Methodenartikel

Genoombrede CRISPR-screening voor het onthullen van stralingsgevoelige en radioresistente genen

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67982

⸱

23 mei 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pulmonary Oncology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Tumor Precision Diagnosis and Treatment Technology and Translational Medicine, Hubei Engineering Research Center, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 3Hubei Key Laboratory of Tumor Biological Behaviors, Zhongnan Hospital of Wuhan University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Er wordt een nauwgezette en gestructureerde aanpak gegeven om resistente en gevoelige stralingsgenen te selecteren door de toepassing van een genoomwijde CRISPR/Cas9-screeningsmethode. Dit protocol heeft ook het potentieel om te dienen als een veelzijdig kader voor andere onderzoeksinspanningen die de mechanismen van resistentie tegen klinisch toegediende chemische geneesmiddelen onderzoeken.

Samenvatting

Het CRISPR-Cas9-systeem is benut en hergebruikt tot een krachtige tool voor het bewerken van het genoom. Door gebruik te maken van deze technologie kunnen onderzoekers DNA-sequenties in levende cellen nauwkeurig knippen, plakken en zelfs herschrijven. Toch gaat de toepassing van CRISPR-schermtechnologie veel verder dan alleen experimenteren. Het dient als een cruciaal hulpmiddel in de strijd tegen genetische ziekten, het systematisch ontleden van complexe genetische landschappen, het stelt onderzoekers in staat om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan biologische verschijnselen te ontrafelen en stelt wetenschappers in staat om de grondoorzaken van ziekten zoals kanker, cystische fibrose en sikkelcelanemie te identificeren en aan te pakken. Kanker vormt onder meer een formidabele uitdaging voor de geneeskunde, die de uitroeiingsinspanningen stimuleert. Radiotherapie, als traditionele behandeling, levert resultaten op, maar heeft beperkingen. Het roeit kankercellen uit, maar beschadigt ook gezonde weefsels, wat nadelige effecten veroorzaakt die de kwaliteit van leven verminderen. Bovendien reageren niet alle kankercellen op radiotherapie en kunnen sommige resistentie ontwikkelen, waardoor de aandoening verergert. Om dit aan te pakken, wordt een uitgebreide CRISPR-screeningtechnologie voor het hele genoom geïntroduceerd, omdat deze de efficiënte identificatie van stralingsgevoelige en radioresistente genen mogelijk maakt, waardoor het onderzoek naar en de behandeling van kanker wordt bevorderd. Een genoombrede CRISPR-screening werd uitgevoerd in longadenocarcinoomcellen die werden blootgesteld aan bestraling volgens het beschreven protocol, waarmee zowel radioresistentie- als radiosensitiviteit-geassocieerde genen werden geïdentificeerd.

Inleiding

Het onderzoek naar biologische verschijnselen is inherent verweven met de studie van cellulair gedrag, en op zijn beurt is het onderzoek naar cellulair gedrag fundamenteel verbonden met de verkenning van het genoom. Naarmate de moderne technologie zich blijft ontwikkelen, verleggen medische onderzoekers geleidelijk hun aandacht naar het veranderen van cellulair gedrag via genbewerking om de behandelingsresultaten van verschillende ziekten te verbeteren. In dit opzicht is de CRISPR-technologie (geclusterde, regelmatig op afstand van elkaar geplaatste) naar voren gekomen als een revolutionair hulpmiddel voor genoombewerking vanwege de relatief eenvoudige toepassing1. Het CRISPR-Cas9-systeem bestaat uit Cas9-nuclease en single-guide RNA (sgRNA), dat specifiek de doel-DNA-sequentie herkent en eraan bindt, waardoor Cas9-nuclease op die locatie wordt geknipt, wat resulteert in een dubbelstrengsbreuk (DSB) in het genoom-DNA 2,3,4. Bovendien kan de introductie van andere stoffen leiden tot specifieke inserties, deleties of mutaties in het genoom, waardoor gerichte genbewerking mogelijk wordt.

