Methodenartikel

Multischaalonderzoek van corticale verwerking door integratie van laminaire polytrodes en optogenetica met micro-elektrocorticografie bij knaagdieren

DOI:

10.3791/67983

⸱

23 mei 2025

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, UC Berkeley, 2Biological Systems and Engineering Division, Lawrence Berkeley National Lab, 3Helen Wills Neuroscience Institute, UC Berkeley, 4Redwood Center for Theoretical Neuroscience, UC Berkeley, 5Scientific Data Division, Lawrence Berkeley National Lab

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we twee protocollen voor de registratie van micro-elektrocorticografie met hoge dichtheid (μEcoG) bij ratten en muizen, inclusief chirurgische, implantatie- en registratiemethoden. μECoG-opnames worden uitgevoerd in combinatie met laminaire polytrode-opname in de auditieve cortex van de rat of met optogenetische manipulatie van neurale activiteit in de somatosensorische cortex van de muis.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrocorticografie (ECoG) is een methodologische brug tussen fundamentele neurowetenschappen en het begrijpen van de menselijke hersenfunctie in gezondheid en ziekte. ECoG registreert neurofysiologische signalen rechtstreeks van het corticale oppervlak met een temporele resolutie van milliseconden en een kolomvormige ruimtelijke resolutie over grote delen van het corticaal weefsel tegelijkertijd, waardoor het uniek gepositioneerd is om zowel lokale als gedistribueerde corticale berekeningen te bestuderen. Hier beschrijven we het ontwerp van op maat gemaakte micro-ECoG-apparaten (μECoG) met hoge dichtheid en het gebruik ervan in twee procedures. Deze roosters hebben 128 elektroden met een lage impedantie en een afstand van 200 μm, vervaardigd op een helder polymeersubstraat met perforaties tussen de elektroden; deze functies maken gelijktijdige μECoG-opname mogelijk met laminaire polytrode-opnames en optogenetische manipulaties. Eerst presenteren we een protocol voor gecombineerde epidurale μECoG-registratie over de somatosensorische cortex van de snorharen van muizen met optogenetische manipulatie van specifieke genetisch gedefinieerde corticale celtypen. Dit maakt causale dissectie mogelijk van de verschillende bijdragen van verschillende neuronale populaties aan sensorische verwerking, terwijl ook hun specifieke handtekeningen in μECoG-signalen worden gecontroleerd. Ten tweede presenteren we een protocol voor acute experimenten om neurale activiteit van de auditieve cortex van de rat vast te leggen met behulp van μECoG-rasters en laminaire polytrodes. Dit maakt het mogelijk om de sensorisch opgewekte neurale responsen over het corticale oppervlak gedetailleerd in kaart te brengen, gelijktijdig met opnames van meerdere neurale eenheden verspreid over de corticale diepte. Deze protocollen maken experimenten mogelijk die gedistribueerde corticale activiteit karakteriseren en kunnen bijdragen aan het begrijpen en uiteindelijke interventies voor diverse neurologische aandoeningen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hersenfuncties die ten grondslag liggen aan sensatie, cognitie en actie zijn georganiseerd en gedistribueerd over enorme ruimtelijke en temporele schalen, variërend van de pieken van afzonderlijke neuronen tot de elektrische velden die worden gegenereerd door populaties van neuronen in een corticale kolom tot de topografische organisatie van kolommen in hersengebieden (bijv. somatotopie in somatosensorische cortex, tonotopie in primaire auditieve cortex). Om de hersenfunctie te begrijpen, is het nodig om elektrische signalen op deze ruimtelijke schalen te detecteren1. De neurowetenschappen hebben momenteel veel veelgebruikte methoden om de activiteit van de hersenen te volgen. Elektrofysiologisch maken laminaire polytrodes (zoals Neuropixels) het mogelijk om een bescheiden aantal (~300) afzonderlijke neuronen te monitoren, meestal binnen een handvol ver uit elkaar liggende kolommen, met een hoge (≥1 kHz) temporele resolutie. Ca2+ beeldvorming maakt het mogelijk om bescheiden tot grote aantallen genetisch en anatomisch geïdentificeerde afzonderlijke neuronen te monitoren binnen een ruimtelijke omvang van ~1-2 mm bij een lagere (~10 Hz) temporele resolutie2. fMRI maakt het mogelijk om de metabolische toestand van grote aantallen neuronen (~1 M neuronen ineen volume van 36 mm3) in de hele hersenen te monitoren met een zeer lage (~0,2 Hz) temporele resolutie. EEG/MEG maakt het mogelijk om de elektrische activiteit van het hele corticale oppervlak/de hersenen te monitoren met een bescheiden temporele resolutie (<100 Hz) en een zeer lage ruimtelijke resolutie (centimeters)3. Hoewel elk van deze methodologieën fundamentele, synergetische inzichten in de hersenfunctie heeft opgeleverd, zijn methoden in opkomst die directe waarneming van elektrofysiologische signalen met hoge temporele resolutie mogelijk maken vanaf precieze anatomische locaties in brede ruimtelijke gebieden van de cortex. De noodzaak van een brede ruimtelijke dekking wordt benadrukt door het feit dat in de hersenen de neuronale functie veel dramatischer verandert over het oppervlak in vergelijking met de diepte4.

Elektrocorticografie (ECoG) is een methode waarbij rasters van elektroden met lage impedantie op het oppervlak van de hersenen worden geïmplanteerd en die opname of stimulatie van de cortex mogelijk maken 1,5. ECoG wordt doorgaans ingezet in menselijke neurochirurgische omgevingen als onderdeel van de klinische opwerking voor de behandeling van farmacologisch hardnekkige epilepsie. Het biedt echter ook unieke inzichten in gedistribueerde corticale verwerking bij mensen, zoals spraak en sensorische topografische kartering 6,7. Deze mogelijkheden hebben het gebruik ervan in diermodellen gemotiveerd, waaronder apen, ratten en muizen 5,8,9,10,11. Bij knaagdieren is onlangs aangetoond dat micro-ECoG (μECoG) een hoge temporele resolutie (~100 Hz) directe elektrische monitoring van neuronale populaties mogelijk maakt met kolomvormige ruimtelijke resolutie (~200 μm) en brede ruimtelijke dekking (vele millimeters). μECoG stelt onderzoekers in staat om gedistribueerde neurale dynamiek te onderzoeken die verband houdt met complexe sensorische verwerking, cognitieve functies en motorisch gedrag in diermodellen12,13. Recente ontwikkelingen hebben μECoG geïntegreerd met optogenetica en laminaire polytrode-opnames 14,15,16,17,18,19,20, waardoor multischaalonderzoek van corticale netwerken mogelijk is en de kloof tussen neuronale activiteit op microschaal en corticale dynamica op macroschaal kan worden overbrugd 21,22. Omdat het μECoG-signaal erg vergelijkbaar is in menselijke en niet-menselijke diermodellen, maakt het gebruik van μECoG de vertaling van resultaten en bevindingen van diermodellen naar mensen veel directer23. Als zodanig zijn integratieve benaderingen cruciaal voor het bevorderen van ons begrip van neurale circuits en zijn ze veelbelovend voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische interventies voor neurologische aandoeningen 5,24,25.

