Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Lipidenuitwisselingstest in levende cellen

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68008

⸱

21 maart 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Stony Brook University, 2Program in Cellular and Molecular Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Biochemistry and Cell Biology, Stony Brook University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een methode voor het gebruik van cyclodextrine om de uitwisseling tussen lipiden van het plasmamembraan met exogene lipiden te bemiddelen. Deze techniek kan worden gecombineerd met experimenten die transmembraaneiwitten bestuderen, die zich anders gedragen in lipidevlotachtige omgevingen dan in niet-vlotachtige omgevingen.

Samenvatting

Lipidevlotten zijn dynamische, geordende domeinen in het plasmamembraan die vaak worden gevormd tijdens de clustering en signalering van membraaneiwitten. De lipide-identiteit van het buitenste blad drijft de neiging van het membraan om lipidevlotten te vormen. De voorbijgaande aard van lipidevlotten maakt het moeilijk om in levende cellen te studeren. Daarom vergemakkelijken methoden die vlotvormende lipiden toevoegen of verwijderen aan de buitenkant van levende cellen het bestuderen van de kenmerken van vlotten, zoals hun effecten op membraaneiwitten. Experimenten met lipidenuitwisseling die in ons laboratorium zijn ontwikkeld, maken gebruik van met lipiden beladen cyclodextrines om exogene fosfolipiden te verwijderen en toe te voegen om de lipidensamenstelling van het plasmamembraan te veranderen. Het vervangen van het membraan door een vlot of niet-vlotvormend lipide kan helpen bij het bestuderen van de effecten op de activiteit van transmembraaneiwitten. Hier beschrijven we een methode voor lipidenuitwisseling op de buitenste folder van het plasmamembraan met behulp van met lipiden beladen cyclodextrine. We demonstreren de voorbereiding van de uitwisselingsmedia en de daaropvolgende behandeling van aangehechte zoogdiercellen. We laten ook zien hoe u de efficiëntie van uitwisseling kunt meten met behulp van HP-TLC. Dit protocol levert een bijna volledige vervanging van het buitenste blad door exogene lipiden op zonder de cellulaire levensvatbaarheid te veranderen, waardoor verder kan worden geëxperimenteerd met gemodificeerde intacte plasmamembranen.

Inleiding

Het plasmamembraan bestaat uit een lipidedubbellaag verrijkt met verschillende membraaneiwitten, waaronder transmembraanreceptoren en ionkanalen. Lipidedomeinen in het membraan zijn opgehelderd door middel van in wasmiddel oplosbare en onoplosbare gebieden die zijn geïdentificeerd in fractioneringsexperimenten met wasmiddelresistente membranen (DRM)1. De onoplosbare fracties werden gekenmerkt door verrijkt te zijn met cholesterol, dicht opeengepakte sfingomyelinen en verzadigde fosfolipiden, die hogere smeltpunten vertoonden, in tegenstelling tot de oplosbare fracties die voornamelijk bestaan uit een lagere smelttemperatuur en los verpakte onverzadigde fosfolipiden. De dicht opeengepakte gebieden worden vloeistofgeordende (Lo) lipidedomeinen of lipidevlotten genoemd, terwijl de meer losjes georganiseerde vloeistofverstoorde (Ld) lipidedomeinen de niet-vlotgebieden van het plasmamembraanzijn 2,3. Van lipidevlotgebieden is bekend dat ze signaleringsprocessen vergemakkelijken, met bewijs dat aangeeft dat de actieve insulinereceptor associeert met deze vlotten 4,5. Vanwege de dynamische aard van het celmembraan en de over het algemeen kleine omvang van domeinen, brengt het direct visualiseren van de aanwezigheid van vlotten in levende cellen echter aanzienlijke uitdagingen met zich mee. In deze context presenteren we een methode om de impact van lipidenvlotten op de insulinereceptor te onderzoeken door middel van lipidenuitwisselingstechnieken.