In functioneel genomics-onderzoek was RNA-interferentie (RNAi) -screening ooit een veelgebruikte methode voor het uitvoeren van grootschalige experimenten met functieverlies om genrollen bij kanker te onderzoeken. De RNAi-technologie bestudeert de genfunctie door specifiek doelgenen uit te schakelen, waardoor onderzoekers kritieke oncogene factoren kunnen identificeren. Het wordt echter beperkt door off-target effecten en onvolledige efficiëntie van het uitschakelen van genen. Off-target effecten kunnen leiden tot het uitschakelen van andere niet-doelwitgenen, waardoor de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van experimentele resultaten in het gedrang komen 1,2. Bovendien vertoont RNAi een lage knockdown-efficiëntie voor bepaalde genen, waardoor de genexpressie van het doelwit mogelijk niet volledig wordt onderdrukt. In tegenstelling tot traditionele RNAi-schermen vertoont het CRISPR-scherm een hogere specificiteit en efficiëntie3. Deze technologie maakt niet alleen nauwkeurige bewerking van specifieke genen mogelijk, maar maakt ook genoombrede grootschalige screening mogelijk, wat robuuste ondersteuning biedt voor onderzoek naar genfunctie. CRISPR-schermtechnologie, een krachtige tool voor het bewerken van genen op basis van het CRISPR-Cas9-systeem, wordt gebruikt voor het efficiënt screenen en onthullen van onbekende functies van specifieke genen in cellen 5,6,7,8. Onderzoekers ontwerpen sgRNA's in batches voor specifieke genen of genregio's, en bereiden overeenkomstige sgRNA-bibliotheken voor met precisie en nauwkeurigheid, waardoor hun integriteit en functionaliteit worden gegarandeerd9. Deze sgRNA-bibliotheken worden vervolgens ingekapseld in lentivirale deeltjes, die worden gebruikt om gastheercellen efficiënt te infecteren. Na een succesvolle infectie worden de geïnfecteerde cellen gekweekt onder persoonlijk gedefinieerde screeningsomstandigheden. Bij screening wordt het genomische DNA van de gescreende cellen geëxtraheerd, waarbij hoge normen voor zuiverheid en kwantiteit worden gehandhaafd. Vervolgens worden gerichte gebieden van sgRNA-belang onderworpen aan PCR-amplificatie, een proces dat de gewenste segmenten van nucleïnezuren nauwkeurig repliceert 3,9. Ten slotte wordt high-throughput sequencing uitgevoerd op de geamplificeerde DNA-fragmenten, waardoor een uitgebreide en efficiënte analyse van de doelregio's mogelijk wordt, en zo waardevolle inzichten wordt verkregen in de functie en het gedrag van de genen in studie4.

Kanker vormt een formidabele bedreiging voor de menselijke gezondheid als complexe ziekte. Wereldwijd leveren onderzoekers en clinici gezamenlijke inspanningen om de moleculaire mechanismen van carcinogenese te ontrafelen en nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen. Er zijn internationale samenwerkingsverbanden tot stand gebracht om de vertaling van fundamentele onderzoeksresultaten naar klinische toepassingen te versnellen, met als uiteindelijk doel de patiëntresultaten te verbeteren. Sasmal et al. stelde een bioorthogonale assemblagestrategie voor op basis van een synthetisch gastheer-gastsysteem voor nauwkeurige targeting van uitgezaaide kankercellen, wat tientallen wetenschappers aanzienlijk heeft geholpen bij het bevorderen van medische technologieën. Hun uitstekende onderzoekswerk heeft een hoge mate van innovatie en unieke inzichten, en levert een zinvolle bijdrage aan de wetenschappelijke gemeenschap10. Kanker wordt gekenmerkt door de tumultueuze staat van genomische instabiliteit, die voortkomt uit de grillige regulatie van de DNA-schadereacties 11-14. DNA-schade omvat single-nucleotide defecten, single-streng breuken en DSB's. Homologe recombinatie (HR) en niet-homologe eindverbinding (NHEJ) nemen deel aan het herstel van DSB's in verschillende stadia 15,16,17. Op basis hiervan is radiotherapie naar voren gekomen als een levensvatbare behandelingsoptie, waarbij hoogenergetische stralen (zoals röntgenstralen en γ-stralen) worden gebruikt om tumorweefsel te bestralen, waardoor DNA-schade in tumorcellen wordt veroorzaakt, waardoor hun groei en proliferatie worden verstoord18. Radiotherapie levert echter niet altijd de gewenste effecten op bij een aanzienlijk deel van de kankerpatiënten, mogelijk als gevolg van schade aan paracancereuze weefsels en beperkingen die worden opgelegd door de inherente kenmerken van de tumor, zoals lage gevoeligheid voor radiotherapie 19,20,21.

Theoretisch kan elk celtype worden gebruikt voor een CRISPR-scherm. Om voldoende vertegenwoordiging in gemuteerde populaties te behouden, is echter een groot aantal startcellen nodig. Celtypen met een lage abundantie zijn niet bijzonder geschikt voor genoombrede screening. Wat de keuze van de bibliotheek betreft, bevatten de meeste bibliotheken 3-6 gRNA's per doelgen, en het handhaven van de distributie van elk gRNA binnen de populatie is van cruciaal belang18. Verlies van vertegenwoordiging als gevolg van verrijking of uitputting van specifieke gRNA's kan leiden tot een ongelijke verdeling van de resultaten. Om dit probleem aan te pakken, kan het een betere keuze zijn om te kiezen voor in de handel verkrijgbare CRISPR-bibliotheken die op de markt zijn getest20. In vitro CRISPR-screening met behulp van homogene kankercellijnen kan de genetische en epigenetische heterogeniteit van in vivo tumoren mogelijk niet volledig weergeven. Hoewel in-vitroscreening sleutelgenen onthulde die betrokken zijn bij het herstel van DNA-schade en door straling geïnduceerde autocriene signalering, repliceerde het de micro-omgeving van de tumor niet volledig, inclusief hypoxie-geïnduceerde radioresistentie (via ROS, metabole aanpassing en autofagie), immuungemedieerde paracriene effecten en ECM-afhankelijke cytokinemodulatie. Voordat de CRISPR-screening wordt gebruikt om genen te onderzoeken die verband houden met stralingsgevoeligheid of -resistentie, moeten deze factoren zorgvuldig worden overwogen. In het licht van het huidige behandelingslandschap is het dringend nodig om factoren die verband houden met radioresistentie en stralingsgevoeligheid te identificeren en grondig te bestuderen om de werkzaamheid van radiotherapie effectief te verbeteren22. Gezien het belangrijkste voordeel van de CRISPR-screening bij het bestuderen van de functies van onbekende genen, wordt een systematisch gedetailleerde CRISPR-screeningtechnologie voor het hele genoom geleverd om stralingsgevoelige en radioresistente genen efficiënt te identificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Het selecteren van een geschikte stralingsdosis

