Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Geoptimaliseerde workflow voor iteratief bleken breidt multiplexiteitsbeeldvorming van sterk autofluorescerende klinische monsters uit

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67980

⸱

11 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Critical Care Medicine and Pulmonary Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Lymphocyte Biology Section and Center for Advanced Tissue Imaging, Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 3Leica Microsystems Inc., 4T Lymphocyte Biology Section, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

De implementatie van een goedkope, veelzijdige fotobestralingstechniek met de handmatige IBEX-methode zorgt voor een optimale beeldvorming van menselijk weefsel met aanzienlijke natuurlijke autofluorescentie. Dit protocol beschrijft hoe gemultiplexte beelden van hele dia's kunnen worden verkregen uit gearchiveerde klinische monsters met behulp van een omgekeerde microscoop, algemeen verkrijgbare reagentia en open-source software voor beelduitlijning en -verwerking.

Samenvatting

De prevalentie van longziekten als gevolg van niet-tuberculeuze mycobacteriën (NTM) is wereldwijd toegenomen. Hoewel NTM-geïnduceerde longziekte zich vaak presenteert met bronchiëctasieën, longknobbeltjes en cavitaire ziekte, is de gastheerrespons geassocieerd met deze verschillende longletselpatronen niet goed gekarakteriseerd in situ. We probeerden mechanismen van NTM-geïnduceerde pathologie te evalueren door een diepgaande fenotypische analyse uit te voeren van immuuncelpopulaties in longweefsel van personen met NTM-ziekte in vergelijking met een gouden standaard van granulomateuze ontsteking, tuberculeuze (TB) longziekte.

Formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) longblokkades van patiënten met gedissemineerde NTM-, pulmonale NTM- of longtuberculoseziekte werden doorgesneden en gekleurd na een aangepaste versie van de Iterative Bleaching Extend multi-pleXity (IBEX) beeldvormingsmethode. Optimalisatie van de IBEX-methode was eerst nodig om de significante endogene fluorescentie van longsecties aan te pakken als gevolg van de hoge dichtheid van collageen, elastine en erytrocyten die eigen zijn aan longweefsel, die wordt verergerd door FFPE-conservering en de ouderdom van de FFPE-blokken. In dit protocol beschrijven we een fotobestralingsprotocol en een aangepaste antigeenophaalmethode die de autofluorescentie van klinisch gearchiveerde monsters vermindert.

Verder geven we richtlijnen voor het ontwerp van antilichaampanelen, inclusief veelvoorkomende uitdagingen zoals kruisreactiviteit, epitoopverlies na fotobestraling, spectrale overlap tussen aangrenzende fluoroforen en lage signaal-ruisverhouding voor bepaalde doelen. Om een efficiënte beeldvorming van hele longweefselsecties mogelijk te maken, werden dia's afgebeeld met een breedveldmicroscoop en nabewerkt met open-source software om de beeldkwaliteit te verbeteren. Samen voorziet deze workflow in een kritieke behoefte door te documenteren hoe sterk gemultiplexte beelden met hoge resolutie van hele dia's kunnen worden verkregen uit uitdagende monsters met behulp van algemeen beschikbare instrumenten en reagentia. Naast kwantitatieve beeldvorming van klinische monsters, kunnen deze technieken worden toegepast op verschillende soorten monsters om zowel endogene als exogene bronnen van fluorescentie te overwinnen.

Inleiding

Tuberculose (tbc) is een van de belangrijkste doodsoorzaken, met ongeveer 1,3 miljoen mensen die elk jaar sterven aan een tbc-infectie. Hoewel niet zo dodelijk als tuberculose, is er de afgelopen jaren een aanzienlijke toename geweest van longinfecties en de daaropvolgende ziekte veroorzaakt door niet-tuberculeuze mycobacteriën (NTM)2. Op weefselniveau is de immuunrespons van de gastheer op pulmonale Mycobacterium tuberculosis (Mtb)-infectie goed bestudeerd en omvat de vorming van granulomen, heterogene aggregaten van lymfocyten, dendritische cellen, macrofagen en neutrofielen3. Hoewel granulomateuze ontsteking ook een fundamenteel kenmerk is van de immuniteit van de gastheer tegen NTM-infectie, blijven de immuuncelpopulaties en de ruimtelijke kenmerken van deze respons onderbelicht. Het verkrijgen van een gedetailleerd begrip van de weefselcomponenten van immunopathologie versus wondgenezing is van cruciaal belang voor de ontwikkeling van behandelingen (bijv. gastheergerichte therapieën) en preventieve (d.w.z. vaccins) therapeutische strategieën.

In deze studie had ons team toegang tot zeldzame, gearchiveerde klinische monsters die waren verkregen tijdens longresecties of autopsies van patiënten met een Mtb- of NTM-infectie. De meerderheid van deze monsters was meer dan 10 jaar oud en werd bewaard als formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) monsters, waardoor het gebruik ervan beperkt bleef tot histologische testen. Om de markerbeperkingen van traditionele immunohistochemie (IHC) en immunofluorescentie (IF) beeldvorming te overwinnen, hebben we de Iterative Bleaching Extend multi-pleXity (IBEX) methode gebruikt, een open-source, sterk gemultiplexte beeldvormingsmethode 4,5. Uitbreiding van de IBEX-methode naar FFPE-monsters van menselijke longen vereiste aanzienlijke optimalisatie vanwege hoge niveaus van endogene fluorescentie, een goed beschreven obstakel voor beeldvorming op basis van multiplexed antilichamen6.