Bijgevolg is er een groeiende behoefte aan protocollen die μECoG-arrays met hoge dichtheid integreren met laminaire opnames en optogenetische hulpmiddelen om uitgebreid multischaalonderzoek van corticale verwerking mogelijk te maken 8,26. Om deze kloof te dichten, hebben we op maat ontworpen μECoG-apparaten ontwikkeld met 128 elektroden met lage impedantie met een elektrodediameter van 40 μm en een afstand tussen de elektroden van 20 μm op een flexibel, transparant polymeersubstraat (paryleen-C en polyimide) met perforaties tussen elektroden, waardoor gelijktijdige μECoG- en laminaire polytrode-opnames met optogenetische manipulaties mogelijk zijn13,22. De belangrijkste aspecten van dit experimentele protocol zijn onder meer: (i) kolomvormige ruimtelijke resolutie en grootschalige dekking van corticale activiteit door middel van μECoG-arrays met hoge dichtheid; ii) het vermogen om vanuit meerdere corticale lagen te registreren met behulp van laminaire polytrodes die via het μECoG-raster worden ingebracht; en (iii) de integratie van optogenetische technieken om selectief specifieke neuronale populaties te activeren of te remmen, waardoor causale dissectie van neurale circuits mogelijk wordt 27,28,29. De configuratie met hoge dichtheid maakt opnames met een hoge ruimtelijke resolutie mogelijk, waardoor in feite een "kolomvormig beeld" van corticale activiteit wordt geboden, aangezien eerdere studies hebben aangetoond dat μECoG-signalen activiteit kunnen oplossen op een ruimtelijke schaal die vergelijkbaar is met de diameter van de corticale kolom van knaagdieren (~20 μm)11. Deze geïntegreerde methodologie maakt gelijktijdige multiscale monitoring en manipulatie van neurale activiteit mogelijk, waardoor causale experimenten mogelijk worden om de neuronale bronnen van μECoG-signalen te bepalen, evenals gedistribueerde corticale verwerking. Om deze doelstellingen te bereiken, biedt dit manuscript gedetailleerde protocollen voor het gebruik van μECoG-arrays met hoge dichtheid in twee combinaties.

Eerst beschrijven we μECoG in combinatie met de manipulatie van laag 5 (L5) piramidale cellen in de primaire somatosensorische cortex van de muis (S1). Bij de muis wordt de μECoG-array epiduraal geplaatst (vanwege de chirurgische hardnekkigheid van durotomie bij muizen). Een optische vezel wordt over het raster geplaatst of gecombineerd met een lens om het optogenetische licht over een klein doelgebied van het corticale oppervlak te focussen. De optogenetische strategie wordt hier beschreven voor remming van laag 5 excitatoire neuronen, maar kan gemakkelijk worden aangepast aan elke populatie van neuronen die zijn voorzien van de corresponderende, populatiespecifieke, Cre-expressieve muislijn. Ten tweede beschrijven we het gecombineerde gebruik van μECoG met silicium laminaire polytrodes om tegelijkertijd corticale elektrische potentialen (CSEP's) en single-unit spiking-activiteit van meerdere neuronen over corticale lagen van de auditieve cortex van de rat (A1) te registreren. De array heeft perforaties tussen elektroden, waardoor meerkanaals laminaire polytrodes door het raster kunnen worden ingebracht om neuronale activiteit over verschillende corticale lagen te registreren. Tijdens de craniotomieprocedure wordt de μECoG-array subduraal over de auditieve cortex geplaatst en wordt de laminaire polytrode via de perforaties ingebracht. Neurale signalen van de μECoG en laminaire sonde worden gelijktijdig opgenomen, gesampled op respectievelijk 6 kHz en 24 kHz, met behulp van een versterkersysteem dat optisch is aangesloten op een digitale signaalprocessor.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beide protocollen volgen dezelfde belangrijke stappen (anesthesie, fixatie, craniotomie, μECoG-registratie), maar hebben opmerkelijke verschillen. In de volgende beschrijving worden de gedeelde stappen samengevoegd, terwijl de specifieke kenmerken van elk protocol worden geannoteerd. Deze stappen hieronder komen overeen met μECoG-registratie met optogenetica (muis) of μECoG-registratie met een laminaire sonde (Rat). Alle hier beschreven procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale ethische of wettelijke autoriteiten (IACUC of ethische commissies). Gebruikte medicijnen kunnen variëren afhankelijk van het goedgekeurde ethische protocol.

1. Voorbereiding en protocol voor muizen- en rattenprocedures

  1. Opmerkelijke verschillen tussen muis- en rattenprotocollen
    1. Opstellingen voor chirurgie versus elektrofysiologische opnames
      1. Gebruik voor een rat dezelfde opstelling tijdens zowel operaties als elektrofysiologische opnames.
      2. Voor een muis voert u de operatie uit in de eerste opstelling en elektrofysiologische opnames in de tweede opstelling.
    2. Kop fixatie
      1. Gebruik voor een rat dezelfde snuitklem voor chirurgie en elektrofysiologische opname.
      2. Gebruik voor een muis een snuitklem voor chirurgie en een externe metalen hoofdstang in de opstelling voor elektrofysiologie om fixatie onder lichte isofluraan-anesthesie mogelijk te maken. Implanteer de hoofdstang met tandcement op de schedel.
    3. Opname-instelling: Gebruik verschillende acquisitie-elektronica, opnamesoftware en sensorische stimulatiesoftware voor de twee soorten.
      1. Gebruik voor het muisprotocol het SpikeGadgets-systeem (https://spikegadgets.com) en de open-source Trodes-software (https://spikegadgets.com/trodes/) voor gegevensverzameling.
      2. Gebruik voor het rattenprotocol de opnamesoftware Synapse - Neurophysiology Suite (https://www.tdt.com/component/synapse-software/) voor gegevensverzameling.
    4. Induceer anesthesie door injectie (Rat) of inhalatie (Muis).
    5. Opname locatie
      1. Voer opnames uit in de somatosensorische cortex (S1) voor een muis.
      2. Voer opnames uit in de primaire auditieve cortex (A1) voor een rat.
        OPMERKING: Dit verschil in anatomische lokalisatie vereist verschillende craniotomieplaatsen voor elke soort.
  2. Voorbereiden en testen van het net
    1. Week het rooster (exclusief de connectorplaat) minimaal 1 uur in een verdund enzymatisch reinigingsmiddel (50% wasmiddel, 50% gedestilleerd water).
    2. Breng het over in een bad met zuiver gedestilleerd water en laat het aan de lucht drogen op een veilige, schone plaats.
    3. Voer platinazwarte elektrodepositie uit als onderdeel van de eerste voorbereiding van het μECoG-apparaat, niet vóór elke opnamesessie.
      OPMERKING: Eenmaal afgezet, vormt de Platinum Black-coating een stabiele laag die effectief blijft voor meerdere opnames, hoewel de prestaties moeten worden gecontroleerd door middel van regelmatige impedantietests. Platinum Black-elektrodepositie (doelbereik van 10-20 kΩ bij 1 kHz.) verlaagt de elektrode-impedantie en verbetert de signaal-ruisverhouding in neurale opnames.
    4. Om de elektrodeafzetting uit te voeren, bereidt u een chloorplatinezuuroplossing (meestal 1-3% chloorplatinezuur [H2PtCl6]) met een kleine hoeveelheid loodacetaat (ongeveer 0,005%) als afzettingsmodificator. Sluit de μECoG-elektroden aan om te dienen als de werkelektrode in een elektrochemische cel met drie elektroden, met een platina tegenelektrode en Ag/AgCl-referentie-elektrode.
    5. Pas een constante stroomdichtheid van ongeveer -0,5--2 mA/cm² toe gedurende 10-30 s terwijl u de impedantiewaarden bewaakt.
    6. Test en registreer de impedantie van rasterelektroden (bijv. met een Nano-Z).
    7. Controleer het raster op een lichtbron en bereid het raster voor op gebruik bij opnamen na de operatie.
  3. Solderen van referentiekabels
    1. Soldeer voor een muis het uiteinde van een zilverdraad (10 mm lang, 30 G) aan een gouden pin voor aansluiting op de referentiekabel van het opnamesysteem.

