Op fluorescentie gebaseerde detectie van FEN1-nuclease-activiteit en screening van kleinmoleculaire remmers

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een biochemische test met gelverschuiving voor het meten van de activiteit van FEN1 (Flap Endonuclease 1) en de ontwikkeling van remmers.

Samenvatting

FEN1 (Flap Endonuclease 1) is een belangrijke DNA-nuclease die betrokken is bij DNA-replicatie en schadeherstel en een cruciale rol speelt bij het handhaven van genomische stabiliteit. Verhoogde niveaus van FEN1-activiteit zijn nauw verbonden met de ontwikkeling van verschillende vormen van kanker, waardoor FEN1 een erkende biomarker en medicijndoelwit is voor long-, borst- en prostaatkanker. Conventionele methoden voor het labelen van radio-isotopen voor het detecteren van FEN1-nucleaseactiviteit brengen uitdagingen met zich mee op het gebied van gemak en veiligheid. In deze studie werd in vitro een DNA-fragmentsubstraat met een flapstructuur gesynthetiseerd. Dit substraat is gelabeld met een fluorofoor aan het 5'-uiteinde van de flap, waardoor de FEN1-nuclease de aangewezen plaats specifiek kan herkennen en splitsen. De FEN1-activiteit werd vervolgens bepaald door het fluorofoorsignaal te detecteren na gelelektroforese. Deze methode maakt een snelle en effectieve beoordeling van de FEN1-nucleaseactiviteit en de screening van de remmers mogelijk. Het biedt een gevoelige en specifieke benadering voor het analyseren van FEN1-activiteit en het evalueren van de werkzaamheid van remmers van kleine moleculen. Bovendien levert het een belangrijke bijdrage aan het onderzoek naar het herstel van DNA-schade en de ontwikkeling van kanker, en biedt het een nieuwe strategie voor klinisch onderzoek naar ziektemechanismen en de detectie van genotoxische stoffen.

Inleiding

De DNA-replicatie is niet altijd vlekkeloos en kan worden verstoord door zowel interne als externe factoren. Bijgevolg zijn de mechanismen van DNA-replicatie en schadeherstel van vitaal belang voor celoverleving en genoomstabiliteit. In dit proces speelt de menselijke vertakkingsstructuurspecifieke endonuclease FEN1 (Flap Endonuclease 1), een kern-DNA-nuclease, een cruciale rol ^1,2,3.

FEN1 is voornamelijk betrokken bij DNA-replicatie en is onmisbaar voor de rijping van Okazaki-fragmenten op de achterblijvende streng ^4,5. Dit zorgt voor een efficiënte progressie van de DNA-replicatie en het nauwkeurige herstel van beschadigd DNA. Abnormale verhogingen van FEN1-spiegels zijn echter nauw verbonden met de ontwikkeling van verschillende vormen van kanker ^6,7, zoals long- en borstkanker⁷. FEN1 is dus niet alleen essentieel voor DNA-replicatie en -herstel, maar heeft ook veel aandacht gekregen als biomarker voor de diagnose van kanker en een potentieel therapeutisch doelwit ^8,9. De detectie van FEN1-activiteit is essentieel voor de vroege diagnose van kankers en voor het bevorderen van onderzoek naar gerichte therapieën.

Gezien het belang van FEN1 en de noodzaak om de activiteit ervan te bestuderen voor vroege diagnose van kanker en de ontwikkeling van gerichte therapie, was het primaire doel van de methode die in dit experiment werd ontwikkeld om de FEN1-nuclease-activiteit nauwkeurig en efficiënt te meten. Deze methode is bedoeld om een betrouwbaar platform te bieden voor het screenen van remmers van kleine moleculen gericht tegen FEN1. Door deze doelen te bereiken, wil de studie bijdragen aan een beter begrip van de rol van FEN1 bij kanker en de ontdekking van nieuwe therapeutische strategieën vergemakkelijken.

