Onderzoeksartikel

Ontwikkeling van muismodellen voor de ziekte van Ménétrier

648 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67981

⸱

6 juni 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Yale School of Medicine, 2Department of Internal Medicine, University of Cincinnati, 3Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

De huidige studie toont aan dat MT-TGFα-muizen spasmolytische metaplasie met polypeptide-expressie (SPEM) in de maag vertonen. Lekken van de promotor verhinderde de demonstratie dat de belangrijkste cellijnen terug te voeren zijn op SPEM. Daarom hebben we bovendien een doxycycline-induceerbaar muismodel (Doxi-TGFα) ontwikkeld en bevestigd dat SPEM is afgeleid van hoofdcellen.

Samenvatting

De ziekte van Ménétrier (MD) is een zeldzame verworven premaligne maagaandoening die wordt gekenmerkt door gigantische rugplooien, verminderde zuursecretie en eiwitverlies. MD-patiënten vertonen verhoogde expressie van een EGF-receptor (EGFR)-ligand, waardoor groeifactor-α (TGFα) in de maag wordt getransformeerd. Het EGFR-neutraliserende antilichaam, cetuximab, resulteert in snelle klinische verbetering en histologische remissie. Afgezien van deze bevindingen zijn de etiologie en onderliggende moleculaire mechanismen niet goed begrepen. De Metallothionein (MT)-TGFα transgene muislijn is het eerste MD-muismodel dat histopathologische kenmerken van MD recapituleert, waaronder foveolaire hyperplasie en verlies van pariëtale cellen. In dit muismodel wordt TGFα aangedreven door de MT-versterker/promotor die door zware metalen wordt geïnduceerd. Eerdere studies hebben zinksulfaat (ZnSO4) gebruikt in drinkwater of intraperitoneale injecties van cadmiumsulfaat (CdSO4) om TGFα te induceren. We ontdekten echter dat MT-TGFα-muizen fenotypes ontwikkelen zonder behandeling met zware metalen, wat wijst op lekkage van de promotor. We ontdekten ook dat overexpressie van TGFα de expressie van Mist1 onderdrukt, een transcriptiefactor die belangrijk is voor de differentiatie van hoofdcellen, waardoor genetische manipulatie in hoofdcellen met behulp van de Mist1-CreERT2-muislijn wordt belemmerd. Om dit te ondervangen, hebben we een induceerbaar muismodel (Doxi-TGFα) ontwikkeld waarin TGFα wordt geïnduceerd door behandeling met doxycycline (CMV-rtTA; TetO-TGFα). Hoewel het Doxi-TGFα-muismodel mildere fenotypes ontwikkelt dan het MT-TGFα-model, recapituleerde het kenmerken van MD, waaronder foveolaire hyperplasie en verlies van pariëtale cellen. Met behulp van het Doxi-TGFα-muismodel ontdekten we dat spasmolytische polypeptide-expressieve metaplasie (SPEM) wordt geïnduceerd in MD, en SPEM wordt afgeleid van hoofdcellen door afstammingstracering met behulp van de Mist1-CreERT2-muislijn. Zowel MT-TGFα- als Doxi-TGFα-muismodellen bieden in vivo modellen van MD en zijn nuttig voor het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van MD en behandelingsopties voor de ziekte. De Doxi-TGFα-muizen zullen ook een nuttig model zijn om de effecten van overexpressie van TGFα in andere weefsels te bestuderen.

Inleiding

De ziekte van Ménétrier (MD), ook bekend als eiwitverliezende hypertrofische gastropathie, is een zeldzame maagpremaligne aandoening. Magen van MD-patiënten vertonen massale foveolaire hyperplasie, wat leidt tot verhoogde secretie van maagslijm en een verminderd aantal pariëtale cellen, wat leidt tot verminderde secretie van maagzuur. Bovendien gaat eiwit selectief verloren in het maagslijmvlies, wat leidt tot hypoalbuminemie en perifeer oedeem 1,2,3. De pathogenese van MD was niet bekend totdat werd gemeld dat transgene muizen met TGFα tot overexpressie brachten onder controle van metallothioneïne (MT) genversterker/promotor de fenotypes van MD in de maag recapituleerden 4,5. Magen van MD-patiënten vertoonden ook een verhoogde expressie van TGFα, een EGF-receptor (EGFR) ligand. Van cetuximab, een anti-EGFR-antilichaam, werd gemeld dat het de eerste effectieve medische behandeling voor MD was, wat bevestigde dat EGFR-activering door TGFα-overexpressie bijdraagt aan de pathogenese van MD 6,7.

Sindsdien wordt de MT-TGFα-muislijn gebruikt als muismodel voor MD. Omdat TGFα-expressie wordt gereguleerd door het gen voor zware metaalrespons, zijn metallothioneïne-enhancer/promotor, zinksulfaat (ZnSO4) in drinkwater of intraperitoneale injecties van cadmiumsulfaat (CdSO4) gebruikt om TGFα-expressie te induceren 5,8. Het MT-TGFα-muismodel is verder gekarakteriseerd voor de fenotypes van MD. Met behulp van dit muismodel is aangetoond dat TGFα mucine-afscheidende oppervlaktefoveolaire celdifferentiatie induceert, terwijl het de differentiatie remt in zuurafscheidende pariëtale cellen en pepsinogeen-afscheidende hoofdcellijnen 9,10. Er is ook aangetoond dat maaglichaam/fundisch slijmvlies geantraliseerd wordt en dat trefoil factor 2 (TFF2)-positieve cellen aanwezig zijn aan de basis van de maagklieren, wat suggereert dat spasmolytische polypeptide-expressie metaplasie (SPEM) optreedt bij MD 8,11.