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het verminderen van autofluorescentie met behulp van een fotobestralingsmethode die is geoptimaliseerd voor long-FFPE-weefselsecties 7,8. Belangrijk is dat de hier beschreven methode gebruik maakt van een goedkope, algemeen verkrijgbare lichtbak die kan worden uitgebreid naar andere monsterpreparaten met een hoge autofluorescentie. Naast het verminderen van autofluorescentie voorafgaand aan beeldacquisitie, bieden we richtlijnen voor het ontwerp van antilichaampanelen, zoals het koppelen van markers met lage abundantie aan heldere fluorofoorlabels, het evalueren van de impact van fotobestraling op antilichaamlabeling en amplificatie met secundaire antilichamen in kanalen met hoge endogene fluorescentie. Gemiddeld verwerkten we vijf objectglaasjes die overeenkwamen met één weefselcoupe, elk variërend van 37 tot 114mm2. Ten slotte laten we zien hoe u volledige diabeelden kunt verkrijgen met behulp van een breedveldinstrument. Samenvattend beschrijft dit protocol de acceptatie van IBEX voor gearchiveerde klinische monsters en biedt het bovendien richtlijnen voor het oplossen van problemen die vaak voorkomen bij het afbeelden van sterk autofluorescerende monsters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Gearchiveerde autopsie en chirurgische resectie longweefselsecties werden verzameld onder protocol 09-H-0172 (NCT00943514), Natural History of Bronchiëctasie, in het National Institutes of Health Clinical Center Laboratory of Pathology. Dit protocol was IRB-goedgekeurd en de deelnemers gaven geïnformeerde toestemming.

1. Geautomatiseerde extractie van antigen

OPMERKING: Deparaffinisatie en antigeenextractie werden uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerd onderzoekskleuringsplatform (Figuur 1). Eerder werk stelde vast dat een benadering voor het ophalen van dubbele antigeen, bestaande uit 30 minuten met een op citraat gebaseerde pH 6-epitoopoplossing (ER1) en vervolgens 30 minuten met een op EDTA gebaseerde pH 9-epitoopoplossing (ER2) de beste immunolabelingsresultaten opleverde voor FFPE-weefsels9. Vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen met behulp van handmatig dewaxing en dubbele antigeenextractie met behulp van andere beschreven methoden en ondersteuning van de IBEX Imaging Community10,11.

  1. Verzamel dia's en geautomatiseerde benodigdheden voor het ophalen van antigeen (dia's, onderzoeksdetectiesysteem, op citraat gebaseerde pH 6-epitoopophaaloplossing (ER1), op EDTA gebaseerde pH 9-epitoopophaaloplossing (ER2), enz.).
  2. Zet het instrument aan, laat het 20 minuten initialiseren, plaats de onderzoeksdetectiearm in het instrument en plaats reagenscontainers in de bodem van de machine.
  3. Open de software, klik op dia instellen en selecteer onderzoek toevoegen en maak een nieuwe naam voor het onderzoek.
  4. Selecteer Dia toevoegen en label de dia's naar wens.
  5. Om dit protocol te volgen, voert u een Bake and Dewax-protocol uit met een HIER-protocol dat bestaat uit 30 minuten ER1 en 30 minuten ER2.
  6. Druk labels af en plak ze op de dia's. Verwijder het zwarte diarek van het instrument en plaats de dia's van belang op het rek. Plaats doorzichtige dia's op elke dia, plaats het diarek terug naar het instrument en druk op de knop onder het rek om het instrument te vragen de barcodes van de dia's te scannen.
  7. Selecteer play | ok en laat het geautomatiseerde ophalen van antigeen beginnen met een geschatte duur van 3 uur.