2. Operatie

  1. Voorbereiding van materialen en algemene monitoring (dierenverzorging en registratie)
    1. Voorbereiding: Reinig en desinfecteer het operatiegebied grondig met een geschikt ontsmettingsmiddel. Zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten worden gesteriliseerd, meestal met behulp van een autoclaaf.
    2. Plaatsing van chirurgisch gereedschap: Plaats chirurgisch gereedschap op het steriele chirurgische kussen. Vul het operatiegebied met applicators met wattenstaafjes en absorberende katoenen chirurgische driehoeken. Gooi biologisch gevaarlijk afval weg in een speciale afvalzak.
    3. Temperatuurregeling: Zet het verwarmingskussen aan op de chirurgische en elektrofysiologische opnameplaats. Regel de temperatuur van het verwarmingskussen tijdens de operatie en opname.
    4. Chirurgisch kussen: Leg een blauw chirurgisch verband of deken over het temperatuurregulerende bed.
      OPMERKING: Dit kussen moet een zachte katoenen witte onderkant hebben, die naar boven moet wijzen.
    5. Microscoop positionering: Bereid de microscoop en de aangesloten illuminator (bijv. LED-ring) voor op één kant van het operatiegebied. Controleer of het goed werkt.
    6. Chirurgische oefening: Bereid de chirurgische boor voor op de craniotomieprocedure.
    7. Zuurstoftoevoer: Stel het debiet van de zuurstoftank in op 1.0 l/min (Rat) of 0.5 l/min (muis) en plaats het zuurstofmasker in de buurt van het regelblok. Het dier heeft na anesthesie continu zuurstof nodig.
    8. Vloeistofvervanging: Vervang tijdens de operatie al het vochtverlies met als doel een vervanging van ten minste 1,5% van het lichaamsgewicht van het dier (muis) of 1 ml per uur (rat). Bereid isotone oplossingen dienovereenkomstig.
    9. Dier: Breng het dier van de dierenkliniek naar de operatiekamer volgens goedgekeurde procedures. Gebruik muizen van 8 tot 16 weken, mannelijk of vrouwelijk, met een C57Bl6-achtergrond; gebruik ook ratten van 7 weken oud, mannetjes, van de Sprague Dawley-stam.
    10. Bereiding van medicijnen: Weeg het dier met behulp van een weegschaal met een precisie van 0,1 g. Bereid de juiste hoeveelheden medicijnen voor de operatie voor, indien nodig met behulp van voorverdunde oplossingen.
  2. Anesthesie inductie
    1. Anesthesie-inductie voor een muis
      1. Plaats het dier in de inductiekamer van isofluraan (3-5% isofluraan in 0,5 l/min Ø2).
      2. Zodra diepe anesthesie is bevestigd (afwezigheid van reflex in staart/teenknijpen), plaatst u het dier op het verwarmingskussen van de operatie en bevestigt u het met het hoofd.
      3. Injecteer subcutane geneesmiddelen voor algemene analgesie: Meloxicam: 5 mg/kg en Buprenorfine: 0,1 mg/kg.
      4. Headfix de muis volgens de stappen 2.2.1.5-2.2.1.6.
      5. Plaats de snuit in het anesthesiemasker en de kop losjes in de hoofdsteun. Om de muis in de bijtstang te plaatsen, moet u er eerst voor zorgen dat de tong zich onder de staaf bevindt en niet tussen de staaf en het gehemelte. Gebruik indien nodig een tang om de tong te bewegen.
      6. Steek de snijtanden van het dier in het gat op de staaf van de bijtstang. Zet het anesthesiemasker van de muis (1,5-2% isofluraan in 0,5 l/min Ø2) vast door de bevestigingsschroef voorzichtig vast te draaien. Hoofdstabilisatie tijdens de operatie wordt uitsluitend verzekerd door de bijtstang.
      7. Bescherm de ogen van het dier met een oogzalf of glijmiddel op petroleumbasis om uitdroging tijdens de operatie te voorkomen.
      8. Zorg voor anesthesie tijdens de procedure met een continue stroom isofluraan door het masker.
    2. Anesthesie-inductie voor een rat
      1. Gebruik isofluraan in eerste instantie om het dier te verdoven om de injectie van inductie-anesthesie te vergemakkelijken.
      2. Dien de medicijnen voor anesthesie en analgesie toe:
        Meloxicam: Dosering van 5 mg/kg, concentratie 10 mg/ml, 0,4 ml/kg
        Ketamine: Dosering van 90 mg/kg, concentratie 100 mg/ml, 0,9 ml/kg
        Xylazine: Dosering van 10 mg/kg, concentratie 100 mg/ml, 0,1 ml/kg
      3. Laat het dier binnen 15-30 minuten diepe anesthesie bereiken, afhankelijk van het gewicht en de leeftijd.
    3. Anesthesie monitoring
      1. Controleer continu de vitale functies van het dier (ademhalingsfrequentie) tijdens de procedure. Controleer de ademhalingsfrequentie als een bijzonder nuttig teken van vroege veranderingen in de anesthesietoestand en pas het anesthesieniveau aan als de ademhalingsfrequentie verandert.
      2. De terugtrekkingsreflex van de poot is een kritiek teken van de anesthesietoestand. Test deze reflex regelmatig, omdat de totale afwezigheid ervan zorgt voor voldoende anesthesie voor een operatie.
  3. Fixatie van het hoofd en monitoring van vitale functies
    1. Monitoring van vitale functies bij dieren
      1. Controleer en noteer de vitale functies van het dier op een experimenteel blad. Als de reflexen van het dier (bijv. het terugtrekken van de poot) niet volledig zijn gedoofd, dien dan een extra halve dosis aanvullende ketamine (Rat) toe of verhoog de isofluraanconcentratie in stappen van 0,5% (Muis).
    2. Kopfixatie voor een rat
      1. Zodra de rat volledig verdoofd is (geen poot- of staartreflexen), steekt u de snijtanden van het dier in het gat op de staaf van de hoofdbevestiging.
      2. Steek de punten van de montagearmen voorzichtig in de neuskam om het hoofd tijdens de operatie te fixeren en zorg ervoor dat het geen contact maakt met de ogen.
      3. Pas de hoek van de armen aan totdat het dak van de bek van het dier stevig tegen de stang wordt gedrukt. Zorg ervoor dat de schedel onder druk onbeweeglijk blijft.
      4. Zet beide armen van de houder vast door de schroeven vast te draaien met een inbussleutel.
    3. Zuurstofopstelling voor een rat
      1. Bevestig de plastic slang van de zuurstoftank over de snuit en neus van het dier en maak deze vast met chirurgische tape. Vermijd kreukels in de slang die de luchtstroom kunnen belemmeren. Stel de zuurstoftank in op een debiet van 1 L/min.
        OPMERKING: De vitale functies van het dier, inclusief hartslag en ademhalingsfrequentie, moeten tijdens de procedure met tussenpozen van 15-30 minuten worden gecontroleerd.
  4. Incisie van de hoofdhuid
    1. Scheren en voorbereiden
      1. Scheer het gebied van de bovenste snuit tot de achterkant van het hoofd, van het ene oog naar het andere en rond de oren. Verwijder het grootste deel van de vacht met een schaar of een elektrische tondeuse en breng vervolgens ontharingscrème aan.
    2. Desinfectie
      1. Desinfecteer het gebied met een wattenstaafje gedrenkt in Betadine en spoel vervolgens af met een wattenstaafje gedrenkt in 70% ethanol. Herhaal dit proces drie keer en eindig met een laatste Betadine-toepassing om ervoor te zorgen dat het gebied steriel is.
    3. Lokale anesthesie-injectie
      1. Injecteer het plaatselijke verdovingsmiddel lidocaïne (1%, 0,1 ml voor muizen/0,4 ml per kg voor ratten) subcutaan in de middellijn van de hoofdhuid van het dier. Masseer zachtjes de hoofdhuid om de lidocaïne te verspreiden en wacht 5 minuten om de verdoving te laten werken.
    4. Incisie
      1. Til voor een muis een punt op de huid op met een pincet en verwijder een klein deel van de huid (ongeveer 1 cm in diameter) met een chirurgische schaar.
      2. Maak voor een rat een precieze incisie aan de voorkant van de hoofdhuid, net boven de neus, op de middellijn met behulp van het scalpel. Trek de huid voorzichtig terug en maak een rechte incisie van tussen de ogen naar de basis van de schedel. Til de hoofdhuid voorzichtig op, snijd bindweefsel weg en leg de schedel volledig bloot.
      3. Leg de craniotomie bloot aan de hand van de stappen 2.4.4.4-2.4.4.5.
      4. Verwijder met een schraper bindweefsel en periosteum op de bovenkant van de schedel. Spoel zoutoplossing door en gebruik aspiratie of een chirurgische spons om de site schoon te maken.
      5. Gebruik chirurgische clips op de huidranden om een duidelijke blootstelling van het schedelgebied waar de craniotomie zal worden uitgevoerd, te vergemakkelijken.
  5. Craniotomie
    1. Algemene boorprocedure
      1. Stel de snelheid van de chirurgische boor in op een lage stand van 5000 tpm of 7000 tpm voor ervaren chirurgen. Doe al het boren terwijl je visualiseert door de microscoop.
      2. Houd de boor evenwijdig aan het oppervlak van de schedel en rust voorzichtig tegen het oppervlak.
      3. Begin met lichte druk op het pedaal op één locatie te boren. Voer het boren uit met korte tussenpozen (5-10 s) en controleer regelmatig op veranderingen in de botkleur.
        OPMERKING: Het bot begint ondoorzichtig wit te worden en naarmate het gat dieper wordt, wordt het doorschijnender en wordt het zichtbaar
      4. Wanneer het boren dicht bij de hersenen is gekomen, vertraag dan en zoek naar tekenen van vocht dat in het gat sijpelt. Als het gat donkerroze is en een lichte glans heeft, stop dan met boren. Prik met een korte naald van 30 G voorzichtig in de resterende laag bot. Heldere vloeistof moet uit het nieuwe gat komen.
    2. Boorprocedure voor een muis
