdens A280-metingen. Verzamel de buisjes met een dramatisch verhoogde extinctie bij A280, omdat ze het His-gelabelde ILY-eiwit bevatten dat meestal in fracties rond buis 13 wordt aangetroffen.
    14. Bewaar de elutiefracties (of buisjes) die het Ily-eiwit bevatten bij 4 °C. Ga de volgende dag verder met verdere stappen om een optimale eiwitstabiliteit te garanderen.
      OPMERKING: Voer alle stappen uit op ijs of bij 4 °C waar mogelijk om de eiwitintegriteit te behouden.
  5. Dag 4: Verwijdering van endotoxinen uit de elutie
    1. Spoel de endotoxine-verwijderende harskolom af met 6-10 ml ultrazuiver water. Druk voorzichtig op de kolom om de stroom te regelen.
    2. Spoel de kolom met 10 ml 1% natriumdeoxycholaatoplossing (vers gemaakt of niet ouder dan 1 maand) om gebonden endotoxinen te verwijderen. Spoel de kolom opnieuw af met 6-10 ml ultrazuiver water om eventueel achtergebleven wasmiddel te verwijderen.
    3. Breng het voorbereide eiwitmonster aan op de harskolom. Incubeer het monster gedurende 1 uur in de kolom bij kamertemperatuur (RT) om een optimale endotoxinebinding mogelijk te maken.
    4. Verzamel de initiële doorstroomfractie. Voeg ddH2O toe aan de kolom voor verdere elutie en verzamel geëlueerde fracties in ongeveer 10 buisjes (1 ml per buis).
    5. Bewaar de harskolom in 25% ethanol bij 4 °C voor toekomstig gebruik. Meet de optische dichtheid (OD) van de geëlueerde eiwitmonsters om de opbrengst te kwantificeren. Verwacht ongeveer 50%-70% van het totale eiwit van de eerste elutiebatch te herstellen.
  6. Dag 5-6: Dialyse
    1. Bereid 2 L dialysebuffer voor door 1600 ml gedestilleerd, gedeïoniseerd water (ddH2O) te autoclaveren. Voeg 200 ml 10x PBS, 200 ml glycerol en 3,5115 g MES (2-(N-morfolino) ethaansulfonzuur) toe aan het geautoclaveerde water.
    2. Roer het mengsel met een magnetische roerstaaf totdat alle reagentia volledig zijn opgelost. Bewaar de resulterende buffer bij 4 °C.
    3. Voeg de opgeslagen elutiefracties toe aan de dialysekit en verwijder vervolgens met een naald lucht uit de dialysekit. Dialyseer de eiwitoplossing met behulp van de dialysekit gedurende 24 uur bij 4 °C met een roersnelheid die is ingesteld op ongeveer 2.
    4. Configureer de dialysekit om ervoor te zorgen dat deze volledig is ondergedompeld in de buffer. Vervang de dialysebuffer in de dialysekit de volgende dag door een verse dialysebuffer in een container van 2 L. Ga nog 24 uur door met de dialyse.
    5. Breng de hele oplossing, inclusief eventuele witte neerslag, voorzichtig over in een steriele buis om het Ily-eiwit, dat kan aggregeren, te behouden. Concentreer het Ily-eiwit met behulp van een centrifugaalfiltereenheid, volgens de instructies van de fabrikant voor centrifugeren.
    6. Verdeel het geconcentreerde ILY eiwit in porties van 200 μL in steriele buisjes. Label elke tube met de datum en naam. Bewaar de aliquots bij -80 °C voor toekomstig gebruik in gelelektroforese- en hemolysetests.