In de huidige studie laten we zien dat MT-TGFα-muizen kenmerken van MD ontwikkelen zonder behandeling met zware metalen. Deze fenotypes omvatten verlies van Mist1-expressie, een transcriptiefactor die essentieel is voor de differentiatie van de belangrijkste cellen en verloren gaat in SPEM. Vanwege het verlies van Mist1 kon de Mist1-CreERT212-muislijn niet samen met de MT-TGFα-muislijn worden gebruikt om te onderzoeken of SPEM in MD voortkomt uit hoofdcellen door afstammingstracering. Met als doel de lekken van het MT-TGFα-muismodel te overwinnen, hebben we een nieuw MD-muismodel ontwikkeld (CMV-rtTA13; TetO-TGFα14) waarbij TGFα wordt geïnduceerd door behandeling met doxycycline (Doxi-TGFα). We hebben bevestigd dat dit muismodel ook kenmerken van MD vertoont. Met behulp van het Doxi-TGFα-muismodel laten we zien dat SPEM ontstaat uit hoofdcellen door afstammingstracering met behulp van de Mist1-CreERT2-muislijn. We introduceren twee MD-muismodellen in de huidige studie. Beide modellen kunnen worden gebruikt om pathogenese te onderzoeken en om te zoeken naar mogelijke therapeutische doelen. De nieuwe Doxi-TGFα-muis zal vooral waardevol zijn wanneer het starten van MD-fenotypes nauwkeurig moet worden gecontroleerd of wanneer genetische modificatie in hoofdcellen vereist is met behulp van de Mist1-CreERT2-muislijn.

Protocol

Alle veehouderij en -procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van Yale University en in overeenstemming met de principes van de Amerikaanse overheid voor het gebruik en de verzorging van dieren die worden gebruikt in onderzoek, onderwijs en testen.

1. Experimenten met muizen

  1. Behandelingen bij muizen
    1. Behandel MT-TGFα-muizen (zowel mannetjes als vrouwtjes in de leeftijd van 2-4 maanden) gedurende 2 weken met 25 mM ZnSO4 in drinkwater om TGFα-overexpressie te induceren.
    2. Behandel CMV-rtTA/+; TetO-TGFα/+ (Doxi-TGFα) muizen (zowel mannetjes als vrouwtjes op de leeftijd van 2-4 maanden) met 2 mg/ml doxycycline in drinkwater gedurende 2 weken om TGFα-overexpressie te induceren.
    3. Voeg een Mist1-CreERT2/+ toe; R26-LSL-mTmG/+ mannelijke of vrouwelijke muis en voeg één Doxi-TGFα-muis van het andere geslacht toe aan de broedkooi voor het traceren van de afstamming van hoofdcellen in MD-muismodellen.
    4. Injecteer Mist1-CreERT2/+; R26-LSL-mTmG/+; CMV-rtTA/+; TetO-TGFα/+ muizen (zowel mannelijk als vrouwelijk in de leeftijd van 2-4 maanden) met tamoxifen (37,5 mg/kg) intraperitoneaal. Injecteer gedurende 7 opeenvolgende dagen, afwisselend tussen het rechter en linker onderste kwadrant van de buik en vermijd het raken van inwendige organen. Induceer TGFα-expressie door behandeling met doxycycline (2 mg/ml) in drinkwater gedurende 2 weken.
      OPMERKING: Controleer of er geen door tamoxifen geïnduceerd letsel in de maagis 15,16, zoals hier wordt gedaan door de pariëtale cellen te tellen bij wildtype muizen met en zonder behandeling met tamoxifen (aanvullende figuur 1).
  2. Fixatie van maagweefsel
    1. Euthanaseer muizen door een overdosis isofluraan na 2 weken overexpressie van TGFα. Gebruik een exsiccatuurpot in een chemische zuurkast om muizen op een geperforeerd platform te plaatsen dat direct contact met het vloeibare verdovingsmiddel voorkomt. Sluit het deksel en houd de muizen in de gaten totdat ze langer dan 60 s niet meer kunnen ademen, gevolgd door cervicale dislocatie.
    2. Ontleed de maag door te snijden bij de gastro-oesofageale overgang, de twaalfvingerige darm door te snijden met een twaalfvingerige darm die aan de maag is bevestigd en alle peritoneale ligamenten rond de maag te verwijderen met een schaar en een tang (Figuur 1A).
    3. Indruppel fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van een spuit van 10 ml met een pipetpunt aan de zijde van de twaalfvingerige darm. Knijp er met de vingers in om de luminale inhoud te verwijderen. Herhaal 3x (Figuur 1B).
    4. Blaas de maag op met 2 ml 10% formaline met behulp van een andere spuit van 10 ml met een pipetpunt eraan. Klem stevig vast met een tang bij de gastroduodenale overgang gedurende 5-10 s terwijl u de punt van de maag verwijdert (Figuur 1C).
    5. Dompel de opgeblazen maag een nacht onder in 10% formaline bij 4 °C en schud (figuur 1D).
      LET OP: Gebruik de juiste beschermingsmiddelen bij het werken met giftige stoffen zoals formaline.
  3. Voorbereiding van de maag voor paraffine-inbedding
    1. Snijd de twaalfvingerige darm en de voormaag weg met een scheermesje (Figuur 1E). Spoel het maagweefsel 5 minuten met PBS, 3x met schudden.
    2. Snijd de maag in 3-4 ringen met dezelfde dikte (3-5 mm) met behulp van een scheermesje. Veranker de maagringen in 2% agarose om de oriëntatie te behouden. Plaats de maagringen achtereenvolgens van de proximale naar de distale ringen door de kleine krommingszijde in dezelfde richting te plaatsen (Figuur 1F).
    3. Plaats de maagringen ingebed in agarosen in een weefselcassette (Figuur 1G) en stuur de monsters naar de histologiekernfaciliteit voor paraffine-inbedding17.