Er bestaan tal van technieken voor het detecteren van FEN1-nucleaseactiviteit, elk met verschillende kenmerken, principes, voordelen, beperkingen en toepasselijke scenario's. Gelelektroforese en op HPLC gebaseerde substraatscheidingsmethoden leveren bijvoorbeeld intuïtieve resultaten op, maar omvatten omslachtige procedures en een lage doorvoer^10,11. Fluorescentiepolarisatie (FP)-assays worden geconfronteerd met uitdagingen bij het evalueren van FEN1-activiteit als gevolg van interferentie van samengestelde autofluorescentie of lichtverstrooiing, die FP-signalen beïnvloedt. Hoewel contrascreeningstrategieën vals-positieven gedeeltelijk kunnen uitsluiten, wordt ongeveer 15% van de primaire actieve verbindingen nog steeds verkeerd geïdentificeerd als gevolg van technische interferentie¹². Het gecombineerde gebruik van fluorescentiedonor/quencher-paren (bijv. TAMRA/BHQ-2) en AlphaScreen-chemiluminescentie heeft nadelen, zoals de hoge synthesekosten van complexe fluorescerende substraten met drie flappen, met name wat hun bruikbaarheid bij grootschalige screening beperkt. Bovendien kan de dubbele flapstructuur van substraten een optimale binding met FEN1 belemmeren, waardoor de enzymatische splitsingsefficiëntie wordt verminderd en de detectiegevoeligheid in het gedrang komt. Bovendien is deze aanpak sterk afhankelijk van gespecialiseerde instrumenten (bijv. ViewLux, EnVision), waardoor de acceptatie ervan in laboratoria met beperkte middelen wordt beperkt 13,14,15. Fluorescerende detectiemethoden op basis van dual-flap haltervormige DNA-nanosondes gefunctionaliseerd met zilveren nanoclusters (DNA-AgNC's) lijden aan batch-tot-batch-variabiliteit vanwege hun afhankelijkheid van nauwkeurig gloeien en in situ nucleatiestappen, waardoor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid worden belemmerd. Hoge kosten en langdurige procedures beperken de praktische toepassing ervan nog^{verder 16}.

In dit artikel wordt een op fluorescentie-etikettering gebaseerde test ontwikkeld om de huidige technische beperkingen aan te pakken en te voldoen aan de groeiende vraag naar veiligere, voor de gebruiker toegankelijke methoden voor het bestuderen van FEN1-activiteit. Deze techniek maakt gebruik van de specificiteit en hoge gevoeligheid van fluorescentiedetectie, evenals de mogelijkheid om DNA-substraten te ontwikkelen met gedefinieerde structuren die kunnen worden herkend en gesplitst door FEN1 (Figuur 1). Deze methode stroomlijnt experimentele procedures met behoud van een hoge nauwkeurigheid bij het beoordelen van FEN1-nuclease-activiteit. Vergeleken met traditionele gelelektroforese en op HPLC gebaseerde technieken, biedt het een vereenvoudigde bediening en een snellere doorlooptijd. In tegenstelling tot fluorescentiepolarisatietesten, maakt deze benadering een snelle kwalitatieve screening van verbindingen mogelijk, waardoor een efficiënte strategie voor voorlopige enzymatische evaluatie wordt vastgesteld.

Deze methode is geschikt voor het bestuderen van FEN1-nuclease-activiteit in laboratoriumomgevingen waar de toegang tot radioactieve materialen beperkt is. Het is ook zeer geschikt voor het screenen van een groot aantal remmers van kleine moleculen in een relatief korte tijd, vooral wanneer een hoge gevoeligheid en specificiteit vereist zijn. Het is echter niet ideaal voor studies die absolute kwantificering met zeer hoge precisie vereisen of voor laboratoria die niet beschikken over basisapparatuur voor fluorescentiedetectie en expertise op het gebied van fluorescentiesignaalanalyse. Voor studies die zich richten op in vivo toepassingen - waarbij het FEN1-gedrag kan worden beïnvloed door complexe biologische factoren die niet worden gerepliceerd in de huidige in vitro testontwerpen - kunnen verdere verfijning of alternatieve methoden nodig zijn.

Deze fluorescentietest is zeer gevoelig en specifiek en biedt een veilig, handig en effectief hulpmiddel voor het bestuderen van FEN1-activiteit en het ontwikkelen van de remmers ervan.

