Methodenartikel

Mycobacteriële DNA-extractie met behulp van kralen kloppen in aangepaste buffer gevolgd door NGS-workflow

DOI:

10.3791/68037

⸱

13 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Experimental Medicine, University of California, San Francisco, 2DSI-NRF Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, SAMRC for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 3Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Zuckerberg San Francisco General Hospital and Trauma Centre, University of California, San Francisco

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol toont aan dat het slaan van kralen in combinatie met het zuiveren van DNA-afvangkralen een snelle en consistente methode biedt voor het extraheren van DNA uit Mycobacterium tuberculosis-monsters , waardoor het een effectieve keuze is voor sequencing-toepassingen van de volgende generatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tuberculose is een dodelijke ziekte en de opkomst van resistentie tegen antibiotica in de veroorzaker bacterie, Mycobacterium tuberculosis, verslechtert de behandelingsresultaten. Nauwkeurige en snelle identificatie van geneesmiddelresistentie door middel van sequencingtechnologieën is nodig om de resultaten voor tuberculosepatiënten te verbeteren door middel van op maat gemaakte therapeutische regimes. De DNA-extractiemethode is van cruciaal belang voor stroomafwaartse moleculaire tests en wordt bemoeilijkt door de taaie celwand van Mycobacterium, de lage bacillaire belasting van veel klinische monsters en de complexiteit van de sputummatrix. Er zijn talloze DNA-extractiemethoden voor M. tuberculose gemeld, maar er is momenteel geen gouden standaard. Bovendien is aangetoond dat weinig van deze methoden consistent werken, en veel zijn niet geschikt voor tuberculose met weinig middelen en veel last. Bijgevolg introduceren laboratoria vaak hun eigen procedurewijzigingen, wat resulteert in een aanzienlijke variabiliteit van de methode. Hier presenteren we een kosteneffectief, snel en gestandaardiseerd protocol voor mycobacteriële DNA-extractie uit zowel klinisch sputum als cultuur dat DNA produceert dat geschikt is voor qPCR en dat moet worden overwogen voor gebruik in laboratoria voor klinische diagnostiek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het extraheren van hoogwaardig DNA uit M. tuberculosis is noodzakelijk voor de detectie van resistente tuberculose (tbc) met behulp van gerichte next-generation sequencing (NGS) en whole genome sequencing (WGS), maar wordt vaak over het hoofd gezien. We hebben een gestandaardiseerd protocol ontwikkeld om consistent DNA van hoge kwaliteit te leveren voor klinische NGS-toepassingen, waaronder gerichte NGS-benaderingen zoals Deeplex-MycTB (GenoScreen) en sequencing van het hele genoom, die nu worden aanbevolen door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) voor de diagnose van resistente tuberculose. Hoewel de WHO deze op NGS gebaseerde diagnostische strategieën aanbeveelt, specificeert het niet de specifieke DNA-extractieprotocollen om ze te ondersteunen. Onze methode kan worden gebruikt met door de WHO goedgekeurde tests en met opkomende technologieën die mycobacterieel DNA van hoge kwaliteit vereisen.