2. Immunofluorescerende kleuring

  1. Voorbereiding van de dia's
    1. Verwarm dia's met paraffinesecties erop in een droge oven of op een warmteblok ingesteld op 60 °C gedurende minimaal 1 uur tot een nacht. Laat afkoelen tot kamertemperatuur en plaats in een glaasje.
  2. Deparaffinisatie, rehydratatie en ophalen van antigeen
    1. Label twee diapotten, A en B, en vul ze elk met voldoende Trilogy-oplossing om het weefsel volledig onder te dompelen.
    2. Plaats het schuifrek in pot A en zet beide potten in een snelkookpan. Zet de snelkookpan 15 minuten op hoge druk. Laat de snelkookpan afkoelen voordat u de glaasjes opent en terughaalt.
    3. Plaats het glaasjesrek van pot A onmiddellijk 2 minuten in pot B om ervoor te zorgen dat de paraffine van de glaasjes wordt verwijderd. Verwijder de glaasjes uit pot B en plaats ze in gedeïoniseerd (DI) water.
      LET OP: Pot A kan worden gevuld met eenmaal gebruikte Trilogy. New Trilogy moet altijd worden gebruikt in Jar B.
    4. Plaats de objectglaasjes 5 minuten in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) voordat u overgaat tot blokkeren.
  3. Niet-specifieke achtergrondkleuring blokkeren
    1. Verwijder de dia's uit het glaasjesrek en tik ze zijwaarts om overtollige TBS te verwijderen.
    2. Teken een doos rond het weefsel met behulp van een hydrofobe marker. Breng een blokkeerbuffer aan om het weefsel volledig te bedekken en incubeer gedurende 30-60 minuten in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur.
  4. Incubatie met primaire antilichamen
    1. Selecteer primaire antilichamen van doeleiwitten die in verschillende gastheersoorten zijn gekweekt en verdun ze in antilichaamverdunningsmiddel volgens de aanbeveling van de fabrikant. Voor deze studie werden de volgende antilichamen gebruikt: H+/K+-ATPase, GIF, Mist118,19 en CD44v9 20,21. Gedetailleerde informatie over de primaire antilichamen is te vinden in de Materiaaltabel.
    2. Verwijder de blokkeerbuffer, breng verdunde antilichamen aan en plaats de dia's terug in de bevochtigde kamer. Incubeer een nacht bij 4 °C.
    3. Verwijder primaire antilichamen en was dia's 3x in TBS gedurende 5 minuten voor elke wasbeurt.
  5. Secundaire antilichamen en lectines
    1. Kies secundaire antilichamen op basis van de gastheersoort van de primaire antilichamen. Lectines kunnen worden gemengd met secundaire antilichamen en tegelijkertijd worden aangebracht.
    2. Verdun de secundaire antilichamen en lectines volgens de aanbevelingen van de fabrikant in verdunningsmiddel voor antilichamen. Gedetailleerde informatie over secundaire antilichamen en lectines die in dit onderzoek zijn gebruikt, is te vinden in de Materiaaltabel.
    3. Breng secundaire antilichamen, lectines en DAPI (1 μg/ml) aan en plaats de glaasjes terug in de bevochtigde kamer. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, uit de buurt van licht.
    4. Verwijder de dia's uit de bevochtigde kamer en spoel 3x met TBS gedurende 5 minuten voor elke wasbeurt.
  6. Montage en voorbereiding op microscopie
    1. Verwijder een dia uit de TBS en verwijder overtollig vocht door de dia zijwaarts op een papieren handdoek te tikken.
    2. Voeg 15-20 μL montagemedium toe. Houd een schoon dekglaasje aan de randen vast en plaats een rand tegenover het weefsel met het montagemedium ertussen.
    3. Laat het dekglaasje langzaam zakken zodat het medium gelijkmatig over het weefsel wordt verdeeld, en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in zitten.
    4. Gebruik een taakveeg om overtollig montagemedium rond de randen op te zuigen. Droog het afgewerkte objectglaasje in het donker bij kamertemperatuur voordat u overgaat tot microscopie. Herhaal dit proces voor de overige dia's.