Cyclodextrines (CD's) worden gevormd door gekoppelde glucosemonomeren die een ringachtige structuur creëren met een centrale holte. De grootte van deze holte wordt bepaald door het aantal glucose-eenheden: zes eenheden vormen alfa-cyclodextrine (α-CD), terwijl zeven eenheden bèta-cyclodextrines (β-CD's) vormen. Cd's zijn zeer goed oplosbare moleculen die in staat zijn lipiden in hun holte in te kapselen, waardoor ze gemakkelijker naar het celmembraan worden getransporteerd6. Bèta-cyclodextrines zijn op grote schaal gebruikt om lipiden toe te voegen aan en te verwijderen uit membranen7; De grotere holte mist echter specificiteit voor cholesterol of fosfolipiden8. Daarentegen vertonen alfa-cyclodextrines, met hun kleinere holte, een grotere selectiviteit bij het binden van lipidemoleculen ten opzichte van sterolen. In het bijzonder heeft methyl-α-cyclodextrine (methyl-α-CD's) geen interactie met sterolen en is het effectief gebruikt om fosfolipiden en sfingomyelines uit te wisselen zonder de cholesterolsamenstelling van het celmembraan te veranderen 8,9.

In dit manuscript geven we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van methyl-α-CD's (MαCD) om lipiden in de buitenste folder van het celmembraan uit te wisselen met exogene lipiden die eigenschappen hebben die de vorming van lipidenvlotten bevorderen of verstoren. Deze uitwisseling wordt gebruikt om de impact van lipidevlotten op de activiteit van insulinereceptoren te onderzoeken. De demonstratie zal zich richten op de introductie van een fosfolipide en sfingomyeline die de vorming van vloeistofgeordende (Lo) domeinen in het plasmamembraan van Chinese Hamster Ovary (CHO) cellijnen beïnvloeden die de insulinereceptor (IR) stabiel tot overexpressie brengen10. De mate van lipidenuitwisseling in de CHO IR-cellen zal worden beoordeeld door middel van hoogwaardige dunnelaagchromatografie (HP-TLC), terwijl veranderingen in insulinereceptoractiviteit zullen worden gekwantificeerd door middel van western blot-analyse na insulinestimulatie na lipidenuitwisseling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van methyl-α-CD-oplossing

  1. Voeg 20 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan ~10 g MαCD-poeder in een glazen fles. Incubeer in een warmwaterbad (45 °C) om op te lossen, af en toe roeren tot alles goed is opgelost.
    OPMERKING: De oplossing kan nog steeds troebel zijn als gevolg van onoplosbare CD-soorten.
  2. Laat de oplossing door een spuitfilter van 0,22 μm lopen. De oplossing zal duidelijk worden.
  3. Gebruik een refractometer om de exacte concentratie MαCD te bepalen.
    1. Breng 10 μl monster aan op het monstergebied van een refractometer, verlicht het met een witte gloeilamp en noteer de brekingsindex van de oplossing.
    2. Bereken de MαCD-concentratie met behulp van de vergelijking
      RI = (1,49 x 10 x C) + 1,33
      waarbij RI = brekingsindex, C = concentratie van MαCD (mM). De vergelijking werd verkregen door middel van gravimetrische analyse, of het meten van de brekingsindex van een bekend gewicht van MαCD opgelost in een bekend volume.
  4. Sluit de glazen fles af met een deksel en wikkel het deksel in een transparante film om verdamping te voorkomen. Bewaren bij 4 °C.