2. Labeling van antilichamen voorafgaand aan fotobestraling

  1. Nadat het ophalen van het antigeen is voltooid, dompelt u de dia's onder in PBS.
    OPMERKING: Bepaalde epitopen zijn gevoelig voor fotoirstraling en worden afgebroken na nachtelijke blootstelling aan de LED. Gevoelige epitopen moeten empirisch worden bepaald en wanneer ze worden ontdekt, moeten immunolabeling van deze epitopen in deze stap plaatsvinden. Zorg ervoor dat de dia te allen tijde nat blijft na het ophalen van het antigeen.
  2. Verwijder een glaasje van PBS en droog alle overtollige PBS op het glaasje af met een pluisvrij doekje; Pas op dat u het weefsel niet aanraakt. Teken een rand rond het weefsel met een hydrofobe pen. Herhaal het proces voor alle resterende dia's. Laat de hydrofobe barrière 10 minuten drogen.
  3. Bereid een Slide Moisture Chamber voor door een kleine hoeveelheid water op de bodem van elk putje te plaatsen. Plaats de glaasjes in de vochtkamer van de glijbaan. Wick PBS af van het weefsel zonder het weefselmonster direct aan te raken.
  4. Voeg 200 μL blokkeerbuffer (Materiaaltabel) toe aan elke dia. Plaats de Slide Moisture Chamber in een niet-verwarmende wetenschappelijke magnetron met een mechanisme om een constante temperatuur te behouden.
  5. Blokkeer niet-specifieke antilichaamlabeling door het volgende programma uit te voeren dat eerder is vastgesteld4: 2-1-2-1-2-1-2-2-2, waarbij "2" staat voor 2 minuten bij 100 W en "1" voor 1 minuut bij 0 W. Voer het bovenstaande programma één keer uit om te blokkeren. Als dit instrument niet beschikbaar is, blokkeer dan de weefselcoupes (5-10 μm) gedurende 1 uur bij 37 °C zoals eerder beschreven5.
  6. Maak primaire antilichaamkleuringsoplossing #1 (cyclus 1) (materiaaltabel) tijdens het blokkeren van bufferincubatie. Bereid antilichaammengsels voor volgens de materiaaltabel. Meng de antilichaamcocktail voorzichtig en draai de antilichaammix met een minicentrifuge gedurende 30 s op 2.680 × g .
    OPMERKING: Deze kleuroplossing bevat een verdunning van 1:5000 Hoechst, wat voldoende zou moeten zijn voor de duur van het experiment met twee cycli. Gebruikers moeten mogelijk Hoechst en andere antilichamen titreren om optimale resultaten te verkrijgen voor hun weefsels en beeldvormingsconfiguratie.
  7. Haal de Slide Moisture Chamber uit de magnetron wanneer de cyclus is voltooid en verwijder de blokkerende bufferoplossing van elk weefsel. Voeg 200 μL primaire antilichaamkleuringsoplossing #1 (cyclus 1) (materiaaltabel) toe aan elk glaasje. Plaats de kamer met dia's terug in de magnetron en voer het primaire antilichaamprogramma ongeveer 30 minuten uit: voer het 2-1-2-1-2-1-2-2-2-2-programma twee keer uit voor het labelen van primaire antilichamen.
    OPMERKING: Hier is 200 μL primaire antilichaamoplossing een schatting. Gebruik een voldoende hoeveelheid oplossing om het gehele oppervlak van de weefselsectie te bedekken.
  8. Zodra de primaire antilichaamlabelingsstap is voltooid, wast u elk objectglaasje met 1.000 μL PBS door het objectglaasje verticaal te kantelen, PBS op het weefsel te pipetteren en het PBS weg te laten lopen. Herhaal deze stap 3-5x.
  9. Afvoer overtollig PBS en fixeer de objectglaasjes met 1% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in de vochtigheidskamer.
    OPMERKING: PFA-fixatie kan epitopen maskeren, waardoor wordt voorkomen dat antilichamen hun beoogde doelen binden. Wanneer u voor de eerste keer een antilichaampanel opstelt, raden we aan om de impact van een zachte fixatie (1% PFA gedurende 10 minuten) te evalueren door het labelpatroon van weefselsecties die met of zonder fixatief zijn behandeld vóór immunolabeling te vergelijken. Als een antilichaam gevoelig is voor 1% PFA-fixatie, verplaats dit antilichaam dan vóór de stap na fixatie.
  10. Was de objectglaasjes 3-5x uitgebreid met 1.000 μL PBS. Laat PBS op het weefsel zitten tot de fotobestralingsstap.

3. Fotobestraling van weefsel

  1. Om de fotobestralingsbox voor te bereiden (Figuur 2), schaft u een 150 W LED-lamp, een 40 W RGBW flood LED-lamp, een grote plastic container (20 gallon [75.71 L] volume of meer), verse 1x PBS en een petrischaaltje aan.
  2. Plaats het petrischaaltje in het midden van de 150 W lamp en vul deze met 1x PBS. Gebruik voldoende volume om de dia's onder te dompelen in PBS. Voer het fotobestralingsproces uit in de koude ruimte om de warmteontwikkeling van lampen te minimaliseren.
  3. Verwijder de objectglaasjes uit de vochtkamer van de objectglaasjes en plaats ze in een petrischaaltje, zorg ervoor dat alle objectglaasjes zijn ondergedompeld in PBS.
  4. Plaats de 40 W lamp direct op de petrischaal met de lichtbron naar de dia's gericht. Zorg ervoor dat de 40 W lamp is ingesteld op de stand voor rood licht voordat u deze plaatst.
  5. Zet zowel de 150 W als de 40 W lampen aan. Bedek de fotobestralingsopstelling met het deksel van de plastic container. Houd de 40 W lamp 2 uur op de stand voor rood licht en schakel vervolgens de resterende 16 uur over naar de instelling voor groen licht via de meegeleverde afstandsbediening.
    OPMERKING: Het is absoluut noodzakelijk om fotobestraling uit te voeren bij ongeveer 4 °C om ongewenste warmtevervorming van het diaweefsel te voorkomen. Pauzepunt: fotobestraling kan 's nachts worden uitgevoerd en het protocol kan de volgende ochtend worden hervat.