Resultaten

Volwassen wildtype (WT) en MT-TGFα muizen kregen zinksulfaat (25 mM ZnSO4) in het drinkwater gedurende 2 weken voor het offeren. De magen van WT-muizen leken normaal, grof en histologisch. In schril contrast hiermee waren de magen van MT-TGFα sterk verdikt (Figuur 2A). Microscopisch gezien vertoonden deze magen massieve foveolaire hyperplasie met verlies van zowel pariëtale als hoofdcellen (Figuur 2B-D), wat de histologische kenmerken van de ziekte van Ménétrier (MD) recapituleert. Verlies van hoofdcellen kan op twee verschillende manieren optreden: dood van hoofdcellen of spasmolytische metaplasie die polypeptide tot expressie brengt (SPEM) als gevolg van hoofdcellen. Om deze twee mogelijkheden te onderscheiden, hebben we afstammingstracering van hoofdcellen uitgevoerd door Mist1-CreERT2 te kruisen; R26-LSL-mTmG muizen met MT-TGFα muizen. Deze muizen werden eerst behandeld met een lage dosis tamoxifen (37,5 mg/kg intraperitoneaal gedurende 7 opeenvolgende dagen) om hoofdcellen te labelen met GFP en vervolgens met ZnSO4 in het drinkwater om TGFα-overexpressie te induceren. We hebben zeldzame GFP-gelabelde cellen waargenomen in de MT-TGFα-muizen (gegevens niet getoond). Bovendien waren er geen grove en histologische verschillen in de MT-TGFα-muizen in de aan- of afwezigheid van ZnSO4  (Figuur 3A-C). Een mogelijke verklaring voor deze bevinding was dat TGFα de expressie van Mist1, een essentiële transcriptiefactor voor hoofdcellen18, kan hebben verminderd en het nut van het Mist1-CreERT2-allel heeft ondermijnd. In feite ging immunohistochemische kleuring voor Mist1 verloren bij MT-TGFα-muizen zonder behandeling met ZnSO4 (Figuur 3D).

Om de lekken van het MT-TGFα-muismodel te verhelpen, hebben we ons gewend tot een doxycycline-induceerbaar Doxi-TGFa-transgeenmodel. Dit werd bereikt door TetO-TGFα-muizen14 te kruisen met een CMV-rtTA-muislijn13; het is eerder gemeld dat rtTA tot expressie komt in de maag. We hebben bevestigd dat 2 weken behandeling met doxycycline foveolaire hyperplasie en een verminderd aantal pariëtale en hoofdcellen induceert in dit nieuwe MD-muismodel (Figuur 4A-C). Vergeleken met histomorfologische kenmerken bij MT-TGFα-muizen vertoonden Doxi-TGFα-muizen minder ernstige slijmvliesdikte en foveolaire hyperplasie, evenals minder afname van pariëtale cellen (aanvullende figuur 2). Desalniettemin waren we in staat om hoofdcellen te traceren met behulp van de Mist1-CreERT2-muislijn en bevestigden we dat hoofdcellijnen ook zijn gelabeld met GSII en CD44v920,21, wat bevestigt dat TGFα-overexpressie SPEM induceert uit hoofdcellen (Figuur 4D).

De huidige studie toont aan dat het MT-TGFα-muismodel de histopathologische kenmerken van MD fenokopieert bij afwezigheid van behandeling met zware metalen, waarschijnlijk als gevolg van de intrinsieke lekkage van de promotor/enhancer en/of het onvermogen om blootstelling aan zware metalen te vermijden (Figuur 3 en aanvullende figuur 2). Omdat TGFα de expressie van Mist1 onderdrukt, kan de Mist1-CreERT2-muislijn niet worden gebruikt in het MT-TGFα-muismodel. We hebben een nieuw MD-muismodel gegenereerd waarin TGFα-expressie kan worden geïnduceerd door behandeling met doxycycline. Met behulp van dit nieuwe Doxi-TGFα MD-muismodel konden we bevestigen dat TGFα-overexpressie SPEM induceert die is afgeleid van hoofdcellen. Het Doxi-TGFα MD-muismodel zal nuttig zijn wanneer nauwkeurige controle van TGFα-expressie nodig is en ook wanneer genetische verandering in hoofdcellen vereist is met behulp van de Mist1-CreERT2-muislijn.

Beschikbaarheid van gegevens:

Alle ruwe gegevens zijn beschikbaar als aanvullende bestanden.

