Microfabricage van implanteerbare optica geïntegreerd in een microgestructureerd beeldvormingsvenster voor geavanceerde in vivo beeldvorming

Summary

Dit protocol beschrijft de fabricage van een implanteerbaar geïntegreerd beeldvormingsvenster met behulp van 3D-laserprinten. Het raam bestaat uit een systeem van microlenzen gekoppeld aan micro-scaffolds. De methode omvat twee-fotonpolymerisatie (2PP) van de biocompatibele fotoresist SZ2080 in een continue sequentie, waardoor de productie-efficiëntie en de afstemming tussen de verschillende componenten worden geoptimaliseerd.

Abstract

In de context van biomaterialen en het testen van geneesmiddelen in diermodellen, presenteert deze studie een gestroomlijnd protocol voor het fabriceren van een nieuw implanteerbaar geïntegreerd beeldvormingsvenster. Het micro-apparaat bestaat uit een geavanceerd systeem van microlenzen gekoppeld aan micro-scaffolds die speciaal zijn ontworpen voor in vivo kwantificering van de immuunrespons met behulp van geavanceerde niet-lineaire excitatiemicroscopie. Het protocol is gebaseerd op twee-fotonpolymerisatie (2PP) van de biocompatibele fotoresist SZ2080, die de fabricage van microsteigers en microlenzen in een continue sequentie mogelijk maakt om de productie-efficiëntie en precisie te verbeteren. Om de snelheid, nauwkeurigheid en structurele integriteit verder te verbeteren, werd een hybride optische fabricagebenadering geïmplementeerd, waarbij de 2PP van de microlens-buitenschaal werd gevolgd, gevolgd door UV-bulkverknoping van de binnenkern. Deze innovatieve techniek optimaliseert de optische eigenschappen van de microlenzen en stroomlijnt tegelijkertijd het productieproces. Het resulterende micro-apparaat vertoont een hoge reproduceerbaarheid en mechanische stabiliteit, waardoor het een effectieve methode is voor het maken van prototypes van optische systemen op microschaal voor een reeks biomedische toepassingen.

Introduction

Intravitale microscopie maakt het mogelijk om biologische processen bij levende dieren te bestuderen door real-time visualisatie. In combinatie met fluorescerende niet-lineaire beeldvormingsbenaderingen kan het zelfs een resolutie bereiken op subcellulaire schaal¹. Bijgevolg is het een belangrijk hulpmiddel geworden op veel gebieden, zoals immunologische tests of kankerstudies, waar observatie van de cellen in hun echte fysiologische omgeving belangrijk is.

Gebruikelijke benaderingen voor intravitale inspecties, zoals dorsale huidplooikamers of craniale en abdominale beeldvormingsvensters, zijn zeer invasief en vormen problemen voor langdurige inspecties van hetzelfde punt. Nieuwe in vivo beeldvormingsbenaderingen die het ongemak bij dieren verminderen en een gemakkelijke herpositionering van het optische beeld mogelijk maken, zijn dus sterk wenselijk².

In dit kader is het mogelijk om een nieuw geminiaturiseerd beeldvormingsvenster te ontwikkelen op basis van een glassubstraat dat een beeldvormingszijde met optische microlenzen en een weefselreferentiezijde met driedimensionale (3D) microsteigers bevat. Dit geminiaturiseerde beeldvormingsvenster kan "subcute" in het dier worden geïmplanteerd en zal functioneren als een "intern" microscoopobjectief. Het werkingsprincipe van het apparaat zal zijn om de microlenzen te gebruiken in combinatie met een extern microscoopobjectief met een lage numerieke apertuur (NA) om in vivo niet-lineaire beeldvorming uit te voeren van de biologische processen die plaatsvinden in de steigers. De microlenzen compenseren sferische aberratie als gevolg van beeldvorming door een inhomogeen medium als weefsel ^3,4, terwijl de microsteiger weefselregeneratie stimuleert en fungeert als optische bakens ^5,6,7, waardoor langdurige inspectie van hetzelfde punt mogelijk is.

De basiscomponenten van het apparaat, d.w.z. micro-scaffolds en micro-lenzen, zijn al afzonderlijk gedemonstreerd, maar hun integratie in hetzelfde apparaat brengt verschillende uitdagingen met zich mee vanwege hun 3D-karakter, hun micrometergrootte en de noodzaak om een perfecte optische uitlijning ertussen te hebben. De microsteigers, bestaande uit rechthoekige kubusvormige roosters, met representatieve totale afmetingen ~ 500 μm x 500 μm x 100 μm en met poriegroottes ~ 50 μm x 50 μm x 20 μm, kunnen de rekrutering van cellen en nieuwe vascularisatie begeleiden en zo de weefselintegratie bevorderen. Bovendien functioneren de microsteigers door hun autofluorescentie als een in situ fluorescentiebaken, waardoor een snelle herpositionering en uitlijning onder de microscoop mogelijk is en zelfs een correctie van sferische aberraties tijdens niet-lineaire beeldvorming om longitudinale in-vivo-waarnemingen met hoge resolutie mogelijk te maken⁵. De microlenzen met een hoge numerieke apertuur, met sferische of quasi-parabolische profielen en brandpuntsafstanden van een paar honderd micrometer, hebben hun mogelijkheden aangetoond voor lineaire en niet-lineaire beeldvorming van biologische preparaten in combinatie met een confocale of twee-fotonenmicroscoop ^3,4.