      1. Om een referentie-elektrode voor fysiologische opnames te plaatsen, boort u een braamgat in het voorste deel van de hemisfeer ipsilateraal van het opgenomen gebied.
      2. Definieer de contour van de craniotomie door een ondiepe greppel aan de omtrek te boren. Begin in de medio-laterale as van de laterale botkam als referentie en trek een venster van 4 mm.
      3. Boor in de antero-posterieure as een venster van 3 mm dat begint met ~ 1 mm anterieur van de achterste botrichel. De uiteindelijke grootte van de open craniotomie is ongeveer een venster van 4 x 3 mm.
    3. Boorprocedure voor een rat
      1. Boor twee gaten: één in het linker achterkwadrant, de andere in het rechter voorkwadrant.
      2. Injecteer de kauwspier met een tweede dosis lidocaïne (0,4 ml/kg bij 10 mg/ml) en verdeel gelijkmatig over de plaats waar de snede moet worden gemaakt.
      3. Resectie alleen de minimale set spieren die nodig zijn om het craniotomiegebied bloot te leggen.
      4. Maak met een vers #10 scalpelmes een transversale dorsaal-ventrale snede in de spierbundel boven de kaak van het dier (rechterkant). Houd de achterste rand van de snede vast met een grijptang en pel weg van de schedel terwijl u langs de benige rand van het jukbeen snijdt. Op deze manier kan de spier met minimale bloedingen van het bot worden losgemaakt.
      5. Snijd de voorste spier op dezelfde manier weg totdat een spleetlijn in de schedel zichtbaar wordt. Deze lijn zal de voorste grens van het craniotomievenster zijn.
      6. Verwijder de spieren rond de achterste richel met het scalpel en de tang, met behulp van een sterke lichtbron om te voorkomen dat ze in sterk gevasculariseerde gebieden snijden.
      7. Slijp de achterste richel met de boor naar beneden totdat deze niet meer boven het oppervlak van de schedel uitkomt.
        OPMERKING: Deze stap is essentieel voor het instellen van het μECoG-raster om direct contact te maken met het corticale oppervlak.
      8. Boor de dorsale rand van het raam net boven de nok waar de gereseceerde spier was bevestigd. Plaats de achterste rand anterieur van de geboorde achterste richel. Plaats de voorste rand achter de spleetlijn die zich naar beneden uitstrekt bij de oogkas.
        OPMERKING: Bij het vrijmaken van de voorste spier moet ervoor worden gezorgd dat het oog wordt vermeden.
  6. Boren van craniotomievensters
    1. Boren in het craniotomievenster (Tips)
      1. Zorg er tijdens het boren voor dat de boor evenwijdig aan het schedeloppervlak wordt gehouden. Oefen zo min mogelijk kracht uit en gebruik de boor als een borstel door de boor licht contact te laten maken met de schedel terwijl hij korte, repetitieve bewegingen maakt langs de beoogde craniotomielijn.
        OPMERKING: Bij ratten heeft de achterrand van het raam het dikste bot. Als het bot te ver naar achteren wordt geboord, kan het een schilferige, "knapperige" kwaliteit vertonen die het meten van de voortgang van het boren bemoeilijkt. Als het verkeerd wordt geplaatst, kan dit botgebied een aderrode kleur vertonen die een verkeerde indruk geeft van de nabijheid van de hersenen.
      2. Boor aan elke kant van het craniotomievenster totdat het bot lichtroze lijkt met een dunne witte spleet of scheur die over de lengte loopt. Oefen lichte druk uit; Het bot moet een duidelijke "wiebel" produceren wanneer het volledig is geboord. Als de scheur onsamenhangend lijkt, ga dan licht door met boren totdat er een ononderbroken lijn is.
    2. Het verwijderen van de uitgedunde schedel in het craniotomievenster
      1. Wanneer de schedel voldoende is uitgedund dat extreem lichte druk ervoor zorgt dat het hele venster zichtbaar wiebelt, verwijdert u de uitgedunde schedel.
      2. Spoel de craniotomie door met een druppel zoutoplossing en wacht minimaal 1 minuut. Dit verzwakt het uitgedunde bot en helpt het bot los te komen van de dura. Giet overtollige zoutoplossing af met een absorberende katoenen driehoek of vacuüm.
      3. Til de uitgedunde schedel voorzichtig op met een tang en vermijd schade aan het onderliggende weefsel.
      4. Gebruik een hemostatische spons om de hersenen vochtig te houden.
      5. Pak het raam aan de dorsale en ventrale zijden stevig vast met een getande tang en trek deze direct weg van de schedel. Als het moeilijk is om het raam uit de plaats te trekken, stop dan en hervat het licht boren totdat het bot voldoende verzwakt is.
      6. Laat voor μECoG-opnamen met muis de dura intact.
  7. Cement en hoofdpost implantaat voor een muis
    1. Plaats de referentiedraad en zet deze vast.
      1. Steek het uiteinde van de zilverdraad ~1 mm in het braamgat, voldoende om contact te maken met het oppervlak van de hersenen, maar niet om bloedingen te veroorzaken.
      2. Breng het tandcement op zijn plaats aan tijdens het aanbrengen van de eerste laag.
    2. Bereiding van tandheelkundig cement
      1. Gebruik een afgekoelde keramische mengschaal om het tandcementmengsel te bereiden. Dit cement dikt snel in en vereist de regelmatige bereiding van een nieuw mengsel. Veeg de mengschaal schoon voordat u een nieuw mengsel bereidt.
        OPMERKING: Het cement mag nooit in direct contact komen met de hersenen.
    3. Aanbrengen van de eerste laag
      1. Breng de eerste laag cement aan rond de craniotomie en over de hele schedel met behulp van micro-applicators. Deze laag fungeert als elektrische isolatie tussen de schedel en de metalen hoofdbalk.
      2. Omring de craniotomie volledig met cement, inclusief zijdelingse dekking, om voldoende bescherming te bieden voor de open craniotomie en het μECoG-raster.
    4. Positioneren van de metalen hoofdstang
      1. Bevestig het grote deel van de hoofdstang aan de houder zonder deze volledig vast te draaien.
      2. Plaats de hoofdstang naar wens en leg het dunne gedeelte langs de middellijn van de schedel in contact met het cementoppervlak.
    5. Het implantaat vastzetten
      1. Bedek de hoofdstang met tandcement en sluit deze aan op het cementoppervlak.
    6. De houder verwijderen
      1. Wacht een paar minuten totdat het tandcement is uitgehard.
      2. Zodra de hoofdstang volledig is vastgezet, verwijdert u deze door eerst de schroef van de houder te verwijderen. Trek vervolgens de houder naar achteren in en zorg ervoor dat er geen kracht op de hoofdstang wordt uitgeoefend.
  8. Durotomie voor rattenchirurgie
    OPMERKING: Dit is een uitdagende chirurgische stap.
    1. Het optillen van de dura
      1. Gebruik een tang nr. 5, die zo parallel mogelijk aan het hersenoppervlak wordt gehouden, en til een klein deel van de dura weg van de hersenen.
      2. Gebruik een verse naald van 30 G (zo kort mogelijk) om de opgetilde dura voorzichtig te scheuren.
        OPMERKING: De dura mater is een dunne, transparante laag weefsel die direct bovenop de hersenen ligt. Het wordt verwijderd voor μECoG-opnames bij ratten. Het is van cruciaal belang om de durotomie uit te voeren zonder het vaatstelsel op het hersenoppervlak te verstoren. Aanbevolen methoden voor het uitvoeren van de durotomie zijn onder meer het gebruik van een tang en een spuitnaald om de dura te doorboren voordat deze wordt teruggetrokken of het gebruik van een duratome-gereedschap dat in de buurt van de schedel is verankerd om de dura voorzichtig terug te trekken.
    2. Resectie van de dura
      1. Blijf de dura met de tang vastpakken en wegtillen van de hersenen. Maak een diagonale scheur met de naald tijdens het optillen.
      2. Gebruik de tang om de dura voorzichtig naar de zijkanten van het craniotomievenster te trekken, zodat het hersenoppervlak ongestoord blijft.
  9. De muis overbrengen naar de opstelling voor elektrofysiologische opname
    1. Haal het dier uit de operatieopstelling door de snuit en snijtanden voorzichtig van de snijtand op te tillen en het dier vervolgens terug te trekken. Injecteer chloorprothixeen (1 mg/kg, intraperitoneaal [IP]), een kalmerend middel dat het mogelijk maakt om continue anesthesie te handhaven met een lagere isofluraanconcentratie.
    2. Plaats de muis in de elektrofysiologische opname-opstelling.
      1. Zorg ervoor dat het verwarmingskussen op zijn plaats zit en goed werkt.
      2. Kop fixeer het dier met behulp van de hoofdstang op de houder in de elektrofysiologische opstelling.
      3. Breng het isofluraanmasker dichtbij om de snuit van het dier volledig te bedekken.
    3. Anesthesie aanpassing
      1. Verlaag de anesthesieniveaus geleidelijk tot 0,7-1% isofluraan (in stappen van maximaal 0,5% om de 5 minuten).
      2. Bewaak de ademhalingsfrequentie en bewegingen van het dier.
        OPMERKING: De ademhalingsfrequentie moet iets toenemen in vergelijking met de chirurgische toestand, maar het dier mag niet bewegen.
      3. Als het dier in beweging is, verhoog dan onmiddellijk de isofluraanconcentratie tot 2% voordat u deze langzaam terugbrengt naar een lager niveau in stappen van 0,5%.
    4. Snorharen inbrengen voor sensorische stimulatie
      1. Bevestig de vibrissae van de muis aan het snorhaarstimulatieapparaat. In dit protocol worden negen vibrissae ingebracht in korte pipetpunten van 10 μl, die zijn verbonden met piëzo-elektrische actuatoren die zorgen voor een snelle afbuiging van de vibrissae.