De extractie-uitdaging komt voort uit de unieke celwand van M. tuberculosis, die bestaat uit mycolzuren en lipiden die het uitzonderlijk moeilijk maken om open te breken. De huidige gepubliceerde extractieoplossingen hebben een aanzienlijke variatie in lysis (bijv. sonicatie, chemische, hitte- en kralenklopping) en DNA-extractiemethoden (bijv. fenol-chloroform-extractie, ethanolprecipitatie, CTAB-gebaseerde en kolom- en kralengebaseerde methoden), wat resulteert in verschillen in DNA-opbrengst, zuiverheid en kwaliteit 1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,16. Daarnaast gebruiken onderzoeksgroepen zelden dezelfde DNA-extractiemethode en meten ze succes vaak anders. Dit maakt het moeilijk om te bepalen welke methode het beste werkt, omdat de optimale aanpak afhangt van het type moleculaire toepassing. Het oplossen van structurele varianten van M. tuberculose in sputum met behulp van long-read sequencing vereist bijvoorbeeld DNA van hogere kwaliteit en nauwkeuriger polymerase dan het uitvoeren van een betaald diagnostisch hulpmiddel dat zich alleen richt op een klein gebied van rpoB. Verschillende factoren bemoeilijken het succes van DNA-extractie verder. De hoeveelheid DNA die we kunnen extraheren, varieert op basis van het type monster, hoeveel bacteriën er aanwezig zijn en of er stoffen zijn (co-geëxtraheerd niet-mycobacterieel DNA en PCR-remmers) die het proces verstoren. Zelfs technische aspecten zoals hoe precies een laborant pipetten gebruikt, kunnen de resultaten beïnvloeden. De huidige methoden schieten vaak tekort bij het verwerken van monsters met een lage bacteriële belasting of hoge niveaus van besmettend DNA, die vaak worden aangetroffen in klinische omgevingen 17,18,19.

Het slaan van kralen in een aangepaste buffer, gevolgd door een protocol voor het opruimen van kralen, biedt belangrijke voordelen ten opzichte van andere methoden. Het is een eenvoudige en snelle workflow die de kans op operator-afhankelijke variatie vermindert en de DNA-integriteit voor downstream NGS-toepassingen handhaaft. Deze gestandaardiseerde aanpak is met name geschikt voor klinische laboratoria die op zoek zijn naar betrouwbare, reproduceerbare resultaten met behulp van door de WHO aanbevolen NGS-resistentietesten voor geneesmiddelen en alle WGS-toepassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd uitgevoerd aan de Universiteit van Californië San Francisco (UCSF) onder goedkeuring van het Institutional Biosafety Committee (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) en volgt de richtlijnen voor onderzoeksethiek van de UCSF. We hebben restmonsters van sputum verkregen die zijn verzameld door Discovery Life Sciences onder een door de IRB goedgekeurd protocol voor vrijstelling van toestemming van personen met niet-tbc-ademhalingsaandoeningen.

1. Voorbereiding van buffers

  1. Aangepaste Triton-buffer (Tabel 1): Om 100 ml aangepaste Triton-buffer te bereiden, begint u met het combineren van 2 ml 5 M NaCl, 1 ml 1 M Tris-HCl (pH 8), 1 ml Triton X-100 en 0,2 ml 0,5 M ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA). Voeg ultrapuur water toe om het totale volume op 100 ml te brengen. Filter steriliseren voor gebruik. De uiteindelijke buffer bevat 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA en 1% Triton X-100.
  2. Lage EDTA TE (Tabel 2): Om 100 ml Low EDTA TE Buffer te bereiden, combineert u 1 ml 1M Tris-HCl (pH 8) en 0,02 ml 0,5 M EDTA. Voeg ultrapuur water toe om het totale volume op 100 ml te brengen. De uiteindelijke buffer bevat 10 mM Tris-HCl en 0,1 mM EDTA.

2. Voorbereiding van lysisbuizen

  1. Snijd met een scalpelmes voorzichtig de bodem van een buis met schroefdop van 1,5 ml, net onder het buigpunt.
  2. Snijd de punt van een P1000-punt, snijd een V-vormige wig aan het uiteinde en klem de voorbereide bodem van de schroefdopbuis erin. Zie afbeelding 1 voor een diagram van de schep.
  3. Vul een steriele container (bijv. een reservoir of petrischaaltje) met 0,1 mm zirkoniumsilicaatkorrels en gebruik de voorbereide schep om een schep kralen (~200 mg) in buisjes met schroefdop van 1,5 ml te verdelen.

figure-protocol-1
Figuur 1: Eigen schepje voor het verdelen van kralen. De schep is ontworpen voor het eenvoudig overbrengen van ~200 mg 0,1 mm zirkoniumkorrels in verwerkingsbuizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Voorbereiding van de input

OPMERKING: Alle monstervoorbereiding moet worden uitgevoerd volgens de bioveiligheidsprotocollen van uw faciliteit. We raden ten zeerste aan om infectieuze materialen te behandelen in een bioveiligheidskast van klasse II (BSC) om het risico op blootstelling aan aerosolen te minimaliseren.