De microlenzen en de microsteigers worden vervaardigd door middel van 3D-laserinscriptie, ook wel twee-fotonpolymerisatie (2PP) genoemd. In 2PP wordt een infrarood femtoseconde laserstraal strak gefocusseerd in een UV-uithardende fotoresist, en door multi-fotonabsorptie op het brandpunt wordt een beperkte voxel van gepolymeriseerd materiaal gecreëerd met een grootte van minder dan een micrometer (~100 nm). Door de laserfocus te verplaatsen ten opzichte van het fotoresistmonster, kunnen driedimensionale structuren van gepolymeriseerd materiaal worden verkregen na het wegspoelen van het niet-gepolymeriseerde materiaal⁸. Het proces heeft een intrinsiek hoge resolutie en een 3D-karakter dat het mogelijk maakt om 3D-microstructuren, zoals steigers en lenzen, te verkrijgen met een goede stabiliteit en een hoge oppervlaktekwaliteit ^9,10,11. Er zijn verschillende technieken voor de fabricage van poreuze microsteigers, zoals 3D-printen, nano-imprinting of elektrospinning 12,13,14,15. Al deze technieken hebben een groot nadeel; Ze zijn niet in staat om resoluties te bereiken in het bereik van minder dan micrometer, waardoor structuren ontstaan met poriën (~100 μm) die groter zijn dan de cellulaire grootte, en bootsen geen extracellulaire matrix na, wat essentieel is voor een goede weefselregeneratie. De fabricage van microlenzen kan worden benaderd door methoden die gebaseerd zijn op de replicatie van de lens uit een mal of masker, zoals spuitgieten, warm reliëf of UV-gieten, of door directe methoden zoals thermische reflow, microplastic-reliëf of microdruppelspuiten^16,17. Ze vertonen allemaal beperkingen op het gebied van oppervlaktemorfologie die kunnen worden verkregen en zijn moeilijk te integreren in een fabricagestroom waar de microsteigers ook moeten worden vervaardigd. Aan de andere kant heeft 2PP zijn veelzijdigheid aangetoond voor de fabricage van complexe optische componenten^18,19, zoals sferische of parabolische lenzen, diffractieve lenzen of zelfs combinaties van verschillende lenzen in dezelfde optische component 20,21,22,23,24. In dit kader lijkt 2PP de beste techniek voor de fabricage van een geheel dat zowel lenzen als micro-scaffolds bevat.

Ondanks dat het een unieke keuze is voor de realisatie van deze 3D-structuren met micrometerresolutie, heeft 2PP twee belangrijke beperkingen, namelijk dat het een tijdrovende benadering is voor structuren met een relatief groot volume, en dat het een beperkte fabricagediepte heeft (langs de optische as) vanwege de korte werkafstand van microscoopobjectieven die worden gebruikt voor strakke scherpstelling.

Dit artikel stelt een uniek protocol voor voor de fabricage van de microsteigers en de microlenzen aan weerszijden van een glassubstraat in een bestralingsproces in één longitudinale stap dat een goede uitlijning van beide elementen garandeert en de beperkingen van de fabricagediepte overwint. Het protocol is ook geoptimaliseerd voor de fabricagetijd; aan de ene kant bespaart de bestraling in één stap uitlijningstijd, en het gebruik van een hybride benadering die 2PP van de lensschaal combineert met UV-uitharding van de binnenste fotoresists verkort de bestralingstijd voor de lenzen met een hoog volume²⁵. Het vermogen van 2PP om 3D-structuren in vrije vorm te fabriceren, maakt het gebruik van dit protocol mogelijk voor elk microlens- en microsteigerontwerp, waardoor de huidige methode wordt versterkt.

Protocol

De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van het monster

1. Eerste drop-casting (Figuur 1A)
   1. Reinig met aceton op beide oppervlakken van een rond glazen dekglaasje met een diameter van 12 mm (dikte 170 μm).
   2. Droog beide oppervlakken af met stikstofgas op kamertemperatuur.
   3. Breng een gecontroleerde hoeveelheid van 46 μL vloeibare fotoresist aan op één kant van het glazen dekglaasje met behulp van een volumepipet.
      OPMERKING: Het lichtgevoelige materiaal dat in dit protocol wordt gebruikt, is een biocompatibele, hybride organische/anorganische fotoresist die bekend staat als SZ2080, die bekend en gevalideerd is voor biomedische toepassingen²⁶. Let erop dat er een vrije externe annulus op de glazen ondergrond achterblijft. Omdat deze glasachtige ruimte vrij is van fotoresist, zorgt deze glasachtige ruimte voor het correct vasthouden van het monster in de drager om de bereiding beter te ondersteunen.
   4. Laat het monster 48 uur onder de chemische kap staan om de eerste druppel fotoresist te laten drogen door de verdamping van het oplosmiddel en het bereiken van de sol-geltoestand.
2. Tweede drop-casting (Figuur 1A)
   1. Wanneer de eerste druppel fotoresist de sol-geltoestand bereikt (stap 1.1.4.), draait u het monster ondersteboven en legt u het schone oppervlak bloot.
   2. Plaats het monster op een ondersteunende houder en til het eerste gegoten oppervlak van de grond.
   3. Breng een tweede druppel van 46 μL vloeibare fotoresist aan op het schone glasoppervlak, laat de externe annulus achter en in stap 1.1.3.
   4. Laat het monster minimaal 48 uur onder de chemische kap liggen en laat het oplosmiddel verdampen.
      OPMERKING: Na 4-6 dagen is het dubbel gegoten monster klaar om te worden gebruikt voor 2PP (Figuur 1B). Let er vanaf nu op dat het monster niet wordt blootgesteld aan omgevingslicht vanwege het lichtgevoelige materiaal. Blootstelling aan licht verslechtert de fotoresist.