3. Opname

  1. Installatie van het rooster
    1. Voorbereidende stappen
      1. Schakel het opnamesysteem en de versterker in.
      2. Controleer de vitale functies van het dier.
    2. Procedure
      1. Volg voor het positioneren van het dier en het gereedschap de stappen 3.1.2.2-3.1.2.4.
      2. Plaats het dier in de opnameopstelling en zorg ervoor dat de craniotomie vochtig blijft door regelmatig een zoutoplossing aan te brengen.
      3. Voor een rat plaatst u de micromanipulator op de reling van de rig, die zich ver achter de craniotomieplaats bevindt, om interferentie te voorkomen.
      4. Voor een muis plaatst u de micromanipulator zijdelings op de craniotomieplaats naast het dier.
      5. Volg de stappen 3.1.2.6-3.1.2.12 om het raster op een muis te bevestigen en te plaatsen.
      6. Bevestig het μECoG-raster aan de hoofdtrap met behulp van de ZIF-clipconnectoren (hoofdstageconnector). Houd het elektronische bord van de hoofdstage op zijn plaats via een mechanische stang die aan een micromanipulator is bevestigd.
      7. Laat het μECoG-raster horizontaal zakken om plat uit te lijnen over de craniotomie langs de anteroposterieure as.
        OPMERKING: Langs de lateraal-mediale as moet de rand van het raster zich in de buurt van de mediale rand van de craniotomie bevinden.
      8. Zodra het rooster in de buurt van de hersenen is geplaatst, maar er niet mee in contact staat, bevestigt u de referentiedraad van het rooster aan de geïmplanteerde zilverdraad-gouden pin. Bevestig indien nodig de massadraad aan het dier (bijv. aan een onbedekte spier) om elektrische ruis te verminderen.
      9. Verlaag verder het raster om contact te maken met de hersenen.
      10. Beweeg het rooster zijdelings om over het vochtige dura-oppervlak te "glijden". Ga door met aanpassen totdat het raster gecentreerd is langs de mediolaterale as.
      11. Gebruik aspiratie of een chirurgische spons rond de randen van de craniotomie om overtollige zoutoplossing te verwijderen.
      12. Zodra het preparaat iets droger is, zorg er dan voor dat het rooster steviger aan de dura hecht en niet over het oppervlak glijdt. Als het droger is, past u een zijwaartse naar mediale beweging toe op het flexibele rooster, waarbij u zorgt voor contact met de meeste laterale elektroden. De flexibele kabel van het rooster zal op natuurlijke wijze buigen om overeen te komen met de contouren van de hersenen.
      13. Om het raster op een rat te plaatsen, volgt u stap 3.1.2.14-3.1.2.18.
      14. Zet de steel van de houdervork vast in de micromanipulator en zorg ervoor dat het connectorbord van het rooster tegen de achterkant van het craniotomievenster zweeft wanneer het wordt neergelaten.
      15. Pas de positie van de micromanipulator op de reling aan zodat het rooster zich ongeveer boven de craniotomieplaats bevindt. Laat het raster zakken totdat het dicht boven het hersenoppervlak zweeft. Bevochtig het hersenoppervlak met een kleine druppel zoutoplossing.
      16. Voer deze stappen uit met behulp van de microscoop. Pas met behulp van de draaiknoppen van de micromanipulator de rasterpositie aan totdat deze plat tegen het hersenoppervlak in het midden van de craniotomie ligt.
      17. Voer vocht voorzichtig af met behulp van een absorberende katoenen driehoek zonder het rooster zelf aan te raken. Zorg ervoor dat elke rij van het raster in contact is met het hersenoppervlak.
        OPMERKING: Het verwijderen van vocht voorkomt de passieve verspreiding van het elektrische signaal door de vloeistof tussen het corticale oppervlak en het rooster, waardoor het signaal dat bij de elektrode wordt gedetecteerd ruimtelijk wordt verspreid.
      18. Gebruik een tang nummer 2 of nummer 5 om de aardingsdraad van het rooster in hetzelfde braamgat te steken of steek de referentiedraad in een braamgat en de aardingsdraad in het nabijgelegen spierweefsel.
        OPMERKING: Draden mogen slechts ~1 mm worden ingebracht, voldoende om contact te maken met de hersenen, maar niet om bloedingen of trauma's aan de hersenen te veroorzaken.
  2. De positionering van het raster controleren
    1. Monitoring van elektrofysiologische activiteit
      1. Observeer de elektrofysiologische activiteit met behulp van de registratiesoftware. Onder lichte anesthesie zijn de hersensignalen variabel en kunnen ze verschillende patronen vertonen.
      2. Een goede aansluiting van de net-, referentie- en aarddraden moet een hoge signaal-ruisverhouding opleveren, met signaalamplitudes in het bereik van mV. Bewaak ruis in het hoge frequentiebereik met behulp van bandpassfiltering met Trodes (bijv. 100-6000 Hz) en zorg ervoor dat deze niet meer dan enkele tientallen microvolt (μV) overschrijdt.
    2. Beoordeel de sensorische responsiviteit met behulp van geluid (bijv. klappen of knippende vingers) om zichtbare gebeurtenisgerelateerde corticale oppervlakte-elektrische potentialen (CSEP's) te induceren.
      OPMERKING: Stimulatie van een enkele snorhaar zou slechts in een paar kanalen (muis) een duidelijke, scherpe gebeurtenisgerelateerde CSEP moeten oproepen.
    3. Verificatie van de rasterpositie
      1. Controleer bij een rat of het rooster correct over de auditieve cortex is geplaatst. Het eerste geregistreerde blok moet doorgaans een witte ruisstimulus uit de jaren 60 zijn die is ingesteld om te controleren of het raster een juiste reactie van de hersenen registreert. Voer alleen diagnostische opnamen van witte ruis en toon uit met het raster voordat u de polytrode invoegt om te bepalen of het raster correct is geplaatst en of er een signaalrespons is.
      2. Om de plaatsing van het raster te controleren, voert u voor een muis een snelle mapping-sessie uit met 20-30 snorhaarafbuigingen met een tussenruimte van 350 ms. Registreer de activiteit in de local field potential (LFP)-band met behulp van Trodes en analyseer deze offline met een aangepaste MATLAB-code om de ruimtelijke omvang van de door snorharen opgewekte activiteit te visualiseren.
    4. Herpositionering
      1. Als het rooster moet worden aangepast, bevochtig dan het corticale oppervlak met druppels zoutoplossing over het rooster.