  1. Bacteriële celcultuur
    1. Centrifugeer ~ 5 ml M. tuberculosiscultuur (MGIT of troebele vloeibare cultuur) in een conische centrifugebuis van 15 ml op maximale snelheid (≥ 3.000 x g) gedurende 10 minuten.
    2. Gebruik een serologische pipet van 10 ml om voorzichtig alles behalve ~ 500 μl van het bovenstaande te verwijderen zonder de pellet te verstoren. Verwijder het resterende bovenstaande middel met een P1000-pipet zonder de pellet te verstoren.
    3. Resuspendeer de pellet in 350 μl aangepaste Triton-buffer door op en neer te pipetteren. Indien nodig (d.w.z. om monsters te verwijderen voor verwerking buiten een BSL-3), deactiveer het monster volgens de standaardwerkprocedures.
  2. Sputum voorbereiding
    1. Breng 1-5 ml sputummonster (spontaan of geïnduceerd) over in een steriele centrifugebuis van 50 ml.
  3. DTT-vloeibaarmaking
    1. Voeg vier volumes van 100 mM dithiothreitol toe aan het sputummonster (volume kan variëren). Als u een in de handel verkrijgbaar reagens gebruikt, volg dan de verdunningsinstructies van de fabrikant.
    2. Draai grondig gedurende 30 s. Incubeer gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur (20-25 °C). Vortex opnieuw gedurende 30 s.
    3. Herhaal stap 3.3.1. en 3.3.2. 1x, voor zeer viskeuze monsters, voer tot 5 incubatie-vortexcycli uit.
    4. Centrifugeer op maximale snelheid (≥ 3.000 x g) gedurende 10 min. Gooi met een serologische pipet van 10 ml voorzichtig alles behalve ~ 500 μl van het supernatant weg. Verwijder het resterende bovenstaande middel met een P1000-pipet zonder de pellet te verstoren.
    5. Resuspendeer de pellet in 350 μL aangepaste Triton-buffer.
  4. NALC-NaOH vloeibaarmaking
    1. Volg voor het bereiden van de NALC-NaOH-oplossing de instructies van de fabrikant voor bereiding en verdunning.
    2. Voeg vier volumes NALC-NaOH-oplossing toe aan het sputummonster (spontaan of geïnduceerd, volume kan variëren).
    3. Vortex voor 30 s. Incubeer gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur (20-25 °C). Herhaal stap 3.4.1 en 3.4.2. 1x. Voer voor zeer viskeuze monsters maximaal 5 incubatie-vortexcycli uit.
    4. Voeg PBS toe aan de 50 ml-markering. Vortex kort mengen. Centrifugeer op maximale snelheid (≥ 3.000 x g) gedurende 10 min.
    5. Gooi met een serologische pipet van 50 ml voorzichtig alles behalve ~ 500 μl van het supernatant weg. Verwijder het resterende bovenstaande middel met een P1000-pipet zonder de pellet te verstoren.
    6. Resuspendeer de pellet in 350 μL aangepaste Triton-buffer. Indien nodig (d.w.z. om monsters te verwijderen voor verwerking buiten een BSL-3), deactiveer het monster volgens de standaardwerkprocedures.