2. Twee-foton polymerisatie (2PP) van de microstructuren

1. Uitlijning instellen (Figuur 2)
   1. Schakel de femtoseconde nabij-infrarood laserbron in (1030 nm golflengte, 1 MHz, met minimale pulsduur = 230 fs).
      OPMERKING: Stel laserparameters in, zoals de pulsbreedte en de herhalingssnelheid.
   2. Lijn het optische pad van de laserstraal uit totdat deze het microscoopobjectief bereikt via een reeks optieken en spiegels die op kinematische spiegelbevestigingen zijn gemonteerd. Draai de spiegels iteratief om de straal te centreren in nabij-infrarood (NIR) uitlijningsgaatjes.
      OPMERKING: De werkafstand van het microscoopobjectief moet langer zijn dan de totale hoogte van het uiteindelijke te vervaardigen apparaat (lenshoogte + dekslipdikte + hoogte microsteiger). NIR-gaatjes zijn goed ontworpen om de uitlijning van IR-balken te vereenvoudigen. Dit zorgt voor een nauwkeurige uitlijning van de straal langs het optische pad, waarbij componenten zoals een halvegolfplaat, een bundelexpander en een dichroïsche spiegel worden doorgelaten. Om het laservermogen automatisch te regelen, gaat de straal door een horizontale polarisator en een halfgolfplaat en de tweede is gemonteerd op een gemotoriseerde rotator. Indien nodig kan de straal door een straalexpander gaan om de straaldiameter te vergroten en de objectieve achteringang te vervullen.
   3. Richt de laserstraal loodrecht op de monsterhouder door deze uit te lijnen met behulp van back-reflectie centrering.
   4. Monteer het microscoopobjectief voor lange werkafstanden op de speciale steun aan het einde van het optische pad dicht bij het monster (Figuur 2).
      OPMERKING: Een CCD-camera is boven de dichroïsche spiegel gemonteerd, uitgelijnd met de optische as van het objectief voor het bewaken van het fabricageproces. Hiermee kan men de laserfocusplek en de gepolymeriseerde structuren zien.
2. Sample montage
   1. Bevestig (met tape) het dubbel gezakte glazen dekglaasje op de monsterhouder die op de vertaaltrappen is gemonteerd. Monteer het monster met de tweede gedeponeerde druppel naar beneden.
      NOTITIE: De monsterhouder heeft een centraal gat waar het monster aan de grond kan worden opgehangen fase⁵. De houder is verbonden met een mechanisch gimbalsysteem dat is vastgeschroefd op een X, Y translatietrap voor samplebeweging.
   2. Centreer het monster handmatig met het gemonteerde microscoopobjectief.
3. Monster centreren
   1. Stel het laservermogen in op de minimumwaarde die voldoende is om de straalreflectie op de CCD-camerasoftware te zien (ongeveer 5 mW).
      OPMERKING: Meet het laservermogen aan de achterkant van de pupil van het objectief (de transmissie van het objectief dat in dit protocol wordt gebruikt, is 70% bij een golflengte van 1030 nm.)
   2. Schakel de software van de gebruikersinterface voor de bewegingscontroller en de CCD-camera in.
   3. Richt de laserstraal op het bovenoppervlak van de eerste fotoresist-druppel.
   4. Volg het gebogen profiel van de druppel en zoek de monsterranden langs de X- en Y-richtingen. Stel het midden van de druppel in als een referentie voor het absolute nulpunt door software.
      OPMERKING: De tape die wordt gebruikt om het monster te bevestigen, speelt een rol bij het detecteren van randen door de brekingsindex te wijzigen, dus de straalreflectie.
4. Compensatie voor monsterkanteling
   1. Richt in het midden van het monster de laserstraal op het interfaceoppervlak tussen het bovenoppervlak van het glazen dekglaasje en de basis van de eerste druppel fotoresist. Stel het in als nulreferentie op de Z-as.
   2. Rekening houdend met de diameter van het monster, verplaatst u naar de randpositie (voor het dekglaasje van 12 mm is dit ~ - 4 mm) in de negatieve richting van de X-as. Stel in die positie het interfaceoppervlak (tussen het glas en de bovenste druppel fotoresist) scherp en stel het in als een referentie van het absolute nulpunt langs de verticale richting Z.
   3. Beweeg naar de randpositie in de positieve richting van de X-as (voor het dekglaasje van 12 mm is dit ~ + 4 mm). Vind hier het interfaceoppervlak dat het objectief in verticale richting Z beweegt.
   4. Kantel het monster om te corrigeren voor de afwijking in de Z-richting tussen de negatieve en positieve posities langs de X-as. Gebruik een verstelbare kinematische bevestiging voor het kantelen van de monsterhouder (zoals een gimbal).
   5. Herhaal de stappen 2.4.2-2.4.4 iteratief totdat het monster volledig in evenwicht is op de X-as.
   6. Voer dezelfde procedure uit als beschreven in de stappen 2.4.2-2.4.5 in de Y-richting.
   7. Zodra het monster perfect in balans is op zowel de vlakke as X als Y, keert u terug naar de centrale positie en stelt u de interface tussen het glas en de fotoresist op dat punt scherp.
   8. Stel de nieuwe Z-waarde van de focus in als referentie in de Z-as (Z = 0).
      OPMERKING: De procedure in stap 2.4 is gericht op het waarborgen van de perfecte loodrechtheid tussen de laserstraal en het dekglaasoppervlak om een perfecte verankering van de 2PP-structuren te garanderen die later zullen worden vervaardigd. Vanaf 2.4 moeten alle ingrepen worden uitgevoerd die overeenkomen met de brekingsindex. Voeg daarom indien nodig het medium van indexmatching van de doelstelling toe.
5. Micro-steigers 2PP op de onderste fotoresist druppel
   1. Schakel een rood LED-verlichtingssysteem in voor real-time monitoring van het polymerisatieproces.
      OPMERKING: Een verlichting met een roodlichtdiode wordt onder de complexe monsterhouder-gimbal geplaatst (Figuur 2). Deze verlichting maakt het mogelijk om het gepolymeriseerde volume te zien tijdens het 2PP-proces. De fotoresist is gevoelig voor kortere golflengten (zichtbaar licht); daarom zal het rode LED-lampje het monster niet verstoren.
   2. Terwijl de laser is uitgeschakeld, beweegt u het objectief in de Z-richting onder het glazen dekglaasje om het tweede interfaceoppervlak tussen het onderste oppervlak van het glas en de basis van de onderste weerstandsdruppel te vinden.
      OPMERKING: De tweede interface bevindt zich op een Z-waarde die ongeveer gelijk is aan de dikte van het dekglaasje (170 μm).
   3. Verhoog het laservermogen tot 100 mW om twee-fotonpolymerisatie te laten plaatsvinden in de bodemdruppel.
   4. Stem de brandpuntspositie af (toenemende Z) om de tweede interface te vinden door een eenvoudige referentiestructuur te polymeriseren.
      OPMERKING: Een voorbeeld van een referentiestructuur is een gepolymeriseerde lijn met een lengte van 50 μm.
   5. Stel de eerste brandpuntspositie waar de polymerisatie van de referentiestructuur plaatsvindt in als de nulreferentie langs de verticale richting (Z-as).
      OPMERKING: De verwijzing in stap 2.5.5 onderstreept het basisvlak voor de 2PP van de microsteigers.
   6. Stel de polymerisatievermogens in (~ 100-200 mW) en voer de machinecode uit als een computerprogramma voor numerieke besturing (CNC) voor de juiste beweging van de translationele fasen om de gewenste 3D-structuur te fabriceren (Figuur 3A).
      OPMERKING: Het CNC-programma bestaat uit een reeks ruimtelijke coördinaten (x, y, z) die bepalen in welke richting de translationele platforms bewegen om het uiteindelijke 3D-object te produceren. Deze polymerisatiekrachten zullen worden beïnvloed door de hoogte van de bovenste druppel en de specifieke experimentele omstandigheden (fotoresist, laser en bewegingssysteem).
6. Microlenzen 2PP op de bovenste fotoresist druppel
   1. Beweeg langs de Z-as en keer terug naar de eerste interface tussen het bovenste glasoppervlak en de bovenste druppel fotoresist (stap 2.4.8). Behoud hetzelfde vlakke referentiesysteem (X-, Y-coördinaat) om een perfecte uitlijning van de microlenzen 2PP met de reeds gefabriceerde microstructuren te garanderen.
   2. Vind de interface door een eenvoudige referentiestructuur te polymeriseren.
      OPMERKING: Gebruik hetzelfde proces als beschreven in stap 2.5.4, maar alleen verschillend in de richting van de verticale beweging.
   3. Stel de eerste polymerisatielijn in als nulreferentie in verticale richting (Z-as).
      OPMERKING: De verwijzing in stap 2.6.3 onderstreept het massavlak voor de 2PP van de microlenzen.
   4. Stel de fabricageparameters in voor de 2PP van de contour van de gewenste microlens (Figuur 3B). De laserstraal beschrijft een cirkelvormig traject dat in straal afneemt om het buitenoppervlak van een enkele microlens continu te polymeriseren. Stel de arcerings- en snijparameters in langs respectievelijk de X- en Z-richting.
      NOTITIE: Bij het ontwerp van de lenzen moet rekening worden gehouden met de door de gebruiker gewenste effectieve brandpuntsafstand. Als vuistregel geldt dat het een waarde moet zijn die langer is dan de dikte van het dekglaasje, en dat het mogelijk moet zijn om de hele atlas af te beelden. Een voorlopige computationele simulatie van het uiteindelijke optische systeem wordt aanbevolen.
   5. Stel het polymerisatievermogen in (~ 15-20 mW) en voer het programma uit dat de beweging van de translatiefasen begeleidt.
      OPMERKING: Deze polymerisatiekrachten worden beïnvloed door de hoogte van de bovenste druppel, de specifieke experimentele omstandigheden en het ontwerp van de gewenste microlens (Figuur 3B). Figuur 4 toont een representatief voorbeeld van een parabolische microlens met de parametrische functie die het microlensprofiel en de belangrijkste geometrische kenmerken ervan beschrijft.