  1. Voorbereiding en uitplating van aanhangende cellen
    1. Pas de celdichtheid aan tot 5 x 105 cellen per ml met RPMI 1640 compleet celkweekmedium met 10% FBS voor doorgang en celgroei. Verdeel de cellen in kweekschaaltjes van 3,5 cm voor bestraling in verschillende doses. Voeg 2 ml (1 x 106 cellen) toe aan elk gerecht en incubeer een nacht bij 37 °C met 5% CO2.
  2. Toepassing van verschillende stralingsdoses
    1. Nummer de kweekschaaltjes van 3,5 cm van 1 tot 5. Gebruik Groep #1 als de controlegroep, met de overige 4 groepen aangewezen als de behandelingsgroepen.
    2. Dicht de randen van de 6-well-platen af met een afdichtingsmembraan voor behandelingsgroepen en dien stralingsdoses van respectievelijk 2, 4, 6 en 8 Gy toe. Na de behandeling plaatst u de gerechten terug in de couveuse.
  3. Uitplating van cellijnen na bestraling
    1. Bereid borden met 6 putjes en 96 putjes voor. Was de cellen in de 3,5 cm kweekschaaltjes één keer met PBS, verteer de logaritmisch groeiende cellen met 0,25% trypsine en pas de celdichtheid aan op 1 x 105 cellen per ml met RPMI 1640 compleet medium met 10% FBS.
    2. Zaai 10 μL/putje (1.000 cellen/100 μL) in de platen met 6 putjes met 3 replicaten voor elke stralingsdosis. Voeg 2 ml volledig medium toe aan elk putje en tel na 14 dagen (wanneer elke kloongroep ongeveer 50 cellen heeft).
    3. Zaai 30 μL/putje (3.000 cellen/100 μL) in de platen met 96 putjes met 5 replicaten voor elke stralingsdosis. Voeg 70 μL volledig medium toe aan elk putje en meet de levensvatbaarheid van de cellen na 72 uur.
  4. Meting van de levensvatbaarheid van cellen
    OPMERKING: Klonogene inhibitiesnelheid = 1 - (aantal klonen in de behandelingsgroep/aantal klonen in de controlegroep) x 100%. De CCK-8-test maakt gebruik van een in water oplosbaar tetrazoliumzout (WST-8) dat kan worden gereduceerd door cellulaire dehydrogenasen om een zeer wateroplosbaar geel formazanproduct te genereren11. De hoeveelheid geproduceerde formazan is recht evenredig met het aantal levensvatbare cellen, en de optische dichtheid (gemeten op een golflengte van 450 nm) weerspiegelt nauwkeurig de cellulaire metabolische activiteit en proliferatieve status11,13. Op basis van dit gevestigde principe is de CCK-8-test op grote schaal toegepast voor verschillende toepassingen, waaronder celproliferatietests en gevoeligheidstests voor tumorgeneesmiddelen. In dit protocol wordt de CCK-8-test gebruikt om de cellulaire levensvatbaarheid onder verschillende stralingsdoses systematisch te evalueren.
    1. Meng CCK8-reagens met RPMI 1640-medium zonder FBS in een verhouding van 1:9. Gooi het medium in de platen met 96 putjes weg en voeg aan elk putje 100 μL van het CCK8-bevattende medium toe.
    2. Incubeer gedurende 1 uur in het donker en meet de OD-waarde bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer.
      OPMERKING: Overlevingspercentage van de cel = [(OD-waarde van de behandelingsgroep - OD-waarde van de lege put) / (OD-waarde van de controlegroep - OD-waarde van de lege put)] x 100%
  5. Selectie van de stralingsdosis
    1. Integreer de klonogene inhibitiesnelheid met de celoverlevingssnelheid om een geschikte stralingsdosis te selecteren op basis van onderzoeksbehoeften. Selecteer een stralingsdosis met een remmingspercentage van 50% voor het screenen van zowel radioresistente als stralingsgevoelige genen.