4. Extractie van DNA

  1. Breng de geïnactiveerde bacteriële suspensie (350 μL uit stap 3) over naar een nieuwe, goed geëtiketteerde buis met schroefdop van 1,5 ml die ~250 μL 0,1 mm zirkoniumoxide-silicaatkorrels bevat.
  2. Bead versloeg het lysaat met 6,5 m/s gedurende 45 s met 2 minuten rust tussen de runs. Herhaal dit voor in totaal drie kralenklopcycli.
  3. Centrifugeer met maximale snelheid (≥ 12.000 x g) gedurende 2 minuten en breng 150 μL van het bovenstaande over in een nieuwe, goed geëtiketteerde buis. Zorg ervoor dat u geen kralen of celresten overbrengt.
  4. Laat de magnetische kralen van de cleanup gedurende 30 minuten in evenwicht komen tot kamertemperatuur en draai grondig om volledige resuspensie te garanderen voor gebruik.
  5. Voeg 180 μl (1,2x volume) aan cleanup magnetische kralen toe en meng door 10x op en neer te pipetteren. Incubeer 2 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Plaats op een magnetisch rek en wacht ~ 2 minuten tot de oplossing is verdwenen. Gooi met behulp van een P200-pipet het bovenstaande voorzichtig weg zonder de magnetische kralen te verstoren.
  7. Terwijl de buis nog op het magnetische rek staat, voegt u 500 μL vers bereide 70 % (v/v) ethanol toe en doseert u langs de tegenoverliggende buiswand naar de magnetische kralen. Wacht 30 seconden.
  8. Herhaal stap 4.5. - 4.7. voor in totaal twee wasbeurten. Verwijder aan het einde van de laatste wasbeurt de resterende ethanol met een P10-pipet. Droog de kralen kort gedurende ~ 2 min.
  9. Onmiddellijk nadat de kralenkorrel ondoorzichtig is geworden, verwijdert u de buis uit het magnetische rek en resuspendeert u deze opnieuw in 20 μL Low EDTA Tris-buffer. Zorg ervoor dat de kralen niet uitdrogen en barsten.
  10. Meng door pipetteren of vortexen om ervoor te zorgen dat alle parels in oplossing zijn. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  11. Plaats op een magnetisch rek en wacht ~ 2 minuten tot de oplossing helder is. Breng het geëlueerde DNA over naar een nieuwe, goed gelabelde buis voor stroomafwaartse analyse. Aspireer <20 μL geëxtraheerd DNA op om overdracht van magnetische kralen te voorkomen.

5. qPCR telling van mycobacterieel DNA

  1. Om mycobacterieel DNA te kwantificeren met behulp van een kwantitatieve PCR gericht op 99 nucleotiden van het mycobacteriële atpE (Rv1305), stelt u een reactiemengsel van 10 μl per monster op ijs samen met 5 μl universele sondemastermix (2x), 0,4 μl elk voorwaartse primer (5'-AATTCCTGGTGTGTAGCGGTGG-3', 10 μM) en omgekeerde primer (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10 μM), 0,2 μl TaqMan-sonde (5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3', 10 μM), 2 μL DNA-sjabloon en 2 μL nucleasevrij water (Tabel 3).
  2. Voer de reactie uit met behulp van de volgende thermische cyclusomstandigheden: eerste denaturatie bij 95 °C gedurende 60 s, gevolgd door 35 cycli van 95 °C gedurende 10 s en 60 °C gedurende 30 s (met hier een opname, met een hellingssnelheid van 2,11 °C/s; Tabel 4).
    OPMERKING: In dit geval werd qPCR uitgevoerd met behulp van een TaqMan-assay met VIC-gelabelde sonde op een QuantStudio 3 Real-Time PCR-systeem,
  3. Voer alle samples, standaarden en besturingselementen uit in technische drievouden. Genereer standaardcurven met behulp van seriële verdunningen van gezuiverd M. tuberculosis-DNA . Voer relatieve kwantificeringsanalyse uit met behulp van analysesoftware.
  4. Exporteer de resulterende relatieve kwantificeringswaarden naar CSV-formaat en visualiseer met R Studio (versie 2024.09.1+394) om boxplots te genereren waarin DNA-opbrengsten worden vergeleken met verschillende extractiemethoden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben het DNA-extractieprotocol getest op zowel gekweekte M. tuberculosis als M. tuberculosis spiked sputummonsters (n = 3 voor elke aandoening). Met behulp van gekweekte M. tuberculosis H37Rv mc² 7901 hebben we de input gestandaardiseerd op 8,4 x 106 cellen per 50 μL, wat overeenkomt met 1 ml van een MGIT-cultuur bij 200 GU. Voor sputumexperimenten hebben we 1 ml sputum gepoold van personen met niet-tbc-ademhalingsaandoeningen (commercieel verkr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit werk presenteren we een robuust, gevalideerd protocol voor het extraheren van hoogwaardig M. tuberculosis-DNA met behulp van kralenkloppen met magnetische kralenopruiming voor stroomafwaartse moleculaire en NGS-toepassingen.