3. Ontwikkeling van monsters

1. Verwijder het monster uit de experimentele fabricageopstelling.
   1. Terwijl de laser is uitgeschakeld, schakelt u de X-, Y- en Z-translatieas uit en verwijdert u de houder.
   2. Verwijder de plakband en maak het monster los van de houder.
      OPMERKING: Let er vóór de ontwikkeling van het monster op dat het monster niet wordt blootgesteld aan omgevingslicht vanwege het lichtgevoelige materiaal. Blootstelling aan licht zou de hele hoeveelheid fotoresist verknopen.
2. Ontwikkeling van de steekproef (figuur 5A)
   1. Plaats het monster op een geschikte steun om het van de grond te tillen en houd het in een horizontale positie.
      OPMERKING: Deze monsterhouder is een op maat gemaakt SLA-geprint monsterrek dat goed is ontworpen om zowel de 2PP-prototypeoppervlakken bloot te stellen aan de ontwikkelingsoplossing⁵.
   2. Bereid een bekerglas van 50 ml voor en plaats de steun met het monster erin.
      OPMERKING: Let erop dat de 2PP-microlenzen op het bovenoppervlak blijven om structurele vervorming tijdens de ontwikkeling te voorkomen als gevolg van hun niet-gepolymeriseerde binnenkern.
   3. Vul het bekerglas met ~20 ml ontwikkeloplossing en bedek het monster volledig. De oplossing wordt gemaakt door 50% (v/v) 2-pentanon en 50% (v/v) isopropylalcoholoplossing.
   4. Laat het monster 45 minuten in de ontwikkeloplossing zitten.
3. Monster wassen
   1. Til de ondersteuning van de ontwikkelende oplossing op.
   2. Door het handmatig te hanteren of door een pincet te gebruiken, neemt u het monster en wast u het zorgvuldig met een paar druppels isopropylalcohol.
   3. Droog beide gefabriceerde oppervlakken van de glazen dekslip af met een zachte stroom stikstof (bij kamertemperatuur).
      OPMERKING: Alle procedures beschreven in de stappen 3.2-3.3 worden uitgevoerd onder een chemische zuurkast.