Protocol

De reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. FEN1 eiwitexpressie zuivering

1. Eiwit zuivering
   1. Verwijder de bacterievoorraad met het doelplasmide (zie materiaaltabel) van -80 °C. Ontdooi bij kamertemperatuur en inoculeer 200 μl uit de bevroren microcentrifugebuisjes van 1,5 ml in een LB-medium van 20 ml dat 50 μg/ml kanamycine bevat met behulp van een pipetpunt van 200 μl.
      OPMERKING: De stam is E. coli BL21(DE3)-FEN1.
   2. Incubeer bij 37 °C en schud gedurende 12 uur bij 160 tpm.
   3. Breng de bacteriële suspensie over in een erlenmeyer van 200 ml die LB-medium bevat, aangevuld met 50 μg/ml kanamycine. Ga door met incuberen bij 37 °C en schud gedurende 2-3 uur bij 160 tpm.
   4. Wanneer de OD₆₀₀ van de cultuur ongeveer 0,6 bereikt, voeg dan 2 ml IPTG toe (eindconcentratie: 1 mM). Ga verder met de incubatie bij 25 °C, 160 tpm gedurende 10 uur.
   5. Breng de geïnduceerde cultuur over in een vooraf gewogen centrifugebuis van 50 ml. Centrifugeer bij 4 °C en 2500 × g gedurende 15 min. Gooi het bovenstaande weg. Weeg de pellethoudende buis en trek het gewicht van de lege buis af om de pelletmassa te berekenen.
   6. Voeg 7 ml lysisbuffer toe per gram natte celpellet. Gebruik een pipet om de pellet grondig te suspenderen door op en neer te pipetteren.
      OPMERKING: Lysisbuffer (10 ml in totaal) bevat 20 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 2% Triton X-100 en ddH₂O. Voer deze stap uit in een zuurkast om een veilige hantering van chemische reagentia te garanderen.
   7. Breng de bacteriële suspensie in lysisbuffer over naar een vriezer van -80 °C en vries deze een nacht in. Ontdooi de suspensie de volgende dag gedurende 1 uur op een shaker van 4 °C om de lysisefficiëntie te verbeteren.
   8. Lyseer cellen met behulp van echografie op 75% vermogen gedurende 45 minuten. Centrifugeer het lysaat bij 12.000 ×g gedurende 20 minuten bij 4 °C om het bovenstaande van de pellet te scheiden.
      OPMERKING: Als het lysaat troebel blijft, verhoog dan het volume van de lysisbuffer of herhaal de vries-dooicycli. Een nucleaseremmer kan ook worden toegevoegd om de eiwitintegriteit te behouden en afbraak te voorkomen.
   9. Breng het geklaarde bovenstaande middel aan op de wand van een tube met bereide eiwitzuiveringshars. Wassen met 10 ml elutiebuffer om niet-specifiek gebonden eiwitten te verwijderen.
      OPMERKING: Elutiebuffer bevat 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 250 mM NaCl, 2% Triton X-100, 200 mM imidazool en gedestilleerd water.
   10. Elueer het FEN1-eiwit door 5 ml elutiebuffer langs de binnenwand van de buis toe te voegen.
2. Identificatie van doeleiwitten door snelle coomassie briljantblauwe kleuring
   1. Bereid SDS-PAGE-gels voor met 12% scheidingsgel en 5% stapelgel volgens de verwachte grootte van FEN1.
   2. Meng het doeleiwitmonster en de BSA-standaard met 5× monsterbuffer in een verhouding van 1:4. Verwarm het mengsel 5 minuten op 95 °C om de eiwitten volledig te denatureren.
   3. Laad 20 μL van de BSA-standaard en gedenatureerde eiwitmonsters in afzonderlijke putjes van de SDS-PAGE-gel.
   4. Sluit het elektroforese-apparaat aan. Stel de spanning in op 90 V en laat 1 uur en 40 minuten draaien.
   5. Breng de gel na elektroforese over in een kleuringscontainer. Spoel af met gedeïoniseerd water, voeg vervolgens 30 ml eiwitkleuringsoplossing toe en bevlek gedurende 25 minuten. Herstel de vlekkenoplossing, spoel de gel af met 20 ml gedeïoniseerd water en ontkleur een nacht op een horizontale schudder.
   6. Plaats de gel na het ontkleuren op een doorzichtige plastic plaat en observeer de eiwitbanden onder wit licht.
      OPMERKING: Als de banden zwak zijn of de eiwitconcentratie laag is, concentreer het monster dan met behulp van ultrafiltratiebuisjes. Deze stap verwijdert overtollig oplosmiddel en kleine moleculen, verbetert de eiwitconcentratie en zorgt voor een nauwkeurige analyse in volgende experimenten.