2. Bereiding van multilamellaire blaasjes (MLV's)

  1. Houd voorraadoplossingen van gewenste exogene lipiden opgelost in chloroform in concentraties van 20 mM tot 50 mM en bewaar bij -20 °C of lager om de verdamping van oplosmiddelen tot een minimum te beperken.
    OPMERKING: Alle lipiden in tabel 1 kunnen volledig worden opgelost in chloroformbouillons. Het is echter mogelijk dat alternatieve lipiden 1:1 chloroform nodig hebben: methanol om volledig op te lossen.
  2. Aliquot lipide wordt in borosilicaatbuisjes verwerkt met behulp van een positief verdringingspipet met een glazen punt. Als alternatief kan een glazen injectiespuit worden gebruikt.
  3. Droog het vetgehalte op een verwarmingsblok bij een lage stand van ongeveer 50 °C onder een stroom van N2-gas totdat alle zichtbare chloroform is verdampt.
  4. Verwijder het resterende oplosmiddel uit het gedroogde lipide door de buis in een vacuümkamer te plaatsen en deze gedurende 1 uur bloot te stellen aan een hoog vacuüm (minder dan 200 mTorr).
  5. Voeg de serumvrije Ham's F-12-media toe aan de droge lipidenfilm om een uiteindelijke concentratie van 20 mM te bereiken. Dek af met een deksel of teflontape en verwarm gedurende 5 minuten in een waterbad van 70 °C.
  6. Vortex om lipiden op te schorten en MLV's te vormen. De media zouden nu troebel moeten lijken.
    OPMERKING: Sommige verzadigde lipiden zijn mogelijk niet volledig gesuspendeerd door alleen vortex en moeten mogelijk worden gesuspendeerd door op en neer te pipetteren totdat de film niet langer zichtbaar is.
    1. Breng het volledige volume over in een microcentrifugebuis. MLV's kunnen tot 3 dagen worden bewaard bij 4 °C.

3. Bereiding van lipidenuitwisselingsmedia

  1. Voeg MαCD-bouillon toe aan een eindconcentratie van 40 mM, samen met bereide MLV's aan de uiteindelijke lipideconcentratie in tabel 1.
    OPMERKING: Als MLV's worden gebruikt die bij 4 °C worden bewaard, worden deze op de bodem van de buis bezonken. Opwarmen tot kamertemperatuur en ervoor zorgen dat ze opnieuw worden gesuspendeerd door de buis te tikken of te roeren.
    1. Laad lipiden op MαCD door gedurende 30 minuten te incuberen in een waterbad van 37 °C of 55 °C volgens tabel 1. De gekozen temperatuur moet boven het smeltpunt van de gel-naar-vloeistoffase van het gekozen lipide liggen. De media zouden van bewolkt naar helder moeten gaan.
    2. Laat de lipidenuitwisselingsmedia 30-60 minuten afkoelen tot kamertemperatuur.

4. Lipidenuitwisselingsbehandeling van cellen

  1. Kweek CHO IR-cellen bij 37 °C en 5 % CO2 in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM, 4,5 g/L glucose) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 300 μg/ml L-glutamine, 100 μg/ml niet-essentiële aminozuren, 50 μg/ml G418, 2 μM methotrexaat en 1x antibioticum-antimycoticum.
    1. Zaai 1,5 x 106 cellen in platen van 60 mm en groei tot ze 80%-90% samenvloeiend zijn.
    2. Was de cellen 3x door 1 ml PBS toe te voegen en vervolgens op te zuigen. Verhonger de cellen een nacht in 2 ml serumvrije Ham's F12-media.
  2. Was de cellen 3x met 1 ml PBS. Voeg 1 ml bereide uitwisselingsmedia of serumvrije media ter controle toe aan de cellen en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (25 °C -27 °C). Wervel de cellen elke 15 minuten om een gelijkmatige blootstelling aan uitwisselingsmedia te garanderen.
    1. Was de cellen 3x met 1 ml PBS. Elke plaat kan vervolgens worden verwerkt voor lipide-extractie in stap 5 of voor IR-autofosforylering in stap 7.

5. Lipidenextractie op celkweekplaat

  1. Verwijder PBS volledig en zet de plaat in een hoek van 45° gedurende 10 minuten of tot hij volledig droog is, waarbij u eventuele buffer verwijdert die zich langs de bodem kan verzamelen.
  2. Voeg 1 ml 3:2 (v:v) hexaan: isopropanoloplossing toe aan de gedroogde cellen en incubeer gedurende 10 minuten op een shaker bij kamertemperatuur.
  3. Breng de oplossing over in een borosilicaatbuis. Dek af met teflontape en bewaar bij -20 °C.
  4. Los de resterende celresten op door 500 μL 1N NaOH toe te voegen en 10 minuten te schudden bij kamertemperatuur.
    1. Gebruik deze oplossing in een eiwitkwantificeringstest zoals de Bradford-test om de eiwitconcentratie van elk monster te bepalen. Deze concentratiewaarden kunnen worden gebruikt om de laadvolumes van de lipide-extracten op HP-TLC-platen te normaliseren voor een gelijkmatige lipidenbelasting over alle monsters.