4. Monster UV-bestraling

1. Blootstelling van microlenzen aan UV-straling (golflengte van 385 nm) (Figuur 5B)
   1. Plaats het glazen dekglaasje op een monsterhouder die aan het grondvlak hangt. Leg het monster met de microlenzen naar beneden gericht.
      OPMERKING: De monsterhouder heeft een centraal gat om het monster te plaatsen dat aan de grondfase hangt, waardoor de integriteit van de microstructuur op het bodemoppervlak behouden blijft.
   2. Bereid een UV-lamp voor met een golflengte van 385 nm.
   3. Plaats het monster onder de UV-bron, loodrecht georiënteerd ten opzichte van het oppervlak van het glazen dekglaasje.
   4. Stel het monster gedurende 120 s bloot aan UV-straling ingesteld op 300 mW.
      OPMERKING: De UV-blootstelling vindt plaats via de microsteiger en het glazen substraat. Op deze manier wordt de nog niet gepolymeriseerde kern van de lenzen UV-verknoopt, waardoor directe en extra blootstelling aan het eerder gepolymeriseerde oppervlak wordt vermeden.
   5. Herhaal stap 4.1.4 door de UV-bron te betitelen op -45° en +45° ten opzichte van de normale positie van het monstervlak.
      OPMERKING: Deze driestaps UV-blootstelling onder verschillende hoeken zorgt ervoor dat de volledige niet-gepolymeriseerde weerstand binnen het volume van de microlens volledig wordt verknoopt, waardoor stabiliteit wordt bereikt. Dit is vooral belangrijk voor brede microlenzen.
   6. Haal het monster uit de houder en bewaar het.

5. Morfologische karakterisering

1. Scanning Elektronenmicroscopie (SEM) acquisities (Figuur 6)
   1. Bereid het SEM-station voor. Bevestig een stuk carbontape aan de SEM-houder voor hechting van het monster.
   2. Plaats het glasmonster op de houder onder een hoek van 45° ten opzichte van de oriëntatie van de SEM-camera. Let erop dat u het monster in een lege ruimte op het dekglaasje bevestigt om de integriteit van de structuur te behouden (Figuur 6B).
   3. Herhaal de acquisitie zoals in stap 5.1.2 voor zowel de oppervlakken van het glazen dekglaasje om 3D SEM-beelden van de microsteigers als de microlenzen te verzamelen (Figuur 6A,C).
   4. Maak het monster voorzichtig los van de carbontape en bewaar het in een afgedekte doos.

Results

Er is een protocol verstrekt voor de fabricage van een dubbelzijdig implanteerbaar microgestructureerd apparaat met een optisch systeem en een referentie voor weefselanalyse. Het proces maakt gebruik van laserpolymerisatie met twee fotonen om 3D-microstructuren en micro-optica aan de andere kant van hetzelfde substraat te fabriceren. Het gebruik van een objectief voor lange afstanden maakt het mogelijk om beide structuren te vervaardigen zonder het substraat om te draaien, waardoor de heruitlijningsstap wordt bespaard en een perfecte uitlijning tussen beide componenten wordt gegarandeerd. Dit apparaat maakt geavanceerde beeldvorming in situ mogelijk door correctie van optische aberraties en herhaalde observaties van hetzelfde gebied mogelijk te maken, dankzij micro-optica en een gemicrofabriceerd referentiekader. Figuur 1 toont de procedure voor het voorbereiden van beide oppervlakken van het ondersteunende substraat voor de latere productie. Een schets van de experimentele opstelling die is gebruikt om beide oppervlakken van het monster te microfabriceren, is weergegeven in figuur 2. De afbeelding toont ook de complexe objectief-monsterhouder, waarbij de eerste zich richt op het monster dat wordt verlicht door een rood LED-verlichtingssysteem, waardoor real-time monitoring van de productie mogelijk is met behulp van machine vision. Figuur 3 toont kwalitatief de flexibiliteit van het protocol aan bij het mogelijk maken van de microfabricage van verschillende ontwerpen van microsteigers en microlenzen. Figuur 4 toont de doorzakfunctie die wordt gebruikt om een microlens te ontwerpen met een asferisch parabolisch profiel en een schets van een representatief ontwerp dat gecorreleerd is aan de belangrijkste kenmerken als voorbeeld. In figuur 5 worden de monsterontwikkeling en UV-blootstellingsstappen gerapporteerd die nodig zijn om het hele volume van de microlenzen volledig te verknopen. Ten slotte toont figuur 6 voorbeelden van resultaten van microfabricage. De gepresenteerde procedure maakt de polymerisatie van 3D-microstructuren van beide oppervlakken van hetzelfde apparaat mogelijk, wat zorgt voor een uitstekende resolutie en stabiliteit. Ten slotte is Figuur 7 een illustratie die de algemene workflow van het protocol weergeeft, eindigend met Figuur 8, die een voorbeeld toont van een uiteindelijke toepassing van het voorgestelde apparaat, d.w.z. in vitro beeldvorming van cellen die in de microsteiger worden gekweekt.