      2. Laat de zoutoplossing 30 s tot 1 minuut staan voordat u probeert het rooster op te tillen.
      3. Til het rooster voorzichtig en langzaam op.
      4. Verplaats het met behulp van de stappen beschreven in stap 3.1.
  3. Laminaire polytrodes voor een rat
    1. Polytrode opstelling
      1. Sluit eerst de hoofdtrapadapter aan op de achterkant van de polytrode. Klem de connector aan de derde set kanalen op het bord van de adapter. Zorg ervoor dat de zwarte markering op de clip naar de rechterkant van het zakelijke uiteinde van de polytrode wijst.
    2. Polytrode inbrengen
      1. Breng de polytrode in de hersenen in totdat de allerlaatste (bovenste) elektroden zichtbaar zijn boven het corticale oppervlak. Een langzame afdaling (tot 1 μm/s) verbetert de signaalkwaliteit. Wacht 15 minuten, zodat de hersenen zich kunnen aanpassen aan de aanwezigheid van de polytrode.
      2. Controleer na 15 minuten of de laatste elektroden in het corticale oppervlak zijn gekomen. Zo niet, laat de polytrode dan iets meer zakken en wacht nog 10 minuten voordat u verder gaat.
  4. De optogenetische lichtbron op een muis plaatsen
    1. Gebruik een fijnafstellingsschroefsysteem in drie dimensies, gemonteerd op een gelede arm, of een micromanipulator om de optische vezelhouder te monteren.
    2. Om de lichtbron te geleiden en te helpen bij het positioneren van de vezel, schakelt u het optogenetische licht met een lage intensiteit in. Gebruik de gelede arm om het optogenetische licht grof in de richting van het doelgebied te positioneren.
    3. Stel scherp en verfijn de positie van de vezel met behulp van een micromanipulator of fijnafstellingsschroeven.
  5. Opnemen van de signalen
    1. Voorbereiding
      1. Koppel alle onnodige lampen, verlengsnoeren en overspanningsbeveiligingen in de chirurgische installatie los om elektrische interferentie te verminderen. Doe de bovenlichten in het tuig uit.
      2. Sluit de deur naar de geïsoleerde opnameruimte en de deur naar de operatiekamer voordat u met het experiment begint.
    2. Startende acquisitie
      1. Voor een rat start u Synapse op het opnameplatform/de computer en bevestigt u dat de acquisitie functioneel is door een voorbeeld te bekijken en te controleren op signalen. Lok grote, scherpe spanningstransiënten uit in het μECoG-signaal door stimuli in de buurt van het dier te presenteren, d.w.z. te klappen.
      2. Voor een muis start u de opnamesessie in Trodes.
    3. Hydratatie
      1. Injecteer de rat of muis subcutaan met respectievelijk 1-2 ml zoutoplossing om de 1-2 uur tijdens de opname om uitdroging te voorkomen. Wacht voor een rat 5-10 minuten na het toedienen van zoutoplossing voordat u een nieuw opnameblok uitvoert.
    4. Stimulus sets
      1. Voor een rat gaat u, zodra de opnameplaats is bevestigd, verder met het opnemen van de vereiste stimulussets. Een voorbeeldset kan bestaan uit
        Witte ruis (60 s)
        Toon Diagnose (5 min)
        Zuivere toon (23 min)
        Dynamisch bewegende rimpeling
        Toon 150 (15 min)
        TIMIT (38 min)
      2. Voor een rat moet u de diagnose van witte ruis en tonen opnieuw presenteren telkens wanneer het raster wordt verplaatst.
      3. Tactiele stimuli voor een muis: Zorg voor tactiele stimuli in een proefstructuur, waarbij elke proef elke 350 ms een reeks willekeurige snorhaarafbuigingen bevat. In het gegeven voorbeeld bevat elke proef 14 doorbuigingen over 4500 ms.
      4. Optogenetische stimuli voor een muis: In sommige proeven wordt een vierkante puls optogenetisch licht toegepast gedurende de gehele duur van de proef (5 s). Bepaal het vereiste lichtniveau op basis van de gebruikte opsin en de diepte van het te bereiken weefsel met behulp van schattingen van lichtpenetrantie (https://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php)
  6. Opruimen
    1. Het rooster optillen en schoonmaken
      1. Zodra de opname is voltooid, sluit u de opnamesoftware en sluit u de lichtbronnen weer aan op de rig.
      2. Als de hersenen droog zijn, breng dan een kleine druppel zoutoplossing aan op het hersenoppervlak met behulp van een spuit. Laat de zoutoplossing 30 s tot 1 minuut staan voordat u probeert het rooster op te tillen.
      3. Werk onder de microscoop en til het rooster voorzichtig van het hersenoppervlak met behulp van micromanipulatoren.
      4. Als er extra kracht nodig is tijdens het optillen van het rooster, gebruik dan een tang met koolstofpunt (gesloten) om het rooster voorzichtig uit de hersenen te tillen. Zorg ervoor dat de beweging van de micromanipulator iets naar voren is om het rooster voorzichtig van het hersenoppervlak af te pellen.
      5. Zodra het rooster volledig is verwijderd, maakt u het los van de grijpvork en maakt u het schoon volgens de stappen 3.6.1.6-3.6.1.7.
      6. Week het rooster (exclusief de connectorplaat) minstens 1 uur in een verdund enzymatisch reinigingsmiddel (50% Enzol, 50% gedestilleerd water). Breng het daarna over naar een tweede bad met zuiver gedestilleerd water en laat het aan de lucht drogen op een veilige, schone plaats.
      7. Als delen van het raster bloed of weefsel hebben afgezet, gebruik dan een katoenen driehoek gedrenkt in enzymatische oplossing om het voorzichtig schoon te vegen.
      8. Eenmaal droog, leg je het rooster terug in de doos.
    2. Euthanasie van het dier
      1. Voor een muis verwijdert u het dier uit de kopfixatie en plaatst u het in de euthanasiekamer. Voeg een gaasje met 5 ml isofluraan toe en wacht 60 s na het stoppen van de ademhaling. Controleer het ontbreken van een terugtrekkingsreflex en onthoofd met een scherpe schaar.
      2. Injecteer voor een rat 0,2 ml pentobarbital IP. Wacht 60 s na het stoppen van de ademhaling, leg het dier op zijn rug en gebruik een #11-mes om een dubbele thoracotomie uit te voeren.
    3. Reiniging van de apparatuur
      1. Breng alle chirurgische instrumenten naar de gootsteen van het laboratorium en leg ze op een chirurgische handdoek. Spuit het gereedschap in met 10% bleekoplossing en was grondig in de gootsteen. Voor vuiler gereedschap, laat ze weken in een bleekoplossing voordat u ze wast.