3. ILY karakterisering door SDS-PAGE elektroforese

  1. Bereid de MOPS SDS-loopbuffer (1x) voor door de lopende buffer (20x) te verdunnen met ddH2O.
  2. Bereid de monsterbuffer voor in een zuurkast door 90 μL 6x laadbuffer te mengen met 10 μL β-mercaptoethanol (β-ME). Meng de oplossing grondig om volledige homogenisatie te garanderen.
  3. Combineer het voorbereide monster met de laadbuffer om een eindvolume van 30 μl te verkrijgen. Ontdooi de monsters en draai ze krachtig om een volledige menging te garanderen.
  4. Verwarm de monsters gedurende 5 minuten op 95 °C om de eiwitten te denatureren. Laad de monsters op een 4%-20% SDS-PAGE-gel. Laat de elektroforese gedurende 90 minuten op een constante spanning van 80 V draaien.
  5. Open de gelcassette voorzichtig en dompel de gel 5 minuten onder in ddH2O. Herhaal de wasstap 2x met behulp van een shaker.
  6. Kleur de gel met Coomassie Brilliant Blue gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT). Was de gel gedurende 30 minuten in ddH2O. Vervang het water door vers ddH2O en incubeer de gel op een shaker gedurende een nacht tot 3 dagen voor volledige kleuring.
  7. Maak een foto van de gekleurde gel met een camera (Figuur 1A). Analyseer de gel met behulp van ImageJ-software voor kwantitatieve en kwalitatieve beoordelingen.

4. Hemolytische test voor ILY activiteit

  1. Ontdooi de opgeslagen ILY (Intermedilysin) monsters volledig bij kamertemperatuur. Draai de ontdooide monsters grondig om homogeniteit te garanderen, aangezien ILY bij ontdooien kan aggregeren.
  2. Zet een plaat met 96 putjes op voor seriële verdunningen. Voeg 160 μL van de ILY stockoplossing (26,7 ng/μL) toe aan het eerste putje. Voeg 80 μL 1x PBS toe aan elk van de volgende putjes in dezelfde rij of kolom.
  3. Breng 80 μl van de ILY oplossing over van het eerste putje naar het tweede putje. Meng grondig door op en neer te pipetteren om ervoor te zorgen dat de oplossing homogeen is. Breng 80 μL over van het tweede putje naar het derde putje en meng grondig.
  4. Herhaal dit proces voor elk putje en breng 80 μl over van het vorige putje naar het volgende totdat het gewenste aantal verdunningen is bereid. Nadat u 80 μl naar de laatste put hebt overgebracht, gooit u 80 μl uit die put weg om consistente volumes over de plaat te garanderen.

5. Preparaat van menselijke rode bloedcellen (RBC's)

  1. Zuig 1-2 ml vers menselijk bloed op in een buisje met een antistollingsmiddel, zoals EDTA. Centrifugeer het bloed bij kamertemperatuur op 3.000 x g gedurende 5 min.
  2. Gooi het bovenstaande weg en was de menselijke RBC-pellet 2x-3x met PBS totdat het bovenstaande helder is. Verdun de gewassen menselijke rode bloedcellen door 10 μl rode bloedcellen toe te voegen aan 900 μl 1x PBS om een verdunning van 1:100 te verkrijgen.
  3. Voeg 10 μL van de verdunde menselijke rode bloedcellen toe aan elk putje. Voeg 30 μl van de serieel verdunde Ily-oplossing van de verdunningsplaat toe aan elk putje. Voeg 160 μL 1x PBS toe om het uiteindelijke volume op 200 μL per putje te brengen (startconcentratie: 4 ng/μL).
  4. Voeg 10 μl van de verdunde menselijke rode bloedcellen toe aan de controleputjes. Voeg 190 μL water of 1x PBS toe aan de controleputjes voor negatieve controles. Meng de platen door er zachtjes op te tikken.
  5. Incubeer de platen gedurende 30 minuten bij 37 °C om hemolyse mogelijk te maken. Centrifugeer de platen gedurende 5 minuten op 3.000 x g om intacte menselijke rode bloedcellen te pelleteren.
  6. Breng voorzichtig 100 μl van het bovenstaande uit elk putje over op een nieuwe plaat met 96 putjes met platte bodem. Meet de absorptie van de supernatanten bij 405 nm met behulp van een microplaatlezer.
  7. Bereken de hemolytische activiteit van ILY door de absorptiewaarden van de monsters te vergelijken met de controle16.