Figuur 1: Protocol voor de voorbereiding van het monster. Deze afbeelding toont een schets van het dubbele stapproces voor fotoresist drop-casting op een ondersteunende ronde glazen dekglaasje (A). Aan de rechterkant is een foto van het monster met de gedroogde fotoresist aan beide zijden gedeponeerd (B). Het monster wordt ondersteund door de monsterhouder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Fabricage-opstelling voor laserpolymerisatie met twee fotonen (2PP). Aan de rechterkant wordt een representatief diagram van de fabricageopstelling gerapporteerd. De belangrijkste componenten van de opstelling zijn een femtoseconde-laserbron met een golflengte van 1030 nm, een minimale pulsbreedte van 230 fs en een herhalingsfrequentie van 1 MHz), een podium voor vermogensregeling, een bundelexpander, een dichroïsche spiegel en een microscoopobjectief met een hoge numerieke apertuur (100x, NA 1.1). Een CCD-camera is gemonteerd boven de dichroïsche spiegel die is uitgelijnd met de objectieve optische as voor het bewaken van het fabricageproces. Aan de linkerkant is er een vergroting, waarbij de zoom van het laatste deel van de optische opstelling een foto toont van het complexe objectief/monsterhouder/LED-verlichtingssysteem voor machine vision. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Meerdere ontwerpen van 3D-microstructuren en microlenzen. De figuur toont verschillende voorbeelden van (A) micro-scaffolds en (B) microlenzen die met behulp van de voorgestelde procedure kunnen worden vervaardigd. De hoge flexibiliteit van het protocol maakt de fabricage van microstructuren mogelijk met een verscheidenheid aan geometrische kenmerken, resolutie, afmetingen en volume, wat de veelzijdigheid ervan aantoont. De grijsschaal in paneel (B) is bedoeld om de afname van het laservermogen en de schrijfsnelheid te benadrukken om het oppervlak glad te strijken en de oppervlakteruwheid te minimaliseren. Nauwkeurige fabricageparameters worden ingesteld op basis van het specifieke ontwerp van de microlens. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Voorbeeld van gefabriceerde microlens. Het paneel toont een representatief voorbeeld van een asferisch parabolisch profiel dat de parametrische beschrijving van het gebogen oppervlak van de lens benadrukt als doorzakfunctie z(r) (A). Hier is H_tot de lensdikte, r is de radiale coördinaat en f_n is de brandpuntsafstand van een parabolische refractieve lens die verschilt van de effectieve brandpuntsafstand. Het dioptrische vermogen wordt bepaald door de brekingsindex van de lens en hoe deze verschilt van die van het omringende medium. Aan de rechterkant benadrukt de ontwerpschets de twee hoofdvlakken die op het hoekpunt V1 liggen en een paar μm boven oppervlak 2 (Π1 en Π2, stippellijnen) (B). De schets toont een enkele asferische parabolische microlens met een diameter van 600 μm en vervaardigd op een N-BK7 glassubstraat (met een dikte van 170 μm). (C) onderstreept de geometrische parameters voor de asferische parabolische lens die is gemicrofabriceerd in SZ2080 fotoresist. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Protocollen voor monsterontwikkeling en UV-blootstelling. De afbeelding markeert het gefabriceerde monster dat als schets in de ontwikkelingsoplossing is gedrenkt (A). Het monster wordt door de houder in de oplossing getild, waardoor beide zijden van het monster goed kunnen worden ontwikkeld en het dubbelzijdige microgestructureerde apparaat wordt verkregen. Aan de rechterkant wordt een foto van de opstellingsconfiguratie voor UV-bestraling van het monster gerapporteerd (B). Op de afbeelding is de UV-lamp te zien die loodrecht op het oppervlak van het monster is geplaatst. Zoals vermeld in het gegevensblad van de UV-lamp, is de stroomafstand tussen de lamp en het monster komt overeen met de werkafstand van de lamp. Het monster dat UV-straling ondergaat en door de monsterhouder wordt gehanteerd, wordt gemarkeerd in de ingezoomde afbeelding aan de rechterkant. Schaal balk: 12 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Scanning elektronenmicroscopie (SEM) verwervingen van representatieve fabricageresultaten. Het paneel belicht een dubbelzijdig gefabriceerd apparaat door middel van een zijaanzicht (B) en twee representatieve resultaten van gefabriceerde microlens (A) en microsteiger (C) door SEM-beelden. De twee constructies die op verschillende vlakken van hetzelfde glassubstraat liggen, zijn duidelijk zichtbaar in de centrale afbeelding (B). De microlenzen zijn weergegeven op het onderste oppervlak van het glas, terwijl de micro-steigers zich op de bovenste bevinden. Het SEM-beeld van een gefabriceerde microlens met een sferisch ontwerp wordt aan de rechterkant weergegeven als een voorbeeld van het stabiele en soepele resultaat van fabricage (A). Aan de linkerkant toont de afbeelding een representatief resultaat van een 2PP poreuze microsteiger met willekeurige geometrie (C). Schaal staven: (A,C) - 50 μm; (B) - 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 7: Schematisch diagram van de protocolworkflow en apparaattoepassing: De afbeelding geeft het algehele productieproces weer dat stap voor stap wordt geschetst. Het begint met de voorbereiding van het monster door het sequentiële fotoresist drop-casting op beide oppervlakken van het glassubstraat (1). Zodra de fotoresist een sol-geltoestand bereikt, is het monster klaar om te worden vervaardigd door laserpolymerisatie met twee fotonen (2). Daarom worden beide fotoresistdruppels achtereenvolgens bestraald, waarbij eerst de microstructuren en vervolgens de microlenzen worden gemicrostructureerd. Daarna ondergaat het dubbelzijdige microgefabriceerde substraat een ontwikkelingsprocedure om alle niet-gepolymeriseerde weerstand rond de constructies te verwijderen (3). Om dit te doen, wordt het monster gedrenkt in een alcoholische oplossing en vervolgens voorzichtig gedroogd. Volgt de UV-straling van het monster door door het glasachtige substraat te gaan om de niet-gepolymeriseerde binnenkern van de microlenzen volledig te verknopen (4). Ten slotte wordt een kwaliteitscontrole van het gemicrofabriceerde monster uitgevoerd door middel van Scanning Electron Microscopy (SEM) acquisities om de microstructuren morfologisch te karakteriseren (5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Mogelijke toepassing van het microgestructureerde beeldvormingsvenster. Aan de linkerkant illustreert een representatieve schets het optische systeem dat wordt gevormd door het apparaat dat in een standaard scansysteem (A) is gekoppeld aan een extern microscoopobjectief. Dit is de zogenaamde virtuele configuratie die in dit geval wordt gebruikt voor het in beeld brengen van de groei van levende cellen in de microsteiger. Fluorescentiefibroblasten (Red Fluorescence Protein (RFP) gelabeld) werden gezaaid op het glazen oppervlak van het apparaat, dat de 3D-microstructuren draagt. Confocale fluorescentiebeelden van cellen zijn gemaakt op het brandvlak van de glazen dekglaasje (B, groene hashtag), dus met het enige gebruik van het externe objectief, en door een enkele microlens in het brandvlak (A, violette hashtag). Celkernen zijn zichtbaar in blauw (Hoechst-kleuring) en cytoskelet in rood (RFP). Schaal staven: (B) - 100 μm; (C) - 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Om een nauwkeurige beeldvorming van het gewenste gebied ^3,6 in het microgestructureerde venster te garanderen, is het verplicht om een nauwkeurige uitlijning van de twee structuren (microsteiger en microlenzen) te hebben. Dit vormt de grootste uitdaging van het voorgestelde protocol, aangezien de hoge resolutie van 2PP nauw verband houdt met een beperking in de fabricagediepte ^3,6. Het omdraaien van het monster tijdens de fabricage om beide oppervlakken achtereenvolgens bloot te stellen aan de laserstraal kan een optie zijn, maar het bemoeilijkt het opnieuw uitlijnen en is tijdrovend⁵. Dit zou ook problemen opleveren bij het vinden van hetzelfde referentiesysteem en dus de goede afstemming tussen micro-optische componenten en micro-steigers in gevaar brengen. Door het hele proces continu uit te voeren zonder het monster te demonteren, blijft een consistent referentiesysteem behouden, waardoor een nauwkeurige uitlijning van de structuren wordt vergemakkelijkt en gegarandeerd. Om dit te doen, gebruiken we een objectief voor een lange afstand (2,5 mm) dat dankzij de hoge numerieke opening een goede resolutie behoudt (stap 1.1). Deze aanpak verkort ook de fabricagetijd aanzienlijk, omdat het de uitlijning van het monster na het omdraaien bespaart³. Bovendien vormt het hanteren van de monsters een andere uitdaging vanwege hun kleine formaat en kwetsbaarheid, waardoor manipulatie en nauwkeurige uitlijning nog belangrijker worden.