2. Selecteren van de juiste MOI en puromycineconcentratie

  1. Uitplating van aanhangende cellen
    1. Pas de celdichtheid aan op 3 x 105 cellen per ml en inoculeer 1 ml (3 x 105 cellen) per putje in een plaat met 12 putjes. Incubeer de plaat een nacht bij 37 °C met 5% CO2.
  2. Lentivirale infectie
    1. Gebruik een pipet om het medium van de plaat met 12 putjes op te zuigen en vervang het door 1 ml RPMI 1640 compleet medium dat 10% FBS bevat. Bereid een op kwaliteit gecontroleerde CRISPR-lentivirale bibliotheek voor het hele genoom voor (in de handel verkrijgbare bibliotheken worden aanbevolen) en stel een logaritmische concentratiegradiënt in (bijv. 0-10-50-100-200-400-800)4,5,6,7,8.
    2. Voeg de overeenkomstige hoeveelheid lentivirus toe aan 2 μl/schaaltje polybreen en breng gedurende 5 minuten in evenwicht bij kamertemperatuur. Druppel het mengsel van lentivirus en polybreen langzaam in elk putje, meng goed en incubeer een nacht bij 37 °C met 5% CO2.
  3. Bepaling van de minimale promeycineconcentratie voor het doden van cellen
    1. Pas de ouderlijke celdichtheid aan naar 3 x 105 cellen/ml en inoculeer 1 ml (3 x 105 cellen) per putje in een plaat met 12 putjes. Incubeer de plaat een nacht bij 37 °C met 5% CO2.
    2. Voeg puromycine toe aan elk putje van de plaat met 12 putjes in een concentratiegradiënt van 0-0,1-0,2-0,5-1-2-4-8 μM. Tel de cellen na 72 uur. De minimale concentratie die alle cellen in de put doodt, is de minimale puromycineconcentratie voor het doden van cellen, die zal worden gebruikt voor de daaropvolgende screening van viraal geïnfecteerde cellen.
  4. Selectie van priomycine na infectie
    1. Zuig op de tweede dag na infectie het medium uit elk putje op en vervang het door 1 ml RPMI 1640 compleet medium dat 10% FBS bevat. Blijf 48 uur kweken.
    2. Vervang na 72 uur infectie het bestaande medium door een volledig medium dat de minimale puromycineconcentratie voor celdoding bevat. Zet 2 putjes in de plaat met 12 putjes zonder lentivirale infectie op als negatieve en positieve controles. Behandel de negatieve controle met puromycine en laat de positieve controle onbehandeld. Ga 72 uur door met kweken.
    3. Na 72 uur selectie van peromycine zullen alle oudercellen in de negatieve controle dood zijn, terwijl de oudercellen in de positieve controle een minimale sterfte vertonen. Bereken het MOI voor elke put.
      OPMERKING: MOI = (Aantal cellen in met virus geïnfecteerde groep / Aantal cellen in de positieve controlegroep) x 100%. Gebruik de virusconcentratie met een MOI van ~0,3 voor latere screening.