      2. U kunt ook een poedervormig wasmiddel (bijv. Contrex AP) met water gebruiken door de instrumenten met een borstel in de gootsteen te schrobben.
      3. Zodra het gereedschap schoon en afgespoeld is, veegt u het af met alcoholdoekjes en plaatst u het terug in de opslagruimte.
    4. De werkruimte ontsmetten
      1. Gooi alle gebruikte naalden en messen weg in de naaldencontainer.
      2. Gooi besmette wattenstaafjes, driehoekjes en alcoholdoekjes weg in de zak met biologisch gevaarlijk materiaal.
      3. Veeg alle werkoppervlakken in de rigruimte af met alcohol en maak alle instrumenten schoon voordat u de werkruimte sluit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben de protocollen beschreven voor het registreren van elektrocorticografische signalen in combinatie met optogenetische methoden en laminaire opnames. Hier worden typische signalen gepresenteerd die zijn verkregen uit de somatosensorische cortex van de muis (Figuur 1, Figuur 2 en Figuur 3) en in de auditieve cortex van ratten als reactie op sensorische stimulatie (Figuur ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven protocollen maken het mogelijk om micro-elektrocorticografie met hoge dichtheid (μECoG) arrays te integreren met laminaire sondes en optogenetische technieken. Het gebruiksgemak van dit protocol in knaagdiermodellen maakt het een krachtig hulpmiddel voor het onderzoek van corticale dynamiek en het aantal proefpersonen kan gemakkelijk worden verhoogd. Het μECoG-raster met hoge dichtheid maakt het mogelijk om de corticale topografie in meerdere gebieden bij muizen en rat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door Lawrence Berkeley National Laboratory LDRD voor het Neural Systems and Machine Learning Lab (K.E.B.), NINDSR01 NS118648A (K.E.B. & D.E.F.) en NINDS R01 NS092367 (D.E.F.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 disposable #11 bladeSwann Morton303Voor chirurgische ingrepen
2 disposable #10 bladesSwann Morton3901Voor chirurgische ingrepen
30 mm cage barsThorlabsERkoomponenten
30 mm cage plateThorlabsCP33Thouden de lenzen
70% ethanolDecon LabsV1016Reiniging / Ontsmettingsmiddel (verdund tot 70%)
Amalgambond PLUS Adjustable Precision Applicator Brush Teal 200/BxHenry Schein1869563precisie applicator voor het cement
Amalgambond PLUS Catalyst 0.7 mL Syringe EaHenry Schein1861119cement component
Amplifier (Tucker-Davis Technologies)Tucker-Davis TechnologiesPZ5M-512Gebruikt voor auditieve stimulus en opnamesoftware.
Articulated armNogaDG60103voor het houden van het fijnafstelschroefsysteem
Aspheric lenses for light collection (and one for focusing the light)ThorlabsACL25416U-Bvoor het verzamelen van LED-licht
Auditory equipmentTucker-Davis Technologies, Sony, CorteraRP2.1 Enhanced Real-Time Processor/HB7 Headphone DriveGebruikt voor auditieve stimulus en opnamesoftware.
BuprenorphineSterile Products LLC#42023017905Algemene analgesie
C&B Metabond Base Cement EaHenry Schein1864477cement component
C&B Metabond L-Powder Cement Clear 3 g Henry Schein1861068cement component
Chlorprothixene hydrochloride (muis)Sigma AldrichCat. No. C1671Voor sedatie, moet dezelfde dag worden bereid en op 4 worden bewaard
Custom-designed 128-channel micro-electrocorticography (μECoG) gridsNeuronexusE128-200-8-40-HZ64Voor neurofysiologische opnamen. Geplaatst op de cortex.
Dengofoam gelatine sponzenDengen dental600034 (SKU)kan droog of nat worden gebruikt, verzadigd met steriele natriumchloride-oplossing
Drill bit, size 5 to 9 (Mouse)Fine Science Tools19007-XXXX is de grootte van de boor, bijv. 05 of 09. Voor muisprocedures
Drill bitSteel Round Bur (5.5 mm/7.5 mm)LZQ ToolsDental Bar Drill Bit Stainless Steel BurVoor ratprocedures
Dumont No. 5 forcepsFine Science Tools11251-10Voor chirurgische ingrepen
Dumont tweezers #5 bent 45°World precision instruments14101voor het verwijderen van het craniotomie-venster
DVD Player (Sony)SonyCDP-C345Systeem dat wordt gebruikt om stimulussets te accepteren en af te spelen
Electrostatic SpeakerSonyXS-162ESGebruikt voor auditieve stimulus en opnamesoftware. Geplaatst in de rig, speelt geluid af naar het verdoofde knaagdier
Enzymatic detergent (Enzol)Advanced sterilization products2252Reiniging/Ontsmettingsmiddel
EverEdge 2.0 Scaler Sickle Double End H6/H7 #9Henry Schein6011862voor het schrobben van de schedel
Fine adjustment screw system in 3 dimensionNarishigeU-3Cvoor precieze positionering van het uiteinde van de optische vezel
Gold pinHarwin IncG125-1020005Gebruikt voor contactreferentie in muis Gelast aan de zilverdraad
Gripping forcepsFine Science Tools00632-11Voor chirurgische ingrepen
IsofluraneCovetrus11695067772vereist een verdamper
Ketamine (Hydrochloride Injectie) (Rat)Dechra17033-101-10Anesthesie/Analgeticum
LEDNew EnergyLED XLAMP XPE2 BLUE STARBOARDBlauwe LED-lichtbron
LED driverThorlabsLEDD1BLED driver
LidocaineCovetrusVINB-0024-6800te verdunnen tot 1% in zoutoplossing
MeloxicamCovetrus6451603845Ontstekingsremmer gebruikt voor algemene analgese
MicromanipulatorNarishige (Stereotaxic Rig)SR-6R + SR-10R-HT componentenGebruikt om ECoG en knaagdier met fijne bewegingen te manipuleren
No. 2 forcepsFine Science Tools91117-10Voor chirurgische ingrepen
No. 55 forcepsFine Science Tools1129551Voor chirurgische ingrepen
Ophtalmic lubricant (Artificial tears)Akorn17478-062-35Wordt gebruikt om de ogen tijdens chirurgische ingrepen tegen uitdroging te beschermen
Optical fiber 200µm Core diameterThorlabsM133L02FC/PC-connector 2 m lang
Pentobarbital (Rat)Covetrus / DechraVINV-C0II-0008Anesthesie/Analgeticum
Platinum BlackSigma205915-250MGVoor neurofysiologische opnamen (Gebruikt voor het elektroplaten van de contacten op de μECoG-grids).
Povidone Iodine 10%Betadinehttps://betadine.com/medical-professionals/betadine-solution/geen catalogusnummer (niet in de winkel)
Powder detergent (Contrex AP)Decon Labs5204Reiniging / Ontsmettingsmiddel
Pre-cut tape for oxygen tubeULINE (Various Providers)S-14726Wordt gebruikt om de zuurstofbuis te bevestigen aan de neuskoker van de stereotaktische rig van het knaagdier
Scalpel handle # 3World precision instruments500236-Gvoor mesjes # 10, #11 en #15
ScraperFine Science Tools1007516Voor chirurgische ingrepen
Short 30 G needlesExelInt26437Voor chirurgische ingrep

