Mycobacteriële DNA-extractie met behulp van kralen kloppen in aangepaste buffer gevolgd door NGS-workflow

Summary

Dit protocol toont aan dat het slaan van kralen in combinatie met het zuiveren van DNA-afvangkralen een snelle en consistente methode biedt voor het extraheren van DNA uit Mycobacterium tuberculosis-monsters , waardoor het een effectieve keuze is voor sequencing-toepassingen van de volgende generatie.

Abstract

Tuberculose is een dodelijke ziekte en de opkomst van resistentie tegen antibiotica in de veroorzaker bacterie, Mycobacterium tuberculosis, verslechtert de behandelingsresultaten. Nauwkeurige en snelle identificatie van geneesmiddelresistentie door middel van sequencingtechnologieën is nodig om de resultaten voor tuberculosepatiënten te verbeteren door middel van op maat gemaakte therapeutische regimes. De DNA-extractiemethode is van cruciaal belang voor stroomafwaartse moleculaire tests en wordt bemoeilijkt door de taaie celwand van Mycobacterium, de lage bacillaire belasting van veel klinische monsters en de complexiteit van de sputummatrix. Er zijn talloze DNA-extractiemethoden voor M. tuberculose gemeld, maar er is momenteel geen gouden standaard. Bovendien is aangetoond dat weinig van deze methoden consistent werken, en veel zijn niet geschikt voor tuberculose met weinig middelen en veel last. Bijgevolg introduceren laboratoria vaak hun eigen procedurewijzigingen, wat resulteert in een aanzienlijke variabiliteit van de methode. Hier presenteren we een kosteneffectief, snel en gestandaardiseerd protocol voor mycobacteriële DNA-extractie uit zowel klinisch sputum als cultuur dat DNA produceert dat geschikt is voor qPCR en dat moet worden overwogen voor gebruik in laboratoria voor klinische diagnostiek.

Introduction

Het extraheren van hoogwaardig DNA uit M. tuberculosis is noodzakelijk voor de detectie van resistente tuberculose (tbc) met behulp van gerichte next-generation sequencing (NGS) en whole genome sequencing (WGS), maar wordt vaak over het hoofd gezien. We hebben een gestandaardiseerd protocol ontwikkeld om consistent DNA van hoge kwaliteit te leveren voor klinische NGS-toepassingen, waaronder gerichte NGS-benaderingen zoals Deeplex-MycTB (GenoScreen) en sequencing van het hele genoom, die nu worden aanbevolen door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) voor de diagnose van resistente tuberculose. Hoewel de WHO deze op NGS gebase....

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd aan de Universiteit van Californië San Francisco (UCSF) onder goedkeuring van het Institutional Biosafety Committee (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) en volgt de richtlijnen voor onderzoeksethiek van de UCSF. We hebben restmonsters van sputum verkregen die zijn verzameld door Discovery Life Sciences onder een door de IRB goedgekeurd protocol voor vrijstelling van toestemming van personen met niet-tbc-ademhalingsaandoeningen.

1. Voorbereiding van buffers

1. Aangepaste Triton-buffer (Tabel 1): Om 100 ml aangepaste Triton-buffer te bereiden, begi....

Results

We hebben het DNA-extractieprotocol getest op zowel gekweekte M. tuberculosis als M. tuberculosis spiked sputummonsters (n = 3 voor elke aandoening). Met behulp van gekweekte M. tuberculosis H37Rv mc² 7901 hebben we de input gestandaardiseerd op 8,4 x 10⁶ cellen per 50 μL, wat overeenkomt met 1 ml van een MGIT-cultuur bij 200 GU. Voor sputumexperimenten hebben we 1 ml sputum gepoold van personen met niet-tbc-ademhalingsaandoeningen (commercieel verkr.......

Discussion

In dit werk presenteren we een robuust, gevalideerd protocol voor het extraheren van hoogwaardig M. tuberculosis-DNA met behulp van kralenkloppen met magnetische kralenopruiming voor stroomafwaartse moleculaire en NGS-toepassingen.

De methode biedt verschillende voordelen ten opzichte van bestaande DNA-extractieprotocollen van M. tuberculosis . Hoewel de traditionele fenol-chloroform-extractie doorgaans enkele dagen duurt en gevaarlijke chemi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mm Zirconia-Silicate Beads	Biospec Products	11079101z	Beads used for bead-beating step to lyse mycobacterial cells
AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	Magnetic beads for DNA cleanup post-lysis
EDTA (0.5M, pH 8.0)	Thermo Fisher Scientific	AM9260G	Custom Triton/ Low EDTA Buffer Components
Fastprep 24	MPbio, USA	116004500	Equipment for bead beating at 6.5 m/s
Forward Primer	Thermo Fisher Scientific	Custom synthesis	Primer sequence: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O (Water, molecular biology grade)	Thermo Fisher Scientific	BP2819-1	Custom Triton/ Low EDTA Buffer Components
Luna Universal Probe	New England Biolabs	M3004	qPCR reagent for Mycobacterial DNA enumeration
MycoPrep Kit	BD	SKU/REF 240863	BD MycoPrep Specimen Digestion for NALC-NaOH Sputum Processing
NaCl (Sodium Chloride, 5M solution)	Thermo Fisher Scientific	AM9759	Custom Triton/ Low EDTA Buffer Components
PBS	Millipore Sigma	P2272	Sputum Processing
Reverse Primer	Thermo Fisher Scientific	Custom synthesis	Primer sequence: GTTTACGGCGTGGACTACCA
TaqMan Probe	Thermo Fisher Scientific	Custom synthesis	Probe sequence: AGGAGGAACACCGGTGGCGA
Tris-HCl (1M, pH 8.0)	Thermo Fisher Scientific	AM9855G	Custom Triton/ Low EDTA Buffer Components
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	28314	Custom Triton/ Low EDTA Buffer Components