3. Genoombrede CRISPR-lentivirale bibliotheekinfectie

  1. Zaaien van aanhangende cellijnen
    1. Pas de celdichtheid aan tot 1 x 107 cellen per ml in RPMI 1640 compleet medium met 10% FBS voor passage en celgroei. Inoculeer 1 ml cellen (1 x 107 cellen) in elk kweekschaaltje van 15 cm bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 8 uur. Zodra de cellen zich hechtten en een samenvloeiing van 70%-80% bereikten, waren ze klaar voor virale infectie (wat een kopieaantal van ongeveer 500 opleverde).
  2. Lentivirale infectie
    1. Zuig het medium uit de kweekschaaltjes van 15 cm en vervang het door 15 ml RPMI 1640 compleet medium met 10% FBS. Bereid een op kwaliteit gecontroleerde CRISPR-lentivirale bibliotheek voor het hele genoom voor.
    2. Voeg de overeenkomstige hoeveelheid lentivirus toe met het MOI = 0,3 tot 30 μL/schaaltje polybreen en breng gedurende 5 minuten in evenwicht bij kamertemperatuur, druppel het mengsel van lentivirus en polybreen langzaam in de kweekschaaltjes van 15 cm, meng goed en incubeer een nacht bij 37 °C met 5% CO2 . Bereid tegelijkertijd een kweekschaaltje van 15 cm voor met de oudercel als contrast.
  3. Selectie van priomycine na infectie
    1. Zuig op de tweede dag na de virale infectie het medium op uit de kweekschaaltjes van 15 cm en vervang het door 15 ml RPMI 1640 compleet medium dat 10% FBS bevat. Blijf 48 uur kweken.
    2. Vervang 72 uur na de infectie het medium door een volledig medium dat de minimale letale concentratie piromycine bevat. Behandel de niet-geïnfecteerde oudercellen op dezelfde manier als een negatieve controle en ga door met kweken gedurende 72 uur. Na 72 uur selectie van puromycine worden alle oudercellen in de negatieve controlegroep gedood en worden de overlevende cellen van de lentivirale infectie als succesvol geïnfecteerd beschouwd.
  4. Extractie van het genoom van dag 0
    1. Verteer de cellen uit een kweekschaaltje van 15 cm met 0,25% trypsine, suspendeer opnieuw in RPMI 1640 compleet medium met 10% FBS en tel het aantal cellen. Label dit monster als Dag 0.
    2. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten (bij kamertemperatuur) en gooi het bovenstaande weg. Resuspendeer in 1 ml PBS, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g en gooi het bovenstaande weg. Extraheer dag 0 genomisch DNA, meet de DNA-concentratie en -zuiverheid met behulp van een nanodrop UV-spectrofotometer.
    3. Gebruik voor de detectie van sgRNA-integriteit de agarosegelelektroforese om de versterkte sgRNA-bibliotheek te analyseren, waarbij u ervoor zorgt dat de banden helder waren en geen significante degradatie, waardoor de integriteit van de bibliotheek behouden bleef23. Gebruik voor de evaluatie van de lentivirale bibliotheekdekking deep sequencing-technologie om sequencing-analyse uit te voeren op de sgRNA's in de bibliotheek24,25.
    4. In het CRISPR-scherm dient PCR-amplificatie als een voorlopige verificatie van de integriteit van het sgRNA-fragment en de bibliotheekkwaliteit6. Om de bibliotheekdekking en sgRNA-distributiepatronen uitgebreider te analyseren en om te zorgen voor een adequate vertegenwoordiging van sgRNA's voor elk doelgen tijdens screening, voert u NGS uit voor diepgaande inzichten in de robuustheid van screening9.
      OPMERKING: Door veranderingen in de pre- en post-screening van de sgRNA-overvloed te detecteren en potentiële sgRNA off-target integratie of bibliotheekbesmetting te identificeren, kan de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de CRISPR-screening verder worden verbeterd. Deze dag 0-monsters dienen als cruciale negatieve controles en ondergaan een uitgebreide kwaliteitsbeoordeling door middel van PCR-amplificatie en NGS om 2 hoofddoelstellingen te bereiken: (1) bevestiging van essentiële gendepletie (wat wijst op adequate bibliotheekvertegenwoordiging) en (2) demonstratie van stabiele expressie in niet-essentiële genen (vaststelling van experimentele basisvoorwaarden)9.
    5. Zorg ervoor dat de dekking het verwachte niveau bereikt om de diversiteit en representativiteit van de bibliotheek te waarborgen en voorkom vooroordelen in het screeningproces. Gebruik voor het meten van de infectie-efficiëntie fluorescentiebeeldvorming om de infectie-efficiëntie te beoordelen en ervoor te zorgen dat deze voldoet aan de experimentvereisten.

4. Toepassing van straling als screeningsvoorwaarde

  1. Groepering
    1. Pas de dichtheid van met CRISPR geïnfecteerde cellen aan tot 1 x 107 cellen per ml en inoculeer 1 ml in elke petrischaaltjes van 15 cm. Incubeer een nacht bij 37 °C met 5% CO2.
  2. Bestraling
    1. Verdeel de cellen willekeurig in 2 groepen: een behandelingsgroep en een controlegroep, met 6 schaaltjes per groep. Dien een geschikte dosis straling toe aan de cellen in de behandelingsgroep, terwijl de cellen van de controlegroep onbehandeld blijven om zich normaal voort te planten. Na de bestraling blijft u gedurende 7 dagen incuberen bij 37 °C met 5% CO2 .
    2. Herhaal in de tweede week het toedienen van een geschikte dosis straling aan de cellen van de behandelingsgroep, waarbij de cellen van de controlegroep onbehandeld blijven en ze zich normaal kunnen voortplanten. Na de radiotherapie nog 7 dagen blijven incuberen bij 37 °C met 5% CO2 .