6. Tamoxifenbehandeling, RM-uitputting en regeneratie

  1. Verwarm maïsolie voor op 42 °C. Los 100 mg tamoxifen op in 5 ml voorverwarmde maïsolie om een stockoplossing te bereiden met een concentratie van 20 mg/ml.
  2. Dien tamoxifen intraperitoneaal (i.p.) toe aan 10-12 weken oude mannelijke CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/- muizen in een dosis van 100 μg/g lichaamsgewicht. Herhaal de tamoxifen-injectie gedurende 3 opeenvolgende dagen.
  3. Wacht 15 dagen na de laatste tamoxifen-injectie om Cre-gemedieerde hCD59-expressie mogelijk te maken.
  4. Injecteer een enkele dosis intermedilysine (ILY) intraveneus in CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/- muizen en CX3CR1CreER+/-/ihCD59-/- nestgenootcontroles in een dosis van 120 ng/g lichaamsgewicht.
  5. Bewaak en bevestig RM-ablatie en daaropvolgende regeneratie door flowcytometrie uit te voeren 1, 3 en 7 dagen na toediening van ILY17.

7. Euthanasie bij muizen

  1. Plaats het dier in een geschikte kamer en stel het bloot aan isofluraan in overeenstemming met de IACUC-protocollen. Controleer de anesthesie door te controleren op de afwezigheid van reflexen, zoals de terugtrekkingsreflex van het pedaal.
  2. Zodra de muis volledig verdoofd is en niet meer reageert, voert u cervicale dislocatie uit om euthanasie te garanderen. Bevestig euthanasie door de afwezigheid van reflexen te verifiëren, zoals de terugtrekkingsreflex van het pedaal.
  3. Maak met een steriel scalpel een incisie in de middellijn van ongeveer 2 cm op de buik en trek de huid voorzichtig terug om de borstholte bloot te leggen. Open de ribbenkast langs het borstbeen met een chirurgische schaar met stompe punt om het hart bloot te leggen.
  4. Steek een 21G-23G-naald in de linker hartkamer. Begin met perfusie met 10-20 ml koude PBS om het bloed weg te spoelen.
  5. Snijd het rechter atrium open om het bloed uit de bloedsomloop te laten wegvloeien. Ga door met perfusie totdat de nieren bleek lijken, wat wijst op een effectieve bloedklaring.
  6. Plaats de nieren tegen de dorsale lichaamswand. Scheid de nieren voorzichtig van de omliggende weefsels met behulp van een tang en een schaar. Snijd de niercapsules weg en plaats de nieren onmiddellijk in koude PBS om afbraak te voorkomen.

8. Spijsvertering van de nieren

  1. Bereid de spijsverteringsenzymcocktail voor door 9 ml HBSS (Ca/Mg-vrij), 1 ml collagenase IV (5 mg/ml) en 20 μl DNase I (10 mg/ml) te mengen. Bereid de enzymoplossing vers en bewaar deze op ijs tot gebruik.
  2. Hak de nieren in kleine fragmenten (idealiter ≤ 1 mm) met behulp van een steriele schaar in een petrischaaltje met 5 ml HBSS. Breng de nierweefselfragmenten over in buisjes van 15 ml die 10 ml van de bereide enzymoplossing bevatten.
  3. Incubeer de buisjes gedurende 30 minuten bij 37 °C en schud zachtjes om het weefsel te dissociëren. Trituleer het weefsel voorzichtig met behulp van een pipet of spuitzuiger om celklonters verder te dissociëren.
  4. Verwijder weefselresten door de celsuspensie door een celzeef van 40 μm te leiden. Centrifugeer de celsuspensie bij 650 x g gedurende 10 minuten bij 18 °C.
  5. Decanteer de buffer voorzichtig na het centrifugeren. Resuspendeer de pellet in 5 ml lysisbuffer en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om rode bloedcellen te lyseren.
  6. Was de cellen met PBS om de lysisbuffer te verwijderen. Houd de resulterende eencellige suspensie op ijs tot verder gebruik.