4. Etikettering van antilichamen na fotobestraling

  1. Haal de objectglaasjes uit het petrischaaltje en dompel ze onder in 1x PBS in een Coplin-potje, 50 ml conische buis of een emmer uit het objectglaasjeskleursysteem. Bereid de primaire antilichaamkleuringsoplossing #2 (cyclus 1) (materiaaltabel) voor in de aanbevolen verdunningen (tabel 1). Gebruik 200 μL van de oplossing voor elk glaasje.
  2. Verwijder overtollige PBS van elke afzonderlijke dia met een pluisvrij doekje en zorg ervoor dat het gebied rond het weefsel droogt zonder het weefsel zelf aan te raken. Plaats de glaasjes in de Slide Moisture Chamber.
  3. Draai voorzichtig Primaire Antilichaam Kleuringsoplossing #2 (Cyclus 1) en voeg 200 μL toe aan elk glaasje, zodat het hele weefsel bedekt is.
  4. Plaats de Slide Moisture Chamber met de glaasjes terug in de magnetron en voer het primaire antilichaamprogramma ongeveer 30 minuten uit, zoals beschreven in stap 2.7
  5. Maak tijdens de etikettering van primaire antilichamen de oplossing voor secundaire antilichaamkleuring #1 (cyclus 1) (materiaaltabel).
  6. Zodra het magnetronprogramma is voltooid, verwijdert u de Slide Moisture Chamber en wast u elke dia 3-5x met 1,000 μL 1x PBS.
  7. Verwijder het overtollige PBS van elk afzonderlijk glaasje met een pluisvrij doekje, draai de secundaire antilichaamkleuringsoplossing los en voeg 200 μL toe aan elk glaasje.
  8. Plaats de Slide Moisture Chamber in de magnetron en voer het secundaire antilichaamprogramma uit: Een 2-1-2-1-2-2-2-2-2-2-programma, waarbij "2" staat voor 2 minuten bij 100 W en " 1" staat voor 1 minuut bij 0 W. Voer het bovenstaande programma eenmaal uit voor het labelen van secundaire antilichamen.
  9. Was de dia's 3-5x uitgebreid met 1 ml 1x PBS en verwijder het overtollige PBS van elke dia.
  10. Voeg primaire antilichaamkleuringsoplossing #3 (cyclus 1) met direct geconjugeerde antilichamen toe aan elk objectglaasje. Voer antilichaamkleuring uit met behulp van de magnetron of een alternatief (1 uur bij 37 °C) zoals beschreven in stap 2.7.
  11. Was de objectglaasjes opnieuw 3-5x met 1 ml 1x PBS en verwijder voorzichtig het overtollige PBS van elk glaasje.
  12. Voeg 30 μL montagemedium rechtstreeks toe aan elke weefselsectie en plaats een dekglaasje dat het hele weefselgedeelte bedekt. Inspecteer de glijbaan op luchtbellen en duw de luchtbellen met lichte druk naar de omtrek van de glijbaan. Herhaal het proces voor de resterende dia's.
  13. Verwijder overtollig montagemedium met een pluisvrije doekje en gebruik optische lensreiniger om eventuele resten op het oppervlak van het dekglaasje te verwijderen. Laat alle objectglaasjes 10-15 minuten bij kamertemperatuur uitharden voordat u beeldacquisitie op een microscoop uitvoert.

5. Microscopie opstelling en beeldacquisitie

  1. Zet de breedveldmicroscoop en LED8-lichtbron aan; Start de software. Selecteer het objectief (hier een 20x/0,8 droog objectief). Zet de camera in de 16-bits modus op het configuratietabblad . Selecteer de vereiste kanalen op basis van de fluoroforen die aanwezig zijn in de antilichaampanelen (zie tabel 1 voor meer richtlijnen).
    OPMERKING: De volgende stappen worden gespecificeerd voor de microscoop waarnaar wordt verwezen. Een equivalente breedveldmicroscoop met een vergelijkbare lichtbron en filterkubussen voor excitatie en emissie van verschillende fluoroforen en een precisietafel zou kunnen worden gebruikt.
  2. Reinig het dekglaasje direct voor het maken van de beeldvorming met lensreiniger en lenspapier. Inspecteer het dekglaasje visueel en verwijder stof of pluisjes van het oppervlak voordat u het beeldmateriaal maakt. Plaats het objectglaasje stevig in de linkerbovenhoek (of gelijkwaardig) van het inzetstuk van de fase, zodat het weefsel consistent in het XY-vlak wordt gepositioneerd (cruciaal voor de uitlijning van cyclische beelden).
  3. Stel de acquisitie-instellingen in door een kanaal te maken dat overeenkomt met elke fluorofoor die in het antilichaampaneel is opgenomen. Selecteer de bijbehorende filterkubus en LED voor elke fluorofoor. Pas de intensiteit van elke LED en de belichtingstijden voor elk kanaal aan. Zie Tabel 1 voor een lijst van de afbeeldingsinstellingen die hier zijn gebruikt.