In 2PP-processen is een breed onderzoek van het fabricageproces essentieel om belangrijke parameters vast te stellen, zoals de optimale lasergolflengte, pulsbreedte, laservermogens en fasebewegingen ^9,10,11. Daarom is een uitgebreide karakterisering van het 2PP-proces uitgevoerd, waarbij zelfs rekening is gehouden met verschillende configuraties van de experimentele opstelling om eerst zeer stabiele 3D-structuren met hoge resolutie en detail op cellulaire schaal voor biologische toepassingen te garanderen, 27,28,29,30. Bovendien was het minimaliseren van de oppervlakteruwheid van de implanteerbare microlenzen cruciaal voor het verkrijgen van hoogwaardige micro-optica met de gewenste optische eigenschappen, waardoor de immunologische respons op het implantaat werd verminderd 19,22,31. Daarom ligt de uitdaging van het proces in het aanpassen van parameters zoals vermogen en pulsbreedte op basis van experimentele factoren zoals de brekingsindex en het volume van het lichtgevoelige materiaal, omgevingsomstandigheden (bijv. vochtigheid en temperatuur) en laserefficiëntie. Er was ook een uitgebreide karakterisering nodig voor de UV-blootstellingstijd en -intensiteit om het volledige volume van de microlenzen volledig te verknopen en hun stabiliteit te garanderen. Deze instellingen moeten worden afgestemd op de UV-bron, de werkafstand en het specifieke volume van het element dat moet worden UV-gepolymeriseerd.