5. Genoomextractie en sequencing

  1. Extractie van dag 14
    1. Na 14 dagen behandeling verteert u de cellen in de behandelings- en controlegroep met 0,25% trypsine, suspendeert u ze opnieuw met een volledig RPMI 1640-medium dat 10% FBS bevat en labelt u ze als dag 14-RT of dag 14-NC.
    2. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten en gooi de supernatant weg. Resuspendeer in 1 ml PBS, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g en gooi het bovenstaande weer weg. Extraheer het genomische DNA van dag 14 en detecteer de concentratie en zuiverheid van DNA met behulp van nanodrop UV-absorptiespectroscopie.
  2. PCR-amplificatie
    1. Bereid de overeenkomstige primers van de sequentie voor (zie Materiaaltabel) en verdun ze tot 10 μM.Zet een reactiesysteem van 20 μl op door de reagentia in een steriele microcentrifugebuis toe te voegen, centrifugeer gedurende 5 s bij 300 x g en meng goed. Stel de parameters van het PCR-instrument in op basis van de amplificatievoorwaarde om PCR-producten te verkrijgen.
  3. Detectie van elektroforese met agarosegel
    1. Bereid een gelgietplaat voor, verzegel de randen van de mal met agarose, plaats de kam en bereid een agarosegel van de juiste concentratie voor op basis van de lengte van het DNA-monster.
    2. Weeg nauwkeurig een bepaalde hoeveelheid agarosepoeder af, voeg een geschikte hoeveelheid elektroforesebuffer toe, meng goed en verwarm in een magnetron om te smelten. Voeg na iets afkoelen een geschikte hoeveelheid nucleïnezuurkleurstof toe, meng voorzichtig en giet langzaam in de gelgietvorm. Laat de gel 30 minuten stollen.
    3. Verwijder de kam en voeg een geschikte hoeveelheid elektroforesebuffer toe aan de elektroforesetank totdat deze de gel bedekt. Voeg een geschikte hoeveelheid laadbuffer toe aan het DNA-monster, meng goed en gebruik een pipet om het mengsel langzaam aan het monsterputje toe te voegen.
    4. Stel de juiste spanning in op basis van de grootte van het DNA-fragment en de concentratie van de agarosegel. Verwijder na elektroforese voorzichtig de gel en plaats deze in een gelimager om de resultaten te bekijken en te controleren of de PCR-amplificatie succesvol was.
  4. Illumina sequencing
    1. Verzamel het genomische DNA van de drie groepen (dag 0-groep, controlegroep en behandelingsgroep) en stuur het naar een bedrijf voor bibliotheekconstructie en Illumina-sequencing. Voer bio-informatica-analyse en visualisatie uit van de sequentieresultaten om radiotherapiegevoelige en radiotherapieresistente genen te verkrijgen26.
    2. Zet meerdere herhaalde experimenten op voor gegevensanalyse en voer statistische analyse uit op de experimentele resultaten om de consistentie en reproduceerbaarheid van de gegevens te waarborgen 27,28.
  5. Kwaliteitsbeoordeling van sequentiegegevens
    1. Onderwerp de onbewerkte gegevens aan strenge filter- en kwaliteitscontrolemechanismen om de precisie van de sequentie-informatie te garanderen5. Bereken de Phred-score (Qphred) voor elk nucleotide op basis van het sequentiefoutenpercentage, met behulp van een gespecificeerd conversiealgoritme en een model dat de waarschijnlijkheid evalueert dat er een fout optreedt tijdens basisaanroepen28.
    2. Houd het sequentiefoutenpercentage voor elke basispositie onder de 1% (gelijk aan een Q30-drempel) en zorg ervoor dat ten minste 80% van de sequentiegegevens aan deze Q30-norm voldoet ter ondersteuning van daaropvolgende analytische procedures.
  6. Gegevensverwerking en kwaliteitscontrole op monsterniveau
    OPMERKING: Voor details verwijzen wij u naar eerder gepubliceerde rapporten 29,30.
    1. Lijn de gefilterde lezingen van sequentiegegevens uit met sgRNA-bibliotheeksequenties. Rapporteer statistieken, waaronder het aantal sgRNA's in de bibliotheek met perfecte uitlijning, de gemiddelde overvloed aan sgRNA's, het aantal niet-gedetecteerde sgRNA's en het aandeel lezingen van individuele monsters die met succes in kaart zijn gebracht in de sgRNA-bibliotheek. Gebruik een hogere toewijzingsverhouding om een grotere dekking aan te geven.
    2. Tel de verrijking van reads voor elk gen (gericht op verschillende sgRNA's) in elk monster. Normaliseer de ondersteunende lezingen voor elk sgRNA in verschillende monsters met behulp van de "mediaan" normalisatiemethode van MAGeCK. Voer kwaliteitscontrole op monsterniveau uit door de verdeling van sgRNA-leestellingen te evalueren, boxplots te genereren, hoofdcomponentenanalyse (PCA) uit te voeren en correlatie-heatmaps op te stellen.
    3. Stel dat het aantal sgRNA-lezingen een Poisson-verdeling volgt. Weergave van genormaliseerde sgRNA-tellingen van verschillende groepen in boxplots om de algehele gegevensverdeling binnen monsters te visualiseren en verdelingen tussen groepen te vergelijken.