figure-results-1
Figuur 1: Workflow voor fixatie en voorbereiding van het inbedden van maagweefsel. (A) Ontleed de maag samen met een kort segment (3-5 mm) van de twaalfvingerige darm. (B) Verwijder de luminale inhoud door PBS uit de twaalfvingerige darm te druppelen met behulp van een spuit met een pipetpunt en er 3x met de vingers in te knijpen. (C) Blaas de maag op met formaline uit de twaalfvingerige darm met behulp van een spuit en knijp in de gastroduodenale overgang om de formaline vast te houden. (D) Dompel de maag onder in formaline en fixeer een nacht bij 4 °C door te schudden. (E) Verwijder de voormaag en de twaalfvingerige darm met een scheermesje en spoel af met PBS. (F) Snijd het maaglichaam en het antrum in 3-4 ringen op een dwarsdoorsnede en veranker ze in 2% agarose om de oriëntatie van de maagweefselringen te behouden. (G) Plaats het in agarose ingebedde weefsel in cassettes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Grove en microscopische fenotypes van MT-TGFα-muizen behandeld met het zware metaal ZnSO4. (A) De maagwand is dikker bij de MT-TGFα-muizen (rechts) in vergelijking met de controlemuizen (links). (B) Maag van MT-TGFα-muizen (rechts) vertoont enorme foveolaire hyperplasie en verlies van pariëtale cellen. Gele pijlpunten geven pariëtale cellen aan en groene pijlpunten geven foveolaire cellen aan. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. (C) Immunofluorescerende kleuring bevestigt dat de MT-TGFα-muizenmaag (rechts) een verhoogd aantal foveolaire cellen (UEA1-positief) en SPEM-cellen (GIF en GSII dubbelpositief) en een verminderd aantal pariëtale cellen (H+/K+-ATPase-positief) en hoofdcellen (GIF enkelvoudig positief) vertoont in vergelijking met de controlemaag van muizen (links). Schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. (D) Kwantificering van verschillende epitheelceltypen en slijmvliesdikte in wildtype (WT) muizen behandeld met ZnSO4 (n = 5) en MT-TGFα-muizen met ZnSO4 (n = 3). Foutbalken geven de standaarddeviatie aan (**p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: MT-TGFα-muizen ontwikkelen maagfenotypes zonder behandeling met zware metalen. (A) Maag van MT-TGFα-muizen (rechts) vertoont enorme foveolaire hyperplasie en verlies van pariëtale cellen zonder behandeling met zware metalen. Gele pijlpunten geven pariëtale cellen aan en groene pijlpunten geven foveolaire cellen aan. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. (B) Immunofluorescerende kleuring bevestigt MT-TGFα maag van muizen (rechts) zonder behandeling met zware metalen vertoont een verhoogd aantal foveolaire cellen (UEA1-positief) en SPEM-cellen (GIF en GSII dubbel positief), en een verminderd aantal pariëtale cellen (H+/K+-ATPase-positief) en hoofdcellen (GIF enkelvoudig positief) in vergelijking met de controlemaag van muizen (links). Schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. (C) Kwantificering van verschillende epitheelceltypen en slijmvliesdikte in WT-muizen zonder ZnSO4 (n = 5) en MT-TGFα-muizen ZnSO4 (n = 3). Foutbalken geven de standaarddeviatie aan (***p < 0,001, ****p < 0,0001). (D) Maag van MT-TGFα-muizen (rechts) vertoont verlies van Mist1-expressie, die normaal tot expressie komt in de hoofdcellen (links). GSII is een marker voor slijmvliescellen. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Doxycycline-induceerbaar TGFα-muismodel (Doxi-TGFα) recapituleert de fenotypes van de ziekte van Ménétrier en SPEM-vorming wordt bevestigd in dit muismodel. (A) Maag van CMV-rtTA; TetO-TGFα-muizen (Doxi-TGFα; rechts) vertonen massieve foveolaire hyperplasie en een verminderd aantal pariëtale cellen. Gele pijlpunten geven pariëtale cellen aan en groene pijlpunten geven foveolaire cellen aan. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. (B) Immunofluorescerende kleuring bevestigt dat Doxi-TGFα-muizenmaag (rechts) een verhoogd aantal foveolaire cellen (UEA1-positief) en SPEM-cellen (GIF en GSII dubbel-positief) vertoont, en een verlaagd aantal pariëtale cellen (H+/K+-ATPase-positief) en hoofdcellen (GIF enkelvoudig positief) in vergelijking met de controlemaag van muizen (links). Schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. (C) Kwantificering van verschillende epitheelceltypen en slijmvliesdikte bij WT-muizen (n = 5) en Doxi-TGFα-muizen (n = 5). Foutbalken geven de standaarddeviatie aan (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). (D) Afstammingstracering van hoofdcellen (GFP-positief) met behulp van Mist1-CreERT2; R26-LSL-mTmG-muizenlijn onthult dat GFP-positieve cellen ook positief zijn voor GSII en CD44v9 in de Doxi-TGFα-muizenmaag, wat de SPEM-vorming bevestigt die is afgeleid van hoofdcellen, terwijl de controlemaag (links) laat zien dat er bijna geen GFP-positieve cellen ook positief zijn voor GSII of CD44v9. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Behandeling met een lage dosis tamoxifen (TMX) veroorzaakt geen maagslijmvliesbeschadiging. Zeven opeenvolgende dagen van behandeling met een lage dosis TMX (37,5 mg/kg) veroorzaken geen beschadiging van het maagslijmvlies, geïllustreerd door het behoud van het aantal pariëtale cellen. (A) Representatieve H&E-beelden zonder TMX-behandeling (linkerpaneel) en met TMX-behandeling (rechterpaneel). Schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. (B) Kwantificering van het aantal pariëtale cellen per maageenheid bij WT-muizen (n = 5) en WT met TMX-behandeling (n = 5). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Vergelijking van fenotypes tussen verschillende muismodellen van de ziekte van Ménétrier (MD). (A) MT-TGFα met ZnSO4-behandeling, MT-TGFα zonder ZnSO4-behandeling en Doxi-TGFα MD-muismodellen vertonen foveolaire hyperplasie, verlies van pariëtale en hoofdcellen, verhoogde spasmolytische polypeptide-expressie metaplasie (SPEM)-cellen (GIF en GSII co-gelokaliseerde cellen) en verdikt slijmvlies. Er zijn geen fenotypische verschillen tussen MT-TGFα met en zonder ZnSO4 behandelingsgroepen. Het Doxi-TGFα-muismodel vertoont minder ernstige fenotypes dan het MT-TGFα-muismodel. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De ziekte van Ménétrier (MD) is een zeldzame premaligne maagaandoening die wordt veroorzaakt door TGFα-overexpressie 1,2,3. Transgene muizen met TGFα tot overexpressie onder controle van de metallothioneïne-genversterker/promotor (MT-TGFα) zijn tot nu toe het enige muismodel voor MD geweest 4,5. Omdat het metallothioneïne-gen gevoelig is voor zware metalen, wordt zinksulfaat aan drinkwater toegevoegd of wordt cadmiumsulfaat geïnjecteerd om TGFα te induceren in dit muismodel 5,8. Een van de kenmerkende fenotypes bij MD is de vervanging van hoofdcellen in de basis van de maagklieren door slijmcellen die positief zijn voor markers die zowel in slijmnekcellen als in antrale mucinecellen aanwezig zijn. Dit kan gebeuren door het afsterven van hoofdcellen of het herprogrammeren van hoofdcellen tot spasmolytische metaplasie die polypeptiden tot expressie brengt (SPEM)8,11. Dit kan worden getest door afstammingstracering van hoofdcellen in een MD-muismodel. We hebben geprobeerd de belangrijkste cellen te traceren met behulp van de Mist1-CreERT2; R26-LSL-mTmG-muizen waarin Mist1-positieve hoofdcellen zijn gelabeld met membraangerichte GFP. We hebben echter slechts een beperkt aantal GFP-gelabelde cellen waargenomen in de MT-TGFα-muizen. Dit suggereert dat ofwel de meeste van de GFP-gelabelde hoofdcellen stierven als gevolg van TGFα-overexpressie of dat de efficiëntie van GFP-labeling in de hoofdcellen te laag was. Omdat er is gemeld dat er geen toename van celdood was door TGFα-overexpressie8, hebben we de mogelijkheid van een verlies van Mist1-expressie onderzocht door MT-TGFα-muizen te evalueren zonder behandeling met zware metalen. We waren verrast door de volledige fenotypes in MT-TGFα-muizen zonder behandeling met zware metalen, inclusief foveolaire hyperplasie en verlies van pariëtale en hoofdcellen. We hebben ook bevestigd dat Mist1-expressie verloren gaat in MT-TGFα-muizen, zelfs zonder behandeling met zware metalen. Eerder is gemeld dat TGFα-expressie niet streng werd gecontroleerd bij MT-TGFα-muizen vanwege het onvermogen om blootstelling aan zware metalen te elimineren; de TGFα-expressie werd echter significant verhoogd door behandeling met zware metalen8. Uitgebreide fenotypische evaluatie is nog niet eerder uitgevoerd bij MT-TGFα-muizen zonder behandeling met zware metalen. De huidige studie toont aan dat MT-TGFα-muizen volledige fenotypische manifestatie ontwikkelen zonder behandeling met zware metalen.