9. Centrifugatie met dichtheidsgradiënt

  1. Om de hematopoëtische cellen te verrijken, resuspendeert u de celpellet van de vorige wasbeurt in 10 ml oplossing met een dichtheidsgradiënt van 30%. Breng de oplossing voorzichtig aan over 3 ml oplossing met een dichtheidsgradiënt van 70% in een centrifugebuis.
  2. Centrifugeer de hellingshoek bij 500 x g gedurende 30 minuten zonder te remmen. Verzamel na het centrifugeren voorzichtig de interfaselaag tussen de 30%- en 70%-oplossingen; Deze laag bevat de verrijkte enkelvoudige cellen.
  3. Was de verzamelde cellen 2x met 10 ml PBS door telkens 10 minuten te centrifugeren op 500 x g . Resuspendeer de uiteindelijke celpellet in 1 ml FACS-buffer (1x PBS met 2% FBS) in een tube van 1,5 ml.
  4. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer onder een helderveldmicroscoop. Pas de celconcentratie aan op 2 x 106 cellen/ml.

10. Flowcytometrie kleuring, acquisitie

  1. Pas de celconcentratie aan van eencellige suspensies bereid uit nierweefsel van muizen tot 2-3 x 106 cellen/ml voor flowcytometrische analyse.
  2. Pellet de cellen in buisjes van 1,5 ml door 5 minuten te centrifugeren op 650 x g . Resuspendeer de celpellet in 1 ml FACS-buffer.
  3. Voeg anti-CD16/32-antilichaam toe in een verdunning van 1:200 om niet-specifieke Fc-receptorbinding te blokkeren. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Gebruik Aqua Live/Dead dye om levende van dode cellen te onderscheiden, volgens de instructies van de fabrikant.
  5. Kleur de cellen met voorgeconjugeerde antilichamen in een verdunning van 1:100, waaronder CD45-e450, CD11b-PE-Cy7, hCD59-PE en F4/80-BV605. Voeg de antilichaamcocktail toe aan de celsuspensie.
  6. Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker om fluoroforen te beschermen tegen fotobleken. Was de gekleurde cellen 2x met FACS-buffer (PBS met 2% foetaal runderserum) door 5 minuten te centrifugeren op 650 x g .
  7. Fixeer de cellen in 1% paraformaldehyde (PFA) gedurende 30 minuten op ijs. Was de vaste cellen 2x met FACS-buffer om achtergebleven PFA te verwijderen.
  8. Verkrijg gekleurde en gefixeerde cellen met behulp van een flowcytometer. Analyseer de gegevens met behulp van de software.
  9. Identificeer nier- en andere weefselresidente macrofagen en microglia met behulp van markers CD45, CD11b en F4/80 zoals beschreven in9 .
  10. Voer initiële gating uit om live cellen te selecteren op basis van profielen voor voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijverstrooiing (SSC). Elimineer doubletten door te gating op voorwaartse verstrooiingsgebied (FSC-A) versus voorwaartse verstrooiingshoogte (FSC-H). Sluit dode cellen uit met behulp van de kleurstof LIVE/DEAD levensvatbaarheid.
  11. Verrijk immuuncellen door gating op CD45+-populaties. Definieer nierresidente macrofagen als CD11b+F4/80++ cellen binnen de CD45+-populatie, zoals weergegeven in de poortstrategie (Figuur 2A).
  12. Definieer microglia-populaties als CD11b+CD45iⁿt-cellen (Figuur 2B). Voer gegevensverzameling uit op de flowcytometer. Voer de eindanalyse uit met behulp van de software om het flowcytometrische onderzoek te voltooien.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De zuivering van His-Tag recombinant ILY volgde hetzelfde protocol als eerder beschreven in14. ILY werd met succes tot expressie gebracht in E. coli BL21(DE3)-cellen, getransformeerd met een plasmide dat codeert voor het ILY-gen van Streptococcus intermedius. Bij inductie met IPTG was overexpressie van het doeleiwit duidelijk. Na expressie werd ILY gezuiverd met behulp van nikkel-NTA-affiniteitschromatografie, waarbij een C-terminale His-tag werd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De succesvolle expressie, zuivering en functionele validatie van His-gelabelde recombinante ILY in deze studie volgde een goed ingeburgerd protocol15. Het proces omvatte echter verschillende cruciale stappen die zorgden voor een hoge eiwitopbrengst, zuiverheid en biologische activiteit. De inductie van E. coli BL21 (DE3)-cellen met IPTG werd geoptimaliseerd om de eiwitexpressieniveaus in evenwicht te brengen en tegelijkert...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die van invloed zouden kunnen zijn geweest op het werk dat in dit manuscript wordt gerapporteerd. Geen enkele belangenconflict, met inbegrip van financiële, niet-financiële, professionele of persoonlijke banden, heeft invloed gehad op de opzet, het gedrag, de interpretatie of de presentatie van het onderzoek.