6. Controle van de wisselefficiëntie met HP-TLC

  1. Maak 100 ml 65:25:5 (v:v:v) chloroform:methanol:30% (v/v) ammoniumhydroxide en giet het in een glazen TLC-tank. Dek goed af en laat de damp minimaal 1 uur in evenwicht komen.
  2. Droog het monster van het lipide-extract op een verwarmingsblok op lage stand onder een stroom N2-gas totdat al het zichtbare organische oplosmiddel is verdampt.
  3. Los de lipidenfilm op in 50 μL 1:1 (v:v) chloroform: methanol.
  4. Gebruik een Hamilton-spuit van 10 μl om 1-10 μl monster in banden van 1 cm op een silica HP-TLC-plaat te laden. Laad maximaal 10 banden op een plaat van 20 cm. Gebruik genormaliseerde waarden om de volumes te bepalen die nodig zijn om gelijke hoeveelheden lipiden in alle monsters te laden.
    NOTITIE: Voordat u elk monster laadt, moet de plaat worden geactiveerd door deze op een kookplaat op een middelhoge stand te plaatsen.
  5. Plaats de plaat rechtop in de TLC-tank en laat het oplosmiddelfront 8 cm reizen om de scheiding van fosfolipidesoorten te garanderen.
  6. Laat de plaat 10 minuten drogen. Spuit met een waterige oplossing van 3% (w/v) koper(II)acetaat en 8% (v/v) fosforzuur.
    1. Laat de plaat 30 minuten drogen op kamertemperatuur of met een heteluchtpistool. De plaat moet van doorschijnend blauw naar ondoorzichtig wit verkleuren.
  7. Verkool de plaat in een oven van 180 °C-200 °C gedurende 5-10 minuten of totdat de zwarte lipidebanden detecteerbaar zijn.