Omdat Mist1-expressie verloren was gegaan in de MT-TGFα-muizen, zelfs vóór de behandeling met zware metalen, bleef er behoefte aan een ander muismodel waarin TGFα-expressie specifiek wordt gecontroleerd, zodat fenotypes zich niet ontwikkelen zonder inductie van TGFα-overexpressie. We hebben een nieuw MD-muismodel gegenereerd waarin TGFα-expressie wordt geïnduceerd door behandeling met doxycycline (Doxi-TGFα). We hebben bevestigd dat dit muismodel foveolaire hyperplasie en verlies van pariëtale en hoofdcellen induceert, de belangrijkste fenotypes van MD. We waren in staat om hoofdcellen te traceren met behulp van de Mist1-CreERT2; R26-LSL-mTmG-muizen in dit muismodel en ontdekten dat sommige GFP-gelabelde cellen ook waren gelabeld met GSII en CD44v9, wat bevestigt dat SPEM voorkomt in dit nieuwe MD-muismodel. Het is het eerste rapport dat bevestigt dat SPEM zich in de maag ontwikkelt met TGFα-overexpressie. SPEM is een vaker voorkomende premaligne maagaandoening, wat de reden kan zijn dat maagkanker toeneemt bij MD-patiënten 22,23.

Een voorbehoud bij het gebruik van de Mist1-CreERT2-muislijn is dat is gemeld dat Mist1 ook tot expressie kan worden gebracht in de maagstamcellen24. We ontdekten dat een lage dosis (37,5 mg/kg) behandeling met tamoxifen Cre-activering induceert, meer specifiek in de hoofdcellen, met minimale activering in de landengte, zelfs op eerdere tijdstippen vóór de behandeling met doxycycline. Soortgelijke bevindingen zijn eerder gerapporteerd25. Afstammingstracering met behulp van de Mist1-CreERT2; R26-LSL-mTmG-muizen vertonen GFP-positieve cellen in de buurt van GFP- en SPEM-marker (GSII en CD44v9), dubbelpositieve cellen zijn voornamelijk gelokaliseerd in de basis waar de hoofdcellen zich bevinden (Figuur 4C). Als de dubbelpositieve cellen van de GFP- en SPEM-marker uit de stamcellen worden getraceerd, zouden er meer GFP-positieve cellen moeten zijn geweest in de richting van de landengte waar stamcellen zich bevinden. Als alternatief kan doxycycline-induceerbare GIF-rtTA muislijn26 of GPR30-rtTA muislijn27 samen met MT-TGFα-muizen worden gebruikt voor genetische modificaties of het traceren van de afstamming van de hoofdcellen. GIF-positieve cellen zijn echter afgenomen in MT-TGFα-muizen zonder ZnSO4-behandeling (Figuur 3B,C), en GPR30-positieve cellen gaan verloren in SPEM, wat voorkomt bij MT-TGFα-muizen zonder ZnSO4-behandeling. Daarom zullen ze minder efficiënt zijn in vergelijking met Doxi-TGFα-muizen gekruist met de Mist1-CreERT2-muislijn.

De huidige studie toont aan dat MT-TGFα-muizen volledige fenotypische veranderingen in de maag ontwikkelen zonder behandeling met zware metalen. We laten ook zien dat een van de fenotypes het verlies van Mist1-expressie is en dit sluit het gebruik van de Mist1-CreERT2 uit; R26-LSL-mTmG muis lijn naar afstamming traceren hoofdcellen. We hebben een nieuw MD-muismodel gegenereerd, Doxi-TGFα, en hebben voor het eerst bevestigd dat SPEM zich in MD ontwikkelt met behulp van dit muismodel. Dit nieuwe MD-muismodel zal nuttig zijn wanneer nauwkeurige controle van de ontwikkeling van MD-fenotypes noodzakelijk is en wanneer genetische modificaties in hoofdcellen nodig zijn met behulp van de Mist1-CreERT2-muislijn. MD-fenotypes worden geïnduceerd door activering van EGFR-signalering door TGFα-overexpressie. Het is echter niet bekend bij EGFR-activering waarbij celtypen verantwoordelijk zijn voor de waargenomen fenotypes. Met behulp van het Doxi-TGFα-muismodel onderzoeken we momenteel de rol van EGFR-signalering in verschillende celtypen, waaronder hoofdcellen die gebruik maken van de Mist1-CreERT2-muislijn.

Openbaarmakingen

Alle auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (K08 DK124686 tot WJH). We danken Gina Della Porta en Sarah E. Glass voor het bewerken van het manuscript.

Bijdrage van de auteur:
TTG voerde experimenten uit, genereerde figuren, schreef het manuscript en redigeerde het manuscript. JDP voerde experimenten uit, genereerde figuren, schreef het manuscript en bewerkte het manuscript. SKM leverde de TetO-TGFα muislijn en redigeerde het manuscript. RJC bedacht experimenten en redigeerde het manuscript. WJH bedacht experimenten, voerde experimenten uit, interpreteerde gegevens, doorzocht de literatuur, schreef het manuscript en redigeerde het manuscript.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Mouse anti H+/K+-ATPase antibodyEen geschenk van Dr. Eunyoung ChoiN/AVerdunning: 1:10000
Antibody DiluentAbcam559148
Anti-rabbit GFPLife Technologies CorporationA11122Verdunning: 1:500
Charged Glass SlidesFisher22-178-277
Cover SlipsGlobe Scientific1411-10
Donkey anti-mouse 594InvitrogenA12102Verdunning: 1:500
Donkey anti-rabbit 488InvitrogenA21206Verdunning: 1:500
Donkey anti-rabbit 594InvitrogenA21207Verdunning: 1:500
Donkey anti-rat 594InvitrogenA21209Verdunning: 1:500
Doxyclycine HyclateTCID4116
Flouromount-GThermo fischer00-4958-02
GSII 488InvitrogenL21415Verdunning: 1:500
Hydrophobic MarkerElectron Microscopy Sciences71312
IncubatorLabnetI 5110
MIST1/bHLHa15 (D7N4B) XP Rabbit mAbCell Signaling14896SVerdunning: 1:200
Pressure Cooker (6QT)CuisinartCPC-600N1
Protein BlockAbcamAB64226
Rabbit anti-GIF antibodyMyBioSourceMBS2028736Verdunning: 1:200
Rat anti CD44v9 mAbCosmo BioLKG-M002Verdunning: 1:20000
Slide JarsSimportM906-12AS
TamoxifenSigma-AldrichT5648
TrilogySigma922P-10-RUO
UEA1 Dylight 649Vector LaboratoriesDL-1068Verdunning: 1:500