De methode biedt verschillende voordelen ten opzichte van bestaande DNA-extractieprotocollen van M. tuberculosis . Hoewel de traditionele fenol-chloroform-extractie doorgaans enkele dagen duurt en gevaarlijke chemi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R01AI153213 Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten (NIAID).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.1 mm Zirconia-Silicate BeadsBiospec Products11079101zKralen gebruikt voor de kralenklopstap om mycobacteriële cellen te lyseren
AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63880Magneetkralen voor DNA-opruiming na lysis
EDTA (0,5M, pH 8,0) Thermo Fisher ScientificAM9260GAangepaste Triton/Low EDTA Buffer Componenten
Fastprep 24MPbio, USA116004500Apparatuur voor kralenkloppen met 6,5 m/s
Forward PrimerThermo Fisher ScientificAangepaste synthesePrimersequentie: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O (Water, moleculaire biologie kwaliteit)Thermo Fisher ScientificBP2819-1Aangepaste Triton/Low EDTA Buffer Componenten
Luna Universal ProbeNew England BiolabsM3004qPCR reagens voor Mycobacterium DNA enumeratie
MycoPrep KitBDSKU/REF 240863BD MycoPrep Specimen Digestion voor NALC-NaOH Sputum Verwerking
NaCl (Natriumchloride, 5M oplossing)Thermo Fisher ScientificAM9759Aangepaste Triton/Low EDTA Buffer Componenten
PBSMillipore SigmaP2272Sputum Verwerking
Reverse PrimerThermo Fisher ScientificAangepaste synthesePrimersequentie: GTTTACGGCGTGGACTACCA
TaqMan ProbeThermo Fisher ScientificAangepaste syntheseProbe sequentie: AGGAGGAACACCGGTGGCGA
Tris-HCl (1M, pH 8,0)Thermo Fisher ScientificAM9855GAangepaste Triton/Low EDTA Buffer Componenten
Triton X-100Thermo Fisher Scientific28314Aangepaste Triton/Low EDTA Buffer Componenten