    4. Gebruik PCA om gegevensanalyse te vereenvoudigen door verschillen tussen de belangrijkste componenten en de mate van variatie binnen elk onderdeel weer te geven, waardoor de observatie van variaties binnen en tussen groepen wordt vergemakkelijkt. Gebruik een correlatie-heatmap om de relaties tussen steekproeven te illustreren.
  7. Basis analyse
    1. Voer differentiële sgRNA-analyse uit tussen groepen en identificeer essentiële genen na kwaliteitscontrole en voorlopige gegevensverwerking. Voer functionele verrijkingsanalyse uit van de relevante genen30. Rangschik essentiële genen op basis van de robuuste rangaggregatie (RRA)-score berekend door MAGeCK of andere statistische methoden zoals MLE, waarbij een lagere RRA-score een groter belang aangeeft.
    2. Gebruik R-taal of andere programmeertalen om bio-informaticaanalyse uit te voeren op de gerangschikte resultaten en visualiseer de bevindingen met behulp van GO- en KEGG-analysediagrammen30. Koppel genen of eiwitten aan overeenkomstige GO-termen (moleculaire functie, biologisch proces en cellulaire component) door middel van ID-mapping of sequentieannotatie.
    3. Gebruik KEGG als een database om functies op hoog niveau en biologische systemen te begrijpen, waarbij de geïdentificeerde genencatalogus wordt verbonden met systeemfuncties op cellulair, soort- en ecosysteemniveau. Selecteer de top 10 of 20 routes uit GO- en KEGG-analyses voor een intuïtieve weergave van routerichtingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Longkanker, met het belangrijkste sterftecijfer, vertegenwoordigt een zeer agressieve en veel voorkomende medische ziekte. Met de longkankercellijn A549 als voorbeeld om een genoombrede CRISPR-screening uit te voeren met straling als screeningsvoorwaarde, wordt de schematische workflow weergegeven in figuur 1. Onderzoek eerst de gevoeligheid van A549-cellen voor verschillende stralingsdoses door middel van kloonvorming en CCK8-experimenten (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Als geavanceerde technologie voor het bewerken van genen heeft het CRISPR-scherm ingrijpende veranderingen teweeggebracht op het gebied van wetenschappelijk onderzoek5. Deze technologie, voortgekomen uit het CRISPR-Cas9-systeem, is een essentieel hulpmiddel geworden voor het bestuderen van genfuncties vanwege de hoge efficiëntie en precisie9. Het CRISPR/Cas9-engineeringprincipe omvat het ontwerpen en introduceren van specifieke sgRNA's met ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door het Regional Science and Technology Innovation Project van de provincie Hubei (2024EIA001) en het Medical Science and Technology Innovation Platform Construction Support Project van het Zhongnan-ziekenhuis van de Universiteit van Wuhan (PTXM2025001). Figuur 1 is gemaakt met behulp van Figdraw.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
150 mm cel- en weefselkweekbakjeWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.715011Celcultuur
35 mm cel- en weefselkweekbakjeWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.706011Celcultuur
A549-cellijnATCC--
Celtellingsklem-8Shanghai Beyotime Biotech IncC0041Voor cellevensvatbaarheidstest
CO2-onafhankelijk mediumPHCbiMCO-50AICCelcultuur
Countess 3 FL geautomatiseerde celtellerThermo ScientificAMQAF2001Voor celtelling
EDTAGibco25200056Celcultuur
Fetaal bovien serumGibco10099141Celcultuur
FluorescentiemicroscoopLEICAebq 100-04Voor fluorescentiemicroscoop
Genoombrede CRISPR-lentivirale bibliotheekShanghai OBiO Technology Co., Ltd.H5070Voor lentivirale infectie
MiniAmp plus PCRThermo ScientificC37835Voor PCR-amplificatie
NEST celcultuurplaten, 12-wellWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.712002Celcultuur
NEST celcultuurplaten, 6-wellWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.703002Celcultuur
NEST celcultuurplaten, 96-wellWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.701001Celcultuur
PBSGibcoC10010500BTCelcultuur
PCR-forwardprimer (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG)Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd.-Voor PCR-amplificatie
PCR-reverseprimer (GATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCA)Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd.-Voor PCR-amplificatie
PolybreenShanghai Beyotime Biotech IncC0351Voor lentivirale infectie
PuromycinMCEHY-K1057Voor selectie na lentivirale infectie
RPMI 1640 celcultuurmediumGibco23400-021Celcultuur
TIANGENamp genomisch DNA-kitBeijing TIANGEN Biotech Co.,Ltd.DP304Voor genomische DNA-extractie
X-ray poederdiffractometerPerkinElmerVoor radiotherapie