  4. Selecteer vóór het verkrijgen van afbeeldingen het Hoechst-kanaal en schakel Linked Shading in. Gebruik de wizard Gekoppelde arcering om dit in te stellen voor het geselecteerde doel.
    OPMERKING: In dit protocol wordt beschreven hoe u volledige dia-afbeeldingen kunt uitvoeren door het verkrijgen van grote tegelscans. Gekoppelde arcering of arceringscorrectie is nodig om ongelijkmatige verlichting van tegelafbeeldingen te verhelpen.
  5. Klik in de software op de knop Live om het Hoechst-kanaal te visualiseren. Gebruik de grove scherpstelknop om het weefselgedeelte scherp te stellen.
  6. Selecteer elk fluorescerend kanaal en beoordeel het weefselgedeelte op het verwachte kleuringspatroon voor alle fluorescerend gelabelde antilichamen in de cyclus.
  7. Selecteer Navigator in de software. Breng met behulp van het Hoechst-kanaal en de spiraalfunctie in Navigator het volledige weefselgedeelte of interessegebied in kaart dat moet worden afgebeeld. Als er meerdere weefselsecties per objectglaasje worden afgebeeld, herhaalt u deze stap om een kaart van het weefsel te maken met Navigator.
  8. Identificeer de ROI('s) die moeten worden afgebeeld met behulp van de polygoon, toverstaf of andere ROI-selectietools in Navigator. Teken voorzichtig de weefselomtrek om zo min mogelijk tegels vast te leggen die nodig zijn om de gewenste ROI('s) te dekken. Verwijder extra tegels om de totale acquisitietijd te verkorten.
  9. Zodra ROI's zijn gemaakt, controleert u de kanaalinstellingen en past u deze aan om verzadigde pixels te minimaliseren en signaal-ruisverhouding te optimaliseren. Selecteer de opzoektabel voor heatmaps in het weergavevenster voor afbeeldingen. De kleuren geven het vulniveau van pixels aan, waarbij rood, oranje, geel en wit gemakkelijker te zien variaties in intensiteit aangeven; Blauwe pixels geven verzadigde pixels aan. Om te voorkomen dat informatie verloren gaat en de beeldkwaliteit in gevaar komt, verkort u de belichtingstijd om het aantal verzadigde (blauwe) pixels te minimaliseren.
  10. Gebruik in Navigator de tool Focuskaart om een topografische kaart van het weefsel te maken. Stel elke 3-4 FOV's een focuskaartpunt in voor grote tegels of ongelijke monsters.
    OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang voor de grote tegelscans die nodig zijn voor beeldvorming van hele dia's. Over het algemeen wordt de kwaliteit van het beeld geschaald met het aantal geselecteerde Focus Map Points; Dit proces kan echter behoorlijk tijdrovend zijn, vooral bij grote tegelscans.
    1. Maak focuskaartpunten in de volgorde waarin ze door de microscoop worden gescand. Als u wilt overeenkomen met de volgorde voor het scannen van tegels van de microscoop waarnaar wordt verwezen, selecteert u Focustoewijzingspunten langs een kronkelig pad dat overeenkomt met het pad dat door de microscoop wordt gebruikt.
    2. Stel het eerste focustoewijzingspunt in met handmatige scherpstelling. Gebruik autofocus voor de resterende Focus Map Points. Ga zitten en kijk om ervoor te zorgen dat de optimale focus is geselecteerd voor elk Focus Map Point. Pas de focustoewijzingspunten indien nodig handmatig aan. Vergroot het bereik dat wordt gebruikt om elk Focus Map-punt te vinden op oneffen en/of grote weefsels.
  11. Stel de verwerking in met behulp van de volgende parameters: Small Volume Computational Clearing (SVCC) met een brekingsindex (RI) die is ingesteld op het montagemedium (hier 1,4); sterkte ingesteld op 98% en functiegrootte ingesteld op 2.000 nm voor membraanmarkers of 3.000 nm voor nucleaire markers. Voer het computationele clearingprotocol uit tijdens het verzamelen van afbeeldingen.
  12. Start de tegelscan. Noteer het tegelnummer en houd de ROI's constant gedurende alle cycli.
  13. Voeg na het verkrijgen van de afbeelding de door de berekening gewiste afbeeldingen samen met Mozaïek samenvoegen op het tabblad Proces , waarbij de optie Vloeiend is geselecteerd. Inspecteer elke afbeelding visueel op naaifouten en herhaal de mozaïeksamenvoeging met nieuwe parameters als er tegelfouten aanwezig zijn.
    OPMERKING: Slecht uitgelijnde afbeeldingen voorkomen registratie van iteratief verkregen afbeeldingen.
  14. Gebruik indien nodig de module Dye Separation om de spectrale overloop tussen kanalen te compenseren, zoals eerder beschreven5.

