Geoptimaliseerde workflow voor iteratief bleken breidt multiplexiteitsbeeldvorming van sterk autofluorescerende klinische monsters uit

Summary

De implementatie van een goedkope, veelzijdige fotobestralingstechniek met de handmatige IBEX-methode zorgt voor een optimale beeldvorming van menselijk weefsel met aanzienlijke natuurlijke autofluorescentie. Dit protocol beschrijft hoe gemultiplexte beelden van hele dia's kunnen worden verkregen uit gearchiveerde klinische monsters met behulp van een omgekeerde microscoop, algemeen verkrijgbare reagentia en open-source software voor beelduitlijning en -verwerking.

Abstract

De prevalentie van longziekten als gevolg van niet-tuberculeuze mycobacteriën (NTM) is wereldwijd toegenomen. Hoewel NTM-geïnduceerde longziekte zich vaak presenteert met bronchiëctasieën, longknobbeltjes en cavitaire ziekte, is de gastheerrespons geassocieerd met deze verschillende longletselpatronen niet goed gekarakteriseerd in situ. We probeerden mechanismen van NTM-geïnduceerde pathologie te evalueren door een diepgaande fenotypische analyse uit te voeren van immuuncelpopulaties in longweefsel van personen met NTM-ziekte in vergelijking met een gouden standaard van granulomateuze ontsteking, tuberculeuze (TB) longziekte.

Formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) longblokkades van patiënten met gedissemineerde NTM-, pulmonale NTM- of longtuberculoseziekte werden doorgesneden en gekleurd na een aangepaste versie van de Iterative Bleaching Extend multi-pleXity (IBEX) beeldvormingsmethode. Optimalisatie van de IBEX-methode was eerst nodig om de significante endogene fluorescentie van longsecties aan te pakken als gevolg van de hoge dichtheid van collageen, elastine en erytrocyten die eigen zijn aan longweefsel, die wordt verergerd door FFPE-conservering en de ouderdom van de FFPE-blokken. In dit protocol beschrijven we een fotobestralingsprotocol en een aangepaste antigeenophaalmethode die de autofluorescentie van klinisch gearchiveerde monsters vermindert.

Verder geven we richtlijnen voor het ontwerp van antilichaampanelen, inclusief veelvoorkomende uitdagingen zoals kruisreactiviteit, epitoopverlies na fotobestraling, spectrale overlap tussen aangrenzende fluoroforen en lage signaal-ruisverhouding voor bepaalde doelen. Om een efficiënte beeldvorming van hele longweefselsecties mogelijk te maken, werden dia's afgebeeld met een breedveldmicroscoop en nabewerkt met open-source software om de beeldkwaliteit te verbeteren. Samen voorziet deze workflow in een kritieke behoefte door te documenteren hoe sterk gemultiplexte beelden met hoge resolutie van hele dia's kunnen worden verkregen uit uitdagende monsters met behulp van algemeen beschikbare instrumenten en reagentia. Naast kwantitatieve beeldvorming van klinische monsters, kunnen deze technieken worden toegepast op verschillende soorten monsters om zowel endogene als exogene bronnen van fluorescentie te overwinnen.

Introduction

Tuberculose (tbc) is een van de belangrijkste doodsoorzaken, met ongeveer 1,3 miljoen mensen die elk jaar sterven aan een tbc-infectie^. Hoewel niet zo dodelijk als tuberculose, is er de afgelopen jaren een aanzienlijke toename geweest van longinfecties en de daaropvolgende ziekte veroorzaakt door niet-tuberculeuze mycobacteriën (NTM)². Op weefselniveau is de immuunrespons van de gastheer op pulmonale Mycobacterium tuberculosis (Mtb)-infectie goed bestudeerd en omvat de vorming van granulomen, heterogene aggregaten van lymfocyten, dendritische cellen, macrofagen en neutrofielen

Protocol

Gearchiveerde autopsie en chirurgische resectie longweefselsecties werden verzameld onder protocol 09-H-0172 (NCT00943514), Natural History of Bronchiëctasie, in het National Institutes of Health Clinical Center Laboratory of Pathology. Dit protocol was IRB-goedgekeurd en de deelnemers gaven geïnformeerde toestemming.

1. Geautomatiseerde extractie van antigen

OPMERKING: Deparaffinisatie en antigeenextractie werden uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerd onderzoekskleuringsplatform (Figuur 1). Eerder werk stelde vast dat een benadering voor he....

Results

Het ontwerpen van een beeldvormingspaneel op basis van multiplexed antilichamen vereist veel tijd, moeite en middelen¹². Deze uitdagingen zijn vooral uitgesproken bij het ontwerpen van een panel voor gearchiveerde FFPE-monsters van sterk autofluorescerende weefsels, zoals hier beschreven (Figuur 1). Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, hebben we eerst de helderste fluoroforen geïdentificeerd die compatibel zijn met ons kleurstofin.......