2. FEN1 TAMRA-gelabeld DNA-substraatpreparaat

1. TAMRA-gelabeld preparatie van DNA-substraat
   1. Ontwerp DNA-oligonucleotidestrengen op basis van de specifieke splitsingsactiviteit van FEN1, verwijzend naar gepubliceerde methoden¹⁷ (zie tabel 1). Het 5′ uiteinde van de D1-sequentie is gemodificeerd met een fluorescerend TAMRA-label.
   2. Voeg gemengde enkelstrengs DNA-oligonucleotiden toe aan 10 μL gloeibuffer in de volgende volumes: 5 μL D1 (10 pmol/μL), 10 μL T1 (10 pmol/μL) en 7,5 μL U2 (10 pmol/μL). Voeg gedeïoniseerd water toe om het totale volume op 50 μL te brengen.
      OPMERKING: De gloeibuffer bevat 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 10 mM MgCl₂.
   3. Verwarm het reactiemengsel in een metalen bad op 100 °C gedurende 1 minuut en breng het vervolgens onmiddellijk over naar 72 °C gedurende 10 minuten¹⁸.
      OPMERKING: Het uiteindelijke DNA-substraat is 80 nucleotiden lang. De hoge begintemperatuur (100 °C) zorgt voor denaturatie, terwijl de gloeitemperatuur (72 °C) een nauwkeurige strengparing bevordert.
   4. Schakel de warmtebron uit en laat de oplossing geleidelijk afkoelen tot kamertemperatuur, zodat het volledige dubbelstrengs DNA-substraat ontstaat.
2. TAMRA-gelabelde DNA-substraattest
   1. Bereid een 12% denaturerende polyacrylamidegel voor door 4,8 ml 30% acrylamide (29:1), 4,32 ml 6 M ureum, 2,4 ml 5× TBE, 50 μl 10% APS, 5 μl TEMED en 0,48 ml gedeïoniseerd water te mengen. Meng grondig om de gel te bereiden.
   2. Plaats de gel 30 minuten in een oven van 37 °C om te stollen.
   3. Pipette voor detectie 2 μL van het gesynthetiseerde DNA-substraat in 18 μL gedestilleerd water en voeg 7,7 μL Stop Buffer toe.
   4. Piket ter referentie 2 μL TAMRA-gelabelde D1 in 18 μL gedestilleerd water en voeg 7,7 μL Stop Buffer toe.
   5. Laad 20 μL van elk geprepareerd monster op de gel en voer SDS-PAGE-elektroforese uit om de vorming van DNA-substraat te analyseren.

3. FEN1-nuclease-activiteitstest

1. FEN1 enzym activiteit test
   1. Bereid 20 μL reactiemengsel voor door 2 μL DNA-substraat te combineren met FEN1-nuclease in de reactiebuffer.
      OPMERKING: De reactiebuffer bestaat uit 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 0,2 mg/ml BSA en gedeïoniseerd water.
   2. Incubeer het reactiemengsel gedurende 15 minuten bij 37 °C in een metaalbad.
   3. Beëindig de reactie door 20 μL 2× beëindigingsbuffer toe te voegen.
   4. Laad 20 μL van het gereageerde monster op een vooraf bereide 12% denaturerende polyacrylamidegel en voer elektroforese uit bij 100 V gedurende 60 min.
   5. Visualiseer na elektroforese de resultaten met behulp van een fluorescentiebeeldvormingssysteem (600-route).

4. Screening van kleine molecuulremmers van FEN1-nuclease

1. Screening van remmers met kleine moleculen
   1. Gebruik een pipet om 2 μl dimethylsulfoxide (DMSO) over te brengen in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml.
   2. Voeg 2 μL FEN1-nuclease en 10 μL 2× reactiebuffer toe aan de buis.
   3. Meng grondig en incubeer het mengsel 10 minuten op ijs.
   4. Voeg 2 μL DNA-substraat en 4 μL gedeïoniseerd water toe, meng grondig om het totale reactievolume op 20 μL te brengen.
   5. Bereid een werkende verdunning van de FEN1-nucleaseremmer, FEN1-IN-4, door een tweevoudige seriële verdunning uit te voeren van een 1 M stockoplossing in DMSO.
   6. Pipetteer 2 μL FEN1-nuclease (0,03 μg/μL) en 2 μL van de verdunde FEN1-IN-4-remmer in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 10 μL 2× reactiebuffer en 4 μL gedeïoniseerd water toe. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 10 minuten op ijs om te zorgen voor voldoende interactie tussen de remmer en het enzym.
   7. Voeg 2 μL DNA-substraat toe aan de buis om een definitief reactiemengsel van 20 μL te vormen.
   8. Incubeer de reactie bij 37 °C in een metaalbad gedurende 15 minuten.
   9. Beëindig de reactie door 20 μL 2× beëindigingsbuffer toe te voegen.