Dankbetuigingen

We betuigen onze dankbaarheid aan zowel voormalige als huidige leden van het Qin Lab voor hun bijdragen aan de ontwikkeling en verfijning van de protocollen die in dit onderzoek zijn gebruikt. We danken ook de groep van Dr. R. K. Tweten aan het Health Sciences Center van de Universiteit van Oklahoma voor het genereus verstrekken van het recombinante ILY plasmide, dat een belangrijke rol speelde in dit onderzoek. Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) via subsidie NIH 5 P51OD011104-58, R01DK129881 (X.Q.) en R21OD024931 (X.Q.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.45 µm syringe filterMilliporeSLHVR33RS
4-15% TGX Stain-Free Protein GelsBio-Rad4568084
6X Loading bufferFisher50-103-6570
70% EthanolWWR Life Science64-17-5
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing BufferGibcoA1049201
Affinity resin beadsMillipore69670
Ampicillin sodium solutionZymo ResearchA1001-5
Anti-CD11b-PE-Cy7 (Clone M1/70)Invitrogen25-0112-82
Anti-CD16/32 (FcγRIII/II, Clone 93)eBioscience48-0161-80
Anti-CD45-e450 (Clone 30-F11)eBioscience48-0451-82
Anti-F4/80-BV605(Clone BM8)BioLegend 123133
Anti-hCD59-PE (Clone OV9A2)Invitrogen12-0596-42
Aqua Live/Dead dyeInvitrogen    L34957A
Beads (resin)Millipore69670
Benzonase NucleaseMillipore70664-10KUN
BugBuster protein extraction reagentMillipore70584-4
Centrifuge for microtubesEppendorf5424
Centrifuge for tubesThermo Scientific75-001-241
Collagenase type IVWorthington Biochemical CorporationLS004188
Corn oilSigma AldrichC8267
Deoxyribonuclease (DNAse) IWorthington Biochemical CorporationLS002007
Detoxi-Gel resin columnMillipore69670
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) solutionCorning21-031-CV
EDTA tubesBD365974
FBS (Fetal bovine serum)Gibco10082-139
GlycerolFisherBP229-1
HBSS (Hank’s Ballanced Salt Solution)Gibco24020117
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) Millipore-Sigma206-703-0
IsofluraneVET one502017
LB media
LSRFortessa flow cytometerBD Biosciences
MES [2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid]Fisher50-488-796
MOPS [3-(N-morpholino) propanesulfonic acid]Fisher50-213-522
Percoll density gradient mediaCytiva17089101
Peristaltic pumpFisher ScientificDiscontinued now, use alternative
PFA (Paraformaldehyde)Thermo ScientificI28800
Purification columnMilliporeUFC900308
rLysozyme solutionNovagen20C71110
Shaking water bath Thermo ScientificTSSB15
Slide-A-Lyzer dialysis kitThermo66107
Sodium deoxycholateFisherBP349-100Fresh made or less than a month
Sterile cell strainer (40 μm)Fisher Scientific22-363-547
TamoxifenSigma Aldrich6734
Ultra centrifugal filterMilliporeUFC900308
Ultrapure waterThermo10977-015
Vortex mixerFisher Scientific2215365
β-ME (β-mercaptoethanol)FisherBP176-100