Discussion

Klinische longpathologie van longtuberculose wordt gekenmerkt door necrotiserende granulomateuze ontsteking. NTM-longpathologie komt voornamelijk voor in twee verschillende patiëntenpopulaties met twee afzonderlijke pathologische patronen: geïsoleerd longletsel gekenmerkt door granulomateuze ontsteking met bronchiolaire vernietiging en holtevorming bij immunocompetente personen, of diffuse nodulaire ziekte die de longen en andere organen aantast bij immunodeficiënte personen 13,14,15,16<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3% Triton-X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Solution for blocking buffer
1% BSA	Sigma-Aldrich	A4503	Solution for blocking buffer
1% Human BD Fc Block	BD Biosciences	564220	Fc Block required for blocking buffer
150 W LED lamp	Amazon	B07VH3CVSF	LED light source for tissue photoirradiation
1x PBS	Gibco	10010-023	Solution for blocking buffer and wash steps
20 Gallon Storage Container	Amazon	B001B1C4G0	Container for photoirradiation process
40 W RGBW flood LED lamp	Amazon	B08QFPJSMD	RGB light source for tissue photoirradiation
Ag85B	Abcam	ab43019/NA	Antibody for IBEX imaging. See Table 1.
Alpha-smooth muscle actin DyLight 755	Novus Biologicals	NBP2-345221R/NA	Antibody for IBEX imaging. See Table 1.
Avidin/Biotin Blocking Kit	Abcam	ab64212	Avidin and biotin blocking solution
BD Cytofix/Cytoperm	BD Biosciences	554714	Fixation solution
BOND Dewax Solution	Leica Biosystems	NC0221076	Deparaffinization solution
BOND Epitope Retrieval Solution 1	Leica Biosystems	NC0235529	Citrate based pH 6 epitope retrieval solution (ER1)
BOND Epitope Retrieval Solution 2	Leica Biosystems	NC0235530	EDTA based pH 9 epitope retrieval solution (ER2)
BOND Research Detection System	Leica Biosystems	NC0396648	Automated research staining reagent
BOND RX Research Stainer	Leica Biosystems	NA	Automated research staining platform
BOND Wash Solution	Leica Biosystems	NC0221077	Wash buffer
CD15	BD Biosciences	347420/AB_400298	Antibody for IBEX imaging. See Table 1.
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Scientific	50-0202-82/AB_11150959	Antibody for IBEX imaging. See Table 1.
CD4 Alexa Fluor 488	R&D Systems	FAB8165G/AB_2728839	Antibody for IBEX imaging. See Table 1.
CD45 Phycoerythrin (PE)	Novus Biologicals	NBP2-34528PE/NA	Antibody for IBEX imaging. See Table 1.
CD68 iFluor 594	Caprico Biotechnologies	1064135/AB_2892745	Antibody for IBEX imaging. See Table 1.
Donkey anti-goat IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Fisher Scientific	A32814/AB_2762838	Antibody for IBEX imaging. See Table 1.
Donkey anti-mouse IgG Alexa Fluor Plus AF647	Thermo Fisher Scientific	A32787/ AB_2762830	Antibody for IBEX imaging. See Table 1.
Donkey anti-mouse IgM Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	715-545-020/AB_2340844	Antibody for IBEX imaging. See Table 1.
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor Plus AF555	Thermo Fisher Scientific	A32794/AB_2762834	Antibody for IBEX imaging. See Table 1.
EasyDip Staining System	Newcomer Supply	5300KIT	Slide staining system
Fluoromount-G	Thermo Fisher Scientific	00-4958-02	Mounting media
Hoechst	Biotium	40046	Nuclear stain for IBEX imaging. See Table 1.
Imaris File Converter x64 10.2.0	Imaris Oxford Instruments		Free file converter
ImarisViewer software x64 10.2.0	Imaris Oxford Instruments		Free image processing software
ImmEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000	Hydrophobic barrier pen
Lithium Borohydride (1 gram)	STREM Chemicals	93-0397	Chemical for dye inactivation, buy small aliquots of this chemical (1 gram)
Lumican Biotin	R&D Systems	BAF2846	Antibody for IBEX imaging. See Table 1.
Micro Cover Glasses	VWR	48393-241	Glass slide covers
Pan-cytokeratin Alexa Fluor 750	Novus Biologicals	NBP2-33200AF750/AB_2868569	Antibody for IBEX imaging. See Table 1.
PELCO BioWave Pro Microwave System	Ted Pella Inc	36500-230	Non-heating scientific microwave
PELCO SteadyTemp Pro	Ted Pella Inc	50062	Fully automated temperature control for scientific microwave
SimpleITK	Open source software		Registration and channel processing software
Streptavidin Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	S11227	Labeling reagent for IBEX imaging. See Table 1.