Referenties

  1. Huh, W. J., Coffey, R. J., Washington, M. K. Menetrier's disease: Its mimickers and pathogenesis. J Pathol Transl Med. 50 (1), 10-16 (2016).
  2. Tanksley, J. Jr, Tanksley, J. Pierre menetrier and his disease. Trans Am Clin Climatol Assoc. 123, discussion 133-124 126-133 (2012).
  3. Rich, A., et al. Distinguishing menetrier's disease from its mimics. Gut. 59 (12), 1617-1624 (2010).
  4. Takagi, H., Jhappan, C., Sharp, R., Merlino, G. Hypertrophic gastropathy resembling menetrier's disease in transgenic mice overexpressing transforming growth factor alpha in the stomach. J Clin Invest. 90 (3), 1161-1167 (1992).
  5. Dempsey, P. J., et al. Possible role of transforming growth factor alpha in the pathogenesis of menetrier's disease: Supportive evidence form humans and transgenic mice. Gastroenterology. 103 (6), 1950-1963 (1992).
  6. Fiske, W. H., et al. Efficacy of cetuximab in the treatment of menetrier's disease. Sci Transl Med. 1 (8), 8ra18(2009).
  7. Burdick, J. S., et al. Treatment of menetrier's disease with a monoclonal antibody against the epidermal growth factor receptor. N Engl J Med. 343 (23), 1697-1701 (2000).
  8. Goldenring, J. R., et al. Overexpression of transforming growth factor-alpha alters differentiation of gastric cell lineages. Dig Dis Sci. 41 (4), 773-784 (1996).
  9. Sharp, R., et al. Transforming growth factor alpha disrupts the normal program of cellular differentiation in the gastric mucosa of transgenic mice. Development. 121 (1), 149-161 (1995).
  10. Bockman, D. E., Sharp, R., Merlino, G. Regulation of terminal differentiation of zymogenic cells by transforming growth factor alpha in transgenic mice. Gastroenterology. 108 (2), 447-454 (1995).
  11. Nomura, S., et al. Evidence for repatterning of the gastric fundic epithelium associated with menetrier's disease and tgfalpha overexpression. Gastroenterology. 128 (5), 1292-1305 (2005).
  12. Shi, G., et al. Loss of the acinar-restricted transcription factor mist1 accelerates kras-induced pancreatic intraepithelial neoplasia. Gastroenterology. 136 (4), 1368-1378 (2009).
  13. Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10933-10938 (1996).
  14. Hardie, W. D., et al. Conditional expression of transforming growth factor-alpha in adult mouse lung causes pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (4), L741-L749 (2004).
  15. Keeley, T. M., Horita, N., Samuelson, L. C. Tamoxifen-induced gastric injury: Effects of dose and method of administration. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (3), 365-367 (2019).
  16. Huh, W. J., et al. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24.e7 (2012).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
  18. Ramsey, V. G., et al. The maturation of mucus-secreting gastric epithelial progenitors into digestive-enzyme secreting zymogenic cells requires mist1. Development. 134 (1), 211-222 (2007).
  19. Huh, W. J., et al. Xbp1 controls maturation of gastric zymogenic cells by induction of mist1 and expansion of the rough endoplasmic reticulum. Gastroenterology. 139 (6), 2038-2049 (2010).
  20. Engevik, A. C., et al. The development of spasmolytic polypeptide/tff2-expressing metaplasia (spem) during gastric repair is absent in the aged stomach. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (5), 605-624 (2016).
  21. Wada, T., et al. Functional role of cd44v-xct system in the development of spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia. Cancer Sci. 104 (10), 1323-1329 (2013).
  22. Halldorsdottir, A. M., et al. Spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia (spem) associated with gastric cancer in iceland. Dig Dis Sci. 48 (3), 431-441 (2003).
  23. Yamaguchi, H., Goldenring, J. R., Kaminishi, M., Lee, J. R. Identification of spasmolytic polypeptide expressing metaplasia (spem) in remnant gastric cancer and surveillance postgastrectomy biopsies. Dig Dis Sci. 47 (3), 573-578 (2002).
  24. Hayakawa, Y., et al. Mist1 expressing gastric stem cells maintain the normal and neoplastic gastric epithelium and are supported by a perivascular stem cell niche. Cancer Cell. 28 (6), 800-814 (2015).
  25. Saenz, J. B., Vargas, N., Cho, C. J., Mills, J. C. Regulation of the double-stranded rna response through adar1 licenses metaplastic reprogramming in gastric epithelium. JCI Insight. 7 (3), e153511(2022).
  26. Caldwell, B., Meyer, A. R., Weis, J. A., Engevik, A. C., Choi, E. Chief cell plasticity is the origin of metaplasia following acute injury in the stomach mucosa. Gut. 71 (6), 1068-1077 (2022).
  27. Hata, M., et al. Gpr30-expressing gastric chief cells do not dedifferentiate but are eliminated via pdk-dependent cell competition during development of metaplasia. Gastroenterology. 158 (6), 1650-1666.e15 (2020).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Ziekte van MenetrierTGF alfa overexpressieEGFR signaleringfoveolaire hyperplasieverlies van pari tale cellenMist1 CreERT2 muizendoxycycline inductiespasmolytische polypeptide metaplasiedifferentiatie van hoofdcellen
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.