7. Controle van receptoractivering met autofosforyleringstest en western blot

  1. Incubeer cellen met 500 μL 100 nM insuline in serumvrije media bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
  2. Was cellen met ijskoude PBS en leg cellen op ijs om de stimulatie te stoppen. Voeg onmiddellijk 1 ml ijskoude PBS toe aan de cellen en oogst met een celschraper. Pelletcellen bij 3000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  3. Voeg 100-200 μL volledige RIPA lysisbuffer (50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 1% (w/v) natriumdeoxycholaat, 1 mM geactiveerd natriumorthovanadaat, 10 μg/ml aprotinine, 10 μg/ml leupeptine) toe aan celpellet op ijs. Pipetteer 30x-40x op en neer om te lyseren.
  4. Incubeer het lysaat op ijs gedurende 10 minuten. Verwijder het lysaat van celresten door gedurende 10 minuten bij 4 °C op 16.000 x g te draaien en het supernatant te verzamelen. Reserveer ongeveer 20 μL lysaat om de eiwitconcentratie te bepalen met de Bradford-test.
  5. Combineer lysaat met 5x Laemmli-buffer (350 mM Tris HCl pH 6,8, 30% v/v glycerol, 10% w/v SDS, 25% v/v β-mercaptoethanol, 0,002 g broomfenolblauw) en kook 5 minuten bij 95 °C. Het volume van de toegevoegde buffer moet voldoende zijn om een uiteindelijke concentratie van 1x Laemmli-buffer te bereiken.
  6. Laat lysaten door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) lopen.
    1. Laad gelijke massa eiwit voor alle monsters samen met de molecuulgewichtmarker op een SDS-PAGE-gel. Draai op 100 V-150 V in lopende buffer (2,5 mM Tris pH 8, 19,2 mM glycine, 0,01% (w/v) SDS) tot goed opgelost in het bereik van 100-250 kDa.
  7. Overbrengen op een polyvinylideenfluoride (PVDF)-membraan in overdrachtsbuffer (2,5 mM Tris pH 8, 19,2 mM glycine) gedurende 1 uur bij 100V en 4 °C.
  8. Blokkeer het PVDF-membraan gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in 5% BSA-oplossing in TBST (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween 20).
  9. Incubeer met pYpY IR-antilichaam of IR-β-antilichaam in een concentratie van 1:1000 in 5% BSA-oplossing in TBST gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C.
    OPMERKING: Het pYpY IR-antilichaam herkent specifiek gefosforyleerde tyrosines 1162 en 1163 en dient om autofosforylering van de receptor aan te geven. Het IR-β-antilichaam herkent de bèta-subeenheid van de receptor zonder onderscheid, ongeacht de fosforyleringstoestand, en dient om globale niveaus van de receptor aan te geven.
  10. Was 3x met TBST op kamertemperatuur. Incubeer met α konijn-HRP-antilichaam in een concentratie van 1:3000 in 1% BSA-oplossing in TBST gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  11. Was 3x met TBST op kamertemperatuur. Incubeer gedurende 1 minuut met verbeterd chemiluminescerend (ECL) substraat en maak de film ziek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de waarneembare verandering in de cellulaire lipidensamenstelling na de uitwisseling aan te tonen, voerden we HP-TLC uit op CHO IR-cellen na uitwisseling van hersen-SM (bSM) en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) (Figuur 1). In gevallen waarin sfingomyelinen zoals bSM worden gebruikt voor uitwisseling, is een toename van de SM-bandintensiteit duidelijk, samen met een afname van de PC-bandintensiteit ten opzichte van de onbehandelde controle. Omg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Sinds de conceptualisering van het bestaan van lipidevlotten in het celmembraan zijn er talloze pogingen gedaan om ze in cellen te visualiseren en lipide- en receptorassociatie te bestuderen. Experimenten met microscopie11 in cellen gebruikten fluorescerend gelabelde biomarkers, meestal eiwitten en lipiden waarvan bekend is dat ze associëren met vlotten, om de lokalisatie van geordende lipidedomeinen in de cel visueel te bestuderen12. Het c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Financiering werd verstrekt door NIH-subsidie GM 122493. CHO IR-cellen waren een vriendelijk geschenk van Dr. Jonathan Whittaker (Case Western Reserve University).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC)Avanti Polar Lipids850335
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)Avanti Polar Lipids850345
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Avanti Polar Lipids850375
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar Lipids850355
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)Avanti Polar Lipids850365
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (POPC)Avanti Polar Lipids850457
Anti-insulin receptor β antibodyCell Signaling TechnologyCST3025
Anti-pYpY1162/1163 Insulin receptor antibodyR&D Systems Inc.AF2507
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074
Borosilicate glastestbuizen (12 x 75 mm)Thermo Fisher Scientific14-961-26
Brain sphingomyeline (bSM)Avanti Polar Lipids860062
Egg sphingomyeline (eSM)Avanti Polar Lipids860061
Fetaal bovien serum (FBS)Corning35-016-CV
G418 disulfaat zoutSigma AldrichA1720
Gibco Antibiotic-antimycotic oplossing (100x)Thermo Fisher Scientific15240062
Gibco Dulbecco’s aangepast eagle medium (DMEM, 4,5 g/L glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat)Thermo Fisher Scientific11965092
Gibco ham’s F12 mediaThermo Fisher Scientific11765054
Gibco L-glutamineThermo Fisher Scientific25030032
Gibco MEM niet-essentiële aminozurenoplossing (100X)Thermo Fisher Scientific11140050
Gibco fosfaatbufferoplossing (PBS) zonder calcium en magnesium (0,144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0,795 g/L Na2- HPO4 (watervrij))Thermo Fisher Scientific10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0,05%), fenol roodThermo Fisher Scientific25300054
Hoge prestatie dunne laagchromatografie (HP-TLC)MerckHP-TLC Silica Gel 60 platen
Immobilon-P PVDF-membraanMilliporeIPVH00010
MethotrexaatSigma Aldrich454126
Methyl-α-cyclodextrine (MαCD)AraChemCDexA076/BR
Pierce ECL Western Blotting SubstraatThermo Fisher Scientific32106
Natriumorthovanadate, geactiveerdSigma Aldrich5.08605