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  2. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  3. Nunez, P. L., Srinivasan, R. Electric Fields of the Brain: The Neurophysics of EEG. , Oxford University Press, USA. (2006).
  4. Mountcastle, V. B., Powell, T. P. Central nervous mechanisms subserving position sense and kinesthesis. Bull Johns Hopkins Hosp. 105, 173-200 (1959).
  5. Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nat Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).
  6. Lewis, C. M., Bosman, C. A., Womelsdorf, T., Fries, P. Stimulus-induced visual cortical networks are recapitulated by spontaneous local and interareal synchronization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E606-E615 (2016).
  7. Bouchard, K. E., Mesgarani, N., Johnson, K., Chang, E. F. Functional organization of human sensorimotor cortex for speech articulation. Nature. 495 (7441), 327-332 (2013).
  8. Fabrication and testing of a large area, high density, parylene MEMS µECoG array. Ledochowitsch, P., et al. 2011 IEEE 24th International Conference on Micro Electro Mechanical Systems, Cancun, Mexico, , (2011).
  9. Bosman, C. A., et al. Attentional stimulus selection through selective synchronization between monkey visual areas. Neuron. 75 (5), 875-888 (2012).
  10. Rubehn, B., Bosman, C., Oostenveld, R., Fries, P., Stieglitz, T. A MEMS-based flexible multichannel ECoG-electrode array. J Neural Eng. 6 (3), 036003(2009).
  11. Baratham, V. L., et al. Columnar localization and laminar origin of cortical surface electrical potentials. J Neurosci. 42 (18), 3733-3748 (2022).
  12. Kellis, S., et al. Decoding spoken words using local field potentials recorded from the cortical surface. J Neural Eng. 7 (5), 056007(2010).
  13. Viventi, J., et al. Flexible, foldable, actively multiplexed, high-density electrode array for mapping brain activity in vivo. Nat Neurosci. 14 (12), 1599-1605 (2011).
  14. A transparent µECoG array for simultaneous recording and optogenetic stimulation. Ledochowitsch, P., Olivero, E., Blanche, T., Maharbiz, M. M. 2011 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Boston, MA, USA, , (2011).
  15. Ledochowitsch, P., et al. Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits. J Neurosci Methods. 256, 220-231 (2015).
  16. Laminar origin of evoked ECoG highgamma activity. Annu Int Conf IEEE Eng Med Biol Soc. Dougherty, M. E., Nguyen, A. P. Q., Baratham, V. L., Bouchard, K. E. 2019, 4391-4394 (2019).
  17. Tian, H., Xu, K., Zou, L., Fang, Y. Multimodal neural probes for combined optogenetics and electrophysiology. iScience. 25 (1), 103612(2022).
  18. Gonzales, D. L., et al. A translaminar spacetime code supports touchevoked traveling waves. bioRxiv. , (2024).
  19. Leonard, M. K., et al. Largescale singleneuron speech sound encoding across the depth of human cortex. Nature. 626 (7999), 593-602 (2024).
  20. Renz, A. F., et al. OptoEDura: a soft, stretchable ECoG array for multimodal, multiscale neuroscience. Adv Healthc Mater. 9 (17), 2000814(2020).
  21. Buzsáki, G. Rhythms of the brain. , Oxford University Press, USA. (2006).
  22. Yang, W., et al. A fully transparent, flexible PEDOT:PSS-ITO-Ag-ITO based microelectrode array for ECoG recording. Lab Chip. 21 (6), 1096-1108 (2021).
  23. Buzsáki, G. Largescale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
  24. Schalk, G., et al. Realtime detection of eventrelated brain activity. Neuroimage. 43 (2), 245-249 (2008).
  25. Kellis, S., et al. Multiscale analysis of neural activity in humans: implications for microscale electrocorticography. Clin Neurophysiol. 127 (1), 591-601 (2016).
  26. Buzsáki, G., Schomburg, E. W. What does gamma coherence tell us about interregional neural communication. Nat Neurosci. 18 (4), 484-489 (2015).
  27. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecondtimescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  28. Cardin, J. A., et al. Driving fastspiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses. Nature. 459 (7247), 663-667 (2009).
  29. Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. Sensory and decisionrelated activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception. Nat Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).
  30. Petersen, C. C. The functional organization of the barrel cortex. Neuron. 56 (2), 339-355 (2007).
  31. Crone, N. E., Sinai, A., Korzeniewska, A. Highfrequency gamma oscillations and human brain mapping with electrocorticography. Prog Brain Res. 159, 275-295 (2006).
  32. Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC crerecombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
  33. Mountcastle, V. The columnar organization of the neocortex. Brain. 120 (4), 701-722 (1997).
  34. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  35. Muller, L., Chavane, F., Reynolds, J., Sejnowski, T. J. Cortical travelling waves: mechanisms and computational principles. Nat Rev Neurosci. 19 (5), 255-268 (2018).
  36. Sato, T. K., Nauhaus, I., Carandini, M. Traveling waves in visual cortex. Neuron. 75 (2), 218-229 (2012).
  37. Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Columnar specificity of intrinsic horizontal and corticocortical connections in cat visual cortex. J Neurosci. 9 (7), 2432-2442 (1989).
  38. Angelucci, A., et al. Circuits and mechanisms for surround modulation in visual cortex. Annu Rev Neurosci. 40 (1), 425-451 (2017).
  39. Singer, W., Gray, C. M. Visual feature integration and the temporal correlation hypothesis. Annu Rev Neurosci. 18, 555-586 (1995).
  40. Quiroga, R. Q., et al. Invariant visual representation by single neurons in the human brain. Nature. 435 (7045), 1102-1107 (2005).
  41. Fusi, S., Miller, E. K., Rigotti, M. Why neurons mix: high dimensionality for higher cognition. Curr Opin Neurobiol. 37, 66-74 (2016).
  42. Stringer, C., et al. Spontaneous behaviors drive multidimensional, brainwide activity. Science. 364 (6437), eaav7893(2019).
  43. Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using celltypespecific expression of channelrhodopsin2. Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
  44. Mardinly, A. R., et al. Precise multimodal optical control of neural ensemble activity. Nat Neurosci. 21 (6), 881-893 (2018).
  45. Mahn, M., et al. Highefficiency optogenetic silencing with somatargeted anionconducting channelrhodopsins. Nat Commun. 9 (1), 4125(2018).
  46. Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. Creating lowimpedance tetrodes by electroplating with additives. Sens Actuators A Phys. 156 (2), 388-393 (2009).
  47. Halnes, G., et al. Electric Brain Signals: Foundations and Applications of Biophysical Modeling. , Cambridge University Press. (2024).
  48. Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nat Rev Neurosci. 9 (5), 370-386 (2008).
  49. Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G. Consciousness and anesthesia. Science. 322 (5903), 876-880 (2008).
  50. Schalk, G., Leuthardt, E. C. Braincomputer interfaces using electrocorticographic signals. IEEE Rev Biomed Eng. 4, 140-154 (2011).
  51. Chestek, C. A., et al. Longterm stability of neural prosthetic control signals from silicon cortical arrays in rhesus macaque motor cortex. J Neural Eng. 8 (4), 045005(2011).
  52. Branco, M. P., et al. Nine decades of electrocorticography: a comparison between epidural and subdural recordings. Eur J Neurosci. 57 (8), 1260-1288 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Optogenetic ManipulationSensory Evoked ResponsesHigh Gamma ActivityTonotopic MappingRodent Brain RecordingAuditory CortexWhisker Somatosensory Cortex

Gerelateerde artikelen