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jouet, A., et al. Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs. Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).
  2. George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform. bioRxiv. , (2020).
  3. Doyle, R. M., et al. Direct whole-genome sequencing of sputum accurately identifies drug-resistant mycobacterium tuberculosis faster than MGIT culture sequencing. J Clin Microbiol. 56 (8), e00666-e00718 (2018).
  4. Noordhoek, G. T., et al. Sensitivity and Specificity of PCR for Detection of Mycobacterium Tuberculosis: A Blind Comparison Study among Seven Laboratories. J Clin Microbiol. 32, (1994).
  5. Jaber, M., Rattan, A., Verma, A., Tyagi, J., Kumar, R. A simple method of DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis. Tubercle Lung Dis. 76 (6), 578-581 (1995).
  6. Käser, M., Ruf, M. T., Hauser, J., Marsollier, L., Pluschke, G. Optimized method for preparation of DNA from pathogenic and environmental mycobacteria. Appl Environ Microbiol. 75 (2), 414-418 (2009).
  7. De Almeida, I. N., Da Silva Carvalho, W., Rossetti, M. L., Costa, E. R. D., De Miranda, S. S. Evaluation of Six Different DNA Extraction Methods for Detection of Mycobacterium Tuberculosis by Means of PCR-IS6110: Preliminary Study. BMC Res Notes. 6, 561(2013).
  8. Pan, S., et al. Comparison of four DNA extraction methods for detecting Mycobacterium tuberculosis by real-time PCR and its clinical application in pulmonary tuberculosis. J Thorac Dis. 5 (3), 251-257 (2013).
  9. Kelly-Cirino, C., Niles, J., Ray, B., Stewart, A. Maximizing Mycobacterium Tuberculosis DNA Yield for Molecular Methods with PrepIT.MAX. PD-WP-00045 (Issue 2/2015-11), Accessed January 27 (2020).
  10. Votintseva, A. A., et al. Same-day diagnostic and surveillance data for tuberculosis via whole-genome sequencing of direct respiratory samples. J Clin Microbiol. 55 (5), 1285-1298 (2017).
  11. Odumeru, J., Gao, A., Chen, S., Raymond, M., Mutharia, L. Use of the Bead Beater for Preparation of Mycobacterium Paratuberculosis Template DNA in Milk. Can J Vet Res. 65 (4), 201-205 (2001).
  12. Oh, T. S., et al. An Effective Method of RNA Extraction from Mycobacterium tuberculosis. Ann Clin Microbiol. 19 (1), 20-23 (2016).
  13. Miyata, M., et al. Assessment of the quality of dna extracted by two techniques from mycobacterium tuberculosis for fast molecular identification and genotyping. Braz J Microbiol. 42 (2), 774-777 (2011).
  14. Votintseva, A. A., et al. Mycobacterial DNA extraction for whole-genome sequencing from early positive liquid (MGIT) cultures. J Clin Microbiol. 53 (4), 1137-1143 (2015).
  15. Kolia-Diafouka, P., et al. Optimized Lysis-Extraction Method Combined With IS6110-Amplification for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Paucibacillary Sputum Specimens. Front Microbiol. 9, 2224(2018).
  16. Bonnet, I., et al. A Comprehensive Evaluation of GeneLEAD VIII DNA Platform Combined to Deeplex Myc-TB Assay to Detect in 8 Days Drug Resistance to 13 Antituberculous Drugs and Transmission of Mycobacterium tuberculosis Complex Directly From Clinical Samples. Front Cell Infect Microbiol. 11, 707244(2021).
  17. Mann, B. C., et al. Systematic review and meta-analysis of protocols and yield of direct from sputum sequencing of Mycobacterium tuberculosis. bioRxiv. , (2024).
  18. Schwab, T. C., et al. Field evaluation of nanopore targeted next-generation sequencing to predict drug-resistant tuberculosis from native sputum in South Africa and Zambia. J Clin Microbiol. 63 (3), e0139024(2025).
  19. Colman, R. E., Seifert, M., De la Rossa, A., et al. Evaluating culture-free targeted next-generation sequencing for diagnosing drug-resistant tuberculosis: a multicentre clinical study of two end-to-end commercial workflows. Lancet Infect Dis. 25 (3), 325-334 (2025).
  20. Oberacker, P., et al. Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB): Open platform for high-throughput nucleic acid extraction and manipulation. PLoS Biol. 17 (1), e3000107(2019).
  21. Limberis, J. D., Metcalfe, J. Z. Turbolysis: A low-cost, small footprint alternative to commercial bead beaters for cell lysis. HardwareX. 19, e00576(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tuberculose diagnostiekDetectie van DrugresistentieVerwerking van SputummonstersZuivering met Magnetische BeadsKwantitatieve PCRNext Generation SequencingCellysis

Gerelateerde artikelen