6. Cycli van kleurstofinactivering, etikettering van antilichamen en beeldacquisitie

  1. Nadat de beeldacquisitie is voltooid, dompelt u de dia's onder in een conische buis van 50 ml steriel 1x PBS totdat de dekglaasjes eraf vallen. Als het dekglaasje er niet af valt, laat de PBS dan direct over de dia lopen of gebruik een pincet om het dekglaasje voorzichtig te verwijderen.
  2. Bereid lithiumboorhydride (LiBH4) oplossing door 3-5 mg poeder in een plastic weegboot af te meten. Voeg diH2O in een verhouding van 1:1 rechtstreeks aan het poeder toe (bijv. 3,2 mg LiBH4 en 3,2 ml diH2O) en homogeniseer de oplossing met een pipet. Gebruik een spuit om de oplossing door een filter van 0,2 μm in een conische buis van 50 ml te laten lopen en noteer de concentratie en het exacte tijdstip waarop de oplossing is gemaakt. Laat de oplossing 3-5 minuten bij kamertemperatuur incuberen tot er grote bellen in de oplossing te zien zijn.
    OPMERKING: We raden aan om de kleurstofinactiveringsoplossing binnen 4 uur na bereiding te gebruiken. LET OP: Voer de volgende stappen uit in een chemische zuurkast en gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). Bij deze reactie kan waterstofgas ontstaan, dat licht ontvlambaar is. Het is belangrijk om te allen tijde met kleine hoeveelheden LiBH4 (<10 mg) te werken. Bekijk voor meer informatie de instructievideo's over hoe u LiBH4 veilig kunt bereiden op de IBEX Knowledge-Base10,11.
    Vervang de injectieflacon LiBH4 na 4 weken gebruik vanwege verminderde bleekeffectiviteit na herhaalde blootstelling aan lucht. We raden aan om kleine hoeveelheden LiBH4 (1 gram) te kopen.
  3. Verwijder elk glaasje uit het 1x PBS-weekscherm, verwijder het overtollige PBS met een pluisvrij doekje en plaats het in de vochtkamer van het glaasje.
  4. Behandel elk niet-afgedekt glaasje gedurende 30 minuten met LiBH4 door de oplossing rechtstreeks op het glaasje te pipetteren met voldoende volume om het weefsel te bedekken. Verwijder de oude LiBH4-oplossing van elk objectglaasje en ververs met een nieuw aliquot LiBH4 op 10 minuten en 20 minuten van dezelfde LiBH 4-voorraadoplossing.
  5. Was de dia's 3-5x uitgebreid met 1x PBS. Gebruik snelle verwisselingen van PBS en week de dia's 1 minuut per wasbeurt.
  6. Om een afbeelding te verkrijgen voor het aftrekken van de achtergrond, plaatst u een nieuw dekglaasje op elk glaasje zoals beschreven in de stappen 4.12-4.13 en maakt u afbeeldingen van het weefsel na het inactiveren van het kleurstof. Maak een nieuw project voor de afbeelding voor het aftrekken van de achtergrond en herhaal de stappen 5.2-5.14 om de afbeelding te verkrijgen. Afbeelding met hetzelfde aantal tegels, kanalen, kanaalinstellingen en FOV's die zijn ingesteld voor de afbeelding van cyclus 1. Houd de punten van de focustoewijzing in dezelfde gezichtsvelden, maar gebruik autofocus om elk focustoewijzingspunt voor deze nieuwe afbeelding aan te passen.
    OPMERKING: Gebruik het kanaal dat de herhaalde fiduciale markering (Hoechst) bevat om unieke structuren (nucleaire vormen) te identificeren die aanwezig zijn in het 'live' beeld (bijvoorbeeld afbeelding voor het aftrekken van de achtergrond) en het vorige beeld (cyclus 1).
  7. Om niet-specifieke fluorescerende signalen van gebiotinyleerde antilichamen in de tweede antilichaamcyclus te minimaliseren, voert u avidine en biotine blokkering uit.
    1. Verwijder overtollige PBS en breng avidine-blokkerende oplossing aan op elke dia bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
    2. Was de dia's 3-5x met 1x PBS en voer overtollige PBS af wanneer de wasbeurten zijn voltooid.
    3. Breng biotineblokkerende oplossing aan op elk glaasje bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en was de dia's 3-5x met 1x PBS zoals in stap 6.7.2.
  8. Bereid nieuwe BSA-vrije blokkeerbuffer (cyclus 2) (materiaaltabel) voor
    Primaire antilichaamkleuringsoplossing #4 (cyclus 2) en secundaire antilichaamkleuringsoplossing #2 (cyclus 2).
    OPMERKING: Voor deze oplossingen is geen runderserumalbumine nodig, omdat BSA de avidine/biotine-blokkerende stap in gevaar kan brengen.
  9. Verdun primaire antilichamen in door de fabrikant aanbevolen concentraties in de primaire antilichaamkleuringsoplossing #4 (cyclus 2). Draai deze oplossing voorzichtig en voeg toe aan elk glaasje in de vochtigheidskamer, zorg ervoor dat het weefsel volledig bedekt is met de primaire antilichaamoplossing. Plaats de vochtkamer van het glaasje met de glaasjes in de magnetron en voer het primaire antilichaamprogramma ongeveer 30 minuten uit, zoals beschreven in stap 2.7-2.8.
  10. Voer secundaire antilichaametikettering uit met secundaire antilichaamkleuringsoplossing #2 (cyclus 2) zoals beschreven in de stappen 4.6-4.9. Zodra het kleuren is voltooid, plaatst u een nieuw dekglaasje op elk objectglaasje, zoals eerder beschreven in de stappen 4.12-4.13. Plaats het glaasje terug op de microscooptafel en verplaats het objectglaasje zodat het zich in hetzelfde XY-vlak bevindt als de vorige afbeeldingen.
    OPMERKING: Gebruik het kanaal dat de herhaalde fiduciale marker (Hoechst) bevat om unieke structuren (nucleaire vormen) te identificeren die aanwezig zijn in het 'live' beeld (bijvoorbeeld cyclus 2) en het vorige beeld (cyclus 1).
  11. Maak een nieuw project voor de afbeelding van cyclus 2 en herhaal de stappen 5.2-5.14 om de afbeelding van cyclus 2 te verkrijgen. Afbeelding met hetzelfde aantal tegels, kanalen, kanaalinstellingen en FOV's die zijn ingesteld voor de afbeelding van cyclus 1. Houd de punten van de focustoewijzing in dezelfde gezichtsvelden, maar gebruik autofocus om elk focustoewijzingspunt voor deze nieuwe afbeelding aan te passen. Zodra het beeld van cyclus 2 is verkregen, gaat u verder met de uitlijning van het beeld of herhaalt u de stappen in sectie 6 voor extra cycli met direct geconjugeerde antilichamen. OPMERKING: Gebruik het kanaal dat de herhaalde fiduciale marker (Hoechst) bevat om unieke structuren (nucleaire vormen) te identificeren die aanwezig zijn in het 'live' beeld (bijvoorbeeld cyclus 2-beeld) en het vorige beeld (cyclus 1). Aanvullende cycli vereisen direct geconjugeerde antilichamen omdat IBEX antilichamen niet stript.