Widefield Microscope	Leica Microsystems	NA	Leica Microsystems THUNDER imager with LED8 light source and LAS X software (3.7.1.21655). For fluorescence imaging, a custom quad-band filter with external filter wheel (PN: 11536075) with two additional single-band filters (PN: 8118215) were used to image seven dye channels per pass. The filter excitation, dichroic and emission lines are (1) Quad-Band cube: dichroic at 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, no excitation or emission filters; (2) external filter wheel position 1: 434/32, position 2: 520/40, position 3: 585/20, position 4: 720/60, position 5: pass-through; (3) single-band 1—585/22 excitation, 594 dichroic, 625/30 emission; (4) single-band 2—635/20 excitation, 647 dichroic, 667/30 emission.
Zeiss Optical Lens Cleaner	Amazon	B00GPVQVCO	Microscope objective lens cleaner
Antibodies
Ag85B	Abcam	ab43019	Polyclonal Rabbit IgG, cycle 1
Alpha-smooth muscle actin DyLight 755	Novus Biologicals	NBP2-345221R	1A4/asm-1, cycle 1
CD4 Alexa Fluor 488	R&D Systems	FAB8165G	Polyclonal Goat IgG, cycle 1
CD8 Alexa Fluor 647	BioLegend	372906	C8/144B, cycle 1
CD68 iFluor 594	Caprico Biotechnologies	1064135	KP1, cycle 1
Donkey anti-goat IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Fisher Scientific	A32814	Polyclonal Donkey, cycle 1
Donkey anti-mouse IgG Alexa Fluor Plus AF647	Thermo Fisher Scientific	A32787	Polyclonal Donkey, cycle 1
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor Plus AF555	Thermo Fisher Scientific	A32794	Polyclonal Donkey, cycle 1
Hoechst	Biotium	40046	Nuclear label, cycle 1
CD15	BD Biosciences	347420	MMA, cycle 2
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Scientific	50-0202-82	L26, cycle 2
CD45 Phycoerythrin (PE)	Novus Biologicals	NBP2-34528PE	2B11 + PD7/26, cycle 2
Donkey anti-mouse IgM Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	715-545-020	Polyclonal Donkey, cycle 2
Lumican Biotin	R&D Systems	BAF2846	Polyclonal Goat IgG, cycle 2
Pan-cytokeratin Alexa Fluor 750	Novus Biologicals	NBP2-33200AF750	AE-1/AE-3, cycle 2
Streptavidin Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	S11227	N/A, cycle 2
Hoechst	Biotium	40046	cycle 2
Solutions
Blocking Buffer (Cycle 1)
Triton-X-100	Sigma-Aldrich	T8787	0.3% by volume
BSA	Sigma-Aldrich	A4503	1% by volume
Human BD Fc Block	BD Biosciences	564220	1% by volume
1x PBS	Gibco	10010-023	97.7% by volume
Primary Antibody Staining Solution #1 (Cycle 1)
Blocking Buffer (Cycle 1)	See above		Top up to volume after adding antibodies
Hoechst	Biotium	40046	1:5000
CD8 AF647	BioLegend	372906	1:10
Primary Antibody Staining Solution #2 (Cycle 1)
Blocking Buffer (Cycle 1)	See above		Top up to volume after adding antibodies
CD4 AF488	R&D Systems	FAB8165G	1:10
Ag85B	Abcam	ab43019/NA	1:100
Secondary Antibody Staining Solution #1 (Cycle 1)
Blocking Buffer (Cycle 1)	See above		Top up to volume after adding antibodies
Donkey Anti-Goat AF Plus 488	Thermo Fisher Scientific	A32814/AB_2762838	1:100
Donkey anti-Rabbit AF Plus 555	Thermo Fisher Scientific	A32794/AB_2762834	1:100
Donkey anti-Mouse AF Plus 647	Thermo Fisher Scientific	A32787/AB_2762830	1:50
Primary Antibody Staining Solution #3 (Cycle 1)
Blocking Buffer (Cycle 1)	See above		Top up to volume after adding antibodies
CD68 iF594	Caprico Biotechnologies	1064135	1:10
a-SMA DL755	Novus Biologicals	NBP2-345221R/NA	1:30
BSA-free Blocking Buffer (Cycle 2)
Triton-X-100	Sigma-Aldrich	T8787	0.3% by volume
Human BD Fc Block	BD Biosciences	564220	1% by volume
1x PBS	Gibco	10010-023	98.7% by volume
Primary Antibody Staining Solution #4 (Cycle 2)
BSA-free Blocking Buffer (Cycle 2)	See above		Top up to volume after adding antibodies
CD15	BD Biosciences	347420	1:30
Lumican Biotin	R&D Systems	BAF2846	1:100
CD45 PE	Novus Biologicals	NBP2-34528PE	1:20
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Scientific	50-0202-82	1:10
Pan-Cytokeratin AF750	Novus Biologicals	NBP2-33200AF750	1:10
Secondary Antibody Staining Solution #2 (Cycle 2)
BSA-free Blocking Buffer (Cycle 2)	See above		Top up to volume after adding antibodies
Donkey anti-Mouse IgM AF488	Jackson ImmunoResearch	715-545-020/AB_2340844	1:100
Strepavidin AF594	Thermo Fisher Scientific	S11227	1:200