Een primaire beperking van het 2PP-proces is de lage doorvoer vanwege de extreem hoge resolutie die het biedt. Gezien het feit dat gepolymeriseerde kenmerken erg klein zijn, van honderden nanometers tot enkele micrometers ^9,26. Daarom nemen de fabricagetijden aanzienlijk toe bij het produceren van constructies op de schaal van honderden micrometers, die relatief groot zijn volgens de 2PP-normen, vooral als het omvangrijke constructies zijn. Als gevolg hiervan kan het maken van geïntegreerde apparaten met meerdere structuren van zulke grote afmetingen enkele uren duren. In dit kader verbeterde het hybride UV-2PP-protocol dat werd voorgesteld voor de productie van microlenzen een vermindering van de fabricagetijd van een enkele microlens met 98% in vergelijking met de 2PP van het volledige volume. Dit zorgde voor een grotere precisie bij het 2PP-scannen van de buitenschaal van de microlens, waardoor de oppervlakteruwheid werd verminderd en een microlensschaal werd verkregen die dik genoeg was om lensstabiliteit te garanderen, en dat alles binnen een aanvaardbare fabricagetijd. Om het proces verder te versnellen, zal in de toekomst een parallellisatiebenadering worden voorgesteld om gelijktijdig schrijven van meerdere structuren mogelijk te maken³². Deze strategie zou inhouden dat de laserstraal in meerdere stralen wordt gesplitst om verschillende brandpunten te creëren, waardoor parallelle fabricage mogelijk wordt en de totale productietijd aanzienlijk wordt verkort.

In tegenstelling tot de meest gebruikelijke zachte lithografische technieken, is een van de belangrijkste voordelen van de 2PP dat het een maskerloze additieve productiebenadering is die de fabricage van willekeurige structuren binnen een hoeveelheid lichtgevoelig materiaal mogelijk maakt¹¹. Deze mogelijkheid maakt de productie mogelijk van complexe driedimensionale en poreuze structuren met een hoog aanpassingspotentieel. Bovendien maakt de 2PP, gebaseerd op het principe van niet-lineaire absorptie, het mogelijk om een resolutie onder de diffractielimiet te bereiken, wat niet haalbaar is met standaard 3D-printtechnieken of fused deposition modeling (FDM) als voorbeeld³³. Dit is met name waardevol voor het maken van poreuze 3D-steigers met functies op cellulaire schaal om cellulaire groei, rekrutering en weefselintegratie te ondersteunen.

De productie van microgestructureerde implanteerbare apparaten met geïntegreerde optica door het hier voorgestelde proces heeft het potentieel om een aanzienlijke impact te hebben op toepassingen die mechanobiologie, in vitro ziektemodellering en weefselmanipulatie omvatten (Figuur 7 en Figuur 8). Het gepresenteerde protocol maakt de fabricage mogelijk van een hoogwaardig technisch apparaat met microstructuren die weefselintegratie ondersteunen en tegelijkertijd dienen als in vivo beeldvormingsreferentiepunten. Bovendien verbeterden die goed ontworpen microlenzen geavanceerde niet-lineaire beeldvorming door sferische aberraties te corrigeren die werden veroorzaakt door het weefsel rond het implantaat⁴. De veelzijdigheid van het proces stelt ons in feite in staat om het ontwerp van het apparaat aan te passen, bijvoorbeeld om steigers en referentiestructuren te maken met een geometrie die is geoptimaliseerd voor specifieke toepassingen, wat helpt bij zowel 3D-reconstructies als correctie van beeldafwijking Ten slotte verbetert het op maat maken van het ontwerp van microlenzen op basis van weefselbrekingsindices de toepassingsspecifieke beeldvorming, waardoor effectief een in-situ optische lens in het apparaat wordt gecreëerd.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beam Expander	Thorlabs, Germany	GBE03-C	3X Achromatic Galilean Beam Expander, AR Coated: 650 - 1050 nm (GBE03-C)
Controlled Motorized Rotator	Aerotech, USA	MPS50GR	MPS50GR-TTM-G80-DC-LMO-PLOTS
Coverslips	Menzel-Glaser, Germany	CB00120RA1	12 mm diameter circular glass coverslip with a thickness between 170 and 230 µm (#1.5)
Development solution	Sigma Aldrich, USA.	Custom Solution	50% v/v 2-pentanone, 50% v/v isopropyl alcohol solution
Dichroic Mirror (1030 nm)	Eskma Optics, Lithuania	810-1030D	Ø1" Shortpass Dichroic Mirror, 805 nm Cutoff
Femtosecond laser	Satsuma, Amplitude	Satsuma Series	Femtosecond Ytterbium (Yb) fiber laser (λ = 1030nm, 1MHz, with minimum pulse duration = 230 fs,
Gimbal	Thorlabs, Germany	GMB100	Gimbal Mounts 100
Half wave plate	Thorlabs, Germany	AHWP05M-980	λ/2 at 690-1200 nm (AHWP05M-980)
Machine vision	Thorlabs, Germany	DCU223M/DCU223C	CCD camera  mounted behind a dichroic mirror
Microscope Objective	Nikon, Japan	MRD71100	CFI plan 100×C WI objective with a numerical aperture  1.1
Movement system	Aerotech, USA	ANT130-035-L-ZS; ANT95-50-XY	ANT130-035-L-ZS; ANT95-50-XY
NIR Alignment Pinhole	Thorlabs, Germany	VRC1D1	Ø1" Disk made from slow-fading phosphor material with a 1.5 mm hole in the center
Photoresist SZ2080	Forth, Greece	SZ2080	UV curable photoresist SZ2080+Irgacure-369 Photoiniziator
Pipette	Gilson, USA	F123615	Pipetman 100G
Scanning electron Microscope (SEM)	Phenom World, Netherlands	Phenom Pro	PHENOM PRO
Software CNC	Aerotech, USA	A3200	Automation 3200 CNC Operator Interface
UV Lamp	Hamamatsu, Japan	LC-L1V3	LIGHTNINGCURE ,LC-L1V3