7. Uitlijning van afbeeldingen

  1. Converteer onbewerkte afbeeldingen van de microscoop en voer .lif-bestanden uit naar .ims-bestanden met de gratis File Converter en beeldverwerking met de open-source software zoals eerder beschreven5 en gedetailleerd in video's op de IBEX Knowledge-Base10,11.
  2. Bewerk voor elke beeldvormingscyclus het bestand en pas de gewenste verwerkingsstappen toe (bijv. kanaalnaamgeving, kanaalpseudo-kleuring).
    1. Voer achtergrondaftrekking en kanaaldrempelwaarde uit met behulp van de kanaalrekenkundige functies die voor SimpleITK zijn gemaakt om het autofluorescentiesignaal (https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html) te verlagen.
      OPMERKING: We voeren deze stappen uit op elke afbeelding (bijv. Cyclus 1, Cyclus 2) voordat we ze uitlijnen tot één samengestelde afbeelding. Dit komt omdat het gemakkelijker is om aan de kleinere, individuele afbeeldingen te werken dan aan de grotere gecombineerde afbeelding.
  3. Bedenk een consistente naamgevingsstrategie om de registratiesoftware te gebruiken. Noem kanalen met een prefix-separator character-postfix (bijv. 'Cycle1 CD8_AF647') met een spatie als scheidingsteken om het kanaal aan te geven waarin het anti-CD8 AF647-antilichaam in de eerste cyclus werd gebruikt.
    OPMERKING: Zie de extensie van het helpbestand voor meer informatie: https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTRegisterSameChannel.html.
  4. Nadat alle kanalen de juiste naam hebben gekregen, start u de registratiesoftware en klikt u op Imaris Extensies | SimpleITK | Affine.
  5. Upload het IMS-bestand voor elke cyclus met behulp van de knop Bladeren naast Bestandsnamen. Voer het scheidingsteken voor het voorvoegsel van de kanaalnaam in. Als u het bovenstaande voorbeeld volgt, typt u één spatie en klikt u op Volgende.
  6. Selecteer het registratiekanaal dat wordt gebruikt als de gemeenschappelijke fiduciale markering tussen cycli (bijv. Hoechst).
  7. Selecteer de Fixed Image, de afbeelding waarop andere afbeeldingen worden geregistreerd.
    OPMERKING: We raden aan om je te registreren voor cyclus 2 van iteratieve afbeeldingen.
  8. Selecteer de gewenste map voor het 'Output File'. De optie Registratie starten bij resolutie wordt standaard ingesteld op maximale resolutie om de best mogelijke registratie mogelijk te maken. Als de rekenkracht beperkt is, verlaagt u deze parameter.
    LET OP: Voor de hier beschreven data (12-15 GB per afbeelding) hebben we een maximale resolutie van 5 gebruikt.
  9. Klik op Registreren om te beginnen. Zodra de registratie is voltooid, wacht u tot de knop Pixels opnieuw berekenen en gecombineerde afbeelding opslaan verschijnt, klikt u erop en wacht u tot de voortgangsbalk is voltooid.
  10. Open het voltooide uitvoerbestand in de verwerkingssoftware. Het geregistreerde beeld met alle cycli en kanaalinformatie zal beschikbaar zijn en klaar voor analyse of publicatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het ontwerpen van een beeldvormingspaneel op basis van multiplexed antilichamen vereist veel tijd, moeite en middelen12. Deze uitdagingen zijn vooral uitgesproken bij het ontwerpen van een panel voor gearchiveerde FFPE-monsters van sterk autofluorescerende weefsels, zoals hier beschreven (Figuur 1). Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, hebben we eerst de helderste fluoroforen geïdentificeerd die compatibel zijn met ons kleurstofin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Klinische longpathologie van longtuberculose wordt gekenmerkt door necrotiserende granulomateuze ontsteking. NTM-longpathologie komt voornamelijk voor in twee verschillende patiëntenpopulaties met twee afzonderlijke pathologische patronen: geïsoleerd longletsel gekenmerkt door granulomateuze ontsteking met bronchiolaire vernietiging en holtevorming bij immunocompetente personen, of diffuse nodulaire ziekte die de longen en andere organen aantast bij immunodeficiënte personen 13,14,15,16<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

A.J.R. is een werknemer bij Leica Microsystems, Inc. De andere auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma van DIR/NIAID, NCI en NHLBI. Figuur 1 is gemaakt met behulp van BioRender onder een institutionele licentieovereenkomst met de NIH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.3% Triton-X-100Sigma-AldrichT8787Oplossing voor blokkeerbuffer
1% BSASigma-AldrichA4503Oplossing voor blokkeerbuffer
1% Human BD Fc BlockBD Biosciences564220Fc Block vereist voor blokkeerbuffer
150 W LED-lampAmazonB07VH3CVSFLED-lichtbron voor foto-irradiatie van weefsel
1x PBS Gibco10010-023Oplossing voor blokkeerbuffer en spoelstappen
20 gallon opslagcontainerAmazonB001B1C4G0Container voor foto-irradiatieproces
40 W RGBW flood LED-lamp AmazonB08QFPJSMDRGB-lichtbron voor foto-irradiatie van weefsel
Ag85BAbcamab43019/NAAntilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie Tabel 1.
Alpha-smooth muscle actin DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NAAntilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie Tabel 1.
Avidin/Biotin Blocking KitAbcamab64212Avidine en biotine blokkerende oplossing
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences554714Fixatieoplossing
BOND Dewax SolutionLeica BiosystemsNC0221076Deparaffinisatie-oplossing
BOND Epitope Retrieval Solution 1Leica BiosystemsNC0235529Citraat gebaseerde pH 6 epitope retrieval oplossing (ER1)
BOND Epitope Retrieval Solution 2Leica BiosystemsNC0235530EDTA gebaseerde pH 9 epitope retrieval oplossing (ER2)
BOND Research Detection SystemLeica BiosystemsNC0396648Geautomatiseerd onderzoekskleuringsreagens
BOND RX Research StainerLeica BiosystemsNAGeautomatiseerd onderzoekskleuringsplatform
BOND Wash SolutionLeica BiosystemsNC0221077Spoelbuffer
CD15BD Biosciences347420/AB_400298Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie Tabel 1.
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82/AB_11150959Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie Tabel 1.
CD4 Alexa Fluor 488R&D SystemsFAB8165G/AB_2728839Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie Tabel 1.
CD45 Phycoerythrin (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE/NAAntilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie Tabel 1.
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135/AB_2892745Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie Tabel 1.
Donkey anti-goat IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814/AB_2762838Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie Tabel 1.
Donkey anti-mouse IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificA32787/ AB_2762830Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie Tabel 1.
Donkey anti-mouse IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_2340844Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie Tabel 1.
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificA32794/AB_2762834Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie Tabel 1.
EasyDip Staining SystemNewcomer Supply5300KITScherpstellingssysteem voor dia's
Fluoromount-GThermo Fisher Scientific00-4958-02Montagemedia
HoechstBiotium40046Kernkleur voor IBEX-beeldvorming. Zie Tabel 1.
Imaris File Converter x64 10.2.0Imaris Oxford InstrumentsGratis bestandsconvertor
ImarisViewer software x64 10.2.0Imaris Oxford InstrumentsGratis beeldverwerkingssoftware
ImmEdge PenVector LaboratoriesH-4000Hydrofobe barrièrepen
Lithium Borohydride (1 gram)STREM Chemicals93-0397Chemisch middel voor kleurstofdeactivering, koop kleine hoeveelheden van dit chemisch middel (1 gram)
Lumican BiotinR&D SystemsBAF2846Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie Tabel 1.
Micro Cover GlassesVWR48393-241Glazendeksels
Pan-cytokeratin Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750/AB_2868569Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie Tabel 1.
PELCO BioWave Pro Microwave SystemTed Pella Inc36500-230Wetenschappelijke magnetron zonder verwarming
PELCO SteadyTemp ProTed Pella Inc50062Volledig geautomatiseerde temperatuurregeling voor wetenschappelijke magnetron
SimpleITKOpen source softwareRegistratie- en kanaalverwerkingssoftware
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificS11227Labelingreagens voor IBEX-beeldvorming. Zie Tabel 1.
Widefield MicroscopeLeica MicrosystemsNALeica Microsystems THUNDER imager met LED8-lichtbron en LAS X-software (3.7.1.21655). Voor fluorescentiebeeldvorming werd een aangepaste quad-bandfilter met externe filterwiel (PN: 11536075) met twee extra enkele bandfilters (PN: 8118215) gebruikt om zeven kleurstofkanalen per doorgang te beeldvormen. De filterexcitatie-, dichroische en emissielijnen zijn (1) Quad-Band kubus: dichroisch bij 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, geen excitatie- of emissiefilters; (2) externe filterwielpositie 1:

Referenties

  1. Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1 (2023).
  2. Dahl, V. N., et al. Global trends of pulmonary infections with nontuberculous mycobacteria: A systematic review. Int J Infect Dis. 125, 120-131 (2022).
  3. Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nat Rev Immunol. 17 (11), 691-702 (2017).
  4. Radtke, A. J., et al. Ibex: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
  5. Radtke, A. J., et al. Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  6. Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: A primer for multiplexed antibody-based imaging. Nat Methods. 19 (3), 284-295 (2022).
  7. Duong, H., Han, M. A multispectral led array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
  8. Nolta, N. F., Liberti, A., Makol, R., Han, M. Gelatin embedding and LED autofluorescence reduction for rodent spinal cord histology. J Neurosci Methods. 346, 108924(2020).
  9. Radtke, A. J., et al. Multi-omic profiling of follicular lymphoma reveals changes in tissue architecture and enhanced stromal remodeling in high-risk patients. Cancer Cell. 42 (3), 444-463.e10 (2024).
  10. Radtke, A. J., et al. The IBEX knowledge-base: A central resource for multiplexed imaging techniques. PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).
  11. Yaniv, Z., et al. The IBEX imaging knowledge-base: A community resource enabling adoption and development of immunofluoresence imaging methods. ArXiv. , (2024).
  12. Quardokus, E. M., et al. Organ mapping antibody panels: A community resource for standardized multiplexed tissue imaging. Nat Methods. 20 (8), 1174-1178 (2023).
  13. Mcshane, P. J., Glassroth, J. Pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria: Current state and new insights. Chest. 148 (6), 1517-1527 (2015).
  14. Hsu, A. P., et al. Mutations in GATA2 are associated with the autosomal dominant and sporadic monocytopenia and mycobacterial infection (monomac) syndrome. Blood. 118 (10), 2653-2655 (2011).
  15. Vinh, D. C., et al. Autosomal dominant and sporadic monocytopenia with susceptibility to mycobacteria, fungi, papillomaviruses. Blood. 115 (8), 1519-1529 (2010).
  16. Filipe-Santos, O., et al. X-linked susceptibility to mycobacteria is caused by mutations in nemo impairing CD40-dependent IL-12 production. J Exp Med. 203 (7), 1745-1759 (2006).
  17. Galeotti, T., Van Rossum, G. D., Mayer, D. H., Chance, B. On the fluorescence of NAD(P)H in whole-cell preparations of tumours and normal tissues. Eur J Biochem. 17 (3), 485-496 (1970).
  18. Schneckenburger, H., Gessler, P., Pavenstadt-Grupp, I. Measurements of mitochondrial deficiencies in living cells by microspectrofluorometry. J Histochem Cytochem. 40 (10), 1573-1578 (1992).
  19. Harman, D. Lipofuscin and ceroid formation: The cellular recycling system. Adv Exp Med Biol. 266, 3-15 (1989).
  20. Brunk, U. T., Terman, A. Lipofuscin: Mechanisms of age-related accumulation and influence on cell function. Free Radic Biol Med. 33 (5), 611-619 (2002).
  21. Jung, T., Bader, N., Grune, T. Lipofuscin: Formation, distribution, and metabolic consequences. Ann N Y Acad Sci. 1119, 97-111 (2007).
  22. Sherratt, M. J. Tissue elasticity and the ageing elastic fibre. Age (Dordr). 31 (4), 305-325 (2009).
  23. Laurent, G. J. Lung collagen: More than scaffolding. Thorax. 41 (6), 418-428 (1986).
  24. Lakowicz, J. R. Principles of frequency-domain fluorescence spectroscopy and applications to cell membranes. Subcell Biochem. 13, 89-126 (1988).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Multiplex-imagingautofluorescente monstersruimtelijke proteomicaFFPE-longweefselfoto-irradiatieprotocolontwerp van antilichaampanelwhole slide imaginggranulomateuze ontstekingmapping van immuuncellen
Geoptimaliseerde workflow voor iteratief bleken breidt multiplexiteitsbeeldvorming van sterk autofluorescerende klinische monsters uit
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.