5. Evaluatie van de remmende werking van FEN1--IN-4 remmer van kleine moleculen

1. Gebruik een micropipet om 10 μL 2×reactiebuffer op te nemen en voeg dit toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
2. Voeg 2 μL FEN1-nuclease toe in een concentratie van 0,03 μg/μL, evenals 2 μL FEN1-remmer FEN1-IN-4 in verschillende concentraties.
   OPMERKING: Er moeten meerdere concentratiegradiënten worden vastgesteld volgens de experimentele vereisten.
3. Voeg 4 μL gedeïoniseerd water toe en meng de oplossing grondig. Plaats de microcentrifugebuis van 1,5 ml op ijs en incubeer gedurende 10 minuten.
4. Voeg 2 μL dubbelstrengs DNA-substraat toe aan de buis om een reactiesysteem van 20 μL te vormen.
5. Plaats de EP-buis gedurende 15 minuten in een metalen bad van 37 °C.
6. Nadat de reactie is voltooid, voegt u 20 μL 2× stopbuffer toe aan het reactiemengsel om de reactie te beëindigen.
7. Bekijk de resultaten met behulp van een fluorescentiebeeldvormingsapparaat en zet de IC_50-curve ¹⁹ uit.
   OPMERKING: Kwantificering van de fluorescentie-intensiteit werd uitgevoerd met behulp van Fiji/ImageJ²⁰, gevolgd door statistische analyse en visualisatie met grafiek- en analysesoftware²¹.

Resultaten

Zoals te zien is in figuur 2A, bindt het kleuringsreagens zich aan het eiwit, waardoor het eiwit als een blauwe band op de gel verschijnt. De eerste baan bevat het gelabelde eiwit dat wordt gebruikt als referentie voor het molecuulgewicht, waarbij de BSA-standaard eiwitband overeenkomt met een molecuulgewicht van 70 kDa en de FEN1-nucleïnezuureiwitband overeenkomt met een molecuulgewicht van 45 kDa. De experimentele resultaten toonden aan dat de FEN1-nucleas...

Discussie

De FEN1-nuclease-activiteitstest en de screening op kleine molecuulremmers staan centraal in onderzoek naar het herstel van DNA-schade en de ontwikkeling van kanker. In vergelijking met traditionele radiolabelingtechnieken biedt de huidige methode een kosteneffectief, efficiënt, eenvoudig te bedienen en veiliger alternatief. Bovendien biedt deze benadering, in tegenstelling tot op fluorescentieburst gebaseerde FEN1-assays, een meer intuïtieve visualisatie van substraatsplitsing, waardoor...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 M Tris-HCL	Beyotime	ST774
30% Acr-Bis (29:1)	Beyotime	ST003-500ml
5M Nacl	Beyotime	ST347
BeyoBlue Plus	Beyotime	P0003S
BL21(DE3)-FEN1	Vazyme	C504-F1
BSA	Beyotime	P0007
Decoloring shaker	Kylin-Bell	TS-100
DL-Dithiothreitol	Beyotime	ST041
Dry Bath Incubator	RUICHENG	DH200
Electrophoresis apparatus	Bei jing Liuyi Biotechnology	DDY-6D
FEN1-IN-4	TargetMOL	T8545
IPTG	Takaba	9030
Kanamycin Sulfate	Biosharp	BS152
Laboratory Centrifuge	Thermo	SL 16R
LB Broth	Solarbio	L8291
Ni-NTA His Bind Resin	7se biotech	PANF001-001C
Odyssey FC	ODYSSEY	LI-COR
SDS-PAGE	Beyotime	P0015L
Trition-x-100	Shyuanye	S15022