Een craniotomie chirurgische ingreep voor chronische Brain Imaging

Samenvatting

Deze video en protocol laten zien hoe je een met glas overdekt craniale venster in knaagdieren implantaat. Deze preparaten kunnen worden gebruikt voor chronische in vivo twee-foton beeldvorming van de neocortex loop van de tijd schalen van maanden. Het kan ook worden gebruikt voor andere vormen van beeldvorming, met inbegrip van optische intrinsieke signaal beeldvorming.

Samenvatting

Beeldvormende technieken worden steeds belangrijker in het onderzoek hersenfunctie. Onder hen, heeft twee-foton laser scanning microscopie ontpopt als een zeer bruikbare methode, omdat het laat de studie van de levende intacte hersenen. Met de juiste voorbereiding, deze techniek kan de observatie van hetzelfde corticale gebied chronisch, van minuten tot maanden. In deze video laten we een voorbereiding voor chronische in vivo beeldvorming van de hersenen met behulp van twee-foton microscopie. Deze techniek werd aanvankelijk ontwikkeld door dr. Karel Svoboda, die nu een Howard Hughes Medical Institute Investigator op Janelia Farm. De voorbereidingen zoals hier getoond wordt kan worden gebruikt voor beeldvorming van neocorticale structuur (bijvoorbeeld, dendritische en axonale dynamiek), om neuronale activiteit opnemen met calcium-gevoelige kleurstoffen, om beeld corticale doorbloeding dynamiek, of voor de intrinsieke optische beeldvorming studies. Diepe beeldvorming van de neocortex is mogelijk met een optimale craniale raam operaties. Opererend onder de meest steriele omstandigheden mogelijk is om infecties te voorkomen, samen met het gebruik van uiterst zorgvuldig te niet de dura mater schade tijdens de operatie, zal resulteren in een succesvolle en langdurige glas bedekte schedel ramen.

Protocol

1. Verdoven muizen met isofluraan (4% voor inductie, 1,5-2% voor een operatie) met behulp van IACUC goedgekeurde procedures. Het is belangrijk dat staart-en / of teen wringt worden gebruikt om ervoor te zorgen het dier volledig verdoofd.
2. Met behulp van een knaagdier trimmer, scheren de haren van de achterkant van de nek tot aan de ogen.
3. Plaats de muis in een stereotaxisch frame, meer dan een chirurgische ingreep water re-circulerende deken. Stevig vast de kop met oor bars.
4. Van toepassing zijn oogzalf, om het dier te voorkomen dat oog uitdroogt.
5. Beheren, subcutaan, Dexamethason (0,2 mg / kg) en Carprofen (5 mg / kg) tot zwelling van de hersenen en / of een ontstekingsreactie, respectievelijk te voorkomen.
6. Voor het begin van de operatie, steriliseren het werkgebied van de huid af te vegen met drie afwisselende swipes van 70% alcohol en betadine.
7. Alle chirurgische instrumenten zijn pre-gesteriliseerd met behulp van een glazen kraal sterilisator. Met een schaar die zijn gesteriliseerd met ethanol, verwijder de huid over de bovenkant van de schedel, te beginnen met een horizontale snede langs de voet van het hoofd, gevolgd door twee sneden in de rostrale richting, bijna het bereiken van de oogleden, daarna twee schuine sneden die samenkomen bij de middellijn.
8. Een daling van lidocaïne + adrenaline oplossing wordt toegepast op dit punt op de periost aan overmatige bloeden of pijn te vermijden. Met een scalpel, trekken de periost aan de randen van de schedel. Ook licht intrekken van de spieren van de achterkant van de nek.
9. Zachtjes schrapen het hele blootgestelde oppervlak van de schedel met de scalpel op een droog oppervlak te creëren. Dit is erg belangrijk, omdat hierdoor de lijm beter hechten wanneer later toegepast.
10. Zodra een imaging is gekozen, is men klaar om de schedel venster te maken. De eerste, voorzichtig "trekken" een cirkel van ongeveer 4 mm in diameter met de pneumatische boor.
11. Na een lichte boor-, weer van toepassing lidocaïne + adrenaline oplossing op de schedel oppervlak. Stop met het boren bij een zeer dunne laag van het bot is gelaten. Door zachtjes op het midden van de craniotomie om te voelen hoe het zo geeft, kan men meestal weten dat dit stadium is bereikt.
12. Onder een druppel zoutoplossing en gebruik te maken van het bot trabekels - de sponsachtige structuur van het bot - til de craniotomie van de schedel met een zeer dunne tip tang. Het zout is belangrijk, omdat het zal helpen opheffen van de schedel en het voorkomen van bloeden van de dura.
13. Van toepassing zijn Gelfoam die eerder is doordrenkt met een zoutoplossing om de dura mater op een kleine bloeden die af en toe doet zich voor wanneer de schedel wordt verwijderd te stoppen.
14. Na het drogen van de dura mater oppervlak en ervoor te zorgen dat er geen bloeden, voorzichtig leg een steriele 5 mm glas dekglas op de top van de dura mater. (Let op: andere groepen ook plaats een druppel laag smeltpunt agarose (1,2%) over de dura en het dekglaasje op de top van de agar put).
15. Breng een druppel cyanoacrylaat-lijm op basis naar de andere halfrond op de schedel. Met behulp van een naald, zacht van toepassing zijn de lijm rondom het raam terwijl oppassen niet te zetten onder het glas. Lijm kan nu worden toegepast in een dunne laag over het gehele oppervlak van de schedel.
16. Zodra de lijm droog is, meng tandheelkundige acryl en toe te passen in de schedel oppervlak, die ook een kleine rand van het dekglas, om het veilig te stellen.
17. Na het veiligstellen van de dekglas, maak een klein goed rond het venster met tandheelkundige acryl. Ook insluiten een titanium bar in de tandheelkundige acryl. Deze bar zal later gebruikt worden om de muis stevig vast op het podium van de microscoop voor beeldvorming. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de bar-niveau is, zodat deze parallel met de schedel raam. Het plaatsen van een stuk papier onder de bar kan zorgen dat de bar te blijven, terwijl het niveau van acryl hardt.
18. De tandheelkundige acryl is toegestaan ​​om (hard) remedie voor 10 minuten, tegen die tijd de titanium bar is bevestigd op zijn plaats. Plaats het dier in een warme kooi tot het zich herstelt.
19. Na herstel van de narcose, kan het dier worden afgebeeld op dezelfde dag.

Discussie

Zoals we hebben laten zien in de video en in de aanvullende cijfers, de craniale raam voorbereiding, in combinatie met het gebruik van twee-foton microscopie, is een zeer krachtig instrument om te studeren in vivo de structuur en functie van de neocortex. De techniek vereist rigoureuze training om vertrouwd te raken met de relevante anatomie en de fijne chirurgische procedures en vaardigheden die deze voorbereiding vereist. Alleen ongerepte operaties kan worden gebruikt voor chronische beeldvorming. Als de dura is overdreven of doorboord ge...

Materialen