Referenties

  1. Barrangou, R., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas systems: Prokaryotes upgrade to adaptive immunity. Mol Cell. 54 (2), 234-244 (2014).
  2. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
  3. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
  4. Arroyo, J. D., et al. A Genome-wide CRISPR death screen identifies genes essential for oxidative phosphorylation. Cell Metab. 24 (6), 875-885 (2016).
  5. Sidik, S. M., et al. A genome-wide CRISPR screen in toxoplasma identifies essential apicomplexan genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
  6. Jing, Y., et al. Genome-wide CRISPR activation screening in senescent cells reveals SOX5 as a driver and therapeutic target of rejuvenation. Cell Stem Cell. 30 (11), 1452-1471 (2023).
  7. Shifrut, E., et al. Genome-wide CRISPR screens in primary human t cells reveal key regulators of immune function. Cell. 175 (7), 1958-1971 (2018).
  8. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  9. Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer biology and therapy. Nat Rev Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).
  10. Sasmal, R., et al. Synthetic host-guest assembly in cells and tissues: Fast, stable, and selective bioorthogonal imaging via molecular recognition. Anal Chem. 90 (19), 11305-11314 (2018).
  11. Roos, W. P., Thomas, A. D., Kaina, B. DNA damage and the balance between survival and death in cancer biology. Nat Rev Cancer. 16 (1), 20-33 (2016).
  12. Huang, R., Zhou, P. K. DNA damage repair: Historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).
  13. O'Connor, M. J. Targeting the DNA damage response in cancer. Mol Cell. 60 (4), 547-560 (2015).
  14. Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481 (7381), 287-294 (2012).
  15. Carusillo, A., Mussolino, C. DNA Damage: From threat to treatment. Cells. 9 (7), 1665(2020).
  16. Li, X., Heyer, W. D. Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance. Cell Res. 18 (1), 99-113 (2008).
  17. Chang, H., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 495-506 (2017).
  18. Andratschke, N., et al. European society for radiotherapy and oncology and European organization for research and treatment of cancer consensus on re-irradiation: Definition, reporting, and clinical decision making. Lancet Oncol. 23 (10), e469-e478 (2022).
  19. Olivares-Urbano, M. A., Grinan-Lison, C., Marchal, J. A., Nunez, M. I. CSC radioresistance: A therapeutic challenge to improve radiotherapy effectiveness in cancer. Cells. 9 (7), 1651(2020).
  20. Schaue, D., McBride, W. H. Opportunities and challenges of radiotherapy for treating cancer. Nat Rev Clin Oncol. 12 (9), 527-540 (2015).
  21. Allen, C., Her, S., Jaffray, D. A. Radiotherapy for cancer: Present and future. Adv Drug Deliv Rev. 109, 1-2 (2017).
  22. Xue, C., Greene, E. C. DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-Mediated genome editing. Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).
  23. Tzelepis, K., et al. A CRISPR dropout screen identifies genetic vulnerabilities and therapeutic targets in acute myeloid leukemia. Cell Rep. 17 (4), 1193-1205 (2016).
  24. Rottner, A. K., et al. A genome-wide CRISPR screen identifies CALCOCO2 as a regulator of beta cell function influencing type 2 diabetes risk. Nat Genet. 55 (1), 54-65 (2023).
  25. Chen, M., et al. CRISPR-Cas9 for cancer therapy: Opportunities and challenges. Cancer Lett. 447, 48-55 (2019).
  26. Gupta, D., et al. CRISPR-Cas9 system: A new-fangled dawn in gene editing. Life Sci. 232, 116636(2019).
  27. Li, B., et al. Genome-wide CRISPR screen identifies host dependency factors for influenza A virus infection. Nat Commun. 11 (1), 164(2020).
  28. Hung, K. L., et al. Targeted profiling of human extrachromosomal DNA by CRISPR-CATCH. Nat Genet. 54 (11), 1746-1754 (2022).
  29. Bhattacharya, D., Van Meir, E. G. A simple genotyping method to detect small CRISPR-Cas9 induced indels by agarose gel electrophoresis. Sci Rep. 9 (1), 4437(2019).
  30. Razavi, Z., Soltani, M., Souri, M., Van Wijnen, A. J. CRISPR innovations in tissue engineering and gene editing. Life Sci. 358, 123120(2024).
  31. Wang, W., et al. A genome-wide CRISPR-based screen identifies KAT7 as a driver of cellular senescence. Sci Transl Med. 13 (575), eabd2655(2021).
  32. Xu, X., et al. Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing. Mol Cell. 81 (20), 4333-4345 (2021).
  33. Huang, M., et al. FACS-based genome-wide CRISPR screens define key regulators of DNA damage signaling pathways. Mol Cell. 83 (15), 2810-2828 (2023).
  34. Feng, J., et al. Genome-wide CRISPR screen identifies synthetic lethality between DOCK1 inhibition and metformin in liver cancer. Protein Cell. 13 (11), 825-841 (2022).
  35. Saurat, N., et al. Genome-wide CRISPR screen identifies neddylation as a regulator of neuronal aging and AD neurodegeneration. Cell Stem Cell. 31 (8), 1162-1174 (2024).
  36. Du, Y., Liu, Y., Hu, J., Peng, X., Liu, Z. CRISPR/Cas9 systems: Delivery technologies and biomedical applications. Asian J Pharm Sci. 18 (6), 100854(2023).
  37. Shi, J., et al. A genome-wide CRISPR screen identifies WDFY3 as a regulator of macrophage efferocytosis. Nat Commun. 13 (1), 7929(2022).
  38. Liu, N., Olson, E. N. CRISPR modeling and correction of cardiovascular disease. Circ Res. 130, (2022).
  39. Feng, X., et al. Genome-wide CRISPR screens using isogenic cells reveal vulnerabilities conferred by loss of tumor suppressors. Sci Adv. 8 (19), 6638(2022).
  40. Ghaemi, A., et al. CRISPR-Cas9 genome editing delivery systems for targeted cancer therapy. Life Sci. 267, 118969(2021).
  41. Derry, W. B. CRISPR: Development of a technology and its applications. FEBS J. 288 (2), 358-359 (2021).
  42. Sharma, G., Sharma, A. R., Bhattacharya, M., Lee, S. S., Chakraborty, C. CRISPR-Cas9: A preclinical and clinical perspective for the treatment of human diseases. Mol Ther. 29 (2), 571-586 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Radiogevoelige genenlongkankercellenradiotherapie resistentieDNA schaderesponslentivirale infectiekolonievormingsassaypuromycineselectiegene ontology analyse

Gerelateerde artikelen