Referenties

  1. Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).
  2. Nelson, P. J., et al. The renal mononuclear phagocytic system. J Am Soc Nephrol. 23 (2), 194-203 (2012).
  3. Wang, Y., Harris, D. C. Macrophages in renal disease. J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).
  4. Islamuddin, M., Qin, X. Renal macrophages and NLRP3 inflammasomes in kidney diseases and therapeutics. Cell Death Discov. 10 (1), 229(2024).
  5. Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
  6. Mily, A., et al. Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection. J Vis Exp. (163), e61807(2020).
  7. Huen, S. C., Cantley, L. G. Macrophages in Renal Injury and Repair. Annu Rev Physiol. 79, 449-469 (2017).
  8. Tang, P. M., Nikolic-Paterson, D. J., Lan, H. Y. Macrophages: versatile players in renal inflammation and fibrosis. Nat Rev Nephrol. 15 (3), 144-158 (2019).
  9. Liu, F., et al. Distinct fate, dynamics and niches of renal macrophages of bone marrow or embryonic origins. Nat Commun. 11 (1), 2280(2020).
  10. Chew, C., et al. Kidney resident macrophages have distinct subsets and multifunctional roles. Matrix Biol. 127, 23-37 (2024).
  11. Cheung, M. D., et al. Resident macrophage subpopulations occupy distinct microenvironments in the kidney. JCI Insight. 7 (20), 161078(2022).
  12. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  13. Feng, D., et al. Cre-inducible human CD59 mediates rapid cell ablation after intermedilysin administration. J Clin Invest. 126 (6), 2321-2333 (2016).
  14. Hu, W., et al. Rapid conditional targeted ablation of cells expressing human CD59 in transgenic mice by intermedilysin. Nat Med. 14 (1), 98-103 (2008).
  15. Giddings, K. S., Zhao, J., Sims, P. J., Tweten, R. K. Human CD59 is a receptor for the cholesterol-dependent cytolysin intermedilysin. Nat Struct Mol Biol. 11 (12), 1173-1178 (2004).
  16. Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  17. Cao, Q., Harris, D. C., Wang, Y. Macrophages in kidney injury, inflammation, and fibrosis. Physiology. 30 (3), 183-194 (2015).
  18. Li, G., et al. The role of macrophages in fibrosis of chronic kidney disease. Biomed Pharmacother. 177, 117079(2024).
  19. Liu, F., et al. Versatile cell ablation tools and their applications to study loss of cell functions. Cell Mol Life Sci. 76 (23), 4725-4743 (2019).
  20. Yashchenko, A., et al. Cx3cr1 kidney resident macrophage heterogeneity. Front Immunol. 14, 1082078(2023).
  21. Duffield, J. S. Macrophages and immunologic inflammation of the kidney. Semin Nephrol. 30 (3), 234-254 (2010).
  22. Lee, S., et al. Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair. J Am Soc Nephrol. 22 (2), 317-326 (2011).
  23. Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in Tissue Repair, Regeneration, and Fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
  24. Guo, C., et al. Crosstalk between proximal tubular epithelial cells and other interstitial cells in tubulointerstitial fibrosis after renal injury. Front Endocrinol. 14, 1256375(2023).
  25. Guillot, A., et al. Bile acid-activated macrophages promote biliary epithelial cell proliferation through integrin αvβ6 upregulation following liver injury. J Clin Invest. 131 (9), 132305(2021).
  26. Kim, S. J., et al. Adipocyte Death Preferentially Induces Liver Injury and Inflammation Through the Activation of Chemokine (C-C Motif) Receptor 2-Positive Macrophages and Lipolysis. Hepatology. 69 (5), 1965-1982 (2019).
  27. Saxena, V., et al. Generation of Atp6v1g3-Cre mice for investigation of intercalated cells and the collecting duct. Am J Physiol Renal Physiol. 325 (6), F770-F778 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Macrofage ablatieIntermedilysine instrumentimmuunbewaking van de niermonocytenrekruteringflowcytometrieintravitale microscopiedichtheidsgradi ntcentrifugatieF4 80 marker
Snelle uitputting van niermacrofagen met behulp van menselijke CD59/Intermedilysin Cell Ablation Tool
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.