Referenties

  1. Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 111-136 (1998).
  2. Brown, D. A. Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals. Physiology. 21, 430-439 (2006).
  3. Schroeder, R., London, E., Brown, D. Interactions between saturated acyl chains confer detergent resistance on lipids and glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins: GPI-anchored proteins in liposomes and cells show similar behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (25), 12130-12134 (1994).
  4. Suresh, P., Miller, W. T., London, E. Phospholipid exchange shows insulin receptor activity is supported by both the propensity to form wide bilayers and ordered raft domains. J Biol Chem. 297 (3), 101010(2021).
  5. Delle Bovi, R. J., Kim, J., Suresh, P., London, E., Miller, W. T. Sterol structure dependence of insulin receptor and insulin-like growth factor 1 receptor activation. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1861 (4), 819-826 (2019).
  6. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochim Biophys Acta. 1768 (6), 1311-1324 (2007).
  7. Ohtani, Y., Irie, T., Uekama, K., Fukunaga, K., Pitha, J. Differential effects of α-, β- and γ-cyclodextrins on human erythrocytes. Eur J Biochem. 186 (1-2), 17-22 (1989).
  8. Suresh, P., London, E. Using cyclodextrin-induced lipid substitution to study membrane lipid and ordered membrane domain (raft) function in cells. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1864 (1), 183774(2022).
  9. Li, G., et al. Efficient replacement of plasma membrane outer leaflet phospholipids and sphingolipids in cells with exogenous lipids. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14025-14030 (2016).
  10. Yoshimasa, Y., Paul, J. I., Whittaker, J., Steiner, D. F. Effects of amino acid replacements within the tetrabasic cleavage site on the processing of the human insulin receptor precursor expressed in Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 265 (28), 17230-17237 (1990).
  11. Gaus, K., et al. Visualizing lipid structure and raft domains in living cells with two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15554-15559 (2003).
  12. Klymchenko, S., Kreder, R. Fluorescent probes for lipid rafts: From model membranes to living cells. Chem Biol. 21 (1), 97-113 (2014).
  13. Pike, L. J. Growth factor receptors, lipid rafts and caveolae: An evolving story. Biochim Biophys ActaMol Cell Res. 1746 (3), 260-273 (2005).
  14. Brown, D. A., London, E. Structure of detergent-resistant membrane domains: does phase separation occur in biological membranes. Biochem Biophys Res Commun. 240 (1), 1-7 (1997).
  15. Lin, Q., London, E. Preparation of artificial plasma membrane mimicking vesicles with lipid asymmetry. PLoS One. 9 (1), e87903(2014).
  16. Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
  17. Deveaux, P. F., Hermann, A., Ohlwein, N., Kozlov, M. M. How lipid flippases can modulate membrane structure. Biochimica et Biophysica Acta Biomembr. 1778 (7), 1591-1600 (2008).
  18. Balasubramaniam, K., Mirnikjoo, B., Schroit, A. J. Regulated externalization of phosphatidylserine at the cell surface: implications for apoptosis. J Biol Chem. 282 (25), 18357-18364 (2007).
  19. Li, G., et al. Replacing plasma membrane outer leaflet lipids with exogenous lipid without damaging membrane integrity. PLoS One. 14 (10), e0223572(2019).
  20. Contreras, F. X., Sanchez-Magraner, L., Alonso, A., Goni, F. M. Transbilayer (flip-flop) lipid motion and lipid scrambling in membranes. FEBS Letters. 584 (9), 1779-1786 (2010).
  21. Suresh, P., London, E. MαCD-based plasma membrane outer leaflet lipid exchange in mammalian cells to study insulin receptor activity. Biophys Approach Study Memb Struct A Exp. 700, 485-507 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Lipid raftsplasmamembraancyclodextrine gemedieerde uitwisselinglipiden van het buitenste bladhogeresolutie TLCreceptor tyrosinekinasesfingomyeline uitwisselingfosfatidylcholine uitwisselinginsulinereceptor signalering
Lipidenuitwisselingstest in levende cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.